CN104813165A - 分离剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离剂，其具有载体和通过化学键合担载于载体表面的配体，其特征在于：上述载体是由无孔性的核和多孔性的壳构成的核-壳型粒子，该壳的细孔直径为9nm以上，该壳由聚烷氧基硅氧烷的水解物构成，上述配体为光学活性聚合物、光学惰性的聚酯、蛋白质、核酸、分子量50～1000的光学活性的有机化合物。

Description

分离剂
技术领域
本发明涉及具有特定的载体、和通过化学键合担载于该载体表面的特定的配体的分离剂。
背景技术
在医药、农药、生化学关联的产业领域中，分离・纯化作为生产对象的目标物质是极其重要的课题，作为这样的分离技术，使用分离剂的方法是自古以来实行的方法。作为这样的分离剂将作为分离对象的物质进行分离的原理，有利用分离剂与目标物质的亲和性的原理、或利用分离剂与目标物质的光学活性的原理。
作为上述分离剂，以往已知有：将全多孔性的硅胶(シリカゲル)作为载体，根据作为分离对象的目标物质，在其载体上担载各种配体而得的分离剂。
作为使用全多孔性的硅胶作为载体而获得的分离剂，例如已知有担载光学活性聚合物而得的分离剂。使用这样的光学活性聚合物担载于载体而得的分离剂时，可以进行光学拆分。
作为上述光学活性聚合物，有人报道了：将纤维素等的多糖进行了衍生物化的多糖衍生物(例如，参见专利文献1)、光学活性的聚(甲基)丙烯酰胺(例如，参见专利文献2)、光学活性的聚氨基酸(例如，参见专利文献3)、光学活性的聚酰胺(例如，参见专利文献4和5)。
另一方面，还已知有：光学活性的低分子化合物(例如，具有联萘结构或冠醚结构的化合物)通过化学键合与载体结合而得的光学异构体的分离剂(例如，参见专利文献6)。
另外，还有人报道了：将由具有交联结构的合成高分子构成的粒子作为载体，其载体上担载作为配体的蛋白质或具有糖链的糖蛋白质的分离剂(例如，参见专利文献7)。
另外，对于使核酸担载于载体而得的物质，例如已知有：在玻璃基板上经由壳聚糖将DNA固定化的技术(例如，参见专利文献8)。
并且，作为用于鉴定离子性高分子而使用的芯片，还已知：将DNA或RNA等担载于玻璃之类的载体上的技术(例如，参见专利文献9)。
作为用于担载配体而使用的载体，以往使用全孔性的硅胶。关于这一点，除了全孔性的粒子之外，还已知：具有无孔性的核、其外面具有多孔性的壳的核壳型的粒子(例如，参见专利文献10)。这样的核壳型粒子中，还已知：使纤维素三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)通过物理性吸附担载于细孔径为10nm的核壳型粒子上而形成的光学异构体用分离剂(例如，非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/102920号；
专利文献2：国际公开第02/088204号；
专利文献3：日本特开平10-128089号公报；
专利文献4：日本特开平11-335306号公报；
专利文献5：日本特开2009-91535号公报；
专利文献6：日本特开2003-327675号公报；
专利文献7：日本特开2012-18135号公报；
专利文献8：日本特开2010-77022号公报；
专利文献9：日本特开2003-284552号公报；
专利文献10：日本特开昭49-36396号公报；
专利文献11：日本特开平07-138301号公报；
专利文献12：国际公开第2012/050124号；
非专利文献
非专利文献1：J. Chromatogr. A 1234, 50-55 (2012)；
非专利文献2：J. Chromatogr. 363, 173 (1986)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供：使用核-壳型的粒子作为载体，通过化学键合使各种配体担载于该载体上而获得的新型分离剂。
用于解决课题的手段
本发明人发现：作为用于分离剂的载体，不使用以往所用的硅胶之类的全孔性的粒子、而是使用由无孔性的核和多孔性的壳构成的核壳型的粒子，并在其上使各种配体担载而获得的分离剂对于各种目标物质的分离是有用的。
即，本发明提供一种分离剂，其特征在于：在具有载体和通过化学键合担载于载体表面的配体的分离剂中，上述载体是由无孔性的核和多孔性的壳构成的核-壳型粒子，该壳的细孔直径为9nm以上，该壳由聚烷氧基硅氧烷的水解物构成，上述配体为光学活性聚合物、光学惰性的聚酯、蛋白质或核酸。
具体实施方式
＜核壳型粒子＞
本发明的分离剂中使用具有无孔性的核和位于其外面的多孔性的壳的核壳型粒子。而且，该核壳型粒子的表面的细孔直径为9nm以上。
通过使核壳型粒子的细孔直径为9nm以上，比表面积大，可以大量导入配体，因此可以期待寄予目标物质的良好分离。通常，细孔直径为100nm以下。
核壳粒子的细孔直径可以通过水银压入法进行测定。
水银压入法是，施加压力使水银浸入开孔部，使用压力值和对应的浸入水银体积，由Washburn式算出假定为圆柱状的细孔的直径的方法，可以适用对于陶瓷成形体而规定的JISR1655。
在此，本发明中所述的无孔性是指，将通过BET法测定的核粒子的表面的比表面积(m2/g)设为A，将能够根据由核粒子的粒径求出的表面积(由粒子半径r算出、4πr2)算出的每单位重量的表面积(m2/g)设为B时，(A-B)/B×100为不足20。
而本发明中所述的的多孔性是指，通过BET法测定的其表面的比表面积为10mm2/g以上。
核壳型粒子的核和壳的厚度之比通常为1：9～9：1。从确保目标物质的良好分离特性的角度考虑，该比优选为4：1～2：1。关于该比，如后所述，可以通过调整核壳粒子的壳层的厚度来调制。
在此，核的厚度是指核的直径。
构成核壳型粒子的核的材料为无机物质，作为其具体例子，可以在选自玻璃、钛和锆之类的金属或其金属氧化物、以及膨润土或云母等粘土矿物所代表的物质中优选举出无孔性的粒子。
形成上述核的材料的粒子，其粒径优选为0.1μm以上、更优选为0.5μm以上、特别优选为1μm以上。另一方面，形成上述核的材料的粒子，优选使用其粒径为200μm以下的粒子、更优选使用其粒径为100μm以下的粒子，特别优选使用其粒径为50μm以下的粒子。
核壳型粒子的粒径通常使用0.2μm以上且1000μm以下。需要说明的是，本发明中所说的核壳型粒子的粒径是指，通过基于离心沉淀法的平均粒径的测定方法测定的粒径。
作为构成核壳型粒子的壳的材料，是将通过部分水解烷氧基硅烷而获得的聚烷氧基硅氧烷进一步水解而得到的材料。从可以容易制备核壳型粒子的角度考虑，优选为这样的材料。
作为上述烷氧基硅烷，优选为四烷氧基硅烷，其中，优选使用四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、四丙氧基硅烷、四丁氧基硅烷，更优选使用四乙氧基硅烷。
在制作上述核壳型粒子时可以参见日本特开昭49-36396号公报。具体而言，首先，对烷氧基硅烷进行部分水解生成聚烷氧基硅氧烷。然后，使如此得到的聚烷氧基硅氧烷溶解于醚、丙酮、二氯甲烷之类的溶剂中，调制聚烷氧基硅氧烷的溶液。使该溶液涂布于上述形成核的粒子上、或使上述核粒子浸入该溶液中，之后通过去除溶剂，由此使聚烷氧基硅氧烷以壳的形式层合于核粒子的表面。而且，之后对于已层合的聚烷氧基硅氧烷，在水的存在下进行缩聚(水解)。由此，可以获得核壳型粒子。
构成核壳型粒子的壳的厚度可以在0.1～100μm范围内适当调整，作为该方法，可以举出：调整形成壳的烷氧基硅烷的粘度，例如，在增厚壳的厚度时，可以举出：将烷氧基硅烷的粘度降低。
另外，作为壳的比表面积和细孔直径的调整方法，可以举出：将壳进行层合，调整进行缩聚时使用的水溶液的pH，例如，增大比表面积和细孔直径时，使pH增加。
在此，壳的厚度是指，从核壳型粒子的直径中减去核的直径，将该值用2除而得到的值。
上述核壳型粒子可以使用作为市售品被销售的“核壳型硅胶”。在这样的市售品中，作为目录值具有上述范围的细孔直径或比表面积、粒径。另外，在这样的市售的核壳型硅胶中，可以使用核由玻璃构成、壳由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)构成的物质。
用作本发明的分离剂的载体的核壳型粒子，可以进行表面处理。作为表面处理的方法，可以举出：使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷等的具有氨基的硅烷偶联剂的方法。
通过这样的表面处理而导入的氨基，可以作为后述的与配体进行化学键合时的反应基团进行利用。
＜配体＞
本发明中所述的“配体”是指，担载于成为载体的核壳型粒子上的物质，对于作为分离对象的目标物质是指，显示物理性的亲和性或可以不对称识别的物质。
1. 光学活性聚合物
作为可在本发明的分离剂中使用的配体，可以举出光学活性聚合物。本发明中所述的光学活性聚合物是指，对于溶解该聚合物而得到的溶液，使平面偏光透过时，偏光面发生旋转的旋光性、即具有手性的聚合物。
更具体而言，用于构成光学活性聚合物的单体具有光学活性，或者，使用光学活性的聚合催化剂使光学惰性的单体聚合、分子量为1,000～1,000,000。
1-(1) 多糖或其衍生物
作为成为本发明中使用的配体的光学活性聚合物，可以举出多糖或其衍生物。作为这样的多糖，可以举出：例如β-1,4-葡聚糖(纤维素)、α-1,4-葡聚糖(直链淀粉、支链淀粉)、α-1,6-葡聚糖(右旋糖苷)、β-1,6-葡聚糖(石耳素)、β-1,3-葡聚糖(凝胶多糖、裂殖菌多糖)、α-1,3-葡聚糖、β-1,2-葡聚糖(冠瘿(Crown Gall)多糖)、β-1,4-半乳聚糖、β-1,4-甘露聚糖、α-1,6-甘露聚糖、β-1,2-果聚糖(菊塘)、β-2,6-果聚糖(左聚糖，levan)、β-1,4-木聚糖、β-1,3-木聚糖、β-1,4-壳聚糖、β-1,4-N-乙酰基壳聚糖(壳多糖)、普鲁兰糖、琼脂糖、藻酸、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、黑曲霉多糖(nigeran)、和含有直链淀粉的淀粉等。
其中，优选为可以容易获得高纯度多糖的纤维素、直链淀粉、β-1,4-壳聚糖、壳多糖、β-1,4-甘露聚糖、β-1,4-木聚糖、菊塘、凝胶多糖、普鲁兰糖、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、黑曲霉多糖等，进一步优选为纤维素、直链淀粉、普鲁兰糖 、黑曲霉多糖。
多糖的数均聚合度(1分子中所含的吡喃糖或呋喃糖环的平均数)优选为5以上、更优选为10以上，对其上限没有特别限定，但从容易操作的角度考虑优选为1000以下、更优选为5～1000、进一步优选为10～1000、特别优选为10～500。
对于这些多糖，例如可以将纤维素或直链淀粉进行化学修饰而得到的酯衍生物或氨基甲酸酯衍生物等用作本发明的配体。
已知这样的多糖衍生物具有作为手性固定相的高光学拆分能。
作为酯衍生物或氨基甲酸酯衍生物的具体例子，例如，关于特公平4-42371号公报中记载的、由于苯基氨基甲酸酯的芳香族环的氢的一部被卤素(氟或氯)取代而得到的取代基、使纤维素的羟基被修饰而成的纤维素衍生物；或关于日本特开2005-315668号公报中记载的、由于苯基氨基甲酸酯的芳香族环的氢的一部被氟、烷基、或烷氧基取代而得到的取代基、使纤维素或直链淀粉的羟基被修饰而成的纤维素衍生物和直链淀粉衍生物，也可以用作本发明的配体。
上述的多糖或其衍生物中，从作为分离对象的光学异构体的分离性能的角度或担载于核壳型粒子上时的容易度考虑，特别优选使用上述多糖衍生物。
对于多糖衍生物，不限于上述的多糖衍生物，可以适当使用。
使上述多糖或其衍生物通过化学键合担载于核壳型粒子上时，可以举出：核壳型粒子与多糖衍生物之间的化学键合、使用了第三成分的化学键合、通过对载体上的多糖衍生物的光照射、γ线等的放射线照射、微波等的电磁波照射等而引起的反应、通过使用自由基引发剂等的自由基反应的化学键合。
核壳型粒子与多糖衍生物之间的化学键合，例如可以使用下述方法：如日本特开平07-138301号公报中所记载，将具有还原末端的多糖的还原末端与经表面处理的载体通过例如醛基与氨基形成席夫碱之后，在还原剂存在下进行还原，利用制成仲胺的方法(参见Glycoconjugate J (1986) 3, 311-319 ELISABETH KALLIN 等)(以后，简称还原氨基化法)进行化学键合之后，将多糖进行衍生物化，从而获得目标光学异构体分离用填充剂。
作为使核壳型粒子上的多糖衍生物使用第三成分进行化学键合的方法，例如可以使用下述方法：如日本特开2002-148247号公报的实施例中所记载，将导入有乙烯基等聚合性基团的聚合性多糖衍生物与同样导入有乙烯基等聚合性基团的核壳型粒子，在具有乙烯基等的第三成分(聚合性单体)的存在下，进行共聚合的方法。
作为通过光照射使核壳型粒子与多糖衍生物进行化学键合的方法，例如可以使用下述方法：如特表平11-510193号公报的实施例中所记载，将多糖衍生物涂布于核壳型粒子上使之担载之后，利用浸渍性水银灯对其照射光线，而将多糖衍生物进行光化学交联的方法。
作为通过γ线等的放射线照射、微波等的电磁波照射而使涂布于核壳型粒子上的多糖衍生物进行化学键合的方法，例如可以使用下述方法：如日本特开2004-167343号公报中所记载，将多糖衍生物涂布于经表面处理的核壳型粒子上之后，对其照射γ线，而使多糖衍生物进行化学键合的方法。
此外，作为使核壳型粒子与多糖衍生物进行化学键合的方法，例如可以使用下述方法：将对多糖衍生物的羟基或氨基的一部导入有烷氧基甲硅烷基的多糖衍生物涂布于核壳型粒子上，通过使其在适当的溶剂中形成基于烷氧基甲硅烷基的交联，而使多糖衍生物进行化学键合的方法。
对于上述核壳型粒子的多糖或其衍生物的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
1-(2) 聚(甲基)丙烯酰胺
本发明中，作为成为配体的光学活性聚合物可以举出聚(甲基)丙烯酰胺。这样的聚(甲基)丙烯酰胺，在下述式(I)所示的(甲基)丙烯酰胺中，优选使用使光学活性物质聚合而得到的聚(甲基)丙烯酰胺。
作为这样的聚合反应，例如可以举出：在路易斯酸催化剂存在下、使用AIBN(偶氮二异丁腈)等的自由基聚合引发剂的自由基聚合。
在此所使用的路易斯酸优选作为金属盐(MX)的金属路易斯酸，例如可以举出：三氟甲磺酸钪(scandium triflate)、三氟甲磺酸钇、溴化镁、氯化铪、三氟甲磺酸镱、三氟甲磺酸镥等。
在聚合反应中，(甲基)丙烯酰胺在常温、常压下为液体时，即使在无溶剂条件下也可以进行聚合反应，但为固体时，作为所使用的反应溶剂，没有自由基俘获效应的通常的任意有机溶剂均可使用。更优选为四氢呋喃、氯仿、甲醇等。
其他的聚合条件可以参见国际公开第02/088204号进行适当调整。
[化学式1]
(式中，R1、R2和R3各自不同、表示氢原子、碳原子数1～30的1价烃基或含有杂原子的1价原子团，R4表示氢原子或碳原子数1～30的1价烃基，R5表示氢原子或甲基。)
上述R1、R2和R3各自不同、为氢原子、碳原子数1～6的烷基、芳基、芳烷基、烷氧羰基、氨基甲酰基、氨基取代烷基、氨基、烷氧基取代烷基、烷氧基或甲硅烷基，R4优选为氢原子、碳原子数1～6的烷基、芳基或芳烷基。R4特别优选为氢原子。
对于上述核壳型粒子的聚(甲基)丙烯酰胺的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
通过化学键合使上述聚(甲基)丙烯酰胺担载于上述核壳型粒子时，可以举出下述的方法：使反应性官能团与核壳型粒子结合的同时，使该反应性官能团与聚(甲基)丙烯酰胺所具有的酰胺基进行反应，或者将能够与上述反应性官能团发生反应的官能团导入到上述聚(甲基)丙烯酰胺中，使其进行反应而结合的方法。
具体而言，可以举出下述的方法：预先通过基于含有环氧基的硅烷偶联剂等进行的表面处理使环氧基包含在核壳型粒子中，再使该环氧基与聚(甲基)丙烯酰胺所具有的酰胺基进行反应的方法。
此外，可以举出下述的方法：预先通过含有乙烯基、(甲基)丙烯酰基之类的聚合性官能团的硅烷偶联剂等进行的表面处理使聚合性官能团导入到核壳型粒子中，另一方面，如日本特开2006-177795号公报中所记载，通过在上述聚(甲基)丙烯酰胺中使用异氰酸酯，也可使(甲基)丙烯酰基之类的聚合性官能团导入到聚(甲基)丙烯酰胺中，再使二者的聚合性官能团进行反应而共聚合，进而产生化学键合的方法。
1-(3) 聚氨基酸
作为本发明中所使用的光学活性聚合物，可以举出聚氨基酸。在本发明所述的聚氨基酸中不包含后述的蛋白质。作为这样的聚氨基酸，可以举出下述式(II)所表示的聚氨基酸。这样的聚氨基酸可以通过例如日本特开昭60-193538号公报中记载的方法进行合成。
[化学式2]
上述式(II)中，n为5以上，R6为选自碳原子数1～5的烷基、苯基和碳原子数7～12的芳烷基和杂环基的基团。这些基团中，可以具有羟基、羧基、巯基、氨基和甲硫基之类的取代基。R7为碳原子数1～5的烷基、优选为甲基或乙基。
作为构成杂环基的杂环，可以举出：5-吡唑啉酮、吡唑、三唑、噁唑酮、异噁唑酮、巴比妥酸、吡啶酮、吡啶、罗丹宁、吡唑烷二酮、吡唑并吡啶酮、米氏酸(Meldrum’s acid)、以及在这些杂环上进一步稠合烃类芳香环或杂环而得到的稠合杂环。
若示例用于构成上述的聚氨基酸的α-氨基羧酸，则可以举出：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。此外，还可以举出：苄基天冬氨酸、甲基谷氨酸、苄基谷氨酸、苄氧羰基赖氨酸、苄氧羰基鸟氨酸、乙酰基酪氨酸、苄基丝氨酸之类的氨基酸衍生物作为聚氨基酸的构成材料。
上述式(II)中，n优选为100以下、更优选为10～40。
对于上述核壳型粒子的聚氨基酸的担载量，优选为相对于100重量份的核壳型粒子，为1.0～25重量份。
通过化学键合使上述聚氨基酸担载于上述核壳型粒子时，可以举出下述的方法：使反应性官能团与核壳型粒子结合的同时，使该反应性官能团与聚氨基酸所具有的氨基进行反应，或者将能够与上述反应性官能团发生反应的官能团导入到上述聚氨基酸中，使其进行反应而结合的方法。
作为导入到核壳型粒子中的反应性官能团，有导入与聚氨基酸所具有的氨基进行反应的环氧基的方法。作为该具体的方法，可以举出：利用含有环氧基的硅烷偶联剂，对核壳型粒子进行表面处理的方法。
此外，还可以举出下述的方法：预先通过基于含有乙烯基、(甲基)丙烯酰基之类的聚合性官能团的硅烷偶联剂等进行的表面处理使聚合性官能团导入到核壳型粒子中，另一方面，使具有能够与聚氨基酸的氨基进行反应的聚合性官能团的单体、例如丙烯酰氯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、氯甲基苯乙烯与聚氨基酸进行反应，合成在末端导入有乙烯基之类的聚合性官能团的聚氨基酸，使核壳粒子状的聚合性官能团与聚氨基酸的聚合性官能团进行反应而共聚合，由此形成化学键合的方法。
1-(4) 聚酰胺
作为本发明的分离剂中所使用的光学活性聚合物，可以举出聚酰胺。该聚酰胺是在重复单元的主链上具有1个光学活性氨基酸残基的聚酰胺。
作为该光学活性聚酰胺的合成中所涉及的单体成分，为采用作为光学活性二羧酸的N-取代氨基酸和二胺的单体成分。作为N-取代氨基酸，例如可以使用：N-取代谷氨酸或N-取代天冬氨酸，作为二胺，可以使用：4,4’-二氨基二苯基甲烷或1,3-苯二胺之类的芳香族二胺。
对上述聚酰胺的合成方法的一个例子进行说明。如上所述，上述聚酰胺可以通过使作为光学活性二羧酸的N-取代氨基酸与二胺聚合来进行合成。具体而言，在将N-甲基吡咯烷酮(以下，记载为“NMP”。)和吡啶(以下，记载为“Py”。)以例如容量比4：1进行混合而得的溶液中加入例如4重量％氯化锂(以下，记载为“LiCl”。)，在所得的溶液(以下，记载为“NMP-Py混合溶液”。)、例如7.5cm3中加入规定量的、例如3mmol的苯甲酰-L-谷氨酸(作为光学活性二羧酸的N-取代氨基酸)、与其等摩尔量的、例如3mmol的4,4’-二氨基二苯基甲烷(二胺)、以及它们的2倍摩尔量的、例如6mmol的亚磷酸三苯基酯，在规定温度、例如80℃下边搅拌边加热规定时间、例如3小时。反应结束后，将产物滴加到甲醇中之后，将其进行过滤，从而获得聚合物，使其进行减压干燥。
本发明所涉及的聚酰胺的合成方法不限于上述的方法，也可以用上述以外的方法进行合成。另外，根据反应中所用的各试剂及其量的不同，适当的反应温度和反应时间也不同。上述显示的反应时间、反应温度、和试剂的量是能够获得本发明所涉及的光学活性聚合物的条件的一个例子，可以适当变更。
由于本发明所涉及的聚酰胺使用作为光学活性二羧酸的N-取代氨基酸进行合成，因此该聚合物内部具有D-或L-光学活性体识别位点，利用该光学活性体识别位点可以进行光学拆分。
对于上述核壳型粒子的聚酰胺的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
通过化学键合使上述聚酰胺担载于上述核壳型粒子时，可以举出下述的方法：使反应性官能团与核壳型粒子结合的同时，使该反应性官能团与聚酰胺所具有的酰胺基进行反应，或者将能够与上述反应性官能团发生反应的官能团导入到上述聚酰胺中，使其进行反应而结合的方法。
具体而言，可以举出下述的方法：预先通过基于含有环氧基的硅烷偶联剂等进行的表面处理使环氧基包含在核壳型粒子中，再使该环氧基与聚酰胺所具有的酰胺基进行反应的方法。
此外，可以举出下述的方法：预先通过含有乙烯基、(甲基)丙烯酰基之类的聚合性官能团的硅烷偶联剂等进行的表面处理使聚合性官能团导入到核壳型粒子中，另一方面，如日本特开2006-177795号公报中所记载，通过在上述聚酰胺中使用异氰酸酯，也可使(甲基)丙烯酰基之类的聚合性官能团导入到聚酰胺中，再使二者的聚合性官能团进行反应而共聚合，进而产生化学键合的方法。
2. 光学惰性的聚酯
作为本发明中所使用的配体，可以举出光学惰性的聚酯。作为这样的聚酯的具体例子，作为聚酯，可以举出：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乙烯・聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸丁二醇酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(ε-己内酰胺)和聚(氧基羰氧基-1,4-亚苯基-2,2-异亚丙基-1,4-亚苯基)｛双酚A的聚碳酸酯)等。其中，优选使用：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乳酸或聚乙醇酸。
上述聚酯的重均分子量，从由于用于聚合物溶解的溶剂的粘性增加而引起的操作容易度的角度考虑，优选为1万～100万、更优选为2万～20万。
通过化学键合使上述聚酯担载于上述核壳型粒子时，可以举出下述的方法：使反应性官能团与核壳型粒子结合的同时，将能够与上述反应性官能团发生反应的官能团导入到上述聚酯中，使其进行反应而结合的方法。
具体而言，预先通过基于含有环氧基的硅烷偶联剂等进行的表面处理使与环氧基等的氨基形成共价键合的官能团导入到核壳型粒子中，另一方面，关于聚酯，使用多元胺进行化学处理，使氨基导入到上述聚酯中。
作为多元胺，包含碳原子数2～8的(多)亚烷基多元胺，可以举出：乙二胺、丙二胺、丁二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺和四亚乙基五胺等。
这些多元胺中，优选使用乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺和四亚乙基五胺、特别优选使用二亚乙基三胺。特别是，若使用包含至少3个氨基的多元胺，则可以良好地将氨基导入到上述聚酯中。此外，若胺为低分子量，则化学处理的后除去容易，因此优选。
作为基于胺进行的化学处理，可以举出下述的方法：在由有机溶剂和胺构成的溶液中、或者由水与有机溶剂的混合溶剂和胺构成的溶液中，将上述聚酯进行加热处理的方法。
使上述的经过了化学处理的聚酯和实施了表面处理的核壳型粒子在真空或空气中发生反应，可以获得聚酯化学键合于核壳型粒子而得的分离剂。
3. 蛋白质
作为本发明分离剂的配体，可以使用蛋白质。在本发明中可以使用的蛋白质，可以举出：分子量为3～300kDa、优选为30～150kDa、对于作为分离对象的例如抗体之类的蛋白质具有亲和性的物质。
其中，作为配体的蛋白A、蛋白G、蛋白L、白蛋白和这些的功能性变异体用于抗体蛋白质的分离时的选择率高，因此优选。
以抗体的分离为主要目的时，作为配体，优选可与免疫球蛋白的一部分特异性结合的配体。
上述功能性变异体是指，在天然氨基酸配列中具有至少1个修饰、且仍维持天然配列所伴有的至少1个功能的蛋白质。在天然配列中包含本来自然产生的氨基酸配列。作为氨基酸的修饰，可以举出：1个以上的氨基酸取代为其它氨基酸、1个以上的氨基酸的缺失和/或1个以上的氨基酸的添加或它们的任意组合。还可以举出：对天然配列进行的添加、缺失和取代的组合这样的方式。功能性变异体还可以包含蛋白质的片段或结构域。功能性变异体的氨基酸配列可以为与天然氨基酸配列至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源、至少95％同源、至少98％同源，且维持天然配列所伴有的至少1个功能。
作为白蛋白，可以举出：卵白蛋白或人血清白蛋白(分子量约66kDa)。
另外，作为可以在本发明中使用的蛋白质，可以举出：以下所示的作为纤维二糖水解酶I和II而已知的纤维二糖水解酶(CBH)。已知纤维二糖水解酶I(CBH I)和纤维二糖水解酶II(CBH II)为占纤维素酶的绝大部分(二者总计为80％以上、此外少量含有内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等)的主要酶。作为该制备方法，可以举出：使用基因重组技术，使目标的纤维二糖水解酶在宿主细胞中大量表达的方法。
本发明中作为蛋白质可以使用α 1-酸性糖蛋白质。作为α 1-酸性糖蛋白质的来源，可以举出：人、牛、家兔等的哺乳类、鸡、天鹅、火鸡等的鸟类。其中，作为优选的α 1-酸性糖蛋白质的具体例子，可以举出：人α 1-酸性糖蛋白质(以下，简称为h-AGP)或鸡AGP(以下，简称为c-AGP)。
人α 1-酸性糖蛋白质(h-AGP)可以使用市售品(例如Sigma-Aldrich社)，根据需要可以通过高速液相色谱进行纯化。
可以在本发明中使用的鸡α 1-酸性糖蛋白质(c-AGP)如下获得：通过将鸡粗卵类粘蛋白利用使用阳离子交换载体(例如，SP-Sepharose)的液相色谱、采用基于乙酸铵缓冲液(pH4.6)进行的逐步洗脱法、分离成卵类粘蛋白和鸡α 1-酸性糖蛋白质(c-AGP)而获得。
并且，分取包含c-AGP的组分，可以通过SP-Sepharose之类的离子交换色谱用载体进行纯化。
上述的人α 1-酸性糖蛋白质是由183个氨基酸残基和5条糖链构成的分子量41000～43000左右的糖蛋白质。就鸡α 1-酸性糖蛋白质而言，氨基酸残基和糖链与人α 1-酸性糖蛋白质相同，但分子量为约30000。
对于上述核壳型粒子的蛋白质的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
通过化学键合使上述蛋白质担载于上述核壳型粒子时，通常可以使用如下的方法，但不限于此。
固定化可以使用下述的方法：使反应性官能团结合于核壳型粒子上之后，使该反应性官能团与蛋白质所具有的官能团进行直接反应的方法，或者，经由分子内分别具有1个以上可分别与结合于核壳型粒子的官能团和上述蛋白质所具有的官能团反应的官能团的低分子或高分子化合物(以下，将这些化合物汇总记作“Spacer，间隔区”)而结合的方法。
例如，将蛋白A之类的具有氨基的配体进行固定化时，作为前者的方法，可以示例下述的方法：通过含有环氧基的硅烷偶联剂等进行的表面处理，使与环氧基等氨基形成共价键的官能团在核壳型粒子中含有，使其与蛋白A进行直接反应而固定化的方法。
此外，作为后者的方法，可以举出下述的方法等：使用作为Spacer的氨基酸(氨基羧酸)类，使该氨基部位与导入到核壳型粒子上的环氧基进行反应之后，通过另一末端的羧基与蛋白A的氨基进行反应的方法；或者，逐次使用作为Spacer的二胺或二醇与(聚)乙二醇二缩水甘油醚等的二缩水甘油化合物，使导入到核壳型粒子上的环氧基与二胺或二醇的一侧末端结合，在另一末端上使二缩水甘油化合物的一侧的环氧基结合，使残留的末端的环氧基与蛋白A结合的方法。
需要说明的是，作为在上述方法中用作Spacer的部分成分的二胺，可以举出：四亚甲基二胺、六亚甲基二胺等的脂肪族二胺类，作为二醇，可以举出：丙二醇、丁二醇、二甘醇、三甘醇等的脂肪族二醇或聚乙二醇类。
作为Spacer，考虑到与配体的反应性或固定化时与核壳型粒子的空间效应的关系，优选具有直链状的结构。若使用分支链状结构的Spacer，则空间效应变大，抑制作为配体的蛋白质与作为分离对象的抗体的亲和结合的形成，使分离性能变差。
另外，作为导入到核壳型粒子上的官能团，还可以举出使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷的3-氨基丙基，在这种情形下，还可以预先使核壳型粒子与碳酸二琥珀酰亚胺酯(N,N’-二琥珀酰亚氨基碳酸酯：DSC)反应，再使其与蛋白质的氨基酸残基的氨基进行反应。
4. 核酸
作为本发明分离剂的配体，可以使用核酸。作为这样的核酸，没有特别限定，可以举出：DNA、RNA、寡核苷酸、修饰寡核苷酸等。另外，还可以使用DNA和RNA的衍生物，DNA或RNA可以为天然型或人工型，考虑到作为分离剂的稳定性，优选使用结构性稳定的人工型。人工型中，可以形成天然型中不存在的配列。
人工型的核酸的碱基数优选为50～200左右，从可以有效地合成的角度考虑，优选使用100碱基左右的核酸。在人工型的核酸中，从防止胸腺嘧啶的二聚体化的角度考虑，优选胸腺嘧啶彼此不邻接。
并且，考虑作为分离剂的耐久性，上述核酸可以利用保护基进行衍生物化。具体而言，可以将位于5’位、3’位的任意一方或双方的羟基使用磷酸酯基、酰基、烷氧基羰基、苄基、取代苄基、烯丙基等进行衍生化。
对于上述核壳型粒子的上述核酸的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。上述核酸的担载量相对于100重量份的核壳型粒子为不足1.0重量份时，无法使上述核酸在分离剂中稳定地存在，无法获得充分的分离性能。而上述核酸的担载量相对于100重量份的核壳型粒子超过25重量份时，无法使上述核酸担载于核壳型粒子上，产生游离的核酸，可能对分离性能产生不良影响。
使上述核酸担载于上述核壳型粒子上时，例如可以举出：如日本特开2010-259405号公报中所记载，经由壳聚糖和该壳聚糖的氨基进行结合的方法。在该方法中，首先，对核壳型粒子按照3-氨基丙基三乙氧基硅烷之类的氨基硅烷、戊二醛、壳聚糖、戊二醛、抗生物素蛋白的顺序进行如下修饰。
使3-氨基丙基三乙氧基硅烷与核壳型粒子进行蒸镀反应后，进行加热处理。
将经3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型粒子浸入戊二醛溶液后，进行洗涤并风干。
将经戊二醛处理的核壳型粒子浸入壳聚糖溶液后，用超纯水进行洗涤。由此，壳聚糖的氨基与戊二醛的醛基共价结合，核壳型粒子的表面上获得多数的氨基，使用于结合核酸的表面积增大。
其次，将导入有壳聚糖的核壳型粒子浸入戊二醛溶液后，进行洗涤并风干。
向所得的核壳型粒子中滴加抗生物素蛋白溶液，静止，由此醛基与抗生物素蛋白的氨基结合，抗生物素蛋白经由壳聚糖固定于核壳粒子上。
然后，向固定化有抗生物素蛋白的核壳粒子上滴加生物素标记的核酸溶液，使之反应，由此获得经由壳聚糖固定化有核酸的核壳型粒子。
5. 分子量50～1000的光学活性的化合物
作为本发明分离剂的配体，可以使用分子量50～1000的光学活性的有机化合物。作为这样的有机化合物，只要是具有不对称中心、分子量为上述50～1000、通过化学键合可与核壳型粒子结合的有机化合物即可，没有特别限定。
5-(1) 具有联萘结构和冠醚样环状结构的化合物
作为分子中具有联萘结构和冠醚样环状结构的化合物，例如可以举出日本特开2003-327675号公报中记载的化合物。
除此之外，可以优选示例：例如下述式(III)所表示的化合物。
[化学式3]
式(III)中，R8和R9分别表示氢，可具有取代基的苯基，可具有取代基的萘基，可具有取代基、任意的非连续的亚甲基可为氧的碳原子数1～8的烷基，或各烷基的碳原子数为1或2的三烷基甲硅烷基。此外，R8和R9中的苯基等可具有的上述取代基，为与冠醚样环状结构的氧原子不发生相互作用的基团，作为这样的取代基，例如可以举出：甲基和氯基。从分离性能提高的角度考虑，R8和R9优选为苯基。
式(III)中，A1和A2分别表示取代联萘环的氢的、结合于载体表面的基团。对A1和A2的大小没有特别限定，从合成的容易度和分离性能提高的角度考虑，优选各自的分子量为100～600。A1和A2可以由碳原子数1～30的亚烷基、碳原子数6～30为亚芳基、醚基、羰基、亚氨基和酰胺基等的各种基团构成。
从上述联萘化合物合成的容易度的角度考虑，A1和A2优选分别包含取代式(III)的联萘的氢的下述式(IＶ)所表示的结构。
[化学式4]
式(IＶ)中，o表示1～30的整数。从合成的容易度和分离性能提高的角度考虑，o优选为4～10。
式(III)中，l表示4～6的整数。从铵离子的包接的角度考虑，优选这样的l、更优选l为4。
式(III)中，m和n表示各自为0～5的整数。其中，m＋n为1～10。但从上述联萘化合物合成的容易度的角度考虑，优选m和n的双方分别为1以上，更优选m和n的一方为1另一方为0。需要说明的是，m或n为0时，是指与载体不结合。
作为使上述式(III)所表示的化合物与上述核壳型粒子进行化学键合的方法，可以经过以下的A～D步骤来进行。
本发明的色谱用分离剂可以通过包括下述步骤的方法进行制备：A步骤，将载体连接基导入下述式(III)所表示的联萘衍生物A的联萘环而获得联萘衍生物B；B步骤，将联萘衍生物B的2,2’位的甲氧基水解而获得上述甲氧基成为羟基的联萘衍生物C；C步骤，将联萘衍生物C的上述各羟基通过聚乙二醇衍生物进行交联而获得具有冠醚样环状结构的联萘衍生物D；D步骤，经由联萘衍生物D的载体连接基使联萘衍生物D通过化学键合结合于核壳型粒子的表面。
[化学式5]
式(Ｖ)中，R8和R9与式(III)的R8和R9相同。联萘衍生物A可以作为市售品获得。作为这样的市售品，例如可以举出：2,2’-二甲氧基-1,1’-联萘和3,3’-二溴-2,2’-二甲氧基-1,1’-联萘(均为东京化成工业株式会社的产品)。从上述联萘化合物合成的容易度的角度考虑，优选使用这样的市售品。
另外，联萘衍生物A可以通过合成来获得。例如，联萘衍生物A可以通过由3,3’-二溴-2,2’-二甲氧基-1,1’-联萘进行合成来获得。由此，本发明的方法进一步包括用于将3,3’-二溴-2,2’-二甲氧基-1,1’-联萘的溴基分别取代为R8和R9来获得联萘衍生物A的步骤，从获得上述联萘化合物的R8和R9的多样性的角度考虑优选。
在A步骤中，载体连接基可以是与核壳型粒子上的表面的官能团结合的基团，也可以是与核壳型粒子的表面直接结合的基团。载体连接基可以是一种也可以是二种以上。另外，载体连接基只要是至少一个即可、也可以是二个以上。并且载体连接基为二个以上时，载体连接基可以仅与联萘的二个萘环的一方结合，也可以与双方分别结合。从上述联萘衍生物D与核壳型粒子的结合容易度的角度考虑，载体连接基优选为与核壳型粒子的表面处理的官能团结合的基团。
作为这样的优选的A步骤，例如可以举出：在氯化铁的存在下，使联萘衍生物A与碳原子数4～33的脂肪族二羧酸一甲酯一氯化物(aliphatic dicarboxylic monomethyl ester monochloride)反应获得联萘衍生物B的步骤。
由于联萘的2,2’位即使在联萘衍生物B中反应性也高，因此上述B步骤可以通过在温和的条件下的反应来进行。作为这样的反应条件，例如可以举出：在冰冷下～室温中，进行基于三溴化硼的脱烷基反应。在这样的条件下进行B步骤，从抑制联萘衍生物B对其他结构的影响、更高收率获得联萘衍生物C的角度考虑优选。
上述C步骤可以通过使聚氧乙烯与联萘衍生物C的2,2’位的羟基进行交联的条件来进行。这样的交联可以利用水解来进行，例如、可以通过使氧化乙烯基的重复数为5～7的聚氧化亚乙基二醇二甲苯磺酸盐(酯)在碱性条件下反应来进行。
上述D步骤可以根据载体连接基或核壳型粒子的表面处理的种类在公知的技术范围内适当地进行。例如，在使用经表面处理的核壳型粒子时，D步骤可以通过使联萘衍生物D的载体连接基与核壳型粒子的表面处理的官能团化学键合来进行。
作为上述核壳型粒子的表面处理剂可以使用硅烷偶联剂。作为这样的硅烷偶联剂，例如可以举出：3-氨基丙基三乙氧基硅烷和3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷。
对于上述核壳型粒子的上述式(III)所表示的化合物的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
5-(2) N-酰基化氨基酸、N-氨基甲酰基氨基酸、N-氨基甲酰基-α-芳香族氨基酸
在本发明的分离剂中，可以通过化学键合使作为配体的N-酰基化氨基酸、N-氨基甲酰基氨基酸、N-氨基甲酰基-α-芳香族氨基酸(以下，称为本发明涉及的氨基酸类)担载于上述核壳型粒子，作为光学异构体用的分离剂。
作为N-酰基化氨基酸，例如可以举出：N-特戊酰基-L-缬氨酸、N-3,5-二硝基苯甲酰基-D-苯基甘氨酸等。作为N-氨基甲酰基氨基酸，例如可以举出：N-氨基甲酰基-亮氨酸、N-氨基甲酰基-缬氨酸等。此外，作为N-氨基甲酰基-α-芳香族烷基胺，例如可以举出：N-氨基甲酰基-α-(非萘基)乙胺(N-carbamoyl-α-(nonaphthyl)ethylamine)等。
上述本发明涉及的氨基酸类，在本发明的分离剂中作为手性部位(chiral site，手性位点)发挥功能。
作为使上述本发明涉及的氨基酸类与上述核壳型粒子进行化学性结合的方法可以举出以下的方法。作为具体的操作，记载于日本特开平5-4045号公报中。
首先，使用具有3-氨基丙基三乙氧基硅烷之类的氨基的硅烷偶联剂，对上述核壳型粒子进行表面处理，使氨基丙基导入到核壳型粒子中。所导入的氨基丙基作为锚定位点发挥功能。作为3-氨基丙基三乙氧基硅烷以外的硅烷偶联剂，可以举出：6-氨基己基烷氧基硅烷、6-氨基己基卤代硅烷、3-氨基丙基三卤代硅烷等。作为3-氨基丙基卤代硅烷的优选的例子，可以举出3-氨基丙基三氯硅烷。
在上述的手性部位与锚定位点之间进一步导入作为亚锚定位点的-NH-(CH2)n-CO-。在此，n为5以上、优选为5～10。若n不足5，则填充剂的分离能降低。而若n超过10，则对分子识别不必要的疏水基间的相互作用和手性部位间的相互作用增大，分离能降低。
作为用于构成上述亚锚定位点的化合物，可以举出氨基链烷酸。进行将该氨基链烷酸用甲酯之类的酯保护的操作。
其次，使上述本发明涉及的氨基酸类与N-羟基琥珀酰亚胺之类的羧酸的活性化试剂反应进行酯化。使其与上述进行了酯化的氨基链烷酸的甲酯反应，使手性部位与亚锚定位点结合。然后，通过使亚锚定位点的羧基与锚定位点的氨基反应，可以使上述本发明涉及的氨基酸类通过化学键合担载于核壳型粒子上。
对于上述核壳型粒子的上述本发明涉及的氨基酸类的担载量，相对于100重量份的核壳型粒子，优选为1.0～25重量份。
本发明的分离剂，当使用光学活性的物质作为配体时，可以用作光学异构体用的分离剂，当使用非光学活性的物质作为配体时，可以用作亲和色谱用的分离剂。这些分离剂还可以用作：气相色谱用、电泳用、特别是毛细管电色谱用(CEC用)、CZE(毛细管区带电泳)法、MEKC(胶束电动色谱)法的毛细管柱的填充剂。
实施例
通过实施例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例的限定。需要说明的是，以下的例子中的理论级数(N)、保持系数(ｋ’)、分离系数(α)通过下式进行定义。
＜理论级数＞
N＝16×[(保持时间)/(峰值宽度)]2
＜保持系数＞
ｋ’＝[(对映异构体的保持时间)-(停滞时间)]/(停滞时间)
＜分离系数＞
α=(较强保持的对映异构体的保持系数)/(较弱保持的对映异构体的保持系数)
此时，停滞时间是将三叔丁苯的洗脱时间作为停滞时间。
＜实施例1＞
通过光交联固定化使2重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)担载的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的合成
使市售品的3,5-二氯苯基异氰酸酯与纤维素在吡啶溶剂中反应，获得了白色固体(1)。反应条件参考了非专利文献2。
[化学式6]
(2) 通过物理性吸附制作担载有2重量%的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂
使(1)所得的0.081g纤维素衍生物(1)溶解于30mL的四氢呋喃中。向其溶液中加入3.9g核壳型硅胶(自株式会社クロマニックテクノロジース社制特殊柱φ4.6cm×L15cm(粒径2.6μm、细孔直径9nm、C4核壳)中抽出填充剂，通过电炉用1小时升温至600度，其后维持5小时放冷后，使其分散于4N盐酸中，搅拌一夜，用纯水洗涤，使其干燥而得到的物质，粒径：2.6μm、细孔直径：9nm(目录值)、核的直径：1.6μm、核的材质：玻璃；壳的厚度0.5μm、壳的材质：硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物))，进行了数分钟的振荡搅拌后，使溶剂减压镏去，由此制作了担载有2重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂。
(3) 通过固定化制作担载有2重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂
将2.76g担载有2重量%的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂悬浮于500mL乙腈/水=60/40(vol./vol.)中，进行了搅拌。将悬浮液用浸渍性水银灯(飞利浦、HPK-125W、石英包覆)照射了10分钟。滤取沉淀，用四氢呋喃洗涤，并使其进行了干燥。
(4) 使用通过固定化担载有2重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂来制作填充柱
将(3)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜应用例1＞
使用＜实施例1＞中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用具有下述结构的化合物(反-二苯乙烯氧化物，trans-Stylbene oxide)，进行了光学异构体分离柱的柱性能(N值)和分离系数的评价。
[化学式7]
作为比较例，显示了按照实施例1记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径5μm、细孔直径12nm)上担载有2.0重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂的光学异构体分离柱的柱性能(k’值、α值、N值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例1和比较例的任一者均使用正己烷/2-丙醇＝90/10作为流动相，且将流速设定为0.15mL/min.、温度设定为25℃。
[表1]
＜实施例2＞
通过光交联固定化使10重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)担载的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 通过物理性吸附制作担载有10重量％的纤维素三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂
使实施例1的(1)中得到的0.4g纤维素衍生物(1)溶解于4mL的四氢呋喃中。将该溶液均匀涂布于3.5g核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：将硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)通过电炉用1小时升温至600℃，其后维持5小时放冷后，分散于4N盐酸中，搅拌一夜，用纯水洗涤，使其干燥而得到的物质)之后，减压镏去四氢呋喃，制作了担载有10重量％纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂。
(2) 通过固定化制作担载有10重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂
将3.6g担载有10重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂悬浮于500mL乙腈/水＝60/40(vol./vol.)中，进行搅拌。将悬浮液用浸渍性水银灯(飞利浦、HPK-125W、石英包覆)照射10分钟。滤取沉淀，用四氢呋喃洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为9.5％。
(3) 使用通过固定化担载有10重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂来制作填充柱
将(2)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例3＞
使具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)固定化的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)的合成
使纤维素、3,5-二氯苯基异氰酸酯和3,5-(三乙氧基甲硅烷基)丙基异氰酸酯反应，得到了具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)。反应条件参考专利文献1的实施例2记载的方法进行了合成。根据1H-NMR的结果，3,5-二氯苯基异氰酸酯和烷氧基甲硅烷基(乙氧基甲硅烷基)的导入率分别为97.4％、2.6％。
[化学式8]
(2) 通过物理性吸附制作担载有10重量%的具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)的填充剂
将(1)中得到的0.4g具有烷氧基甲硅烷基的纤维素衍生物(2)溶解于3.2mL的四氢呋喃中。将该溶液均匀涂布于3.6g表面用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)进行制备)上之后，减压镏去四氢呋喃，制作了担载有10重量％的具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)的填充剂。
(3) 制作使具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)固定化的填充剂
将3g的(2)中得到的填充剂分散于乙醇/水/三甲基氯硅烷(27.5mL/7mL/0.45mL)中，边在110℃的油槽中沸腾边进行10分钟的反应，进行了在硅胶上的固定化。用甲醇洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为5.6％。
(4) 使用使具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)固定化的填充剂来制作填充柱
将(3)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例4＞
将纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)化学键合的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 制作将纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)化学键合的填充剂
将5g使纤维素与表面用氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由将硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)通过电炉用1小时升温至600℃，其后维持5小时放冷后，使其分散于4N盐酸中，搅拌一夜，用纯水洗涤，使其干燥而得到的物质进行制备)化学键合而得的物质参考专利文献11的实施例1记载的方法进行了合成。其中，此时的纤维素添加量比专利文献记载量多5倍，获得了纤维素化学键合于核壳型硅胶的物质。将4g所得的结合纤维素的核壳型硅胶悬浮于N,N-二甲基乙酰胺、吡啶混合溶剂中，向其中添加3.1g的3,5-二氯苯基异氰酸酯，在80℃下进行了48小时的反应。过滤悬浮液，用甲醇洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为0.9％。
(2) 使用将纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)化学键合的填充剂来制作填充柱
将(1)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例5＞
将聚对苯二甲酸丁二醇酯化学键合的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 通过物理性吸附制作担载有10重量%的聚对苯二甲酸丁二醇酯(3)的填充剂
使0.4g聚对苯二甲酸丁二醇酯(Duranex300FP)(3)溶解于4mL的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIPA)中。将该溶液均匀涂布于3.6g表面用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)进行制备)之后，减压镏去HFIPA，制作了担载有10重量％的聚对苯二甲酸丁二醇酯(3)的填充剂。
(2) 制作将聚对苯二甲酸丁二醇酯(3)化学键合的填充剂
将2.5g的(1)中得到的填充剂在200℃的烘箱中进行3小时的反应，进行了在硅胶上的固定化。用HFIPA洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为7.7％。
(3) 使用将聚对苯二甲酸丁二醇酯(3)化学键合的填充剂来制作填充柱
将(2)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例6＞
将聚对苯二甲酸乙二醇酯化学键合的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 通过物理性吸附制作担载有10重量%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(帝人化成社制TR8550FF)(4)的填充剂
将0.4g聚对苯二甲酸乙二醇酯(4)溶解于2.0mL的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIPA)和2.0mL二氯甲烷的混合溶液中。将该溶液均匀涂布于3.6g表面用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)进行制备)之后，减压镏去HFIPA和二氯甲烷，制作了担载有10重量％的聚对苯二甲酸乙二醇酯(4)的填充剂。
(2) 制作将聚对苯二甲酸乙二醇酯(4)化学键合的填充剂
将2.5g的(1)中得到的填充剂在200℃的烘箱中进行3小时的反应，进行了在硅胶上的固定化。用HFIPA洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为7.1％。
(3) 使用将聚对苯二甲酸乙二醇酯(4)化学键合的填充剂来制作填充柱
将(2)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例7＞
将(S)-[1,2-[6-(5-羰基戊酰基)]-(3-苯基萘并)]-[1’,2’-(3’-苯基萘并)]-1,6,9,12,15,18-六氧杂-环二十碳-2,4-二烯((S)-[1,2-[6-(5-carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1’,2’-(3’-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-diene)化学键合的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 合成(S)-[1,2-[6-(5-羰基戊酰基)]-(3-苯基萘并)]-[1’,2’-(3’-苯基萘并)]-1,6,9,12,15,18-六氧杂-环二十碳-2,4-二烯(5)
手性冠醚(5)利用专利文献12的实施例的[0057]～[0064]中记载的方法进行了合成。
[化学式9]
(2) 制作将(S)-[1,2-[6-(5-羰基戊酰基)]-(3-苯基萘并)]-[1’,2’-(3’-苯基萘并)]-1,6,9,12,15,18-六氧杂-环二十碳-2,4-二烯(5)化学键合的填充剂
使0.21g的手性冠醚(5)、0.16g的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐和42μL的N-甲基吗啉溶解于15mL的N,N-二甲基甲酰胺中并加入到表面用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的1.97g核壳型硅胶(Advanced Materials Technology(AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)进行制备)中，在室温下进行了4小时的反应。用稀盐酸/甲醇溶液、N,N-二甲基甲酰胺进行洗涤。将所得的填充剂分散于15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入3.2g的吡啶、1.87g的乙酸酐，在室温下进行了3小时的反应。用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇进行洗涤，并使其干燥。根据元素分析的结果，担载率为7.1％。
(3) 使用将(S)-[1,2-[6-(5-羰基戊酰基)]-(3-苯基萘并)]-[1’,2’-(3’-苯基萘并)]-1,6,9,12,15,18-六氧杂-环二十碳-2,4-二烯(5)化学键合的填充剂来制作填充柱
将(2)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜实施例8＞
将人血清清蛋白(HSA)化学键合的填充剂的制备方法和填充柱的制作方法
(1) 制作将人血清清蛋白(HSA)化学键合的填充剂
使1.0g表面用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理的核壳型硅胶(Advanced Materials Technology (AMT)社制、粒径：2.7μm、细孔直径：16nm(目录值)、核的直径：1.7μm、核的材质：玻璃；壳的厚度：0.5μm、壳的材质：按照已知的方法由硅胶(聚烷氧基硅氧烷的水解物)进行制备)和1.0g的N,N’-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC)溶解于50mL乙腈中，在所得溶液中进行悬浮，在30℃下搅拌了17小时。过滤该溶液，按照乙腈、水、甲醇、乙腈的顺序进行了洗涤。将滤渣进行干燥，获得了N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)活性化硅胶。
将所得的0.5g的NHS活性化硅胶加入到20mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，将30mg的HSA(SIGMA-ALDRICH、纯度≥99％)溶解于20mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)中而得的溶液维持在pH6.8的同时花费30分钟加入，在4℃下搅拌了17小时。过滤该溶液，用100mL水进行了洗涤。向滤渣中加入将1.4g盐酸氨基葡萄糖溶解于20mL的20mM磷酸缓冲液(pH6.8)中而得的溶液，在室温下搅拌了1小时。过滤该溶液，按照水、10％乙醇水的顺序进行洗涤，由此获得了使HSA固定化的填充剂。利用Bradford法定量了反应过滤液中的HAS，根据该结果，担载率为3.5％。
(2) 使用将人血清清蛋白(HSA)化学键合的填充剂来制作填充柱
将(1)中制作的担载型填充剂通过匀浆填充法加压、填充至φ0.21cm×L15cm的不锈钢制柱中，进行了柱的制作。
＜应用例2＞
使用实施例2中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用上述中显示出结构的反-二苯乙烯氧化物，进行了光学异构体分离柱的柱性能的评价。作为比较例1，显示了按照实施例2记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径：3μm、细孔直径：30nm)上担载有10重量％的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(1)的填充剂(根据元素分析的结果，担载率为8.6％。)的光学异构体分离柱的柱性能(k’值、α值、N值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例2和比较例1的任一者均使用正己烷/2-丙醇＝90/10作为流动相，且将流速设定为0.15mL/min.、温度设定为25℃。
＜应用例3＞
使用实施例3中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用反-二苯乙烯氧化物，进行了光学异构体分离柱的柱性能的评价。作为比较例2，显示了按照实施例3记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径：3μm、细孔直径：30nm)上固定化有具有烷氧基甲硅烷基的纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)(2)的填充剂(根据元素分析的结果，担载率为4.6％。)的光学异构体分离柱的柱性能(t值、α值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例3和比较例2的任一者均使用正己烷/2-丙醇＝90/10作为流动相，且将流速设定为0.15mL/min.、温度设定为25℃。
[表2]
＜应用例4＞
使用实施例5、6中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用以下的邻三联苯、间三联苯和对三联苯，进行了柱性能(t值、α1值(邻三联苯和间三联苯的分离系数)、α2值(间三联苯和对三联苯的分离系数))的评价。作为比较例3，显示了按照实施例5记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径：3μm、细孔直径：12nm)上固定化有聚对苯二甲酸丁二醇酯(3)的填充剂(根据元素分析的结果，担载率为8.5％。)的柱的柱性能(t值、α1值、α2值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例5、实施例6和比较例3的任一者均使用正己烷/2-丙醇＝100/1作为流动相，且将流速设定为0.15mL/min.、温度设定为25℃。
[化学式10]
[表3]
＜应用例5＞
使用实施例7中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用以下的化合物(酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、α-氨基-ε-己内酰胺)，进行了光学异构体分离柱的柱性能的评价。作为比较例4，显示了按照实施例7记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径：3μm、细孔直径：30nm)上化学键合有(S)-[1,2-[6-(5-羰基戊酰基)]-(3-苯基萘并)]-[1’,2’-(3’-苯基萘并)]-1,6,9,12,15,18-六氧杂-环二十碳-2,4-二烯(5)的填充剂(根据元素分析的结果，担载率为9.1％。)的光学异构体分离柱的柱性能(t值、α值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例7和比较例4的任一者均使用高氯酸水溶液(pH1.5)/乙腈＝80/20作为流动相，且将流速设定为0.10mL/ min.、温度设定为25℃。
[化学式11]
[表4]
＜应用例6＞
使用实施例8中制作的光学异构体分离柱，通过液相色谱法，使用以下所示的化合物(环己烯巴比妥，Hexobarbital)，进行了光学异构体分离柱的柱性能的评价。作为比较例5，显示了按照实施例8记载的方法使用在全多孔型硅胶(粒径：5μm、细孔直径：12nm)上化学键合有人血清清蛋白(HSA)的填充剂(通过Bradford法将反应滤过液中的HAS进行定量，根据该定量结果，担载率为8.0％。)的光学异构体分离柱的柱性能(t值、Rs值、N值)。需要说明的是，就评价条件而言，实施例8和比较例5的任一者均使用10mM乙酸铵水溶液(pH7.0)/2-丙醇＝95/5作为流动相，且将流速设定为0.10mL/min.、温度设定为25℃。
[化学式12]
[表5]

Claims (8)

1. 一种分离剂，其具有载体和通过化学键合担载于载体表面的配体，其特征在于：
上述载体是由无孔性的核和多孔性的壳构成的核-壳型粒子，该壳的细孔直径为9nm以上，该壳由聚烷氧基硅氧烷的水解物构成，
上述配体为光学活性聚合物、光学惰性的聚酯、蛋白质、核酸、分子量50～1000的光学活性的有机化合物。
2. 权利要求1所述的分离剂，其中，上述核-壳型粒子的核由无机材料构成，核与壳的厚度之比为4：1～2：1。
3. 权利要求1或2所述的分离剂，其中，上述光学活性聚合物选自多糖或其衍生物、光学活性的聚(甲基)丙烯酰胺、光学活性的聚氨基酸、光学活性的聚酰胺。
4. 权利要求1或2所述的分离剂，其中，上述蛋白质选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、白蛋白和它们的功能性变异体。
5. 权利要求1或2所述的分离剂，其中，上述光学惰性的聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乳酸。
6. 权利要求1或2所述的分离剂，其中，上述核酸选自碱基数5～10000的DNA、RNA和它们的衍生物。
7. 权利要求1或2所述的分离剂，其中，上述分子量50～1000的光学活性的有机化合物选自具有联萘结构和冠醚样环状结构的化合物、N-酰基化氨基酸、N-氨基甲酰基氨基酸、N-氨基甲酰基-α-芳香族烷基胺。
8. 权利要求1～7的任一项所述的分离剂，其中，上述分离剂为色谱用分离剂。
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