JP2003284552A - イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法 - Google Patents
イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡなどのイオン性高分子に結合するイオ
ン性高分子を同定する。 【解決手段】 例えば正に荷電したイオン性高分子を同
定するためには負に荷電した別のイオン性高分子を基盤
やビーズ上に固定化する。そこに正に荷電したイオン性
高分子を吸着させる。周囲のイオン環境を急激に低下さ
せると吸着した複合体は安定化する。しかし吸着してい
ない固定化されたイオン性高分子は構造が不安定にな
る。安定な構造と不安定な構造を区別するマーカーを固
定化されたイオン性高分子につけておくと同定したいイ
オン性高分子がどの固定化されたイオン性高分子に吸着
したかが判定できる。
ン性高分子を同定する。 【解決手段】 例えば正に荷電したイオン性高分子を同
定するためには負に荷電した別のイオン性高分子を基盤
やビーズ上に固定化する。そこに正に荷電したイオン性
高分子を吸着させる。周囲のイオン環境を急激に低下さ
せると吸着した複合体は安定化する。しかし吸着してい
ない固定化されたイオン性高分子は構造が不安定にな
る。安定な構造と不安定な構造を区別するマーカーを固
定化されたイオン性高分子につけておくと同定したいイ
オン性高分子がどの固定化されたイオン性高分子に吸着
したかが判定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡやたんぱく
質に代表されるイオン性高分子を同定するためのバイオ
チップ、及びこれを利用するイオン性高分子の同定方法
に属する。
質に代表されるイオン性高分子を同定するためのバイオ
チップ、及びこれを利用するイオン性高分子の同定方法
に属する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡやたんぱく質を同定することによ
り、医薬開発や医療検査のツールとすることが期待され
ている。
り、医薬開発や医療検査のツールとすることが期待され
ている。
【０００３】ＤＮＡは４種類の塩基配列からなる高分子
であり、ＤＮＡ同士がその配列によって特異的な結合を
おこなうが、核酸はどちらも同じマイナスチャージをも
っているため、イオン性の高い溶媒でハイブリダイゼー
ションを行っていた。これを利用し、従来のバイオチッ
プはプローブのＤＮＡを担体に固定して、サンプルのＤ
ＮＡを検出していた。
であり、ＤＮＡ同士がその配列によって特異的な結合を
おこなうが、核酸はどちらも同じマイナスチャージをも
っているため、イオン性の高い溶媒でハイブリダイゼー
ションを行っていた。これを利用し、従来のバイオチッ
プはプローブのＤＮＡを担体に固定して、サンプルのＤ
ＮＡを検出していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、例え
ば、ＤＮＡ結合たんぱく質を同定する場合は、従来のバ
イオチップでは同定できない。つまり、サンプルとして
のたんぱく質は、バイオチップ上のプローブＤＮＡに対
して相補的なＤＮＡ部分によって特異的に吸着する場合
と、本来ＤＮＡから見れば吸着すべきではないにもかか
わらず非特異的に吸着する場合がある。特異的な吸着と
非特異的な吸着の両者が見かけ上プローブＤＮＡに吸着
するため、サンプルたんぱく質の同定を行うことを事実
上不可能にしていた。
ば、ＤＮＡ結合たんぱく質を同定する場合は、従来のバ
イオチップでは同定できない。つまり、サンプルとして
のたんぱく質は、バイオチップ上のプローブＤＮＡに対
して相補的なＤＮＡ部分によって特異的に吸着する場合
と、本来ＤＮＡから見れば吸着すべきではないにもかか
わらず非特異的に吸着する場合がある。特異的な吸着と
非特異的な吸着の両者が見かけ上プローブＤＮＡに吸着
するため、サンプルたんぱく質の同定を行うことを事実
上不可能にしていた。
【０００５】そこで、多数あるたんぱく質等のイオン性
高分子に特異的に結合するチップの開発と、これを利用
したイオン性高分子を的確に同定する手法の開発が望ま
れていた。
高分子に特異的に結合するチップの開発と、これを利用
したイオン性高分子を的確に同定する手法の開発が望ま
れていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
した結果、特定の構造の高分子チップを用いることによ
り、ＤＮＡ結合たんぱく質を初め、広くイオン性高分子
の同定が容易かつ高精度で行うことが出来ることを見出
し本発明に到達した。
した結果、特定の構造の高分子チップを用いることによ
り、ＤＮＡ結合たんぱく質を初め、広くイオン性高分子
の同定が容易かつ高精度で行うことが出来ることを見出
し本発明に到達した。
【０００７】即ち、本発明のイオン性高分子同定用高分
子チップは、担体に第１のイオン性高分子が固定され、
前記第１のイオン性高分子にプローブとして標識を有す
る第２のイオン性高分子が相補的に結合されたものであ
り、サンプルとなる第３のイオン性高分子を特異的に結
合することにより、イオン性高分子を同定するものであ
る。
子チップは、担体に第１のイオン性高分子が固定され、
前記第１のイオン性高分子にプローブとして標識を有す
る第２のイオン性高分子が相補的に結合されたものであ
り、サンプルとなる第３のイオン性高分子を特異的に結
合することにより、イオン性高分子を同定するものであ
る。
【０００８】ここで、前記第１〜３のイオン性高分子
は、例えば、たんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、合成高分子から選ばれることが好ましい。
は、例えば、たんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、合成高分子から選ばれることが好ましい。
【０００９】より具体的には、本発明は、ＤＮＡ結合た
んぱく質同定用ＤＮＡチップであり、担体に第１のＤＮ
Ａが固定され、前記第１のＤＮＡに標識を有する第２の
ＤＮＡが相補的に結合している。
んぱく質同定用ＤＮＡチップであり、担体に第１のＤＮ
Ａが固定され、前記第１のＤＮＡに標識を有する第２の
ＤＮＡが相補的に結合している。
【００１０】また、前記第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡ
の塩基配列数は、それぞれ４〜１３個であることが好ま
しい。この範囲のＤＮＡの塩基配列数の時、前記第１及
び第２のＤＮＡの相補的結合、更にこれらからなるＤＮ
ＡチップとサンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質との化
学及び物理構造に基づく特異的結合が強固となり、サン
プルたんぱく質の同定が容易かつ高精度となる。
の塩基配列数は、それぞれ４〜１３個であることが好ま
しい。この範囲のＤＮＡの塩基配列数の時、前記第１及
び第２のＤＮＡの相補的結合、更にこれらからなるＤＮ
ＡチップとサンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質との化
学及び物理構造に基づく特異的結合が強固となり、サン
プルたんぱく質の同定が容易かつ高精度となる。
【００１１】前記担体の材料及び形状は特に限定され
ず、バイオチップの担体に用いられる材料及び形状が適
用される。その中で、ガラス、シリカゲル、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、メンブレンから選ばれ、平板状又
はビーズ状のものが好ましく用いられる。
ず、バイオチップの担体に用いられる材料及び形状が適
用される。その中で、ガラス、シリカゲル、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、メンブレンから選ばれ、平板状又
はビーズ状のものが好ましく用いられる。
【００１２】第２のイオン性高分子に付与される前記標
識は、バイオチップの分野で用いられるものが適用され
る。特に、蛍光を発する物質が読み取り段階での光学的
処理のために好ましい。
識は、バイオチップの分野で用いられるものが適用され
る。特に、蛍光を発する物質が読み取り段階での光学的
処理のために好ましい。
【００１３】また、本発明のイオン性高分子の同定方法
は、担体に第１のイオン性高分子が固定された高分子チ
ップに、イオン性溶媒中で標識を有する第２のイオン性
高分子を前記第１のイオン性高分子に相補的に結合させ
てプローブとし、乾燥後、サンプルとなる第３のイオン
性高分子を前記プローブに吸着させ、イオン性溶媒で洗
浄して非特異的に結合（本来プローブと結合するべきで
ないにもかかわらず結合しているもの）している第３の
イオン性高分子を除去し、更に非イオン性溶媒で洗浄し
て第３のイオン性高分子が特異的に結合（本来プローブ
と結合するべきもの）している部分以外の標識を有する
第２のイオン性高分子を除いた後、残存する標識量を読
み取ることにより、イオン性高分子を同定する。
は、担体に第１のイオン性高分子が固定された高分子チ
ップに、イオン性溶媒中で標識を有する第２のイオン性
高分子を前記第１のイオン性高分子に相補的に結合させ
てプローブとし、乾燥後、サンプルとなる第３のイオン
性高分子を前記プローブに吸着させ、イオン性溶媒で洗
浄して非特異的に結合（本来プローブと結合するべきで
ないにもかかわらず結合しているもの）している第３の
イオン性高分子を除去し、更に非イオン性溶媒で洗浄し
て第３のイオン性高分子が特異的に結合（本来プローブ
と結合するべきもの）している部分以外の標識を有する
第２のイオン性高分子を除いた後、残存する標識量を読
み取ることにより、イオン性高分子を同定する。
【００１４】ここで、標識を有する第２のイオン性高分
子を前記第１のイオン性高分子に相補的に結合させた前
記プローブと、サンプルとなる前記第３のイオン性高分
子が同じチャージをもつ場合は、第４の逆のイオン性を
もつサンプル高分子を添加することで、これらを強固に
固定した後、非イオン性溶媒で洗浄を行う工程を付加す
ることが好ましい。
子を前記第１のイオン性高分子に相補的に結合させた前
記プローブと、サンプルとなる前記第３のイオン性高分
子が同じチャージをもつ場合は、第４の逆のイオン性を
もつサンプル高分子を添加することで、これらを強固に
固定した後、非イオン性溶媒で洗浄を行う工程を付加す
ることが好ましい。
【００１５】前記第１〜３のイオン性高分子は、例え
ば、たんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成
高分子から選ばれることが好ましい。
ば、たんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成
高分子から選ばれることが好ましい。
【００１６】より具体的には、本発明は、担体に第１の
ＤＮＡが固定されたＤＮＡチップに、イオン性溶媒中で
標識を有する第２のＤＮＡを前記第１のＤＮＡに相補的
に結合させてプローブとし、乾燥後、サンプルとなるＤ
ＮＡ結合たんぱく質を前記プローブに吸着させ、イオン
性溶媒で洗浄して非特異的に結合しているたんぱく質を
除去し、更に非イオン性溶媒で洗浄してＤＮＡ結合たん
ぱく質が特異的に結合している部分以外の標識を有する
第２のＤＮＡを除いた後、残存する標識量を読み取るこ
とにより、サンプルたんぱく質を同定する。
ＤＮＡが固定されたＤＮＡチップに、イオン性溶媒中で
標識を有する第２のＤＮＡを前記第１のＤＮＡに相補的
に結合させてプローブとし、乾燥後、サンプルとなるＤ
ＮＡ結合たんぱく質を前記プローブに吸着させ、イオン
性溶媒で洗浄して非特異的に結合しているたんぱく質を
除去し、更に非イオン性溶媒で洗浄してＤＮＡ結合たん
ぱく質が特異的に結合している部分以外の標識を有する
第２のＤＮＡを除いた後、残存する標識量を読み取るこ
とにより、サンプルたんぱく質を同定する。
【００１７】また、前記第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡ
の塩基配列数は、それぞれ４〜１３個であることが好ま
しい。この範囲のＤＮＡの塩基配列数の時、前記第１及
び第２のＤＮＡの相補的結合、更にこれらからなるＤＮ
ＡチップとサンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質との化
学及び物理構造に基づく特異的結合が強固となり、サン
プルたんぱく質の同定が容易かつ高精度となる。
の塩基配列数は、それぞれ４〜１３個であることが好ま
しい。この範囲のＤＮＡの塩基配列数の時、前記第１及
び第２のＤＮＡの相補的結合、更にこれらからなるＤＮ
ＡチップとサンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質との化
学及び物理構造に基づく特異的結合が強固となり、サン
プルたんぱく質の同定が容易かつ高精度となる。
【００１８】前記担体の材料及び形状は特に限定され
ず、バイオチップの担体に用いられる材料及び形状が適
用される。その中で、ガラス、シリカゲル、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、メンブレンから選ばれ、平板状又
はビーズ状のものが好ましく用いられる。
ず、バイオチップの担体に用いられる材料及び形状が適
用される。その中で、ガラス、シリカゲル、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、メンブレンから選ばれ、平板状又
はビーズ状のものが好ましく用いられる。
【００１９】第２のイオン性高分子に付与される前記標
識は、バイオチップの分野で用いられるものが適用され
る。特に、蛍光を発する物質が読み取り段階での光学的
処理のために好ましい。
識は、バイオチップの分野で用いられるものが適用され
る。特に、蛍光を発する物質が読み取り段階での光学的
処理のために好ましい。
【００２０】また、前記非イオン性の溶媒は限定されな
いが、例えば、純水、アルコール、アセトン、ヘキサン
から選ばれる１種又は２種以上の混合物が挙げられる。
前記イオン性の溶媒は限定されないが、例えば、塩化ナ
トリウム水溶液や塩化カリウム水溶液が挙げられる。
いが、例えば、純水、アルコール、アセトン、ヘキサン
から選ばれる１種又は２種以上の混合物が挙げられる。
前記イオン性の溶媒は限定されないが、例えば、塩化ナ
トリウム水溶液や塩化カリウム水溶液が挙げられる。
【００２１】ＤＮＡやたんぱく質（ポリアミノ酸、ポリ
ペプチド）といった生体高分子はチャージを持ってお
り、ＤＮＡの場合はリン酸基のマイナスチャージ、たん
ぱく質は、アミノ酸の種類により、プラスチャージやマ
イナスチャージを持っている。ＤＮＡの二重鎖は、通常
マイナスイオンのため反発がおこり純水中ではハイブリ
ダイズはおこなえないが、プラスイオンが存在する系に
おいてはたとえばＮａ+イオンがＤＮＡのリン酸基にキ
レートすることでイオン存在下では水素結合によりハイ
ブリダイズを行うことが可能となる。また、プラスチャ
ージを持っているたんぱく質などは、そのチャージの部
分でマイナスチャージをもっているＤＮＡに結合する。
ペプチド）といった生体高分子はチャージを持ってお
り、ＤＮＡの場合はリン酸基のマイナスチャージ、たん
ぱく質は、アミノ酸の種類により、プラスチャージやマ
イナスチャージを持っている。ＤＮＡの二重鎖は、通常
マイナスイオンのため反発がおこり純水中ではハイブリ
ダイズはおこなえないが、プラスイオンが存在する系に
おいてはたとえばＮａ+イオンがＤＮＡのリン酸基にキ
レートすることでイオン存在下では水素結合によりハイ
ブリダイズを行うことが可能となる。また、プラスチャ
ージを持っているたんぱく質などは、そのチャージの部
分でマイナスチャージをもっているＤＮＡに結合する。
【００２２】これらの生体高分子がそのチャージにより
結合した状態でイオン強度を変化した溶媒でバイオチッ
プを洗浄することで、イオン強度が低い場合は同じチャ
ージを持った高分子は解離し、逆のチャージをもった高
分子は強固に結合する。イオン強度が高い場合は同じチ
ャージをもった高分子でも結合が可能となり、違うチャ
ージをもった高分子の結合は弱くなり、解離する。
結合した状態でイオン強度を変化した溶媒でバイオチッ
プを洗浄することで、イオン強度が低い場合は同じチャ
ージを持った高分子は解離し、逆のチャージをもった高
分子は強固に結合する。イオン強度が高い場合は同じチ
ャージをもった高分子でも結合が可能となり、違うチャ
ージをもった高分子の結合は弱くなり、解離する。
【００２３】このようにイオン強度を変化させることに
よって、様々な高分子の同定を行うことを可能とする。
よって、様々な高分子の同定を行うことを可能とする。
【００２４】本発明で用いられるＤＮＡ結合タンパク質
とは、ＤＮＡに親和性をもち，塩基配列に対して特異的
あるいは非特異的に結合するタンパク質を意味する。こ
のようなＤＮＡ結合タンパク質には、主に１）ＤＮＡ構
造に変化を与えて遺伝子発現を調節する２本鎖ＤＮＡ結
合タンパク質、２）ＤＮＡの複製、組換え、修復の過程
に必須な１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、３）染色体の高
次構造の保持に関与するタンパク質、４）ＤＮＡ依存性
ＡＴＰ分解、５）ＤＮＡ超らせん構造を形成するトポイ
ソメラーゼ、などがある。１）の多くは転写因子であ
り、ラムダファージＣｒｏタンパク質とｃＡＭＰ受容体
タンパク質の構造から見出されたヘリックス‐ターン‐
ヘリックス、システィンとヒスチジンにより亜鉛イオン
をキレートさせたジンクフィンガー、αヘリックスの片
側にロイシンが並んだタンパク質が２分子集まりジッパ
ーのように組み合わさって形成されるロイシンジッパー
などのいくつかの構造モチーフが知られている。２）は
バクテリオファージから高等生物までみられるタンパク
質であり、ＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ―ｓｔｒａｎｄｅｄＤ
ＮＡ―ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる。
３）については，真核生物の染色体中のヒストンタンパ
ク質が代表例であり、ヌクレオソーム構造を形成する。
細菌においても、同様のＨＵタンパク質が結合しヌクレ
オソーム様の構造形成が知られている。４）には、ＤＮ
Ａ複製（ＤｎａＢタンパク質など）、組換え（Ｒｅｃ
Ａ、ＲｅｃＢＣタンパク質）や２本鎖ＤＮＡの巻き戻し
を促進するヘリカーゼがある。更に、本発明では、上記
のような本来ＤＮＡ結合性を有するタンパク質だけでな
く、物理的または化学的処理によってＤＮＡ結合性を有
することとなったタンパク質も用いることができる。
とは、ＤＮＡに親和性をもち，塩基配列に対して特異的
あるいは非特異的に結合するタンパク質を意味する。こ
のようなＤＮＡ結合タンパク質には、主に１）ＤＮＡ構
造に変化を与えて遺伝子発現を調節する２本鎖ＤＮＡ結
合タンパク質、２）ＤＮＡの複製、組換え、修復の過程
に必須な１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、３）染色体の高
次構造の保持に関与するタンパク質、４）ＤＮＡ依存性
ＡＴＰ分解、５）ＤＮＡ超らせん構造を形成するトポイ
ソメラーゼ、などがある。１）の多くは転写因子であ
り、ラムダファージＣｒｏタンパク質とｃＡＭＰ受容体
タンパク質の構造から見出されたヘリックス‐ターン‐
ヘリックス、システィンとヒスチジンにより亜鉛イオン
をキレートさせたジンクフィンガー、αヘリックスの片
側にロイシンが並んだタンパク質が２分子集まりジッパ
ーのように組み合わさって形成されるロイシンジッパー
などのいくつかの構造モチーフが知られている。２）は
バクテリオファージから高等生物までみられるタンパク
質であり、ＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ―ｓｔｒａｎｄｅｄＤ
ＮＡ―ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる。
３）については，真核生物の染色体中のヒストンタンパ
ク質が代表例であり、ヌクレオソーム構造を形成する。
細菌においても、同様のＨＵタンパク質が結合しヌクレ
オソーム様の構造形成が知られている。４）には、ＤＮ
Ａ複製（ＤｎａＢタンパク質など）、組換え（Ｒｅｃ
Ａ、ＲｅｃＢＣタンパク質）や２本鎖ＤＮＡの巻き戻し
を促進するヘリカーゼがある。更に、本発明では、上記
のような本来ＤＮＡ結合性を有するタンパク質だけでな
く、物理的または化学的処理によってＤＮＡ結合性を有
することとなったタンパク質も用いることができる。
【００２５】このように、本発明では、これらのＤＮＡ
結合タンパク質を広く用いることができる。また、１種
類のＤＮＡ結合タンパク質を用いる場合だけでなく、２
種類以上のＤＮＡ結合タンパク質を併用する場合も本発
明に含まれる。
結合タンパク質を広く用いることができる。また、１種
類のＤＮＡ結合タンパク質を用いる場合だけでなく、２
種類以上のＤＮＡ結合タンパク質を併用する場合も本発
明に含まれる。
【００２６】ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡ結合ドメイ
ンの部分にプラスチャージをもち、マイナスチャージを
もつＤＮＡやＲＮＡに特異的、非特異的に結合すること
を特徴とする。そして、これらＤＮＡ結合タンパク質が
結合した二重鎖のＤＮＡはイオン強度が低くなるほど、
結合は強固になる。
ンの部分にプラスチャージをもち、マイナスチャージを
もつＤＮＡやＲＮＡに特異的、非特異的に結合すること
を特徴とする。そして、これらＤＮＡ結合タンパク質が
結合した二重鎖のＤＮＡはイオン強度が低くなるほど、
結合は強固になる。
【００２７】
【発明の実施の形態】図１は、本発明のイオン性高分子
同定用高分子チップの一例であるたんぱく質同定用ＤＮ
Ａチップの模式図を示す。担体１にＧＣＴＡの塩基配列
を有する第１のＤＮＡ２が固定されている。これをイオ
ン性溶媒中でＣＧＡＴの塩基配列を有し、蛍光物質で標
識された第２のＤＮＡ３を加えると、両者は相補的に結
合して２重鎖を形成する。同様にＣＣＡＡの塩基配列を
有する他のＤＮＡ５に、ＧＧＴＴの塩基配列を有し、別
の蛍光物質で標識された第２のＤＮＡ６を加えると、両
者は相補的に結合して２重鎖を形成する。このようなＤ
ＮＡチップに未だ同定されていないたんぱく質４を加え
ると、このたんぱく質４はＤＮＡ２とＤＮＡ３が相補的
に結合した２重鎖に結合する。しかしながら、このたん
ぱく質４はＤＮＡ５とＤＮＡ６が相補的に結合した２重
鎖には結合しない。このような現象を蛍光強度を計測す
ることにより、たんぱく質の同定を行う。
同定用高分子チップの一例であるたんぱく質同定用ＤＮ
Ａチップの模式図を示す。担体１にＧＣＴＡの塩基配列
を有する第１のＤＮＡ２が固定されている。これをイオ
ン性溶媒中でＣＧＡＴの塩基配列を有し、蛍光物質で標
識された第２のＤＮＡ３を加えると、両者は相補的に結
合して２重鎖を形成する。同様にＣＣＡＡの塩基配列を
有する他のＤＮＡ５に、ＧＧＴＴの塩基配列を有し、別
の蛍光物質で標識された第２のＤＮＡ６を加えると、両
者は相補的に結合して２重鎖を形成する。このようなＤ
ＮＡチップに未だ同定されていないたんぱく質４を加え
ると、このたんぱく質４はＤＮＡ２とＤＮＡ３が相補的
に結合した２重鎖に結合する。しかしながら、このたん
ぱく質４はＤＮＡ５とＤＮＡ６が相補的に結合した２重
鎖には結合しない。このような現象を蛍光強度を計測す
ることにより、たんぱく質の同定を行う。
【００２８】図２は、図１のたんぱく質同定用ＤＮＡチ
ップを用いて、たんぱく質を同定する経路を示すチャー
トである。担体１にＤＮＡ２とＤＮＡ％が固定されたＤ
ＮＡチップを準備する（ａ）。このＤＮＡチップに、イ
オン性溶媒の存在下に蛍光物質で標識が付与されたＤＮ
Ａ３とＤＮＡ６を相補的に結合させる（ｂ）。イオン性
溶媒を除去し、未だ同定されないたんぱく質４を添加す
る。たんぱく質４は本来結合すべきＤＮＡ２と３の２重
鎖に特異的に結合するとともに、本来結合すべきでない
ＤＮＡ５と６の２重鎖にも非特異的に結合する（ｃ）。
そこで、イオン性溶媒により洗浄し、非特異的に結合し
ていたたんぱく質を除去する（ｄ）。更に、非イオン性
溶媒で洗浄して、蛍光物質で標識が付与されたＤＮＡ６
を除去する（ｅ）。残留する蛍光を読み取り、その結果
よりたんぱく質を同定する（ｆ）。
ップを用いて、たんぱく質を同定する経路を示すチャー
トである。担体１にＤＮＡ２とＤＮＡ％が固定されたＤ
ＮＡチップを準備する（ａ）。このＤＮＡチップに、イ
オン性溶媒の存在下に蛍光物質で標識が付与されたＤＮ
Ａ３とＤＮＡ６を相補的に結合させる（ｂ）。イオン性
溶媒を除去し、未だ同定されないたんぱく質４を添加す
る。たんぱく質４は本来結合すべきＤＮＡ２と３の２重
鎖に特異的に結合するとともに、本来結合すべきでない
ＤＮＡ５と６の２重鎖にも非特異的に結合する（ｃ）。
そこで、イオン性溶媒により洗浄し、非特異的に結合し
ていたたんぱく質を除去する（ｄ）。更に、非イオン性
溶媒で洗浄して、蛍光物質で標識が付与されたＤＮＡ６
を除去する（ｅ）。残留する蛍光を読み取り、その結果
よりたんぱく質を同定する（ｆ）。
【００２９】
【実施例】以下、本発明の実施例を述べる。以下の実施
例では、既に同定が行われているＴＲＦ、ｃ−Ｍｙｂ、
及びＰｕｒの各たんぱく質をサンプルとして用いた。こ
こで、ＴＲＦは、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｇａ
ｄｏｉ，Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ａｉｍｏｔ
ｏ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮ
Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＴＲＦ１.”
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６，１０５７−１０６５（１９９
８）、ｃ−Ｍｙｂは、Ｏｇａｔａ，Ｋ.，Ｈｏｊｏ，
Ｈ．，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｒａｉ，Ａ．，Ｉｓｈｉｉ，
Ｓ．＆Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ａｈｅｌｉｘ−ｔｕ
ｒｎ−ｈｅｌｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ ｗｉ
ｔｈ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒ
ｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，６４２８−６４３２（１９９２）、及びＰｕ
ｒは、Ｎａｇａｄｏｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｅｎａｒｉ，Ｍ．，Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｓ
ａｍｐｅｉ，Ｇ．，Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．
＆ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ａ
ｎｄ ＤＮＡ−Ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｕｒｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒＤＮＡ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３，
１２１７−１２２４（１９９５）に紹介されている。
例では、既に同定が行われているＴＲＦ、ｃ−Ｍｙｂ、
及びＰｕｒの各たんぱく質をサンプルとして用いた。こ
こで、ＴＲＦは、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｇａ
ｄｏｉ，Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ａｉｍｏｔ
ｏ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮ
Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＴＲＦ１.”
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６，１０５７−１０６５（１９９
８）、ｃ−Ｍｙｂは、Ｏｇａｔａ，Ｋ.，Ｈｏｊｏ，
Ｈ．，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｒａｉ，Ａ．，Ｉｓｈｉｉ，
Ｓ．＆Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ａｈｅｌｉｘ−ｔｕ
ｒｎ−ｈｅｌｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ ｗｉ
ｔｈ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒ
ｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，６４２８−６４３２（１９９２）、及びＰｕ
ｒは、Ｎａｇａｄｏｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｅｎａｒｉ，Ｍ．，Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｓ
ａｍｐｅｉ，Ｇ．，Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．
＆ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ａ
ｎｄ ＤＮＡ−Ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｕｒｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒＤＮＡ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３，
１２１７−１２２４（１９９５）に紹介されている。
【００３０】まず、次のようなバイオチップを作成し
た。ＴＲＦ用プローブＤＮＡの配列を５'−ＧＴＴＡＧ
ＧＧＴＴＡＧＧＧ−３'、ｃ−Ｍｙｂ用プローブＤＮＡ
の配列を５'−ＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＣ−３'とし、
それぞれ５'末端をビオチン化して、アビジンコート済
みのスライドガラスにＳＰＢＩＯ（日立ソフトウエアエ
ンジニアリング（株）製：商品名）にて２４箇所スポッ
トした。スポットしたプローブＤＮＡの濃度は１ｍＭに
なるよう純水で調製した。スポットしたバイオチップは
図３のようになる。
た。ＴＲＦ用プローブＤＮＡの配列を５'−ＧＴＴＡＧ
ＧＧＴＴＡＧＧＧ−３'、ｃ−Ｍｙｂ用プローブＤＮＡ
の配列を５'−ＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＣ−３'とし、
それぞれ５'末端をビオチン化して、アビジンコート済
みのスライドガラスにＳＰＢＩＯ（日立ソフトウエアエ
ンジニアリング（株）製：商品名）にて２４箇所スポッ
トした。スポットしたプローブＤＮＡの濃度は１ｍＭに
なるよう純水で調製した。スポットしたバイオチップは
図３のようになる。
【００３１】サンプルＤＮＡを２本作成した。配列はＴ
ＲＦ用サンプルＤＮＡが３'−ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣ
ＣＣ−５' と、ｃ−Ｍｙｂ用サンプルＤＮＡの配列が
３'−ＧＧＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧ−５' でそれぞれ５'
末端を蛍光色素のＣｙ５で標識した。
ＲＦ用サンプルＤＮＡが３'−ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣ
ＣＣ−５' と、ｃ−Ｍｙｂ用サンプルＤＮＡの配列が
３'−ＧＧＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧ−５' でそれぞれ５'
末端を蛍光色素のＣｙ５で標識した。
【００３２】その後、 ５ｘＳＳＣ溶液にそれぞれのサ
ンプルＤＮＡの濃度を１０μＭとなるように調整して、
作成済みのバイオチップ上に２０μｌ添加し、３０分間
乾燥しないように湿度を保った状態でハイブリダイゼー
ションを行った。
ンプルＤＮＡの濃度を１０μＭとなるように調整して、
作成済みのバイオチップ上に２０μｌ添加し、３０分間
乾燥しないように湿度を保った状態でハイブリダイゼー
ションを行った。
【００３３】ハイブリダイズを行った後に、１ｘＳＳＣ
で洗浄、乾燥し、蛍光スキャナーであるＣＲＢＩＯ２
（日立ソフトウエアエンジニアリング（株）製：商品
名）にて読み取りを行った。
で洗浄、乾燥し、蛍光スキャナーであるＣＲＢＩＯ２
（日立ソフトウエアエンジニアリング（株）製：商品
名）にて読み取りを行った。
【００３４】読み取りを行った画像を図４に示す。黒く
なっているスポットがＣｙ５標識したサンプルが存在す
る個所を表している。また、ＤＮＡは相補鎖とハイブリ
ダイズすることからＴＲＦ用プローブＤＮＡのスポット
してあるところにはＴＲＦ用サンプルＤＮＡと、ｃ−Ｍ
ｙｂ用プローブＤＮＡがスポットしているところにはｃ
−Ｍｙｂ用プローブＤＮＡがハイブリダイズしている。
これらのことはサンプルＤＮＡを個別にハイブリダイズ
した結果からも確認済みである。（画像は省略）その
後、ＴＲＦたんぱく質を１１０μＭ、５ｍＭのＫＰＢ
（リン酸）、３０ｍＭのＮａＣｌで調製したＴＲＦたん
ぱく質サンプル液をハイブリ済みのバイオチップ上に添
加し、１０分間ハイブリダイズした。
なっているスポットがＣｙ５標識したサンプルが存在す
る個所を表している。また、ＤＮＡは相補鎖とハイブリ
ダイズすることからＴＲＦ用プローブＤＮＡのスポット
してあるところにはＴＲＦ用サンプルＤＮＡと、ｃ−Ｍ
ｙｂ用プローブＤＮＡがスポットしているところにはｃ
−Ｍｙｂ用プローブＤＮＡがハイブリダイズしている。
これらのことはサンプルＤＮＡを個別にハイブリダイズ
した結果からも確認済みである。（画像は省略）その
後、ＴＲＦたんぱく質を１１０μＭ、５ｍＭのＫＰＢ
（リン酸）、３０ｍＭのＮａＣｌで調製したＴＲＦたん
ぱく質サンプル液をハイブリ済みのバイオチップ上に添
加し、１０分間ハイブリダイズした。
【００３５】その後、４０℃の１ｘＳＳＣで洗浄、４０
℃の純水で洗浄をおこなった後に、ＣＲＢＩＯ２（日立
ソフトウエアエンジニアリング（株）製：商品名）にて
読み取りを行った。読み取りを行った各スポットの画像
は図５に示す。
℃の純水で洗浄をおこなった後に、ＣＲＢＩＯ２（日立
ソフトウエアエンジニアリング（株）製：商品名）にて
読み取りを行った。読み取りを行った各スポットの画像
は図５に示す。
【００３６】同様にしてｃ−Ｍｙｂたんぱく質を７４μ
Ｍ、１０ｍＭのＫＰＢ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭの
ＮａＮ3をバイオチップ２上でハイブリダイズ後に１ｘ
ＳＳＣ，純水での洗浄を行った後にＣＲＢＩＯ２にて読
み取りを行った各スポットの画像を図６に示す。
Ｍ、１０ｍＭのＫＰＢ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭの
ＮａＮ3をバイオチップ２上でハイブリダイズ後に１ｘ
ＳＳＣ，純水での洗浄を行った後にＣＲＢＩＯ２にて読
み取りを行った各スポットの画像を図６に示す。
【００３７】同様にしてＰｕｒたんぱく質を527μＭ、
１ｍＭのＫＰＢ、２０ｍＭのＫＣｌ、０．０５ｍＭのＮ
ａＮ３を倍チップ３上でハイブリ後に１ｘＳＳＣ、純水
での洗浄を行った後にＣＲＢＩＯ２（日立ソフトウエア
エンジニアリング（株）製：商品名）にて読み取りを行
った各スポットの画像を図７に示す。
１ｍＭのＫＰＢ、２０ｍＭのＫＣｌ、０．０５ｍＭのＮ
ａＮ３を倍チップ３上でハイブリ後に１ｘＳＳＣ、純水
での洗浄を行った後にＣＲＢＩＯ２（日立ソフトウエア
エンジニアリング（株）製：商品名）にて読み取りを行
った各スポットの画像を図７に示す。
【００３８】これら図５、６、７から、それぞれを認識
するＤＮＡが存在する場合は、それぞれのたんぱく質が
ハイブリダイズをしている二重鎖のＤＮＡに強固に結合
することで、純水中でもその二重鎖が解離することなく
検出を行うことができる。
するＤＮＡが存在する場合は、それぞれのたんぱく質が
ハイブリダイズをしている二重鎖のＤＮＡに強固に結合
することで、純水中でもその二重鎖が解離することなく
検出を行うことができる。
【００３９】図５、図６、図７の画像のスポット位置に
おける蛍光強度を数値化し、図４の画像のスポット位置
における蛍光強度と比較したものを図８に示す。図８に
おいて、縦軸は蛍光強度比較を示す。横軸は各スポット
番号であり、１〜２４がｃ−Ｍｙｂ用プローブによる蛍
光強度比較を示し、２５〜４８がＴＲＦ用プローブによ
る蛍光強度比較を示す。
おける蛍光強度を数値化し、図４の画像のスポット位置
における蛍光強度と比較したものを図８に示す。図８に
おいて、縦軸は蛍光強度比較を示す。横軸は各スポット
番号であり、１〜２４がｃ−Ｍｙｂ用プローブによる蛍
光強度比較を示し、２５〜４８がＴＲＦ用プローブによ
る蛍光強度比較を示す。
【００４０】理想的には蛍光強度が減少していないスポ
ットについては１．０の値をとり、減少に応じて、１．
０以下の値をとるようになっている。図８の結果からＴ
ＲＦプローブのスポットはＴＲＦたんぱく質を添加した
場合において、蛍光強度の減少が抑えられ、ｃ−Ｍｙｂ
プローブのスポットはｃ−Ｍｙｂたんぱく質を添加した
場合において、蛍光強度の減少が抑えられているのが確
認できる。これはそれぞれのたんぱく質がハイブリダイ
ズした二重鎖ＤＮＡに強固に結合し、イオンの存在しな
い純水中でも二重鎖ＤＮＡが解離せずに結合しているこ
とを示す。
ットについては１．０の値をとり、減少に応じて、１．
０以下の値をとるようになっている。図８の結果からＴ
ＲＦプローブのスポットはＴＲＦたんぱく質を添加した
場合において、蛍光強度の減少が抑えられ、ｃ−Ｍｙｂ
プローブのスポットはｃ−Ｍｙｂたんぱく質を添加した
場合において、蛍光強度の減少が抑えられているのが確
認できる。これはそれぞれのたんぱく質がハイブリダイ
ズした二重鎖ＤＮＡに強固に結合し、イオンの存在しな
い純水中でも二重鎖ＤＮＡが解離せずに結合しているこ
とを示す。
【００４１】
【発明の効果】転写因子等のたんぱく質などのイオン性
高分子の網羅的な同定に効果的である。特に、多数のた
んぱく質を容易かつ正確に同定することが出来る。これ
により、医薬の開発や医療検査のツールとして期待出来
る。
高分子の網羅的な同定に効果的である。特に、多数のた
んぱく質を容易かつ正確に同定することが出来る。これ
により、医薬の開発や医療検査のツールとして期待出来
る。
【図１】本発明のイオン性高分子同定用高分子チップの
一例であるたんぱく質同定用ＤＮＡチップの模式図を示
す。
一例であるたんぱく質同定用ＤＮＡチップの模式図を示
す。
【図２】図１のたんぱく質同定用ＤＮＡチップを用いた
たんぱく質の同定方法を示すチャート。
たんぱく質の同定方法を示すチャート。
【図３】バイオチップを説明する図。
【図４】ＤＮＡハイブリダイズ後の読み取り画像。
【図５】ＴＲＦたんぱく質添加後の読み取り画像。
【図６】ｃ−Ｍｙｂたんぱく質添加後の読み取り画像。
【図７】Ｐｕｒたんぱく質添加後の読み取り画像。
【図８】各読み取り画像を数値化し、相対的に比較した
グラフ。
グラフ。
１：担体、２：第１のＤＮＡ，３：第２のＤＮＡ，４：
たんぱく質、５：第１のＤＮＡ，６：第２のＤＮＡ。
たんぱく質、５：第１のＤＮＡ，６：第２のＤＮＡ。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２
37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
(72)発明者 中尾 素直
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株式会
社内
(72)発明者 森田 敏樹
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株式会
社内
Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02
FB07 FB12
4B024 AA11 CA09 HA14
4B029 AA07 AA23 FA15 GA08
4B063 QA18 QQ42 QR55 QS34 QX02
Claims (17)
- 【請求項１】 担体に第１のイオン性高分子が固定さ
れ、前記第１のイオン性高分子にプローブとして標識を
有する第２のイオン性高分子が相補的に結合されたこと
を特徴とする、サンプルとなる第３のイオン性高分子の
同定用高分子チップ。 - 【請求項２】 前記第１〜３のイオン性高分子が、それ
ぞれたんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成
高分子から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の
イオン性高分子同定用高分子チップ。 - 【請求項３】 担体に第１のＤＮＡが固定され、前記第
１のＤＮＡに標識を有する第２のＤＮＡが相補的に結合
され、サンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質を特異的に
結合するたんぱく質同定用ＤＮＡチップ。 - 【請求項４】 前記第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡの塩
基配列数がそれぞれ４〜１３個であることを特徴とする
請求項３に記載のたんぱく質同定用ＤＮＡチップ。 - 【請求項５】 前記担体の材料が、ガラス、シリカゲ
ル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレンから選
ばれることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載
のイオン性高分子同定用高分子チップ又はサンプルたん
ぱく質同定用ＤＮＡチップ。 - 【請求項６】 前記担体は、平板又はビーズ状であるこ
とを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のイオン
性高分子同定用高分子チップ又はサンプルたんぱく質同
定用ＤＮＡチップ。 - 【請求項７】 前記標識は、蛍光を発する物質であるこ
とを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のイオン
性高分子同定用高分子チップ又はサンプルたんぱく質同
定用ＤＮＡチップ。 - 【請求項８】 担体に第１のイオン性高分子が固定され
た高分子チップに、イオン性溶媒中で標識を有する第２
のイオン性高分子を前記第１のイオン性高分子に相補的
に結合させてプローブとし、乾燥後、サンプルとなる第
３のイオン性高分子を前記プローブに吸着させ、イオン
性溶媒で洗浄して非特異的に結合している第３のイオン
性高分子を除去し、更に非イオン性溶媒で洗浄して第３
のイオン性高分子が特異的に結合している部分以外の標
識を有する第２のイオン性高分子を除いた後、残存する
標識量を読み取ることを特徴とするイオン性高分子の同
定方法。 - 【請求項９】標識を有する第２のイオン性高分子を前記
第１のイオン性高分子に相補的に結合させた前記プロー
ブと、サンプルとなる前記第３のイオン性高分子が同じ
チャージをもつ場合は、第４の逆のイオン性をもつサン
プル高分子を添加することで、これらを強固に固定した
後、非イオン性溶媒で洗浄を行うことを特徴とする請求
項８に記載のイオン性高分子の同定方法。 - 【請求項１０】 前記第１〜３のイオン性高分子が、そ
れぞれたんぱく質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合
成高分子から選ばれることを特徴とする請求項８又は９
に記載のイオン性高分子の同定方法。 - 【請求項１１】 担体に第１のＤＮＡが固定されたＤＮ
Ａチップに、イオン性溶媒中で標識を有する第２のＤＮ
Ａを前記第１のＤＮＡに相補的に結合させてプローブと
し、乾燥後、サンプルとなるＤＮＡ結合たんぱく質を前
記プローブに吸着させ、イオン性溶媒で洗浄して非特異
的に結合しているたんぱく質を除去し、更に非イオン性
溶媒で洗浄してＤＮＡ結合たんぱく質が特異的に結合し
ている部分以外の標識を有する第２のＤＮＡを除いた
後、残存する標識量を読み取ることを特徴とするサンプ
ルたんぱく質の同定方法。 - 【請求項１２】 前記第１のＤＮＡ及び第２のＤＮＡの
塩基配列数がそれぞれ４〜１３個であることを特徴とす
る請求項１１に記載のサンプルたんぱく質の同定方法。 - 【請求項１３】 前記担体の材料が、ガラス、シリカゲ
ル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレンから選
ばれることを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記
載のイオン性高分子の同定方法又はサンプルたんぱく質
の同定方法。 - 【請求項１４】 前記担体は、平板又はビーズ状である
ことを特徴とする請求項８〜１３のいずれかに記載のイ
オン性高分子の同定方法又はサンプルたんぱく質の同定
方法。 - 【請求項１５】 前記標識は、蛍光を発する物質である
ことを特徴とする請求項８〜１４のいずれかに記載のイ
オン性高分子の同定方法又はサンプルたんぱく質の同定
方法。 - 【請求項１６】 前記非イオン性の溶媒は、純水、アル
コール、アセトン、ヘキサンから選ばれる１種又は２種
以上の混合物であることを特徴とする請求項８〜１５の
いずれかに記載のイオン性高分子の同定方法又はサンプ
ルたんぱく質の同定方法。 - 【請求項１７】 前記イオン性の溶媒は、塩化ナトリウ
ム水溶液又は塩化カリウム水溶液であることを特徴とす
る請求項８〜１６のいずれかに記載のイオン性高分子の
同定方法又はサンプルたんぱく質の同定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002090129A JP2003284552A (ja) | 2002-03-28 | 2002-03-28 | イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法 |
| US10/368,451 US20030186298A1 (en) | 2002-03-28 | 2003-02-20 | Polymer chip and method for identifying an ionic polymer |
| EP03003924A EP1348767A3 (en) | 2002-03-28 | 2003-02-21 | Polymer chip and method for identifying an ionic polymer |
| US11/107,845 US20050181441A1 (en) | 2002-03-28 | 2005-04-18 | Polymer chip and method for identifying an ionic polymer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002090129A JP2003284552A (ja) | 2002-03-28 | 2002-03-28 | イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003284552A true JP2003284552A (ja) | 2003-10-07 |
Family
ID=27800499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002090129A Pending JP2003284552A (ja) | 2002-03-28 | 2002-03-28 | イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1348767A3 (ja) |
| JP (1) | JP2003284552A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007072976A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-28 | Sharp Kabushiki Kaisha | A method of producing a multimeric capture agent for binding a ligand |
| WO2013176215A1 (ja) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | 株式会社ダイセル | 分離剤 |
| WO2014087937A1 (ja) | 2012-12-06 | 2014-06-12 | 株式会社ダイセル | 分離剤 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10240098B4 (de) * | 2002-08-30 | 2006-04-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Synthese und selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden, Peptidmimetika und Proteinen |
| JP2004117201A (ja) * | 2002-09-26 | 2004-04-15 | Hitachi Software Eng Co Ltd | イオン性高分子同定用高分子チップを用いた結合定数および解離定数算出方法 |
| GB2433505A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | Capture agents for binding a ligand |
| GB2433591A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | Method for functionalising a hydrophobic substrate |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP0647719A4 (en) * | 1992-03-19 | 1997-08-20 | Nippon Gene Kk | A SOLID-PHASE ANCHOR CARRYING A NUCLEIC ACID AND METHOD FOR ITS ADAPTATION. |
| US5556752A (en) * | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
| US6420109B1 (en) * | 1998-09-11 | 2002-07-16 | Genelabs Technologies, Inc. | Nucleic acid ligand interaction assays |
| US6294333B1 (en) * | 1998-12-31 | 2001-09-25 | Ingeneus Corp. | Fluorescent intensity assay for protein or peptide binding to nucleic acids |
-
2002
- 2002-03-28 JP JP2002090129A patent/JP2003284552A/ja active Pending
-
2003
- 2003-02-20 US US10/368,451 patent/US20030186298A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-21 EP EP03003924A patent/EP1348767A3/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-04-18 US US11/107,845 patent/US20050181441A1/en not_active Abandoned
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007072976A1 (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-28 | Sharp Kabushiki Kaisha | A method of producing a multimeric capture agent for binding a ligand |
| JP2009519433A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-14 | シャープ株式会社 | リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 |
| JP4750187B2 (ja) * | 2005-12-20 | 2011-08-17 | シャープ株式会社 | リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 |
| CN101331400B (zh) * | 2005-12-20 | 2012-09-26 | 夏普株式会社 | 用于产生结合配体的多聚体捕获试剂的方法 |
| WO2013176215A1 (ja) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | 株式会社ダイセル | 分離剤 |
| US9233355B2 (en) | 2012-05-23 | 2016-01-12 | Daicel Corporation | Separating agent |
| EP4016075A1 (en) | 2012-05-23 | 2022-06-22 | Daicel Corporation | Separating agent |
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| KR20150091372A (ko) | 2012-12-06 | 2015-08-10 | 주식회사 다이셀 | 분리제 |
| US9409145B2 (en) | 2012-12-06 | 2016-08-09 | Daicel Corporation | Separating agent |
Also Published As
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|---|---|
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| US20030186298A1 (en) | 2003-10-02 |
| EP1348767A3 (en) | 2003-12-10 |
| EP1348767A2 (en) | 2003-10-01 |
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