JP4750187B2 - リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 - Google Patents

リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、二量体型、またはより高次である多量体型捕捉剤を表面に作製する新規な方法、その新規な方法により製造される捕捉剤、およびその捕捉剤のアレイに関する。
〔背景技術〕
ペプチドなどの分子のコンビナトリアル生成（combinatorial production）は周知の技術である。この技術は強力なツールを提供し、ハイスループットスクリーニングなどの技術に用いることができる分子の巨大ライブラリーの作製を可能にしている。このような技術の例、およびこれらを関心のある分子の同定に利用している例は、例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３，８９６９，（１９９８）に開示されている。この文献においては、３ｍｅｒの１，０００ペプチドライブラリーを、ダンシル「ピンセット」（dansyl ‘tweezer’）分子と水中で反応させている。ライブラリー中の３％が、「ピンセット」と結合している。Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，５，７９４，（２００３）には、スプリットおよび混合合成のための、三脚シクロトリベラトリレン骨格（tripodal cyclotriveratrylene scaffold）が記載されており、〜２，０００の構成を含むライブラリーが記載されている。
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２，５６８，（２００４），Ｄａｒｉｏ Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌには、ＤＮＡタグが付着した有機分子結合剤の二つのライブラリーが記載されている。より多様性に富んだライブラリーを作製するために、ＤＮＡの相補性が用いられている。さらなるライブラリーがまた、三重らせん形成を用いて作製されている。２４ｍｅｒオリゴが、複合体アセンブリに用いられている。有機分子の解析は、付着しているＤＮＡタグの配列を調べることにより、または、オリゴヌクレオチドアレイに結合させることによりおこなわれている。結合剤は、ｎＭのアフィニティを有するタンパク質となるように産出される。
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｍｅ．，１２，３４６，（２００１）には、ペプチドマイクロアレイおよび低分子マイクロアレイの作製についての記載がある。この文献にはまた、化学選択的ライゲーションが、ペプチドおよびスライド表面に用い得ることが開示されている。この技術においては、Ｎ末端システイン残基が、スライド表面のアルファケトアルデヒドと反応してチアゾリジン環を形成する。他にも、遊離チオールとマレイミドとの間での遊離ラジカルマイケル付加が用いられている。
さらに、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５８１，（２００５）には、フォトリソグラフィー合成により、環状ペプチドの複合体ライブラリーを表面上に構築するストラテジーが記載されている。あらかじめ作製されているコアに側鎖をコンビナトリアル付加するために、ディファレンシャルプロテクション（differential protection）ストラテジーが利用されている。
有意義なライブラリーに必要とされる多様性を獲得するためには、公知の技術では、多数の合成をおこなう必要があり、それにより要する時間およびライブラリー作製のコストが増加する。
〔発明の開示〕
本発明の目的は、必要とされる多様性を有する分子のライブラリーを、高速かつ安価に作製する方法を提供することである。
本発明の第１の態様によれば、リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含んでおり、
（ａ）上記第１単量体ユニッにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、
（ｂ）上記付着部分を介して、上記第１単量体ユニットを担体上に固定化する工程、
工程（ａ）は、工程（ｂ）よりも前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後におこなわれることを特徴とする作製方法が提供される。
捕捉剤は、担体上にてアセンブルされることが好ましい。
本発明に係る捕捉剤の可能な作製方法の概略は、図１、２および３に示されており、また実施例１において説明されている。
本発明の別の実施形態では、リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、（ａ）上記第１単量体ユニッにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、を含んでいることを特徴とする作製方法もまた提供される。
この別の実施形態においては、上記捕捉剤を担体上に固定化する工程をさらに含むことが好ましい。
本発明の様々な実施形態は、以下に、より詳細に明確にされる。明確にされた各実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができ、また、明らかに反対のことが示されていない限り複数の実施形態を組み合わせることができる。とりわけ、好ましいまたは有利であると示されたいかなる特徴も、好ましいまたは有利であると示された他の任意のまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
ある好ましい実施形態において、第１単量体ユニットと第２単量体ユニットとは、共有結合している。
付着部分は、捕捉剤を担体上に固定化する任意の適した手段を含んでいることが、理解される。固定化は、例えば、共有結合相互作用、イオン相互作用、疎水性相互作用、極性相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、アビジン−ビオチン相互作用、または他の高アフィニティな非共有結合相互作用によるものであることが理解される。
好ましくは、付着部分は、捕捉剤を担体上に固定化するために、共有結合による手段または疎水性相互作用による手段を含んでいる。
単量体ユニットが任意の適した種類の分子であり得ることは、理解される。好ましくは、単量体ユニットは、ヌクレオチドまたはアミノ酸である。より好ましくは、単量体ユニットは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。最も好ましくは、単量体ユニットは、ポリペプチドである。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについては、それぞれ２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の鎖を意味している。
第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、合成されることが好ましい。第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは固相上に合成され、互いに同じかまたは異なるものであることがより好ましく、単量体ユニットは、第１の態様における使用の前に固相から切り離されることがさらに好ましい。
ポリヌクレオチド合成およびポリペプチド合成は当業者にとって周知の技術である。
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、十分に確立されている。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（例えば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。例えば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
捕捉剤がペプチド多量体を含んで構成されている場合に、第１ペプチドおよび第２ペプチドが、同じかまたは異なる一次アミノ酸配列を有し得ることは、一見して明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成され得ること、ならびに、各アミノ酸群は、同じであってもよくまたは異なるものであってもよいことは、さらに明白である。
第１ペプチドおよび第２ペプチドは、２〜１００アミノ酸の長さであることが好ましく、２〜５０アミノ酸の長さであることがより好ましく、５〜２５アミノ酸の長さであることが最も好ましい。
リガンド結合部分を形成する各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群から選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群から選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群から選択される。
群（set）に含まれている各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物（amino acid mimetic）、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体であり得ることが理解される。好ましくは、アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかである。
好ましくは、群に含まれている各アミノ酸は、実質的に鏡像異性的に単一である。
本発明に係る方法に用いる第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、好ましくは１０個以下のリガンド結合残基を含んでおり、より好ましくは８個以下のリガンド結合残基を含んでおり、より好ましくは６個以下のリガンド結合残基を含んでおり、さらに好ましくは４個以下のリガンド結合残基を含んでおり、最も好ましくは３個以下のリガンド結合残基を含んでいる。
好ましい実施形態においては、反応基は、ペプチド合成の間は保護されており、第１の態様における捕捉剤の生成に使用する前に、保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、例えば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリが挙げられる。この技術によれば、側鎖が保護されているとともにアミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを産出できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準的なペプチド合成条件下において、共役できるカルボン酸反応基共役の任意のものと反応し得る。例えば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を有するシステインが、組み込まれ得る。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
本発明の任意の実施形態に用いる上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールから選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。上記反応基としては、チオール基がより好ましい。好ましくは、反応基がチオール基である場合には、少なくとも１つのチオール基は活性化チオールである。好ましくは、チオール基は、ニトロチオピリジル基またはチオピリジル基で活性化されている。
反応スキームの概略を示す図４には、さまざまな反応基を含むペプチドを産出する、可能な反応経路が示されている。
多量体型捕捉剤を形成するために、任意の適した反応を本発明の方法に用いることができることは理解され、例えば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（例えば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
ペプチド内にあるアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有するようになることは明白である。例えば、側鎖はリガンド結合のための正電荷を提供し得る。正電荷は、好ましくは、リシン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に四つのＣＨ２基）、オルニチン残基（ペプチド鎖と正電荷との間に三つのＣＨ２基）によってもたらされ、最も好ましくは、ジアミノブチリル残基（ペプチド鎖と正電荷との間に二つのＣＨ２基を有する）によってもたらされる。
アミノ酸は、あるいは、リガンド結合のための水素結合供与体および／または受容体としての役割を果たすことができる水酸基を提供し得る。水酸基は、好ましくは、セリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、ホモセリン残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間に二つのＣＨ２を有する）によってもたらされる。
アミノ酸は、リガンド結合のための疎水性部分を提供し得る。好ましくは、アラニン残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つもＣＨ２基がない）が疎水性部分をもたらし、より好ましくは、アミノブチリル残基（ペプチド鎖とメチル基との間に一つのＣＨ２基を有する）が疎水性部分をもたらす。
また、アミノ酸は、リガンド結合のための負電荷を提供し得る。負電荷は、好ましくは、グルタミン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基（carboxylate group）との間に二つのＣＨ２基）によってもたらされ、より好ましくは、アスパラギン酸残基（ペプチド鎖とカルボキシレート基との間に一つのＣＨ２基）によってもたらされる。
好ましくは、当業者において周知のように、ペプチドは、コンビナトリアル方式（combinatorial manner）によりアミノ酸の群（set）から生成され、それにより群内にあるアミノ酸の可能な組み合わせの全てを生成することができる。例えば、群内にＮ種のアミノ酸があり、ペプチドの長さがＬである場合には、完全な群は、ＮＬ種類のペプチドを含むことになる。
好ましい実施形態において、任意の所定のアミノ酸群から生成され得る可能なコンビナトリアルペプチドの、副群（subset）を用いることができる。副群は、ペプチド合成において特定のルールを含めて決定することができ、例えば、群内における各アミノ酸の最大レベルおよび最小レベルを規定することができ、または、組み込まれる疎水性アミノ酸の割合の最大レベルおよび最小レベルを規定することができる。
本発明の方法により、多様性が増大した捕捉剤が生成される。これは、本方法により生成されるコンビナトリアル作製捕捉剤は、多量体型であるという事実によるものである。例えば、多量体型捕捉剤が二量体の場合には、リガンド結合部分の任意の所定の長さにおける可能な多様性は、二つのペプチド鎖があることにより、二乗した数になる。したがって、初期合成の数を減らして合成することが必要である。
好ましい実施形態において、リガンド結合に好ましいように側鎖が配置するように、ペプチドを固定化する。
捕捉剤が共有結合相互作用によって固定化されている場合には、これは、例えば、図５に示すように、Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に有するペプチドを合成することによって実現する。
または、図６に示すように、ベータアミノ酸を含む群を用いてペプチドを合成してもよく、または、ペプチドの繰り返し単位あたり偶数個の原子を有する他のキラルアミノ酸単量体を用いて合成してもよい。
ある好ましい実施形態においては、図７に示すように、リガンド結合領域にあるアミノ酸が一アミノ酸おきにのみ異なるようにペプチドを合成する。
この実施形態は、リガンド結合にとって最も自然で最も有利な間隔にて側鎖が配置されている点において有利である。
各ペプチドは、上述した種類のアミノ酸の一つ以上を含み得ること、および、用いられる特定の組み合わせが、様々なペプチド鎖を含む捕捉剤の特性に影響を与えることは、当業者にとって明らかである。
担体への捕捉剤の固定化が共有結合によりなされている場合には、捕捉剤を担体上に「配列」させることができ、また、アレイは任意の使いやすい形態をとることができる。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、「高密度」アレイの全ての種類に適用できる。
好ましくは、第１の態様の方法によって生成され、共有結合により固定化されている捕捉剤は、アレイ上の個別の空間符号化部位（spatially encoded loci）に配置されている。好ましくは、アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の全ては、ペプチドの同じ対を含んで構成されている。より好ましくは、アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれている。
分子（例えばペプチド）の担体への固定化に関して、用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書および本実施形態において、交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合を包含することを意図している。
本発明の特定の実施形態では、「官能化された」不活性な担体またはマトリクス（例えばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている担体を使用しており、官能化は、例えば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。そのような支持体の例としては、ガラスなどの不活性担体上に支持されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されるものではない。そのような実施形態においては、生体分子（例えばペプチド）は介在物質（例えばヒドロゲル）に直接共有結合をしているが、介在物質そのものは担体またはマトリクス（例えばガラス担体）に非共有結合で結合していてもよい。用語「担体に共有結合」には、適宜、この種の処理を包含していると解釈すべきである。
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチド二量体が多コピー含まれている。
捕捉剤を担体に共有結合させるための好ましい反応スキームとしては、スルフヒドリル（sulfhydryls）とマレイミド誘導化表面との間の反応、マレイミド誘導化表面とジエン官能化捕捉剤との間のディールス−アルダー反応、アジドおよびアセチレン３＋２付加環化反応、チアゾリジン環形成、ならびに改変シュタウディンガーライゲーションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、担体への捕捉剤の共有結合は、入れ換えた方法、例えば、チオール誘導化表面とマレイミド置換ペプチドとの間の反応によっても、成立し得る。
特に好ましい実施形態においては、捕捉剤を担体に共有結合させるために、チオエステル誘導化捕捉剤と、アミノ基およびシステインのスルフヒドリル基の両方が存在するシステイン誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションが用いられる。
最も好ましい反応スキームでは、図８に示すように、Ｎ末端システインを有する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションを用いている。
ネイティブケミカルライゲーションでは、ペプチド上のＮ末端システインと表面付着チオエステルとの間のペプチド結合が形成される。本発明のこの実施形態における特に有利な点は、ペプチド側鎖の保護が必要ないという点である。本発明のこの実施形態におけるさらに特に有利な点は、形成される表面付着ペプチドが、ジスルフィド結合形成による二量体レセプターの形成に利用され得る内部システイン、またはチオールとマレイミド官能化ペプチドとの間の反応に利用され得る内部システインを保持する点である。
チオエステル官能化ガラス表面の調製における好ましい反応スキームを図９に示す。
捕捉剤を担体表面にてアセンブルさせる場合における、好ましい反応スキームは図１０に示されている。この実施形態においては、第１ペプチドは、チオエステル基とＮ末端システイン残基との間のネイティブケミカルライゲーション反応を介して、官能化担体に共有結合している。多量体型捕捉剤は、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することによって生成される。
チオエステル表面を調製するためのより好ましい経路としては、アミノ化表面と下記種類のチオラン２，４−ジオンとの間の反応が挙げられる。
Figure 0004750187
 チオエステル表面は、下記種類のチオエステルシリルクロライド共役を用いた水酸化表面の誘導化によっても形成できる。
Figure 0004750187
 共有結合によって捕捉剤が担体に固定化されている場合には、二量体が形成されており、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、リガンド結合部位のＮ末端側もしくはリガンド結合部位のＣ末端側にあるペプチド配列中に、または二分されたリガンド結合部位に挟まれた内側に、チオール基（活性化されていても、活性化されていなくてもよい）を保持している。これらの実施形態のいずれにおいても、チオール基部分はリガンド結合残基と同じ配向性または反対の配向性を有していてもよく、また、第１ペプチドおよび第２ペプチド内の各チオール基の位置は独立であることは、明らかである。
別の一実施形態において、捕捉剤は、捕捉剤と担体との間の疎水性相互作用によって、担体に固定化されている。
本実施形態において、本発明の方法に従って作製された捕捉剤は、少なくとも２つの単量体ユニットを含んでおり、第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、それぞれ、少なくとも１つの疎水性部分と、少なくとも１つの反応基と、少なくとも１つのリガンド結合部分とを含んでいる。
好ましくは、本発明に従って作製した捕捉剤は、少なくとも２つのペプチドを含んでおり、上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基と、少なくとも１つの反応基と、少なくとも１つのリガンド結合部分とを含んでおり、上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および上記少なくとも１つのリガンド結合部分は、疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を形成するように、上記ペプチドの一次構造中に配置されている。
本発明に係る方法の本実施形態において、上記ペプチドの上記疎水性面が、上記付着部分を形成していることが理解される。
好ましくは、各ペプチドは、付着部分を形成している複数の疎水性アミノ酸を含んでいる。
好ましくは、本発明の本方法に用いる上記第１ペプチドは４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、６〜２５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
好ましくは、リガンド結合部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含んでいる。より好ましくは、リガンド結合部分は、複数のアミノ酸を含んでいる。
リガンド結合面に位置しているアミノ酸は、例えばアミノ酪酸残基などの疎水性残基もまた含まれていてよいことが理解される。
図１１に示すように、本実施形態に用いている各ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を含んで構成されていることが好ましい。
疎水性面および実質的な非疎水性面となるような側鎖の配置となる他のペプチド配列を容易に設計できることは、当業者によって理解される。例えば、疎水性残基の間にある３つの非疎水性アミノ酸残基、または奇数個のアミノ酸の任意の組み合わせが挙げられる。または、ペプチドは、結果として疎水性面および実質的な非疎水性面となるように、例えば、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸およびベータアミノ酸の組み合わせを含んでいてもよい。
リガンド結合面に存在するように配置されている各アミノ酸は、好ましくは、本質的に２０種未満のアミノ酸からなる群より選択され、より好ましくは、１２種未満のアミノ酸からなる群より選択され、さらに好ましくは、６種未満のアミノ酸からなる群より選択され、最も好ましくは、４種のアミノ酸からなる群より選択される。
本実施形態に用いる各ペプチドは、好ましくは、疎水性アミノ酸残基を１０％〜９０％含んでおり、より好ましくは、２０％〜８０％含んでおり、さらに好ましくは、３０％〜７０％含んでおり、最も好ましくは、４０％〜６０％含んでいる。
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、５０％の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン（norleucine）、バリン、ノルバリン（norvaline）、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンである。
好ましい実施形態においては、捕捉剤は、実質的に非疎水性であるリガンド結合面がリガンド結合に好ましいように、疎水性担体上に配置している。
本方法に用いる担体としては任意の適した疎水性担体、例えば、疎水性有機チオール処理によって修飾された金、表面処理により修飾されたガラスまたはプラスチックが使用可能であることが理解される。好ましくは、担体はプラスチックである。
または、実質上水性である溶媒の存在下において、捕捉剤を自身に固定化できる疎水性化合物によって、担体をコートしてもよい。
好ましい実施形態において、本発明の本実施形態に用いる第２ペプチドは、第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少なく、また、ペプチドと疎水性面との間の相互作用が相対的に弱くなるように、疎水性残基の数がより少なくなっている。
第１ペプチドおよび第２ペプチドの長さならびに担体上に保持されるのに必要な疎水性アミノ酸残基の数は、表面の疎水性ならびに第１ペプチドおよび第２ペプチド内の疎水性アミノ酸次第であり、また結合されるリガンドの性質にもよることは、当業者にとって明白である。
担体に保持されるペプチドの量は、担体が供される洗浄のストリンジェンシー次第であることは、当業者にとって、一見して明白である。ペプチドの固定化の後、担体を例えば、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１．０Ｍ ＮａＣｌにより洗浄することが好ましい。
第２ペプチドは、疎水性面に、好ましくは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、２〜５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、２〜４個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
好ましくは、リガンド結合残基は、実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置している。
捕捉剤が疎水性相互作用によって担体に固定化されている場合に、反応基は、第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中において、任意の適した場所に位置することができる。例えば、反応基は、一次ペプチド配列中において、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置するように、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、配置され得る。
または、反応基がペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に配置され、第１ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
さらなる実施形態では、第１ペプチドにおいては、反応基がペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置するように、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、反応基がリガンド結合部位に対して反対側の（疎水性の）面に位置するように、かつリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置され得る。
好ましい実施形態においては、図１０に示すように、第１ペプチドの反応基は、一次アミノ酸構造中において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面上、リガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、第２ペプチド中において、疎水性面中、リガンド結合部位のＮ末端側に位置している。
好ましくは本実施形態において、捕捉剤は、アレイを形成するように担体に結合している。アレイが任意の使いやすい形態をとることができることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、「高密度」アレイの全ての種類に適用できる。
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位には、異なる捕捉剤が含まれており、より好ましくは、各部位には、多コピーの捕捉剤が含まれている。
分子（例えばペプチド）の担体への固定化に関して用語「固定化した」および「付着した」は、本明細書において交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、疎水性相互作用を包含することを意図している。通常、分子（例えばペプチド）は、例えばペプチドリガンド結合を必要とする用途などに、担体の使用を意図している条件下において、担体に固定化されている状態または付着している状態にとどまりさえすればよい。
本発明の特定の実施形態では、「官能化された」不活性な担体またはマトリクス（例えばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用してもよい。この官能化は、例えば、ペプチドなどの疎水性結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域には複数のペプチド分子が含まれている。好ましくは、アレイ上の各部位には、単一のペプチドが多コピー含まれている。
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、配列番号１に示される構造を有している；
（Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｐｈｅ−Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
ここでＸ、ＹおよびＺはリガンド結合残基であり、Ｃｙｓは二量体形成に用いられる求核チオールを提供する。
第２ペプチドは、配列番号２に示される好ましい構造を有している；
ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐ−Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｙ’−Ｐｈｅ−Ｚ’−Ｐｈｅ
ここで、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はリガンド結合残基であり、ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐは二量体形成に用いられる活性化チオール（最も好ましくは、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されているチオール）である。
上記の好ましい実施形態は、例示のみを目的としており、限定して解釈すべきではないことは理解すべきである。多くの他の反応基および活性化基を本発明の方法に採用できることは、当業者にとって明白である。
最も好ましい実施形態においては、本発明の方法により作製された捕捉剤は、組み合わせが多様な二量体の、アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、適した担体上に分配される。好ましくは、ペプチドは、非接触型ディスペンサー（例えばＰｉｅｚｏｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて個々に担体上に分配され、ｉｎ ｓｉｔｕでアセンブルされる。
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の方法により作製された捕捉剤が提供される。
本発明の第３の態様によれば、第１の態様の方法により作製された少なくとも１つの捕捉剤が固定化されている、担体が提供される。
上記捕捉剤は、共有結合相互作用または疎水性相互作用によって固定化されていることが好ましい。
本発明は、本発明の方法により作製した多量体型捕捉剤と、固定化に適した担体とを含んでいるキットもまた提供する。
あるいは、キットは、本発明の方法に使用するために生成された第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでいてもよい。キットには、適した担体がさらに含まれていることが好ましい。
本発明によれば、関心のあるリガンドを結合している、本発明の方法により作製された多量体型捕捉剤の検出方法であって、上述した任意の態様に係るコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、上記リガンドが結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法もまた提供される。
任意の実施形態において、固定化したペプチドへのリガンドの結合に関して用語「結合」とは、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態においては、共有結合が好ましい。しかしながら、例えばリガンド−レセプター相互作用を必要とする用途などの、担体の使用を意図している条件下において、リガンドが、固定化されているペプチドに結合している状態に通常とどまりさえすればよい。
捕捉剤へのリガンドの結合を当該技術分野において周知であるさまざまな方法によって同定できることは、当業者にとって明白であり、例えば、リガンドが結合しているアレイ上の位置を同定できるように、リガンドまたは捕捉剤を標識してもよい。この標識は、例えば、放射性標識、または、例えば蛍光体（fluorophore）を用いた蛍光標識であり得る。または、関心のあるリガンドの捕捉剤への結合を、当該技術分野において周知の他のさまざまな技術を用いて検出してもよく、例えば、熱量測定、吸光光度法、ＮＭＲ法、原子間力顕微鏡および走査型トンネル顕微鏡を用いた方法、電気泳動またはクロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴検出、弾性表面波検出ならびにマイクロカンチレバーに基づく多くのアプローチがある。
捕捉剤が結合する特定のリガンドは、捕捉剤を形成しているペプチドの長さおよび配列によって決まるので、本発明の方法により作製した多量体型捕捉剤および多量体型捕捉剤のアレイは、選択した任意の検出物質（analyte of choice）の同定に使用できる。好ましい実施形態においては、リガンドとしては、真核細胞、原核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物または無機化合物が含まれる。リガンドは、好ましくは、生理代謝産物または薬理代謝産物であり、最も好ましくは、診断または予後医療マーカーとして用いることができる、人もしくは動物の体液中にある生理代謝産物または薬理代謝産物である。
本発明のさらなる目的、特徴および長所は、以下の記述で明らかになるであろう。さらに、本発明の利点は、図面を参照する以下の説明によって明らかになる。
〔発明を実施するための最良の形態〕
ここで使用される用語「スペーサーアミノ酸」は、側鎖がリガンド結合に関与しないアミノ酸であって、アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸類似物またはアミノ酸模倣物を意図する。
ここで使用される用語「捕捉剤」は、リガンドが当該捕捉剤に接触したとき、リガンドと結合するような構造を有する多量体分子を意図する。
ここで使用される用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸残基を含む鎖を意図し、合成アミノ酸、アミノ酸類似物、アミノ酸模倣物、またはこれらのいずれかの組み合わせを意図する。用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中において、交換可能に使用される。
ここで使用される用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、２つ以上のヌクレオチドを含む鎖を称し、本明細書中において、交換可能に使用される。
ここで使用される用語「実質的に鏡像異性的に単一」は、残基が実質的に１種類の異性体を含み、他の種類の異性体は不純物としてのみ含むことを意図する。
ここで使用される用語「リガンド結合に好ましいように配置する」は、多量体捕捉剤を形成するペプチドの側鎖が、リガンドに接触し相互作用し得るように配置することを意図する。
ここで使用される用語「実質的に非疎水性」は、疎水性残基よりも親水性残基を実質的に多く含むことを意図する。
〔実施例１〕
図１は、本発明に係る捕捉剤の生成方法の概略を示す図である。
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットはリガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望であれば、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでおり、上記反応基Ｙは合成の間は保護され、その後、使用する前に保護がはずされるものであってもよい。所望であれば、合成の間Ｚも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
次いで、群Ｄの単量体ユニットのそれぞれを、アレイ上の空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）表面と接触させ、このときに上記表面への付着にＺが用いられるようにする。
次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄ由来の表面結合単量体ユニット（Ｆ）を、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）と反応させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
図２は、本発明に係る捕捉剤のさらなる生成方法の概略を表す図である。
この実施形態においては、単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。合成の間は反応基Ｘを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
また、単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。合成の間、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）および反応基Ｙを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。所望であれば、合成の間はＺも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）のそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。次いで、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｄ）を形成するように、群（Ａ）由来の所定の固相結合単量体ユニットと、過剰量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）とを反応させる。
次いで、固相に結合している各二量体構造（Ｄ）を固体支持体から切り離し、溶液中に二量体構造（Ｅ）を得る。
二量体構造が部分Ｚを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、各液相二量体構造（Ｅ）を、最終的に、アレイの空間符号化部位にて固体表面（Ｆ）と接触させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
図に示したＸ、ＹおよびＺの位置は説明のための単なる例示であり、本発明はこれに限定されない。
図３は、第３の態様における捕捉剤のさらなる作製方法の概略を示す図である。
単量体ユニット（Ａ）の第１群を固相上に調製する。この単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ１−Ｒ４）および反応基Ｘを含んでいる。所望により、合成の間はＸを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
単量体ユニット（Ｂ）の第２群を固相上に調製する。これらの単量体ユニットは、リガンド結合部分（Ｒ’１−Ｒ’４）、反応基Ｙ、および付着部分Ｚを含んでいる。合成の間は反応基Ｙを保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。所望により、合成の間はＺも保護し、その後、使用する前に保護をはずしてもよい。
群（Ａ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｃ）を得る。
群（Ｂ）の単量体ユニットのそれぞれを、固体支持体から切り離し、溶液中に単量体ユニット（Ｄ）を得る。
次いで、二量体構造がＺを用いて固体表面（Ｆ）に付着するように、また、残基Ｘと残基Ｙとが反応して固相に結合している二量体構造（Ｇ）を形成するように、群Ｄの単量体ユニットを、過剰量または等モル量の所定の液相単量体ユニット（Ｃ）に接触させ、アレイの空間符号化部位において、固体支持体（Ｅ）の表面に接触させる。
配列され、空間符号化された二量体構造（Ｇ）は、その後、選択性および適したアフィニティをもって結合する関心のあるリガンドとの結合に使用できる。
本発明の最も重要な利点は、アレイ表面における単量体ユニットの対（またはさらに大きい数）のコンビナトリアル結合によって、配列の多様性が「二乗化」（またはさらに高い次数のべき乗化）されることである。
〔実施例２〕
有機溶媒層中または疎水性表面上におけるペプチドのセルフアセンブリを実証するために、以下の一連のペプチドを合成した。ペプチドのセルフアセンブリは、上記有機溶媒層または疎水性表面に接触する水溶性溶媒中において、エントロピー効果により引き起こされる。
全てのペプチドのＮ末端を、ローダミン色素ＴＡＭＲＡで標識した。５−ＴＡＭＲＡおよび６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を標識に用いた。
Figure 0004750187
 以下では、紙面の前に突き出す残基の側鎖は、組み合わせ多様な「リガンド結合面」に相当する。紙面の後ろへ突き出す残基の側鎖は、「疎水性面（あるいはネガティブコントロール残基）」に相当する。
ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−８の群において、４つの側鎖（アスパラギン酸、アラニン、セリン、およびリシン）の混合物を用いた。ペプチド２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１６の群において、４つの親水性（アスパラギン酸）の鎖を用いた。
ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−４の群、およびペプチド２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１２の群において、５残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−５〜２ＤＯＳ−８の群、およびペプチド２ＤＯＳ−１３〜２ＤＯＳ−１６の群において、３残基の側鎖を「疎水性面（またはネガティブコントロール残基）」に用いた。
ペプチド２ＤＯＳ−１、２ＤＯＳ−５、２ＤＯＳ−９、および２ＤＯＳ−１３においては、ノルロイシン残基を「疎水性面」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−２、２ＤＯＳ−６、２ＤＯＳ−１０、および２ＤＯＳ−１４においては、フェニルアラニン残基を「疎水性面」に用いた。ペプチド２ＤＯＳ−３、２ＤＯＳ−７、２ＤＯＳ−１１、および２ＤＯＳ−１５においては、セリン残基を、「疎水性面」に対する弱いネガティブコントロールとして用いた。ペプチド２ＤＯＳ−４、２ＤＯＳ−８、２ＤＯＳ−１２、および２ＤＯＳ−１６においては、アスパラギン酸残基を、「疎水性面」に対する強いネガティブコントロールとして用いた。
Figure 0004750187
Figure 0004750187
Figure 0004750187
 標準ＦＭＯＣ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ペプチドを２μｍｏｌスケールで合成し、５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中に１０μＭになるように溶解した。
疎水性面（ポリプロピレンマイクロタイタープレートのウェル）上におけるペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６の保持を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）水溶性アセトニトリル中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
１０μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６および１０μＭのＴＡＭＲＡを、１００μｌずつ等分し、図１３に示すように、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウェルに入れた。
このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さ（scan height）を＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
ペプチドが乾燥するように、一晩中暗所で蒸発乾燥させ、マイクロタイタープレートを再び上述したようにスキャニングした。
次いで、２５０μＬの水でウェルを１０回洗浄した。
残りの表面結合ペプチドを、最後に、１００μｌの、５０％(ｖ／ｖ)アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、マイクロタイタープレートを、再び、上述したようにスキャニングした。
蛍光画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
３回の実験で得られた、６００Ｖ、５００Ｖ、４００Ｖおよび３００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図１４に示す。
定量化データ（４００Ｖでスキャンしたときのデータを用いた）を表２に示し、グラフを図１５に示した。
Figure 0004750187
 この結果は、フェニルアラニン残基は、ノルロイシン残基よりも強い保持を引き起こすことを示している。この結果は、さらに、５つの疎水性「アンカー残基」を有するペプチドの方が、３つの疎水性「アンカー残基」を有する同等ペプチドよりもよく保持されることを示している。リガンド結合残基を、アスパラギン酸、アラニン、セリンおよびリシンから、４つのアスパラギン酸残基が連続したものに変更すると、ポリプロピレン表面における保持の低下が引き起こされる。
表３に示すペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびペプチドＰ２−１〜Ｐ２−２の、ポリプロピレン表面における保持を調べるために、さらなる実験を行った。
Figure 0004750187
 ポリプロピレンシートを、使用前に５０％(ｖ／ｖ)アセトニトリル水溶液を用いて拭いた。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５ １μＭ、およびペプチドＰ２−１〜Ｐ２−２ １μＭ、ならびにＴＡＭＲＡ １μＭの、８×複製２０ｎｌ量を、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ)を用いて、１ｍｍ間隔で、３”×１”×１ｍｍポリプロピレンシートに分注した。「サイドシュート」オプションを用いて、前もって５００滴分注した。また、チューニングを３０μｓ、７２Ｖに設定した。
このスライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。このとき、６００ＶのＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテン（platen）に設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
スライドの下半分（テストアレイを含む）を１０ｍＭ ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０)を含む１００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ中で１分間洗浄し、上述したように再スキャニングした。
同じスライドの半分を、１０ｍＭ ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む１００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ中で３０分間、２回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
同じスライドの半分を、１００ｍｌの水で３０分間、３回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
様々なアレイの蛍光画像を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
図１６Ａおよび図１６Ｂに示した、配列した様々なペプチドからの蛍光値を、以下の表４〜６に示す。
１回目の洗浄後のデータを表４ａおよび４ｂに示す。
Figure 0004750187
Figure 0004750187
 ２回目の洗浄後のデータを表５ａおよび表５ｂに示す。
Figure 0004750187
Figure 0004750187
 ３回目の洗浄後のデータを表６ａおよび表６ｂに示す。
Figure 0004750187
Figure 0004750187
 これらの結果をグラフ化し、図１７に示す。
この図は、ペプチド鎖長の増加に伴ってペプチドの保持が増加することを明確に示している。明確に示すように、１９アミノ酸の鎖長を有するペプチドＰ１−５が、最も高い保持を有する。
〔実施例３〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着させたペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）のｐＨ耐性を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、ペプチド２ＤＯＳ−２を、５０μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウェル中で乾燥させた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
最初の１１ウェル中にある乾燥したペプチドサンプルを、表３に示すスキームにしたがって、２００μｌの１００ｍＭ リン酸緩衝液中で、室温にて３０分間インキュベートした。
Figure 0004750187
 上清を全てピペットで吸い取り、１２ウェルの全てにおいて残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌに再懸濁した。そして、このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレン上に付着した２ＤＯＳ−２のｐＨ耐性を示す蛍光画像を、図１９に示す。
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表８に示し、グラフ化したものを図１９に示す。
Figure 0004750187
 この結果は、ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、幅広いｐＨ範囲において安定しており、低ｐＨおよび高ｐＨにおいて保持が最大となり、おおよそｐＨ６．５で保持が最小となることを示している。
〔実施例４〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）の時間依存持続性を、水性バッファーの存在下で、以下に示すように調べた。
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、５μＭのペプチド２ＤＯＳ−２を、１００μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートの上部横列のウェルに分注した。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
ウェル１〜１０中で乾燥させたペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、２５０μｌの１Ｍ ＮａＣｌと共に、以下に示す時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、全ての上清を、ピペットにより８回出し入れし、その後取り出して、マイクロタイターの下横列のウェルに入れた。
１２ウェル全てに残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０μｌ中に再懸濁し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０ フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２の、水性バッファー存在下における時間依存持続性に対する蛍光データを、図２０に示す。
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表９および図２１に示す。
Figure 0004750187
 この結果は、疎水性ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中への懸濁時間を増加させても、安定であることを示している。
〔実施例５〕
異なる形状のポリプロピレンウェル上における、ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６（上記参照）の保持を調べた。
５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
１０μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６、および１０μＭのＴＡＭＲＡを、１μｌずつ等分し、図２２に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒ平底ポリプロピレンマイクロタイタープレートにピペットで入れた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
マイクロタイタープレートの上部横２列のペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２５０μｌの１Ｍ ＮａＣｌ中で、室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウェル中で、洗浄バッファーをピペットにて８回出し入れした。
洗浄ペプチドサンプルおよび非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ＰＭＴ電圧６００Ｖおよび５００Ｖにおいてスキャニングしたプレートの蛍光画像を、図２３に示す。
Ｖ底ウェルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１０および図２４に示す。
Figure 0004750187
 平底ウェルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１１および図２５に示す。
Figure 0004750187
 この結果は、異なる形状のポリプロピレンウェル上における、ペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６の保持は同等であり、ペプチドの保持は、Ｖ底形状のウェルでの乾燥に依存しないことが示している。
〔実施例６〕
ポリプロピレンおよびポリスチレン表面におけるペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６（上記参照）の保持を比較した。
７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチドおよびＴＡＭＲＡのための溶媒として用いた。
５μＭのペプチド２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６、および５μＭのＴＡＭＲＡを、２０μｌずつ等分し、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｖ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、およびＧｒｅｉｎｅｒ Ｖ底ポリスチレンマイクロタイタープレートに、図２６に示すスキームに従って、ピペットで入れた。
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で蒸発乾燥させた。
マイクロタイタープレートの横列の上部２列におけるペプチドサンプルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２５０μｌの１Ｍ ＮａＣｌ中において、１５分間、室温でインキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウェル中において、ピペットで８回洗浄バッファーを出し入れした。
洗浄および非処理のペプチドサンプルを、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準解像度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
６００Ｖ、５００Ｖおよび４００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたスライドの蛍光画像を図２７に示す。
プレートの上側半分のペプチドサンプルを洗浄し、プレートの下側半分のペプチドサンプルを非処理とした。
ＣｏｓｔａｒポリプロピレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１２に示す。
Figure 0004750187
 ＧｒｅｉｎｅｒポリプロピレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１３に示す。
Figure 0004750187
 ＧｒｅｉｎｅｒポリスチレンＶ底ウェルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１４に示す。
Figure 0004750187
 これらのグラフを図２８に示す。
この結果は、３つの全ての表面において、同様のペプチドの挙動が見られることを示しており、さらに、保持は、ある特定のプラスチック表面に特有の性質というよりもむしろ、ペプチドの配列特異的な性質であることを示している。
〔実施例７〕
７つのフェニルアラニン残基からなる「表面結合面」を有する４つのペプチドを合成した。これらのペプチドはまた、帯電残基および非帯電残基からなる中央領域と、末端から２番目の可変残基とを有している。末端から２番目の可変残基は、アラニン、セリン、システイン、またはニトロピリジルチオ活性化システイン残基である。
さらに、ＴＡＭＲＡ標識した４つの蛍光ペプチドもまた合成した。これらの蛍光ペプチドは、可変Ｃ末端残基に結合しているグリシン残基に結合しているＮ末端ＴＡＭＲＡ蛍光体を含んでいる。可変Ｃ末端残基は、アラニン、セリン、システイン、またはニトロピリジルチオ活性化システイン残基である。
実施例１に示した５−ＴＡＭＲＡ異性体および６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を標識として用いた。
８つのペプチドの全ての群を表１５および１６に示す。
Figure 0004750187
Figure 0004750187
 ペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−４、およびペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４を二量体形成の調査に用いた。
２つの異なるプロトコールを使用した。「液相」プロトコールでは、ＳＢペプチドをポリプロピレン表面上で乾燥させた。次いで、水溶液中にＴＬＳＰペプチドを添加した後、ウェルを洗浄して、保持された蛍光材料を分析した。
「共乾燥」プロトコールでは、ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを混合し、これらの両方をポリプロピレン表面上で共に乾燥させた後、ウェルを洗浄し、保持された蛍光材料を分析した。
ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを水溶液中で混合して、ペプチド二量体を生成させるために反応させ、ポリプロピレン表面上で乾燥させる、さらに他のプロトコールは、当業者により容易に行い得る。
「液相」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのＳＢ−１ペプチド〜ＳＢ−４ペプチド ５０μｌを、表１７に示す配列に従って、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
Figure 0004750187
 サンプルを一晩、暗所にて乾燥させた。１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４ ５０μｌを、表１８に示すスキームに従って、ウェルに添加した。
Figure 0004750187
 サンプルを室温で１時間、暗所にてインキュベートした。上清を除去し、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２００μｌの１Ｍ ＮａＣｌを用いて、ウエルを２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、最後にウェルに添加した。
マイクロタイタープレートをＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
「共乾燥」プロトコールでは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−４ ５０μｌを、表１９に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ Ｖ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
Figure 0004750187
 ５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４ ５０μｌを、表２０に示すスキームに従って、ウェルに添加した。
Figure 0004750187
 サンプルを一晩、暗所で乾燥させた。
ウェルを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、２００μｌの１Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の、５０μｌの１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、最後にウェルに添加した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ＢＰ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
「液相」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図２９Ａに示す。
「液相」プロトコールにより得られた蛍光データを表２１に示す。
Figure 0004750187
 結果をグラフ化し、図２９Ｂに示す。
「共乾燥」プロトコールを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図３０Ａに示す。
「共乾燥」プロトコールにより得られた蛍光データを表２２に示す。
Figure 0004750187
 結果をグラフ化し、図３０Ｂに示す。
ポリプロピレン表面と蛍光標識したペプチドとの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下で、蛍光標識されたペプチドの保持によって、二量体の収率を分析した。
「液相」プロトコールにおける二量体の収率は、「共乾燥」プロトコールにおける二量体の収率よりも低いが、二量体の化学特異性はより優れていた。最大となる二量体形成は、表面ペプチドが遊離チオール基を有するとき、および溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに観察された。表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときの二量体形成、表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するときの二量体形成、および表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するときの二量体形成も観察された。
遊離チオールによる遊離チオールへの結合は、ジスルフィド結合を形成する、単純な好気性酸化によるものであってよい。Ｓ−ニトロピリジル活性チオールによるＳ−ニトロピリジル活性チオールへの結合は、残りのＳ−ニトロピリジル活性チオールと反応し得るいくつかの遊離チオールを残すような、不完全なチオール活性の結果によるもの、またはいくつかの他のメカニズムによるものであってもよい。
「共乾燥」プロトコールの結果は、上述した結果に酷似している。この方法においては、二量体の収率は徐々に高くなるが、非特異的結合もまた高くなる。特に、表面に付けられたヒドロキシル化ペプチドと、遊離チオール基およびＳ−ニトロピリジル活性チオール基の両方を含む溶液ペプチドとの間で、いくつかの反応性が観察された。
〔実施例８〕
本実施例では、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）非接触ディスペンサーを用いて、平面プラスチック表面上においてペプチド二量体を形成した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）は、高密度アレイに、ナノリットル量をピペットで移すように厳密に設計されている。液量を、圧電性電動チップにより制御した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムは、ソースプレートホルダー、超音波ウォッシュボウル、コンピュータおよびモニタならびにシステム液体ボトルを含む。
ポリプロピレンシートをＳＢＡプラスチック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂａ．ｃｏ．ｕｋ／， Ｐｒｏｐｙｌｅｘ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｓｈｅｅｔ ２４４０×１２２０×１ｍｍ）から得た。このポリプロピレンシートを、使用前に、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液によりふき取った。
表２３に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中またはコントロール溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのペプチドＳＢ−１〜ＳＢ−３ ５ｎｌの６つの１０×１０アレイを、３”×１”にカットされた１ｍｍポリプロピレンシートに、分配した。
Figure 0004750187
 表２４に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中、あるいは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中のいずれかにおける、１００μＭのペプチドＴＬＳＰ−４ ５ｎｌの６つの１０×１０アレイを、上記スポット上に分配した。
Figure 0004750187
 サンプルを室温で３０分間、暗所においてインキュベートした。スライドを、１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、１００ｍｌの５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、スライド上に水道水を１分間流した。
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧４００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中、サンプルを加圧した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
ポリプロピレンスライドの蛍光画像を図３１に示した。
ポリプロピレン表面および蛍光標識したペプチドの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在下にて、蛍光標識したペプチドの保持によって、二量体収率を分析した。
表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに、二量体形成が観察された。単純なプロトコール（蒸発を防ぐためのグリセロールなしで）により、より高い二量体収率が得られた。
〔実施例９〕
本実施例では、ペプチドＬ１−Ｐ１−１〜Ｌ１−Ｐ１−１６、およびペプチドＬ１−Ｐ２−１〜Ｌ１−Ｐ２−１６を含む二量体の、２０個の２５６成分マイクロアレイ（256-element microarrays）を、同時に作製した。
１ｍｍポリプロピレンシートを、１３６ｍｍ×８０ｍｍにカットし、グラスペーパーで軽く研磨し、使用前に５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液でふき取った。
Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて、表２５に示すように、Ｐ１ペプチドの１８×６ｎｌ等分を、０．７２ｍｍ間隔にて、ポリプロピレンスライドの縦列に配列した。
Figure 0004750187
 ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）
ＴＣＥＰ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（tris (2-carboxyethyl) phosphine）
Ｐ１ペプチドの配列：
P1-5 TAMRA-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Phe-Ala-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-1 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-2 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-3 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-4 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-5 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-6 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-7 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-8 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-9 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-10 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-11 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-12 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-13 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-14 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-15 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-16 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥させた後、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ）を用いて、表２６に示すように、０．７２ｍｍ間隔にて、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、１ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＬ１−Ｐ２ペプチドの１８×１２ｎｌ等分を、ポリプロピレンスライドの横列に沿って配列した。
Figure 0004750187
 Ｐ２ペプチドの配列：
L1-P2-1 CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-2 CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-3 CysSTP-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-4 CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-5 CysSTP-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-6 CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-7 CysSTP-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-8 CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-9 CysSTP-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-10 CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-11 CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-12 CysSTP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-13 CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-14 CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-15 CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-16 CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-17 TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-18 TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-19 TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-20 TAMRA-CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥した後、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ５０ｍｌ中で、スライドを１０分間洗浄した。
スライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザーおよび５８０ ＢＰ ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ｖ２００３．０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
二量体の１枚の１８×１８アレイの蛍光画像およびコントロールスポットを図３２に示す。
配列させて分配した各Ｌ１−Ｐ１ペプチドの縦列の蛍光シグナルを観察することができる。この結果は、Ｌ１−Ｐ１ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示している。また、配列させて分配したＬ１−Ｐ２ペプチドの横列の蛍光シグナルも観察することができる。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示している。
Ｌ１−Ｐ１ペプチドのチオール基と競合（compete）する、非標識Ｐ２ペプチドおよびＴＡＭＲＡ標識されたＰ２ペプチドの両方を用いて作製された１６×１６アレイの二量体蛍光と比較して、ＴＡＭＲＡ標識したＰ２ペプチドのみを有するサンプルの二量体蛍光はより強かった。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドは全て、ＴＡＭＲＡ標識されたそのカウンターパートと首尾よく競合し、それゆえに、１６個の全てのＬ１−Ｐ１ペプチドと、１６個の全てのＬ１−Ｐ２ペプチドとの間で、首尾よくペプチド二量体が形成されることを示している。
上述した本発明は、同様の方法が、多くの方法に変更され得ることは明確である。このような変更は発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとって明白なこのような変更のすべてが、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本発明は、配列多様性が増大した合成捕捉剤を提供する。本発明に係る捕捉剤は、例えばガラスまたはシリコンのような様々な表面を機能化し得るので、上記表面へのリガンド結合を可能にし、または様々な種類のアレイを形成する。
本発明に係る捕捉剤の第１の作製方法の概略を示す図である。 本発明に係る捕捉剤の第２の作製方法の概略を示す図である。 本発明に係る捕捉剤のさらなる作製方法の概略を示す図である。 様々な反応基を含むペプチドを形成するための可能な経路を示す図である。 Ｌ型アミノ酸とＤ型アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。 ベータアミノ酸を含むペプチドを示す図である。 一アミノ酸おきにアミノ酸が異なるペプチドを示す図である。 Ｎ末端システインを保持する捕捉剤とチオエステル誘導化表面との間のネイティブケミカルライゲーションの方法を模式的に示す図である。 チオエステル官能化ガラスを調製するための好ましい反応スキームを示す図である。 担体表面に二量体型捕捉剤を調製するための好ましい反応スキームを示す図である。 疎水性アミノ酸と非疎水性アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。 疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する二量体型捕捉剤の一例を示す図である。 ９６ウェルプレート中のさまざまな疎水性捕捉剤の場所を示す図である。 ウェル中に様々なペプチドがあることを示している、図１１の９６ウェルプレートの蛍光画像を示す図である。 図１４の４００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。 ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。 ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。 図１６Ａおよび図１６Ｂを定量化した結果を示すグラフである。 ポリプロピレン疎水性表面上に分配したペプチド２ＤＯＳ−２のｐＨ抵抗性を示す蛍光画像である。 図１８の３００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。 水性バッファー存在下における、ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２の時間依存持続性を示す蛍光画像である。 図２０の３００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 平底９６ウェルプレートおよびＶ底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。 洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図２２のプレートの蛍光画像である。 図２３のＶ底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 図２３の平底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。 ポリプロピレンおよびポリスチレンＶ底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。 洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図２６のプレートの蛍光画像である。 図２６のポリプロピレンプレートおよびポリスチレンプレートにおける、洗浄後のさまざまなペプチドの保持率をパーセント表示したグラフである。 「液相」プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。 表２１に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。 「共乾燥」プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。 表２２に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。 ポリプロピレンシート上における二量体形成を示す蛍光画像である。 ペプチド二量体の２５６成分マイクロアレイの蛍光画像である。

Claims (36)

  1. リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、
    上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、
    上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、
    上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、
    上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、
    以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含んでおり、
    （ａ）上記第１単量体ユニットにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程、
    （ｂ）上記付着部分を介して、上記第１単量体ユニットを担体上に固定化する工程、
    工程（ａ）は、工程（ｂ）よりも前に、または工程（ｂ）と同時に、または工程（ｂ）の後におこなわれ、
    上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットはそれぞれ、第１ペプチドおよび第２ペプチドであり、
    上記第１ペプチドは、
    （i）X1-R-X1-X2-X1-X3、
    （ii）X1-R-X1-X2-X1-X3-X1-X4、または
    （iii）X1-R-X1-X2-X1-X3-X1-X4-X1-X5
    で表されるアミノ酸配列を有しており、
    X1は、疎水性アミノ酸であり、Rは第１反応基を含むアミノ酸であり、X2〜X5はリガンド結合残基であり、
    上記第１反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする作製方法。
  2. リガンド結合用多量体型捕捉剤の作製方法であって、
    上記捕捉剤は、少なくとも第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでおり、
    上記第１単量体ユニットは、第１リガンド結合部分、第１反応基および付着部分をさらに含んでおり、
    上記第２単量体ユニットは、第２リガンド結合部分および第２反応基をさらに含んでおり、
    上記第１反応基および第２反応基は、互いに同じか、または互いに異なるものであり、
    上記第１単量体ユニットにある反応基と第２単量体ユニットにある反応基とが反応して多量体型捕捉剤を形成するように、上記第１単量体ユニットと上記第２単量体ユニットとを反応させる工程を含んでおり、
    上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットはそれぞれ、第１ペプチドおよび第２ペプチドであり、
    上記第１ペプチドは、
    （i）X1-R-X1-X2-X1-X3、
    （ii）X1-R-X1-X2-X1-X3-X1-X4、または
    （iii）X1-R-X1-X2-X1-X3-X1-X4-X1-X5
    で表されるアミノ酸配列を有しており、
    X1は、疎水性アミノ酸であり、Rは第１反応基を含むアミノ酸であり、X2〜X5はリガンド結合残基であり、
    上記第１反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする作製方法。
  3. 上記多量体型捕捉剤を、上記付着部分を介して担体上に固定化する工程をさらに含んでいることを特徴とする請求項２に記載の作製方法。
  4. 少なくとも上記第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットは、合成されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の作製方法。
  5. 第１ペプチドおよび第２ペプチドは、それぞれ、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から生成されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の作製方法。
  6. 上記第１アミノ酸群と第２アミノ酸群とは、異なるものであることを特徴とする請求項５に記載の作製方法。
  7. 各アミノ酸残基は、実質的に鏡像異性的に単一であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の作製方法。
  8. 実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、２０種未満のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の作製方法。
  9. 実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、４種のアミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の作製方法。
  10. 実質的に鏡像異性的に単一である各アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸または他のキラルアミノ酸単量体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の作製方法。
  11. 実質的に鏡像異性的に単一である上記アミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の作製方法。
  12. 上記第１ペプチドおよび第２ペプチドは、互いに異なるアミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の作製方法。
  13. 上記第２ペプチドは、２〜５０個のアミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の作製方法。
  14. 上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジン活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の作製方法。
  15. 上記反応基は、チオール基であることを特徴とする請求子１〜１４の何れか１項に記載の作製方法。
  16. 上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項１〜１５の何れか１項に記載の作製方法。
  17. 上記捕捉剤は、上記担体に共有結合していることを特徴とする請求項１〜１６の何れか１項に記載の作製方法。
  18. 上記ペプチドは、上記捕捉剤のリガンド結合領域において、１アミノ酸おきにのみアミノ酸が異なるように合成されていることを特徴とする請求項１〜１７の何れか１項に記載の作製方法。
  19. 上記第２ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を含んでおり、
    上記疎水性アミノ酸残基および上記リガンド結合部分は、疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する捕捉剤を形成するように、上記ペプチドの一次構造中に配置されていることを特徴とする請求項１〜１６の何れか１項に記載の作製方法。
  20. 上記第２ペプチドの上記疎水性面が、上記付着部分を形成していることを特徴とする請求項１９に記載の作製方法。
  21. 第２ペプチドは、上記付着部分を形成している複数の疎水性アミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項１９または２０に記載の作製方法。
  22. 上記第２ペプチドは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項１９〜２１の何れか１項に記載の作製方法。
  23. 上記疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜２２の何れか１項に記載の作製方法。
  24. 上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１〜２３の何れか１項に記載の作製方法。
  25. 上記第２ペプチドは、１０個以下のリガンド結合残基を含んでいることを特徴とする請求項１〜２４の何れか１項に記載の作製方法。
  26. 上記第１ペプチドは、配列番号１に示される配列を有していることを特徴とする請求項１〜２５の何れか１項に記載の作製方法。
  27. 上記第２ペプチドは、配列番号２に示される配列を有していることを特徴とする請求項１９〜２６の何れか１項に記載の作製方法。
  28. 上記捕捉剤は、上記担体上にてアセンブルされていることを特徴とする請求項１〜２７の何れか１項に記載の作製方法。
  29. 請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法によって生成される多数の捕捉剤が固定化されているアレイを作製する作製方法であって、
    アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法により生成した捕捉剤を、適した担体上に供給する工程を含むことを特徴とするアレイの作製方法。
  30. 上記アレイが個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることを特徴とする請求項２９に記載のアレイの作製方法。
  31. 上記アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項２９または３０に記載のアレイの作製方法。
  32. 上記アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれていることを特徴とする請求項３１に記載のアレイの作製方法。
  33. 関心のあるリガンドに結合している多量体型捕捉剤の検出方法であって、
    請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法により生成したコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、
    上記関心のあるリガンドを上記アレイに接触させる工程と、
    上記リガンドが結合している捕捉剤を検出する工程と、を含むことを特徴とする検出方法。
  34. 請求項２、４〜１６の何れか１項に記載の方法により生成した多量体型捕捉剤と、固定化に適した担体とを含んでいることを特徴とするキット。
  35. 請求項１、２、４〜１６の何れか１項に記載の方法により生成した第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットを含んでいることを特徴とするキット。
  36. 適した担体をさらに含んでいることを特徴とする請求項３５に記載のキット。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
US9188584B2 (en) 2008-06-18 2015-11-17 California Institute Of Technology Capture agents and related compositions, methods and systems
CN107759799B (zh) * 2017-09-21 2020-10-23 中山大学 一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0279975A (ja) * 1988-09-16 1990-03-20 Matsushita Electric Ind Co Ltd タンパク質固定化法
JPH04506511A (ja) * 1989-03-20 1992-11-12 ラ　ホヤ　キャンサー　リサーチ　ファウンデーション 接着性ペプチドのための疎水性結合部分
JP2001131208A (ja) * 1999-09-01 2001-05-15 Affymetrix Inc 重合性ブラシにおける高分子のアレイおよびそれを調製するための方法
JP2003284552A (ja) * 2002-03-28 2003-10-07 Hitachi Software Eng Co Ltd イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法
WO2005014615A2 (en) * 2003-06-25 2005-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof
JP2005519579A (ja) * 2001-04-26 2005-07-07 アヴィディア リサーチ インスティテュート 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
JP2005524057A (ja) * 2002-04-25 2005-08-11 へリックス バイオファーマ コーポレイション マルチサブユニット複合体のためのタンパク質相互作用系

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5200526A (en) * 1987-04-27 1993-04-06 The Governors Of The University Of Alberta Syntheses of optically pure α-amino acids from 3-amino-2-oxetanone salts
CA1337639C (en) * 1989-08-01 1995-11-28 Joseph Eugene Celebuski Dna probe assay using neutrally charged probe strands
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
ES2145044T3 (es) * 1992-02-13 2000-07-01 Surmodics Inc Inmovilizacion de especies quimicas en matrices reticuladas.
JP3329868B2 (ja) * 1992-09-30 2002-09-30 株式会社クラレ ペプチドおよびこれを担体上に固定化してなる吸着剤
US5491074A (en) * 1993-04-01 1996-02-13 Affymax Technologies Nv Association peptides
WO1995016788A1 (en) * 1993-12-17 1995-06-22 Cubicciotti Roger S Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices
AU695450B2 (en) * 1994-01-19 1998-08-13 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Peptomers with enhanced immunogenicity
US5738996A (en) * 1994-06-15 1998-04-14 Pence, Inc. Combinational library composition and method
US5824483A (en) * 1994-05-18 1998-10-20 Pence Inc. Conformationally-restricted combinatiorial library composition and method
US5549748A (en) * 1995-01-12 1996-08-27 University Of Chicago Method for harvesting single crystals from a peritectic melt
US5780221A (en) * 1995-05-03 1998-07-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Identification of enantiomeric ligands
US6083708A (en) * 1995-08-11 2000-07-04 Dade Behring Inc. Polypeptide: dendrimer complexes
IL126581A (en) * 1996-04-25 2004-03-28 Pence Inc Biosensor for detecting a binding event between a ligand and ligand-binding receptor
US6130037A (en) * 1996-04-25 2000-10-10 Pence And Mcgill University Biosensor device and method
US6165335A (en) * 1996-04-25 2000-12-26 Pence And Mcgill University Biosensor device and method
US5955379A (en) * 1996-04-25 1999-09-21 Mcgill University Biosensor device and method
US6107080A (en) * 1996-04-25 2000-08-22 Mcgill University Biosensor device and method
US6709814B1 (en) * 1998-04-02 2004-03-23 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Peptides causing formation of compact structures
US7115396B2 (en) * 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6787368B1 (en) * 1999-03-02 2004-09-07 Helix Biopharma Corporation Biosensor method for detecting analytes in a liquid
IL147970A0 (en) * 1999-08-09 2002-09-12 Tripep Ab Pharmaceutical compositions containing tripeptides
US8143195B2 (en) * 2000-01-24 2012-03-27 Yingjian Wang Arrays for bringing two or more reagents in contact with one or more biological targets and methods for making and using the arrays
US7429466B2 (en) * 2000-01-24 2008-09-30 Hypromatrix, Inc Methods and arrays for detecting biological molecules
US6827579B2 (en) * 2000-11-16 2004-12-07 Rutgers, The State University Of Nj Method and apparatus for rehabilitation of neuromotor disorders
WO2002064619A2 (en) * 2001-02-09 2002-08-22 Massachusetts Institute Of Technology Peptides that inhibit poly-glutamine aggregation
JP4408628B2 (ja) * 2001-03-09 2010-02-03 ボストン プローブス，インコーポレイテッド 組み合わせオリゴマーならびにそれらの調製のためのライブラリーに適する、方法、キット、および組成物
US20040175756A1 (en) * 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20030157561A1 (en) * 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) * 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20060223114A1 (en) * 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20050053973A1 (en) * 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20030143576A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-31 Heman Chao Method and device for integrated protein expression, purification and detection
JP2005504309A (ja) * 2001-10-01 2005-02-10 ワン，インジアン 生体分子を検出する方法およびアレイ
AU2002364207A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Applera Corporation Heteroconfigurational polynucleotide and methods of use
US20040043508A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-04 Frutos Anthony G. Polymer-coated substrates for binding biological molecules
MXPA05006836A (es) * 2002-12-22 2005-08-16 Scripps Research Inst Colecciones ordenadas de proteinas.
US20060292438A1 (en) * 2002-12-23 2006-12-28 Applera Corporation; Applied Biosystems Group Heteroconfigurational Polynucleotides and Methods of Use
US20050164301A1 (en) * 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
US20060008844A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0279975A (ja) * 1988-09-16 1990-03-20 Matsushita Electric Ind Co Ltd タンパク質固定化法
JPH04506511A (ja) * 1989-03-20 1992-11-12 ラ　ホヤ　キャンサー　リサーチ　ファウンデーション 接着性ペプチドのための疎水性結合部分
JP2001131208A (ja) * 1999-09-01 2001-05-15 Affymetrix Inc 重合性ブラシにおける高分子のアレイおよびそれを調製するための方法
JP2005519579A (ja) * 2001-04-26 2005-07-07 アヴィディア リサーチ インスティテュート 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
JP2003284552A (ja) * 2002-03-28 2003-10-07 Hitachi Software Eng Co Ltd イオン性高分子同定用高分子チップ及びイオン性高分子の同定方法
JP2005524057A (ja) * 2002-04-25 2005-08-11 へリックス バイオファーマ コーポレイション マルチサブユニット複合体のためのタンパク質相互作用系
WO2005014615A2 (en) * 2003-06-25 2005-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof

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