JPH04506511A - 接着性ペプチドのための疎水性結合部分 - Google Patents
接着性ペプチドのための疎水性結合部分Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
接着性ペプチドのための疎水性結合部分λ丑旦!盈
本発明はペプチド、特に固体基質への結合を促進する疎水性領域を持つペプチド
に関する。
種々のアッセイおよび精製法は、ペプチドのようなリガンドが固体の支持体に固
定化されることを必要とする。一般に2つの方法がそのような固定化に使用され
てきた。ペプチドを溶液として表面に付与した後、蒸発させ、乾燥したペプチド
を表面に残す。そのような非特異的結合は小さいペプチドには非効率的であり、
高濃度の固定化ペプチドを必要としない場合にのみ適用可能であり、その多くが
溶液中で再び可溶化される。さらに、非特異的結合であるためペプチドはランダ
ムにさまざまな方向に結合する。特定の活性部分の提示が重要な場合、そのよう
な変化はさらに結合ペプチドの特異性を低下させ得る。
さらに一般的な二段階化学結合法では、固体表面はまず、イムノグロブリンまた
は生血溝アルブミンのような大きなタンパク質で受動的にコートされる。N−サ
クシニミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネートまたはグルタルアルデ
ヒドのような異種二官能性架橋剤が、タンパク質に結合され溶液中のペプチドを
捕捉するのに使用される。そのような方法は時間を浪責するが、現在、例えば高
濃度の結合ペプチドを必要とする細胞培養法などに使用されている。
現在では多くの細胞間相互作用および細胞−マトリ。7クス間相互作用が1種々
の接着性タンパク質に共通のアルギニンーグリシンーアスパラギン酸のアミノ酸
領域(Arg−Gly−AspまたはRGD)に媒介されることがわかっている
。この結合部分はレセプターに認識される。そのような領域を持つ合成ペプチド
は、組織培養プレートまたは人工器官のコーティング、およびカラム上での接着
レセプターの精製を目的とする固定化を含む種々の方法に使用される得る。RG
D含有ペプチドを固体基質に結合させるには他のペプチドと同様の問題点がある
。さらに、接着領域が小さいため、スペーサー基を用いてトリペプチドをコート
されるべき面から離して該領域がリガンドに近づき得るようにすることが重要で
ある。例えば人工器官とともにコーティングがインビボで使用される場合には、
さらに免疫原性および細胞毒性がないことが重要である。
そこで固体表面にRGD含有ペプチドのようなペプチドを一工程で結合させる迅
速で再現性のある方法が必要となってくる。
理想的には、そのような方法は簡単で効果的であるべきである。ざらにRGD領
域のような重要なエピトープが適当に提示されることが好ましい。本発明はこれ
らの必要性を満たし、一連の利点を提供する。
及匪立!且
本発明は例えばRGD含有接着性ペプチドなどの生物学的に活性な部位を持つペ
プチドを、疎水性領域を介して固体面に結合させる方法、およびそのようにして
結合されたペプチドを提供する。疎水性領域は、ロイシン、バリン、イソロイシ
ンまたはフェニルアラニンのような疎水性アミノ酸;または例えばミリスチン酸
、パルミチン酸、アラ牛トン酸のような脂肪酸または他の脂肪酸;あるいは疎水
性成分のいずれかを含み得る。さらに、疎水性領域と生物活性領域との間のアミ
ノ酸などのスペーサーは生物活性部位の提示を改善する。本発明の特異的ペプチ
ドは次のものを含む。
GRGDSPASSKGJSRLsRNH2;GRGDSPASSKS3RL8
RNH2;およびGRGDSPASSKSSKRL’、RNH2固体表面に結合
させると、そのようなペプチドは生物活性部分に相捕的なりガントの存在の検出
に利用され得る。
及豆旦毘亙呈鳳里
本発明は、ペプチドの固体表面への結合を促進させるために、疎水性アミノ酸ま
たは脂肪酸のような疎水性領域をペプチドに使用することに関する。疎水性領域
を用いて合成ペプチドを特異的に結合させるそのような方法は広範な合成ペプチ
ドを多様な表面に局在させるのに有用である。本方法はRGD含有接着性ペプチ
ドの特定の使用法である。この方法は、通常の二工程の化学結合法を省略するも
のであり、特異的レセプターおよび特異的なタイプの細胞の両方に結合するRG
D活性部分を提示する迅速で再現性のある方法を提供する。さらにコーティング
は比較的、免疫原性および細胞毒性がなく、特に天然に存在するアミノ酸および
脂肪酸が使用された場合にほそうである。
1?GDがファイプロネクチンのような種々の細胞外マトリックスタンパク質の
結合部分を構成するごとが知られている。基質にコートされたRGD含有ペプチ
ドは細胞の接着を促進する。
あるいは、溶液の形態ではRGD含有ペプチドは細胞の基質への接着を抑制し、
あるいは基質からの脱着を促進する。アルギニン基はDまたはL型で有り得る。
アメリカ合衆国特許第4578079号、4616517号および479252
5号、およびアメリカ合衆国出願第738078号を参照。これらをすべてここ
に引用文献として含める。
ペプチドは疎水性領域を、好ましくは目的とする生物活性部分のカルボキシル末
端側に含むよう作製される。疎水性領域はロイシン、バリン、イソロイシンある
いはフェニルアラニンのような複数の疎水性アミノ酸残基、あるいはミリスチン
酸エステルCH3(CH2)+2COO−、パルミチン酸エステルCH3(CH
2)+aCOO−、7ラキドン酸エステルcH3(CH2)+5COO−などの
ような脂肪酸を含み得る。他の非天然あるいは非生物学的アミノ酸および他の有
機物賀あるいは無機物質を含む疎水性の化学部分もまた使用され得る。
ある実施態様においては、疎水性領域はL6NH2またはLaNH2のような複
数のロイシン残基を含む。あるいはフェニルアラニン、インロイシンまたはバリ
ンのようなアミノ酸配列が使用され得る。
接着を促進するに十分な疎水性を得るためには疎水性領域は少な(ともL4配列
程度の疎水性をもたねばならない。本明細書においては、疎水性領域とは、少な
(とも 4アミノ酸の連鎖により示される疎水性の程度と同等の疎水性を有する
領域をさしていう。
活性部分と疎水性領域との間にアミノ酸スペーサーヲ入しると活性部分がより良
く提示される。これらのスペーサーは、例えばグリシンまたはセリンで有り得る
。好ましくはS2゜S3またはG4のようなlを超える残基が使用される。さら
に、糖類または他の炭素を含む非疎水性成分のような有機化合物も使用され得る
。
結合部分にアルギニン、リジン、ホモアルギニンあるいはオルニチンのような正
に荷電しおり接着を促進することが知られているアミノ酸を疎水性領域と組み合
わせて接着部分として用いると特異性の低い細胞接着ができる。たとえば、R8
GL6NH2およびRL8RNH2はどちらも細胞接着をある程度促進すること
が示されている。
溶液中においてはこれらのペプチドは、組織培養器、人工移!具、細胞またはレ
セプター分離用のカラムの表面のコーティング、およびELISAの表面のコー
ティングに使用され得る。表面は疎水性でも親水性でもよい。水溶液中では疎水
性領域は溶液から自然に追い出されて上述のような表面に接着する。ペプチド溶
液を表面上で乾かすとよりよ(、ペプチドをコートすることができる。適当な表
面にはMillicel l”−CM。
Immobi 1onT″、ポリスチレン、ポリカーボネート、 テフロン(ポ
リテトラフルオロエチレン)、シリコーン、ポリウレタン、ポリ乳酸、チタニウ
ム、ポリエチレン、Gortex ヲ伸張させたポリテトラフルオロエチレン、
歯象牙質およびセメント質などが含まれる。
ペプチドに細胞接着促進作用があるため、本方法は無血清条件での細胞培養法に
改善をもたらす。また本方法は移植された器具に細胞が接着することが望まれる
人工器具にも応用される。さらには、天然の細胞外マトリックス結合部分を基質
上に再現することによって、そのような基質を必要とする細胞性タンパク質が増
産される。
表面に結合させることによって、本発明のペプチドは活性部分に相捕的な、つま
り活性部分に特異的に結合することの可能なリガンドの検出あるいは分離に有効
に利用され得る。
そのようなリガンドには生物活性部分の性質により広範なタイプのものが含まれ
得る。例えば、疎水性領域をRGD結合部分と組み合わせて用いるとRGD部分
を認識するレセプターの検出および分離を促進する。活性部分に結合しているリ
ガンドの存在は標識抗リガンド抗体を使用するような種々の方法で決定され得る
。そのような構成や標識は当業者には周知である。
ヒトに使用される人工器具のコーティングには天然のアミノ酸あるいは脂肪酸を
使用することが他の疎水性成分を使用することよりも望ましい。なぜなら、それ
らは比較的免疫原性および毒性がないからである。
次に示すアミノ酸残基の標準略号がここでは使用されている。 (以下余白)
nMeはn−メチル基を示す。
表 1
アミノ酸 3文字略号 1文字略号
アラニン Ala A
アルギニン Arg R
D−アルギニ7 D−Arg dR
アスパラギン Asn N
アスパラギン酸 Asp D
システィン Cys C
グルタミン Gin Q
グルタミン酸 Glu E
グリシン GlyG
ヒスチジン His H
インロイシン Ile l
ロイシン Leu L
リジン Lys K
メチオニン Met M
フェニルアラニン Phe F
プロリン Pro P
セリン Ser S
スレオニン Thr T
トリプトファン Trp W
りそれぞれのペプチドの最終濃度が0.15μg/ウェルになるますべてのアミ
ノ酸は特に示さない限りL型である。
次に示す実施例は本発明の説明を意図するものであり、本発明を限定するもので
はない。
実施例 1
1A立ヱ二R盗
ペプチドは自動ペプチド合成機(モデル430A:Applied Bi。
systems、Foster C1ty、CA)を用いて製造業者から提供さ
れた取り扱い書に従って合成し、逆相HPLCを用いてバイオゲルTSK 5P
−5−PW陽イオン交換カラム(Bio−Rad Laboratories、
Richmond、 CA)で精製した。
実施例 11
ニブl」舒υ1含
次に示されるペプチドのプラスチックウェルへの自然接着性とその結果起こる細
胞の接着作用促進性を試験した:XG(R)GDSPASSKL2NH2,XG
(R)GDSPASSKL4NH2゜XG(R) GDSPASSKL6NH2
,XG (R)GDSPASSK6. XG (R) GDSPASSE6.こ
こでXはNO3,nMe、アセチルあるいは他のアミノ酸である。開始濃度I
B/mlでペプチドを70%エタノール中に可溶化した。。次に組織培養に未使
用の96ウエルボリスチレンマイクロタイタープレートの最初の2ウエルに、2
00μLのペプチド溶液がデュブリケートで加えた。残りのウェルには100μ
Lの70%エタノールを加えた。。最初の2ウエルのlIIIg/l111溶液
から100μLをとで段階希釈を行った。プレートは乾燥剤存在下で37・Cで
一晩乾燥した。
翌日、ペプチドをコートしたプレートを実施例II!で述べる標準接着実験に使
用した。この実施例ではAmerican TypeTissue Cu1tu
reから入手可能な骨肉腫細胞株MG−63を用いた。
実施例 II+
糧13JL−二上Δ−
プレートをPBS (150mM NaC1/10mM リン酸ナトリウム、p
H7,4)で一度洗浄した。これらのプレートを牛血清アルブミン(BSA 2
.5mg/ml;Sigma Chemical Co、、St、 Louis
、MO)を含むDMEM (0,1ml/ウェル)で1時間インキュベートした
。2xlO5個/mlの細胞(MG−63)を、BSA(2,5o+g/ml)
を含むDMEM中に懸濁させた。1ウエルにつき100μlの細胞懸濁液を加え
、プレートを37・C,7,5%CO2/92.5%airで1時間インキュベ
ートした。
その後、プレートをPBSで1度洗浄した。接着した細胞を3%パラホルムアル
デヒドで固定し、1%トルイジンブルーの10%ホルムアルデヒド溶液で一晩染
色した。翌日、過剰の染色液を除去した後、プレートを水で洗浄し100μmの
1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を各ウェルに加えた。そして細胞接着
の程度をカイネチノクマイクロプレートリーダー(Molecular Dev
ices)で630no+の吸光度を読むことにより測定した。
その結果を表I!に示す。XG(R)GDSPASSKLaNH2i! 3u
g/’y x ルまで有意に細胞接着を促進した。XG(R)GDSPASSK
LJH2は最高濃度100μg/ウェルでのみかろうじて細胞接着を促進した。
他のペプチド、nMeG(dR)GDSPASSKL2NH2,nMeG(dR
)GDSPASSKs。
nMeG(dR)GDSPASSEsは有意に細胞接着を促進しなかった(表1
1ン 。
表 11
μg/ウェル too 50 25 12 6 3 1.5εe 8 5 3
322 2
L2 6 6 3 2 1 L I
L444 12 16 10 2 1 1Ls 100 76 60 60 6
0 5 3数値は最高結合に対する割合(%)を示す。
実施例 IV
疎性一体としてのフェニルアラニン
RGD含有ペプチドの疎水性結合は池の疎水性アミノ酸とともに達成される。次
のペプチドnMeG(dR)GDSPASSKRF4RNH2を70%エタノー
ルに可溶化し、実施例I11で述べられた接着アッセイに使用した。この実験は
また、S3スペーサーをRFaRNH2尾部につけると細胞結合が増すことをも
証明している。RGEには細胞結合作用がないことが知られているのてGRGE
SPSsLeNH2をネガティブコントロールとして用いた。その結果を表II
+に示す。
表II+
疎水性領域としてのフェニルアラエフ
8g/ウェル 100 50 25 12 6 3 1.5nMeGRGDSP
ASSKSsRFeRNH269696066657070nMeGRGDSP
ASSKRFsRNH270755652575450nMeGRGDSPAS
SKLsNH280785866605647nMeGRGDSPASSKRL
sRNH272685866604434nMeGRGDsPAssKRFaR
N)12 70 73 60 59 56 50 34GRGESPS8L8N
H2271716101683数値は最高結合に対する割合(%)を示す。
実施例 V
疎 性担体としてのミリスチン
脂肪酸もまたRGD含有ペプチドの疎水性結合を促進するものとして使用され得
る。ミリスチン酸を、nMeG(dR)GDSPASSににリジンのイプシロン
アミノグループを介して結合させた。細胞結合作用を実施例11およびII+の
方法により測定した。
(球千牛白)
表 IV
μg/ウェル 100 So 25 12 6nMeG(dR)GDSPASS
K−ミリスチン酸 33 30 50 75 45nMeGRGDsPAssK
Le−NHz 100 100 100 50 35数値は最高結合に対する割
合(%)を示す。
実施例 V+
細胞結合はまた、ペプチドR8GL8のような正に荷電した疎水性尾部のみを使
用することよっても促進される。プラスチックウェルを実施例11で示されたよ
うにペプチドでコートし、実施例IIIのアッセイに使用した。
RaGLe To 60 50 50 50 43nMeG(dR)GDSPA
SSKLs−NH21008565505045数値は最高結合に対する割合(
%)を示す。
実施例 Vll
RGD結合部分の疎水性領域間へのアミノ酸スペーサーの付加はRGDペプチド
の細胞結合への提示を増大する。プラスチックウェルを、実施例11の手順によ
りペプチドで4時間コートした。
表Vl
ペプチド μg/ウェル 10 5 2.5 L、25 6nMeG(dR)G
DSPASSKS4RLsRNH257761009276nMeG(dR)G
DSPASSKS2RLaRNH23453574638nMeG(dR)GD
SPASSKLsNH2−6565129数値は最高結合に対する割合(%)を
示す。
実施例 Vll+
細胞膜レセプターを取り込んだフォスファチヂルコリンリポソームを、おもにM
iIIssらの方法、Biochemistry 20+833(1981)
(ここにこれを引用文献として加える)により調製した。ビトロネクチンレセプ
ターとllb/1llaとはPytelaの方法Meth、Enzym、、14
4:475(1987) (ここにこれを引用文献として加える)により胎盤か
ら分離した。概要を述べると、50μgの卵黄フォスファチジルフリン(Sig
ma、 St、 Louis、MO)および[3H]フオスフアチジルコリン(
1−2μCi、New England Nuclear、 Boston、
MA)ヲ1mlの適当なレセプターフラクション(レセプター濃度1−20μg
/l)に加えた。次いでこの溶液を 1!LMCaC12および1mM MgC
1+を含む界面活性剤不含PBSで4℃24時間透析した。この方法により電子
顕微鏡下の測定で平均直径200nmのリポソームが形成される。96ウエルの
マイクロタイタープレート(Titertek、 Flow Laborato
ries、Inc、、 MeLean、 VA)を室温で一晩、疎水性ペプチド
(AC)GRGDSPASSKG4SRL8RNH2,細胞外マトリックスタン
パク質(ビトロネクチン(VN)、フイブリノゲン(FG))、あるいは生血溝
アルブミン(BSA)のいずれかでコートした。これらのプレートを10%無脂
乳のPBS溶液で4℃、6時間ブロックした後、冷トリス緩衝化生理食塩水(T
BS)で洗浄した。プレートをレセプター含有リポソームと共に4℃で32時間
インキュ・ベートした。冷やしたTBSで洗浄後、結合したリポソームを 1%
SO3で可溶化し、放出された放射線活性をベータカウンタ〜(Beckman
、Model LS5000CE)で測定した。
(AC)GRGDSPASSKG4SRLsRNHz (PepTite−20
00” Te1ios Pharmaceuticals、lnc、、La J
olla、CA)がリポソームレセプター実験でビトロネクチンレセプター(表
VI +)およびilb/1llaレセプター(表’/l11)の両方に有効な
基質であることが示された。RGD配列がペプチド(Pept−)から除かれて
GSPASSKRL6RNH2になると、ビトロネクチンおよびJib/1II
aインテグリンレセブターの結合は消失した。
表Vl+
ビトロ不りチンレセプターリポソームアノセイ12.5 ml! 25 ml春
l
ビトロネクチン 1782 180g
PepTi te−2000r″’、788 1921数値はCpmを示す。
表’/II+
11b/l1la レセプターリポソームアッセイ12 、 m l M 25
1 M!フィブリ/ゲン 3636 3958
PepTi te−2000” 1888 2307Pept−14120
BSA 40
本発明を現在において好適な実施g様を引用して説明してぎたが、多様な改変が
当業者によって本発明から逸脱することなく加え得ることは理解されるべきであ
る。従って本発明は次に述べる請求の範囲によってのみ限定される。
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)平成3年9月20日国
Claims (25)
- 1.生物活性部分を含有するペプチドであって、該生物活性部分のカルボキシル 末端の疎水性領域を有するペプチド。
- 2.細胞接着を促進する結合部分および疎水性結合領域を有する接着性ペプチド 。
- 3.前記細胞の接着を促進する結合部分がRGDを含有する、請求項2に記載の 接着性ペプチド。
- 4.前記細胞の接着を促進する結合部分が正に荷電した基を含有する、請求項2 に記載の接着性ペプチド。
- 5.前記正に荷電した基がアミノ酸である、請求項4に記載の接着性ペプチド。
- 6.前記のアミノ酸が、アルギニン、リジン、ホモアルギニンあるいはオルニチ ンでなる群から選択される、請求項5に記載の接着性ペプチド。
- 7.前記疎水性領域が疎水性アミノ酸を含有する、請求項1に記載のペプチド。
- 8.前記疎水性領域が疎水性アミノ酸を含有する、請求項1に記載のペプチド。
- 9.前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよび バリンでなる群から選択される、請求項8に記載のペプチド。
- 10.生物活性部分、疎水性領域、および該生物活性部分と該疎水性領域との間 にスペーサー配列を含有するペプチド。
- 11.前記スペーサーが約2個と約4個との間の数のセリンあるいはグリシン残 基を含有する、請求項10に記載のペプチド。
- 12.次の工程を包含する、ペプチドの表面への結合法:a)該ペプチドに疎水 性領域を付与する工程;およびb)該ペプチドを疎水性表面に結合させる工程。
- 13.生物活性部分、および表面に吸着される疎水性領域を有するペプチドを含 有する組成物。
- 14.前記生物活性部分が細胞接着促進領域あるいは生物学的に認識されている 他のエピトープである、請求項13に記載の組成物。
- 15.前記細胞接着促進部がRGDである、請求項14に記載の組成物。
- 16.次のアミノ酸配列を有するペプチド:X−GRGDSPASSKG4RL 6RNH2ここでXはNH2,nMe,アセチル基あるいは他のアミノ酸である 。
- 17.次のアミノ酸配列を有するペプチド:X−GRGDSPASSKS3RL 6RNH2ここでXはNH2,nMe,アセチル基あるいは他のアミノ酸である 。
- 18.次のアミノ酸配列を有するペプチド:X−GRGDSPASSKSSKR L6RNH2ここでXはNE2,nMe,アセチル基あるいは他のアミノ酸であ る。
- 19.ペプチドの生物活性部分に相補的なリガンドの、試料中での存在を検出す る方法であって、 a)該試料を、生物活性部分および疎水性領域を有するペプチドであって、該試 料中のいかなるリガンドも該生物活性部分と結合可能であるように表面に結合さ れたペプチドと接触させる工程;および b)該活性部分に結合した該相補的なリガンドの存在を決定する工程; を包含する方法。
- 20.前記生物活性部分がRGDを含有し、そして、前記相補的なリガンドがR GD部位を認識するレセプターである、請求項19に記載の方法。
- 21.細胞を表面に接着させることを促進する方法であって、RGD部位と疎水 性領域とを有するペプチドを、該表面へ結合させて、細胞をそれに結合させるこ とを包含する方法。
- 22.前記表面が人工器具、歯科用インプラントおよび組織培養器具でなる群か ら選択される請求項21に記載の方法。
- 23.前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、テフロン、シリコーン、 ポリウレタン、ポリ乳酸,チタニウム、ポリエチレン、伸張ポリテトラフルオロ エチレン、ポリグリコール酸、歯象牙質あるいはセメント質でなる、請求項21 に記載の方法。
- 24.前記表面が、人工器具、歯科用インプラントおよび組織培養器具でなる群 から選択される請求項14に記載の組成物。
- 25.前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、テフロン、シリコーン、 ポリウレタン、ポリ乳酸,チタニウム、ポリエチレン、伸張ポリテトラフルオロ エチレン、ポリグリコール酸、歯象牙質あるいはセメント質でなる請求項14に 記載の方法。
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