SU1186243A1 - Способ получени адсорбента дл аффинной хроматографии - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНШ АДСОРБЕНТА ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ путем модифицировани  полимера-носител , содержащего сложноэфирные группы, первичным амином, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  технологии процесса получени  адсорбента и повышени  селективности его биоспецифического действи , модифицирование полимера-носител  осуществл ют обработкой расплавом первичного аъшна при температуре, не превышающей температуру разложени  носител . (Л

Description

00

а ю

4

СО 11 Изобретение относитс  к биологической химии, .а именно к способам получени  адсорбентов дл  аффинной хроматографии, которые могут быть использованы при исследовани х, полу чении и анализе белков и различных :биологически- активных веществ, а так же в медицинской, фармацевтической, микробиологической и пищевой промышленности дл  выделени , очистки и им мобилизации антител, антигенов ферментов ,их субстратов, других белков и низкомолекул рных веществ. Известен способ получени  адсорбе тов дл  биоспецифической хроматографии , заключающийс  п образовании химической пространственной группы (ножки) путем взаимодействи  исход ного носител  с инертныьш водорастворимыми полисахаридами, содержащими функциональные группы, обеспечивающи ми ковалентное св зывание пространст венной группы с носителем, активации полисахаридов бромцианом и последующ го присоединени  аффинного лиганда к носителю через активированную пространственную группу lJ. Недостатками этого способа  вл ютс  сложность технологии, высока  стоимость исходных реагентов, необходимость применени  высокотоксичных веществ (бромциапа), возможность неспецифичного взаимодействи  за счет образовани  N,N-замещенных гуанидинов . Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ получени  адсорбента дл  .аффинной хроматографии, заключающийс  в модификации Сферона (полиоксиалкилметакрилата ) путем обработки его поверхности воднььм раствором бромциана при рН 11 и охлаждении льдом с последующей промывкой и обра боткой водным раствором св зываемого вещества, содержшцего аминогруппу, при рН 9,0 и комнатной температуре в течение нескольких часов 2 J. Недостатками известного способа  вл ютс  сложность процесса модификации , предусматривающего строгое поддержание рН реакционной смеси, вы сока  токсичность используемых цеактивов (бромциана), что вызывает необ ходимость применени  р да мер предосторожности , усложн ющих процесс модификации, пониженна  биоспецифичность получаемых адсорбентов, обусловлеш а  образованием N,N -дизаме3 :щенных гуанидинов, несущих положительные зар ды и действующих в определенных услови х как детергенты, в результате чего возникает неспецифическа  сорбци  и возможна денатураци  раздел емых белков. Цель изобретени  - упрощение технологии процесса получени  адсорбента и повышение селективности его биоспецифического действи . Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  адсорбента дл  аффинной хроматографии путем модифицировани полимера-носител , содержащего сложноэфирные группы, первичным амином, модифицирование полимера-носител  осуществл ют обработкой расплавом первичного амина при температуре, не превышающей температуру разложени  носител . Сущность предлагаемого способа заключаетс  в термохимической модификации исходного носител  полиэфирной природы первичным амином, в результате чего происходит аминолиз части сложноэфирных групп, в то врем ,как сущность известного способа состоит в предварительной активации исходного носител  водным раствором бромциана, привод щей к образованию на нем цианатных jpynn, последующей обработке водным раствором гексаметилендиамина при комнатной температуре, в результате чего возникает гуанидинова  структура. В качестве полимера-носител  могут использоватьс  любые полимеры со сложноэфирной группой, в частности эфиры полиакриловьк кислот, поперечно сшитые этиленгликолевые эфиры дикарбоновых кислот. В качестве аминов используют первичные моно- и диамины. Пример 1. Перегон ют гексаметилендиа ин при нормальном давлении и добавл ют к расплаву 5 вес.ч. гексаметилендиамина, 2 вес.ч. сухого адсорбента - полиоксиалкилметакрила .та Сферон-1000 с размером частиц 60-100 мкм. Смесь нагревают в колбе с обратным холодильником при 205 С в течение времени, определ емого необходимым количеством аминогрупп в конечном продукте. В данном примере кип че1ше смеси производ т в течение 1,5 ч. Перенос т реакционную смесь в воронку со стекл нным фильтром, установленную в колбе Бунзена, и промывают ее последовательно 20 объемами воды, 5 объемами ацетона и 5 объемам диэтилового эфира. Полученный препарат высушивают при комнатной температуре и осуществл ют качественный и количественный анализ полученного адсорбента стандартнЕЛми методами. Пример 2. Осуществл ют аналогично тфимеру 1 за исключением того , что в качестве полимера используют полиэтиленгликольадипинат и обработку ведут 10 мин. Количественный анализ полученных адсорбентов провод т с помощью нинги ринового реактива и осуществл ют непр мым иодатометрическим способом. Дл  этого к 10 мг сухого адсорбента добавл ют 2 мл раствора НС1 (20 MKI- экв/мл) и инкубируют смесь в течение 5 мин при 25 С и при легком перемешивании . Далее суспензию отстаивают по 1 мл жидкости, наход щейс  над осадком, перенос т во флаконы, куда затем добавл ют по 1 мл смеси 1%-ног NaU и 1%-ного KJOj . Вьщелившийс  йод титруют 0,01М раствором тиосульфата натри . Рассчитывают количество св занной с адсорбентом кислоты и по не му суд т о содержании аминогрупп в адсорбенте. При этом учитывают также результаты контрольного титровани  н модифицированного адсорбента. Присоединение аффинного лиганда к модифицированным адсорбентам, полученным по известному и предлагаемому способам, провод т методом карбодиимидного св зывани . В качестве аффинного лиганда используют п-анисовую кислоту. Полученный предлагаемым способом биоспец фический адсорбент успешно используют дл  вьщелени  анизолсв зывающего белка обон тельного эпители  собаки согласно методу Прайса. Количество неспецифически св завшегос  с адсорбентом белка определ ют путем его элюировани  из хроматографической колонки раствором 5М моч . вины и ЗМ NaCl и измерени  ультрафио летового поглощени  элюата проточной кюветой Увикорд. Пример 3. В качестве исходны адсорбентов используют полиоксиалкил метакрилат типа Сферон-300 и поперечно сшитый полиэтиленгликольтерефталат . Модифицирующим реактивом слу жит путресцин (1,4-диаминобутан). Модификацию известным и предлагаемым способами, а также количественный и качественный анализ полученных адсорбентов провод т аналогично примеру 1, но при температуре расплава 160°С. Пример 4, Осуществл ют аналогично примеру 3 за исключением того , что в качестве полимера используют полиэткленгликольтерефталат и обработку ведут 10 мин. Пример 5. В качестве исходного адсорбента используют Сферон1000 . Модифицирующим реактивом служит бензиламин, который в данном случае  вл етс  и аффинным лигандом. Модификацию адсорбента предлагаемым способом осуществл ют аналогично примеру 1.. Концентрацию бензиламина на полученном аффинном адсорбенте определ ют методом исчерпывающего сульфировани  . Полученные данные процесса модификации адсорбентов приведены в таблице . Приведенные в таблице результаты подтверждают повьш1ение биоспецифич- ности адсорбента, неспецифическое св зывание белка с которым уменьшилось в 4 раза (с 0,4 мг белка/г сухого адсорбента до О,1 мг белка/г сухого адсорбента), и расширение количества типов адсорбентов, пригодных дл  использовани  в аффинной хроматографии (в частности поперечно сшитый полиэтиленгликольадипинат ). Количество биоспецифически св занно о белка при использовании адсорбентов по известному способу и примеру 1 составл ет t4 мкг/мл гел . Измен   врем  термохимической обработки исходного адсорбента модифицирующим реагентом, можно варьировать концентрацию аффинного лиганда в широких пределах, что позвол ет точно регулировать свойства получаемого аффинного адсорбента. Таким образом, варьиру  типы адсорбентов , типы первичных аминов и врем  модификации, можно получать, реализу  предлагаемый способ, широкий спектр адсорбентов дл  аффинной хроматографии с заранее заданными свойствами. Преимуществами предлагаемого способа получени  адсорбента дл  аффинной хроматографии по сравнению с известным  вл ютс  простота технологии , осуществл емой в одну стадию, включающую в себ  кип чение реакционной смеси без контрол  и поддержани  рН, промывку и сушку полученного продукта, в то врем , как при реализации известного способа необходима предварительна  обработка исходно го адсорбента токсичным бромцианом, повышенна  биоспецифи.чность получаемого адсорбента, определ ема  образованием амидной-св зи в процессе .аминолиза сложных эфиров и  вл юща с  св зывающим звеном между исходным адсорбентом и ножкой (или аф(1)инным лигандом). Образованна  аминна  св з  вл  сь злектронейтральной и гидрофильной , не оказывает дёнатурирующего воздействи  на раздел емые белки и не снижает специфичности их сорбции в то врем , как в известном способе вместо амидной св зи образуетс  N,N - дизамещениа  изомочевинна 

группировка, несуща  положительньп зар д и обладающа  свойствами детергента , безопасность технологии, определ ема  отказом от использовани  крайне токсичного бромциана, сравнительно низка  стоимость получаемого продукта и возможность получени  адсорбента многоцелевого применени  за счет возможности регулировани  числа присоединенных активных групп, что . важно при протекании р да хроматографических процессов.

Промьшшенное производство модифицированньк адсорбентов на базе Сферона по предлагаемому способу, учитыва  их высокое качество и достаточно низкую стоимость, позвол ет использовать их в некоторых отрасл х пищевой , фармацевтической и .Ш1кробиологической промышленности, где ранее использование аффинных адсорбентов было вообще невозможно из-за их высокой стоимости.

Сферон10 мин

5%-ный вод1000 рН 11 ный раствор, рН 9, 2 ч

То же .

Сферонрасплавом , 1000 1,5 ч.

отсутств, Т-205С

Расгшавом 10 мин Т -

194

0,4

3000 ,1

260

2,3

10 мин

СферонрН 11 300

Предлагаемый по

примеру 3 Сферон300

9

215

Расплавом 1,5 ч

326

Расплавом

233 10 мин Т -

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ путем модифицирования полимера-носителя, содержащего сложноэфирные группы, первичным амином, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса получения адсорбента и повышения селективности его биоспецифического действия, модифицирование полимера-носителя осуществляют обработкой расплавом первичного амина при температуре, не превышающей температуру разложения носителя.

   .•“X § ω

   86243