JP5766599B2

JP5766599B2 - 誘導体化トリアジンをアフィニティーリガンドとして使用する抗体フラグメントの精製法

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Publication number: JP5766599B2
Application number: JP2011508993A
Authority: JP
Inventors: リッデル，ジョン・マクドナルド
Original assignee: フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ・ユーケイ・リミテッド
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-05-07
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2029-05-07
Also published as: KR20110017854A; US20110046353A1; CN102056943A; JP2011521909A; EP2285830A1; WO2009138714A1; GB0808908D0; CA2724019A1

Description

本発明は、フラグメント抗体（ｆＡｂｓ）の精製法に関する。

フラグメント抗体（ｆＡｂｓ）は、様々な治療分野において重要性を増しつつある。ｆＡｂｓの最も重要な製造法の一つは組換え技術によるものである。そのような技術は、宿主細胞を使用して所望のｆＡｂを発現させ、次いでそれを生成培地から分離し、精製するというものである。精製は一般的にクロマトグラフィーによって達成されるが、通常、複雑な多段階プロセスである。この複雑さが必然的に、得られうるｆＡｂの収量を制限する役割を担い、製造プロセスを著しく緩徐化することにもなる。従って、簡素化された操作に適した精製法を特定することが望ましいであろう。

多くの全長抗体(whole antibody)は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって精製されている。しかしながら、プロテインＡは、時として過酷なプロセス条件下における乏しい安定性、変性、高コスト、及びプロテインＡ自体が生物起源材料であるという事実に由来する規制上の懸念など、いくつかの欠陥を有すると認識されている。そこで、プロテインＡにアフィニティーを有する抗体の精製の代替手段として合成アフィニティーリガンドが開発されてきた。

ｆＡｂｓは、プロテインＡに対するアフィニティーを持たず、従って結合しないため、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製されない。

本発明の一側面に従って、培地からのｆＡｂの分離法を提供する。該方法は、ｆＡｂを含む培地を、支持マトリックスに付着させた合成アフィニティーリガンドと、ｆＡｂが合成アフィニティーリガンドに結合する条件下で接触させることを含む。ここで、前記合成アフィニティーリガンドは、式：

［式中、
Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表し；
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、水素結合が可能な一つ又は複数の置換基、好ましくは一つ又は複数の−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＣＯ_２Ｈ基で置換されている−Ｙ−フェニル又は−Ｙ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立して、−ＮＲ、−Ｏ−又は−Ｓ−を表し；そして
各Ｒは、独立して、Ｈ又はＣ_１−４アルキル基を表す］
を有する。

本発明の方法によって精製できるｆＡｂｓは、免疫グロブリンのドメイン又は免疫グロブリンのドメインの集合体(assembly)を含み、抗原に結合することが可能な抗体の一部分である。ｆＡｂｓは、多くの態様において、少なくとも１本の重鎖（Ｈ鎖）、一般的にはＶ_Ｈ鎖、又はその機能的フラグメント、あるいは軽鎖（Ｌ鎖）、一般的にはＶ_Ｌ鎖、又はその機能的フラグメントを少なくとも一つの他方の鎖と共に含む。一定の態様において、ｆＡｂは、重鎖と軽鎖を含み、各鎖は定常ドメインと可変ドメインで構成されている。例えばＦａｂのようなものである。他の態様において、ｆＡｂは２個以上のドメインを含む。典型的には、重鎖又は軽鎖いずれかの可変及び定常ドメインのいずれかの組合せ、２本の重鎖からの可変ドメインの組合せ、２本の軽鎖からの可変ドメインの組合せ、又は軽鎖からの可変ドメインと重鎖からの可変ドメインの組合せである。一部の態様において、ｆＡｂは、解離を防止するフレキシブルなポリペプチドリンカーによって結合されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）。なお更なる態様において、ｆＡｂは単一ドメイン、又はそのフラグメントを含む。典型的には、可変重鎖もしくはそのフラグメント、又は可変軽鎖もしくはそのフラグメントのいずれかである。なお更なる態様において、ｆＡｂは、多量体形式、例えば、ビスｓｃＦｖ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ_３、ミニボディ(minibody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)又はタンダブ(tandab)である。

本発明の方法によって精製できるｆＡｂｓの例は、重鎖と軽鎖の組合せを含むタンパク質又はポリペプチド構造体を含む。各鎖は定常ドメインと可変ドメインで構成され、そのような免疫グロブリンの軽鎖と重鎖は相互作用して単一の機能的抗原結合部位を形成している。

更なる例は、Ｖ_Ｈ鎖ベースドメイン抗体を含む。これは標的に結合できるポリペプチドで、このポリペプチドは少なくとも一つの結合ドメインを含む。前記結合ドメインは可変重鎖抗体の単一可変ドメイン又はその機能的フラグメントである。

なお更なる例は、Ｖ_Ｌ鎖ベースドメイン抗体を含む。これは標的に結合できるポリペプチドで、このポリペプチドは少なくとも一つの結合ドメインを含む。前記結合ドメインは可変軽鎖抗体の単一可変ドメイン又はその機能的フラグメントである。

最も好ましくは、ｆＡｂｓは組換え技術によって製造される。例えば、大腸菌(E.coli)のような原核宿主又はピキア・パストリス(メタノール資化性酵母、Pichia pastoris)のような真核宿主などの宿主細胞における発現によって製造される。

好適なアフィニティーリガンドは、式：

の化合物である。式中、Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表し、Ａ及びＢは、それぞれ独立して、一つ又は複数の−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＣＯ_２Ｈ基で置換されている−ＮＨ−フェニル又は−ＮＨ−ナフチル基である。Ａ又はＢのいずれかがフェニルを表す場合、置換基、最も好ましくは−ＯＨは、好ましくは−ＮＨ部分への結合に対してメタ又はパラ位に位置する。特に好適なアフィニティーリガンドは、式：

の化合物を含む。式中、Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表す。

Ｑで表しうるスペーサー基は、所望により置換されていてもよいアミノアルキルアミノ部分などである。例えば、式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−Ｇの基（前記式中ｎは１２までの正の整数、好ましくは２〜６であり、Ｇは固体の支持マトリックスである）；式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇの基（前記式中ｎ及びＧは前述の定義の通りである）；式−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇの基（前記式中ｎ及びＧは前述の定義の通りである）；式−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇの基（前記式中ｎ及びＧは前述の定義の通りである）；式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇの基（前記式中ｎ及びＧは前述の定義の通りである）；式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｘＯ−Ｇの基（前記式中ｎ及びＧは前述の定義の通りであり、ｘは１〜６である）。一つ又は複数の−ＣＨ_２−部分は、一つ又は複数の置換基、例えばＯＨ又はＮＨ_２基によって置換されていてもよい。

アフィニティーリガンドが付着できる固体の支持マトリックスはアフィニティークロマトグラフィーの分野で周知であり、合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール又はポリスチレン、特に架橋合成ポリマー；無機支持体、例えばシリカ系支持体；及び特に多糖支持体、例えばデンプン、セルロース又はアガロースなどである。

一定の態様において、ＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔＡ１Ｐ及びＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔＡ２Ｐの商標名で市販されている支持アフィニティーリガンドを用いて優れた結果が達成されている。

ｆＡｂを含有する培地と支持アフィニティーリガンドとの接触は、ｆＡｂがアフィニティーリガンドに結合する条件下で実施される。多くの態様において、ｆＡｂを含む水溶液はほぼ中性のｐＨ、例えばｐＨ約６〜８、例えば６．５〜７．５、特にｐＨ７である。一部の態様において、該水溶液は、高イオン強度、例えば７５〜１２５ｍＳ／ｃｍを有するが、多くの態様において、該水溶液は、好ましくは低イオン強度、例えば５０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば１０〜４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約３０ｍＳ／ｃｍ、例えば２７〜３３ｍＳ／ｃｍを有する。接触は、好ましくは実質的にすべてのｆＡｂがアフィニティーリガンドに結合するまで持続される。ｆＡｂを含む培地中に存在しうる多くの不純物はアフィニティーリガンドに結合しないので、培地中に残る。

一般的に、支持アフィニティーリガンドはクロマトグラフィーのカラムに使用され、ｆＡｂを含む培地をカラムに流す。カラムへの１回通過が採用されうるが、代替として、培地をカラムに再循環させることもできる。２本以上のカラムを順々に使用してもよい。

結合したｆＡｂを含む支持体は、ｆＡｂの結合が保持される条件下で、一つ又は複数の洗浄液で洗浄することができる。例えば、ｆＡｂの性質にもよるが、低イオン強度及びほぼ中性のｐＨの水性緩衝液を使用するか、又はほぼ中性のｐＨ及びｆＡｂをロード(load)するのに使用された水溶液のイオン強度に相当する、又はそれより高いイオン強度の緩衝液を使用して洗浄する。

次に、リガンドからｆＡｂを放出させる溶液と接触させることによって、例えばイオン強度を変えることにより、ｆＡｂをアフィニティーリガンドから分離することができる。多くの態様において、溶離溶媒は、ｆＡｂをリガンドに付着させた際の培地よりも低いｐＨを有する水溶液、例えば２〜４の範囲のｐＨを有する緩衝液を含む。所望であれば、グラジエント溶離法を採用することもできる。

本発明の第二の側面に従って、ｆＡｂの製造法を提供する。該方法は、
ａ）組換え技術によってｆＡｂを製造して、ｆＡｂを含む培地を製造し；
ｂ）ｆＡｂを含む培地を、支持マトリックスに付着させた合成アフィニティーリガンドと、ｆＡｂが合成アフィニティーリガンドに結合する条件下で接触させることを含む方法によってｆＡｂを培地から分離し、ここで、前記合成アフィニティーリガンドは、式：

［式中、
Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表し；
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、水素結合が可能な一つ又は複数の置換基、好ましくは一つ又は複数の−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＣＯ_２Ｈ基で置換されている−Ｙ−フェニル又は−Ｙ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立して、−ＮＲ、−Ｏ−又は−Ｓ−を表し；そして
各Ｒは、独立して、Ｈ又はＣ_１−４アルキル基を表す］
を有し；そして
ｃ）ｆＡｂをアフィニティーリガンドから放出させる
ことを含む。

本発明の第二の側面による方法によって製造されたｆＡｂｓは、所望であれば更なる精製ステップ、例えば一つ又は複数のイオン交換クロマトグラフィー；疎水性に基づくクロマトグラフィー、例えばＨＩＣ、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、又は混合モードクロマトグラフィー；又はサイズベースの精製法、例えばゲルろ過に付してもよい。

ＳＤＳＰＡＧＥゲルＳＤＳＰＡＧＥゲル

本発明を以下の実施例によって制限なしに例示する。

実施例１
ｆＡｂ（モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１．３由来）を組換え大腸菌株でペリプラズム発現によって製造した。総分子量４７．４ｋＤａのｆＡｂ（二本鎖−コンテスタント（contestent）ドメイン付きの可変軽鎖ドメインを含む重鎖及び定常ドメイン付きの可変軽鎖ドメインを含む重鎖）を細胞のペリプラズム（周辺腔）に分泌させ、次いで発酵増殖培地中に分泌させた。発酵終了時、発酵槽の上清中に存在するＤ１．３の量はおよそ１００ｍｇ／Ｌであった。

ｆＡｂＤ１．３の初期単離は、遠心分離による細胞物質の除去と、その後の０．４５／０．２ミクロンフィルタに通すろ過を含んでいた。得られた清澄溶液は、２９．３ｍＳ／ｃｍの導電率と６．７のｐＨを有していた。

直径１．６ｃｍの２本のカラムに、一つのカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ１Ｐを、第二のカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ２Ｐ生体模倣プロテインＡクロマトグラフィー媒体をそれぞれ２．５ｃｍのベッド高まで詰めた。カラムの充填は、非対称性とＨＥＴＰによって評価した。

各カラムとも類似のプロトコルに従った。

平衡化洗浄５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
Ｄ１．３の結合化
ロード後洗浄５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
溶離５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３
再生０．５ＭＮａＯＨ
いずれの場合も、Ｄ１．３のロード物質のコンディショニングは、ｐＨを７に調整する以外は行わなかった。いずれの場合も、５０ｍＭクエン酸塩の溶離緩衝液で単一の溶出ピークが得られた。

溶出画分のＳＤＳＰＡＧＥゲルは、いずれの場合も高精製度のｆＡｂＤ１．３が得られたことを示していた（図１及び図２参照）。

比較例２
ｆＡｂＤ１．３をプロテインＡ媒体に結合させようとする比較実験を実施した。実施例１で使用したのと同じｆＡｂＤ１．３のサンプルを１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）のプロテインＡカラムに適用した。ｆＡｂＤ１．３の発酵槽上清を遠心分離して細胞を除去し、０．４５／０．２ミクロンフィルタに通してろ過し、ｐＨを７に調整した。ロード物質の導電率は２９ｍＳ／ｃｍであった。

準拠したクロマトグラフィープロトコルは製造業者がＩｇＧ結合用に推奨したものであった。

平衡化洗浄１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７
Ｄ１．３のローディング
ロード後洗浄１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７
溶離１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３
再生１０ｍＭＮａＯＨ
１００ｍＭクエン酸塩の溶離緩衝液を適用したが溶出ピークは見られなかった。ＳＤＳＰＡＧＥによる溶出画分の検査で、溶出洗浄画分中にｆＡｂＤ１．３は検出できず、ｆＡｂＤ１．３はプロテインＡ媒体には結合していないことが確認された。

実施例３
Ｖ_Ｌ系ドメインのフラグメント（抗ＴＮＦドメイン、ＴＡＲ１−５−１９ −国際特許出願ＷＯ２００５０３５５７２Ａ２の図１２中、配列ＩＤ番号１６）を組換え大腸菌株でのペリプラズム発現によって製造した。総分子量１１．９ｋＤａのドメインを細胞のペリプラズム（周辺腔）に分泌させ、次いで発酵増殖培地中に分泌させた。発酵終了時、発酵槽の上清中に存在する抗ＴＮＦドメインの量はおよそ２．４ｇ／Ｌであった。

ドメインＴＡＲ１−５−１９の初期単離は、遠心分離による細胞物質の除去と、その後の０．４５／０．２ミクロンフィルタに通すろ過を含んでいた。得られた清澄溶液は、約３２ｍＳ／ｃｍの導電率と７．２のｐＨを有していた。

直径１．６ｃｍの２本のカラムに、一つのカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ１Ｐを、第二のカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ２Ｐ生体模倣プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、４．３ｃｍ（Ａ１Ｐ）及び２．３ｃｍ（Ａ２Ｐ）のベッド高まで詰めた。カラムの充填は、非対称性とＨＥＴＰによって評価した。

各カラムとも類似のプロトコルに従った。

平衡化洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
ＴＡＲ１−５−１９ドメインの結合化
ロード後洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
溶離２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７から２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３への１５ＣＶにわたるリニアグラジエント
再生０．５ＭＮａＯＨ
いずれの場合も、抗ＴＮＦドメインのロード物質のコンディショニングは、ｐＨを７に調整する以外は行わなかった。抗ＴＮＦドメインの結合は、ＳＤＳＰＡＧＥゲルによって評価され、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの量であると評価された。

実施例４
Ｖ_Ｈ系ドメインのフラグメント（抗ニワトリ卵白リゾチームドメインＨＥＬ４ −Ｊｅｓｐｅｒｓら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ（２００４）３３７８９３−９０３）を組換え大腸菌株中でのペリプラズム発現によって製造した。分子量１２．８ｋＤａのドメインを細胞のペリプラズム（周辺腔）に分泌させ、次いで発酵増殖培地中に分泌させた。発酵終了時、発酵槽の上清中に存在するＨＥＬ４ドメインの量はおよそ１．５ｇ／Ｌであった。

ＨＥＬ４の初期単離は、遠心分離による細胞物質の除去と、その後の０．４５／０．２ミクロンフィルタに通すろ過を含んでいた。得られた清澄溶液は、約３１ｍＳ／ｃｍの導電率と６．９のｐＨを有していた。

各カラムとも類似のプロトコルに従った。

平衡化洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
ＨＥＬ４ドメインの結合化
ロード後洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
溶離２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７から２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３への１５ＣＶにわたるリニアグラジエント
再生０．５ＭＮａＯＨ
いずれの場合も、ＨＥＬ４ドメインのロード物質のコンディショニングは、ｐＨを７に調整する以外は行わなかった。ＨＥＬ４ドメインの結合は、ＳＤＳＰＡＧＥゲルによって示された。

実施例５
タンデム抗体フラグメントから誘導されたタンデム抗体フラグメント（二本鎖で構成されるタンダブ、各鎖は４個のドメイン（国際特許出願ＷＯ２００７／０８８３７１の実施例１５に記載のような（Ｖ_ＨＶ_ＬＶ_ＨＶ_Ｌ）_２の形式の２個のＶ_Ｈ及び２個のＶ_Ｌドメイン）を含有する）を組換え大腸菌株中でのペリプラズム発現によって製造した。総分子量約１００ｋＤａのタンダブを細胞のペリプラズム（周辺腔）に分泌させ、次いで発酵増殖培地中に分泌させた。発酵終了時、発酵槽の上清中に存在するタンダブの量は約１００ｍｇ／Ｌと推定された。

タンダブの初期単離は、遠心分離による細胞物質の除去と、その後の０．４５／０．２ミクロンフィルタに通すろ過を含んでいた。得られた清澄溶液は、約３１ｍＳ／ｃｍの導電率と６．９のｐＨを有していた。

直径０．７ｃｍの２本のカラムに、一つのカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ１Ｐを、第二のカラムにはＰｒｏｍｅｔｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡ２Ｐ生体模倣プロテインＡクロマトグラフィー媒体を３ｃｍのベッド高まで詰めた。

各カラムとも類似のプロトコルに従った。

平衡化洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
タンダブ抗体フラグメントの結合化
ロード後洗浄２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
溶離２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３
再生０．５ＭＮａＯＨ
いずれの場合も、タンダブ抗体フラグメントのロード物質のコンディショニングは、ｐＨを７に調整する以外は行わなかった。タンダブ抗体フラグメントの結合は、ＳＤＳＰＡＧＥゲルによって評価され、特異的結合及び溶出が検出された。

Claims

プロテインＡに対するアフィニティーを欠いているフラグメント抗体を培地から分離する方法であって、フラグメント抗体を含む培地を、支持マトリックスに付着させた合成アフィニティーリガンドと、フラグメント抗体が合成アフィニティーリガンドに結合する条件下で接触させることを含み、前記合成アフィニティーリガンドは、式：
［式中、
Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表し；
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、水素結合が可能な一つ又は複数の置換基で置換されている−Ｙ−フェニル又は−Ｙ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立して、−ＮＲ、−Ｏ−又は−Ｓ−を表し；そして
各Ｒは、独立して、Ｈ又はＣ_１−４アルキル基を表す］
を有する方法。
プロテインＡに対するアフィニティーを欠いているフラグメント抗体を製造する方法であって、
ａ）組換え技術によってプロテインＡに対するアフィニティーを欠いているフラグメント抗体を製造して、フラグメント抗体を含む培地を製造し；
ｂ）フラグメント抗体を含む培地を、支持マトリックスに付着させた合成アフィニティーリガンドと、フラグメント抗体が合成アフィニティーリガンドに結合する条件下で接触させることを含む方法によって、フラグメント抗体を培地から分離し、ここで、前記合成アフィニティーリガンドは、式：
［式中、
Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表し；
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、水素結合が可能な一つ又は複数の置換基で置換されている−Ｙ−フェニル又は−Ｙ−ナフチル基であり；
各Ｙは、独立して、−ＮＲ、−Ｏ−又は−Ｓ−を表し；そして
各Ｒは、独立して、Ｈ又はＣ_１−４アルキル基を表す］
を有し；そして
ｃ）フラグメント抗体をアフィニティーリガンドから放出させる
ことを含む方法。
前記フラグメント抗体が、大腸菌又はピキア・パストリス宿主細胞の発現によって製造される、請求項２に記載の方法。
水素結合が可能な置換基が、−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＣＯ_２Ｈ基から独立して選ばれる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
支持マトリックスに付着させた合成アフィニティーリガンドが、式：
［式中、Ｑは、固体の支持マトリックスへの、所望によりスペーサー基を介していてもよい付着を表す］の化合物から選ばれる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
Ｑが、式−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−Ｇ；−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇ；−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇ；−Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇ；−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｇ；及び−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−（ＣＨ_２）_ｘＯ−Ｇ
［式中、ｎは１２までの正の整数であり；
ｘは１〜６であり；そして
Ｇは固体の支持マトリックスである］の基からなる群から選ばれるスペーサー基を表す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
ｎが２〜６である、請求項６に記載の方法。
前記フラグメント抗体が６〜８のｐＨでリガンドに結合している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
前記フラグメント抗体が６．５〜７．５のｐＨでリガンドに結合している、請求項８に記載の方法。
前記フラグメント抗体が、５０ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは１０〜４０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する溶液中を用いてリガンドに結合される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記フラグメント抗体が、１０〜４０ｍＳ／ｃｍのイオン強度を有する溶液中を用いてリガンドに結合される、請求項１０に記載の方法。
前記フラグメント抗体が、Ｆａｂ；ｓｃＦｖ；単一ドメイン、又はそのフラグメント；ビスｓｃＦｖ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ_３、ミニボディ(minibody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)又はタンダブ(tandab)である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
前記フラグメント抗体が、可変重鎖からの単一ドメイン又はそのフラグメント、あるいは可変軽鎖からの単一ドメイン又はそのフラグメントである、請求項１２に記載の方法。