DE19505070C2 - Künstliche Gefäßsysteme und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems, in welchem die innere Oberfläche des Gefäßsystems vorbeschichtet und in einem weiteren Verfahrens­ schritt eine Substanz aufgebracht wird, die von bestimmten Zell­ adhäsionsrezeptoren gebunden wird.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein künstliches Blutgefäß­ system, auf dessen vorbeschichteten Oberflächen eine Substanz mit Zelladhäsion aufgebracht ist.

Die chemische und physikalische Zusammensetzung von künstlichen Gefäßsystemen wird stetig weiterentwickelt und verbessert, da autologe Gefäßsysteme als Ersatz für natürliche Gefäßsysteme nur beschränkt verfügbar sind. Bei den Gefäßsystemen ist insbesonde­ re die innere Oberfläche, die zahlreiche mechanische und metabo­ lische Eigenschaften aktiviert, von entscheidender Bedeutung. Dies gilt ganz besonders für künstliche Blutgefäßsysteme, denn die innere Oberfläche dieser Gefäßsysteme ist entscheidend für den störungsfreien Blutfluß und die Blutgerinnung.

So kann der Einsatz unbehandelter, synthetischer Gefäßtrans­ plantate, die insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie als Blutgefäßersatz verwendet werden, bei den Patienten einen Ver­ schluß der Gefäßsysteme verursachen, die zu den bekannten, mög­ licherweise auch letalen Konsequenzen, beispielsweise zu einem Schlaganfall, führen können.

Um derartige Störungen bei künstlichen Gefäßsystemen zu vermei­ den, muß die innere Oberfläche entsprechend vorbehandelt werden. So werden bei künstlichen Gefäßprothesen Endothelzellen (EC) in das Innere des Systems eingebracht. Die Anlagerung einer natür­ lichen Endothelzellschicht an den Innenwänden der künstlichen Gefäßsysteme verringert die Gefahr einer Thrombose und somit die Verschlußrate der Kunstprothese.

Ein wesentlicher Nachteil besteht jedoch darin, daß die Adhäsion von Zellen, insbesondere von Endothelzellen an die Innenwände der synthetischen Materialien sehr gering ist. Die Endothelzel­ lenbesiedlung an den Innenwänden wird jedoch gefördert, wenn dort vorher eine Substanz aufgebracht wird, die die gewünschte Zelladhäsion erhöht. Diese Substanzen werden dann von den Rezep­ toren der Zellen, die angesiedelt werden sollen, erkannt und ge­ bunden. Bezüglich der Endothelzellenadhäsion bei künstlichen Blutgefäßen sind verschiedene Verfahren bekannt, die diese Adhä­ sion an den Innenwänden des Gefäßsystems verbessern. Die innere Oberfläche dieser synthetischen Blutgefäßsysteme wird z. B. unter Verwendung verschiedener Matrixproteine zunächst vorbeschichtet.

Als Vorbeschichtungssubstanzen sind insbesondere Plasmaproteine wie Collagen und Laminin bekannt, die eine Adhäsion der Endo­ thelzellen verbessern. Fibronektin, das auf PTFE-Oberflächen aufgebracht wird, gilt als die Haupterfolgssubstanz der Zell­ adhäsion.

Sank et al. offenbaren ein Verfahren, in dem PTFE-Transplantate zunächst entweder fit Plasmaproteinen wie Gelatine, Laminin, Fibronektin und Collagen oder mit Peptiden, die eine RGD-Sequenz enthalten, direkt beschichtet werden. Anschließend erfolgt die Besiedelung mit Endothelzellen (Sank et al., Am J Surg 1992, Nr. 164, Seiten 199-204).

Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 290 642 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems bekannt. Dieses besteht aus einem synthetischen Material, wobei die innere Oberfläche des Materials vorbeschichtet wird und anschließend eine Substanz aufgebracht wird, die von Zell­ adhäsionsrezeptoren erkannt und gebunden wird. Die Substanzen zur Zelladhäsion sind dabei Biopolymere wie Collagen IV und Laminin.

In der europäischen Patentanmeldung EP 0 531 547 A1 wird ein künstliches Blutgefäßsystem beschrieben, das mit einem Plasma­ protein, das Endothelzellenadhäsion aufweist, beschichtet wird. Die verwendeten Proteine sind Collagen, Gelatin, Laminin und Fibronektin. Das Plasmaprotein wird an die Innenwände des syn­ thetischen Materials des Gefäßsystems über funktionelle Hydroxid-, Carboxyl-Epoxy- oder Aminogruppen kovalent gebunden.

Auf diesen derart vorbeschichteten Innenwänden können dann Endo­ thelzellen angesiedelt werden.

Einige dieser aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen jedoch erhebliche Nachteile auf.

So steht eine komplizierte und langanhaltende Vorbeschichtung, die vor der Zellbesiedlung stattfindet, einer klinischen An­ wendung in breitem Umfang entgegen. Eine mögliche Übertragung von Virusinfektionen, die beispielsweise durch eine Vorbe­ schichtung mit Humanplasmakomponenten, wie Fibrinkleber, er­ folgen kann, sollte ebenfalls vermieden werden. Darüber hinaus ist eine intravaskuläre Anwendung der Plasmaproteine Thrombin und Fibrin hochgradig thrombogen und fördert möglicherweise eine Koagulation, sofern eine Endothelzellenmonoschicht nicht sofort nach der Endothelzellenbesiedlung erzielt werden kann. Die be­ kannten Verfahren werden hauptsächlich verwendet, um Oberflächen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) zu beschichten. Die Beschich­ tung von Oberflächen aus Dacron und Polyurethan wurde auch, wenn auch seltener, durchgeführt.

Die Adhäsion von Endothelzellen an Fibronektin und auch an Laminin und Tenascin ist auf eine Aminosäuresequenz zurückzu­ führen, die in diesen Plasmaproteinen enthalten ist. Diese Sub­ stanz ist ein Peptid, das eine Arginin-Glycin-Asparagin (RGD)- Aminosäuresequenz enthält. Eine Substanz, die mindestens eine Arginin-Glycin-Asparagin-Aminosäuresequenz enthält, wird im fol­ genden RGD-enthaltende Substanz genannt. Diese Sequenz wird von Integrinrezeptoren der Endothelzelle und anderen Zellen erkannt (Takemoto et al., ASAIO Transactions 1989; Nr. 35, Seiten 354-356).

Gegenüber den natürlich vorkommenden Sequenzen in Plasmapro­ teinen wird jedoch die Zellenhaftung durch synthetische, RGD- enthaltende Peptide erhöht. Dies wird auf die gegenüber den natürlichen Sequenzen unterschiedlichen Strukturen der synthe­ tischen Peptide zurückgeführt. Darüber hinaus können synthe­ tische, RGD-enthaltende Peptide für Zellrezeptoren selektiver sein als Peptide, die den natürlichen Sequenzen extrazellulärer Matrixproteine entsprechen. Substanzen, die eine RGD-Sequenz enthalten, werden von verschiedenen Zellrezeptoren, insbesondere von Endothelzellrezeptoren, erkannt und gebunden.

Wird die RGD-enthaltende Substanz direkt auf die synthetische, innere Gefäßoberfläche gebracht, so erfolgt nur eine zufällige, unspezifische und unvollständige Bindung der RGD-enthaltenden Substanz an das synthetische Material. Dies hat zur Folge, daß die Dichte der RGD-Sequenzen an den Innenwänden des Gefäßsystems sehr gering ist. Diese geringe Dichte hat wiederum nur eine ge­ ringe Zellenbesiedlung zur Folge. Ein störungsfreier Durchfluß durch das künstliche Gefäßsystem kann nicht gewährleistet wer­ den. Die direkte Beschichtung der Gefäßoberfläche mit einer RGD- enthaltenden Substanz ist daher sowohl für die Zellenadhäsion und -retention als auch für die daraus resultierenden metaboli­ schen Eigenschaften des künstlichen Gefäßsystems als nicht opti­ mal anzusehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Her­ stellung eines künstlichen Gefäßsystems zur Verfügung zu stel­ len, das zu einer deutlichen Erhöhung der Adhäsion und Retention von Zellen an der Innenwand der Gefäßsysteme und damit zu einer Verbesserung der metabolischen Eigenschaften der künstlichen Ge­ fäßsysteme führt.

Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kün­ stliches Blutgefäßsystem zur Verfügung zu stellen, in welchem die Adhäsion und Retention von Zellen, insbesondere von Endo­ thelzellen, gesteigert und verbessert wird. Der Einsatz derar­ tiger künstlicher Blutgefäßsysteme bewirkt einen störungsfreien Blutfluß, wodurch die Thrombosegefahr verringert und somit die Verschlußrate der künstlichen Gefäßprothese gesenkt wird.

Zur Lösung dieser Aufgabe dienen die Merkmale der unabhängigen Ansprüche; vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteran­ sprüchen definiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:

• a) Das künstliche Gefäßsystem wird in einem ersten Verfahrens­ schritt mit einer makromolekularen Komponente beschichtet, die mehr als eine primäre Aminogruppe aufweisen muß.
• b) In einem zweiten Verfahrens schritt wird die primäre Amino­ gruppen enthaltende, makromolekulare Komponente mit einer zweiten Komponente umgesetzt, die mindestens zwei reaktive Gruppen, davon mindestens eine Aldehydgruppe, enthält.
• c) Das durch die Schritte a) und b) vorbeschichtete, künst­ liche Gefäßsystem wird mit einer Substanz umgesetzt, die von bestimmten Zellrezeptoren erkannt und gebunden wird.

Vorwiegend besteht das erfindungsgemäße künstliche Gefäßsystem aus einem synthetischen Material, wie Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyurethan, Silicon und dgl. Im Verfahrensschritt a) wird die Innenwand des künstlichen Gefäßsystems mit der ersten makromolekularen Komponente beschichtet. Ein wesentlicher Aspekt des erfinderischen Verfahrens ist, daß die primären Aminogruppen der makromolekularen Komponente des Verfahrensschrittes a) in Seitenketten angeordnet sind. Vorzugsweise wird als makromole­ kulare Komponente Poly-lysin-hydrohalogenid, insbesondere Poly- L-lysin-hydrohalogenid, verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Poly-L-lysin-hydrobromid.

Im Verfahrensschritt b) wird diese makromolekulare Komponente mit einer zweiten Komponente umgesetzt, wobei die zweite Kompo­ nente in einer molaren Menge verwendet wird, die geeignet ist, sämtliche primären Aminogruppen der ersten Komponente zu funk­ tionalisieren. Besonders vorteilhaft ist hierbei die Verwendung von Glutardialdehyd. Das künstliche Gefäßsystem wird durch die Verfahrensschritte a) und b) innenseitig beschichtet. Nachdem die Vorbeschichtung der inneren Oberfläche erfolgt ist, wird im Verfahrensschritt c) eine Substanz, insbesondere ein Peptid oder Protein, auf die beschichtete Oberfläche aufgebracht, das die Zelladhäsion und -retention der gewünschten Zellen bewirkt. Die­ se Substanz ist ein Oligopeptid, -saccharid oder -protein. Sie muß wenigstens eine reaktive Gruppe enthalten, die mit dem derivatisierten Beschichtungsmaterial reagieren kann, z. B. pri­ märe Aminogruppen.

Die Verfahrensschritte a) und b) führen zu einer Beschichtung der künstlichen Gefäßinnenwände, die aus zwei Komponenten be­ steht. Hierbei hat sich gezeigt, daß die zweite Komponente der Beschichtung, die mindestens zwei reaktive Gruppen und davon mindestens eine Aldehydgruppe enthält, für die Erfindung be­ sonders bedeutungsvoll ist. Diese Komponente wirkt als Abstands­ halter (spacer) zwischen der inneren Oberfläche des Gefäßsystems und den Zellrezeptoren der Zellen, die auf der Oberfläche ange­ siedelt werden. Die Zwei-Komponenten-Beschichtung bewirkt eine gezielte Orientierung und Bindung der die Zelladhäsion bewir­ kenden Substanzen; denn über die im gleichen Abstand voneinander entfernten, regelmäßig angeordneten primären NH₂-Gruppen der ersten Komponente erfolgt die gezielte Bindung der zweiten Kom­ ponente, die vorzugsweise ein Glutardialdehyd darstellt. Das Glutardialdehyd wird über die ersten Aldehydfunktionen an die primären Aminogruppen des mit Poly-lysin-hydrohalogenid, insbe­ sondere mit Poly-L-lysin-hydrobromid, vorbeschichteten künstli­ chen Gefäßsystems gebunden. Anschließend wird das vorbeschichte­ te Gefäßsystem mit einer Substanz umgesetzt, die eine spezifi­ sche Adhäsion gegenüber den Zellen aufweist, die angesiedelt werden sollen. Oligosaccharide, -peptide oder -proteine, die beispielsweise eine RGD-Sequenz enthalten, sind für die Adhäsion und Retention von Endothelzellen und anderen Zellen besonders geeignet. Die frei verfügbaren Aldehydfunktionen der Zwei-Kompo­ nenten-Beschichtung, die insbesondere von einem derivatisierten Polylysin bereitgestellt werden können, binden beispielsweise primäre Aminogruppen der verwendeten spezifische Zelladhäsion aufweisende Substanzen. Der Beschichtungsmechanismus des er­ findungsgemäßen Verfahrens ist in den Fig. 1 a) bis c) wie­ dergegeben.

Aufgrund des erfinderischen Verfahrens erfolgt keine zufalls­ mäßige und unkoordinierte Bindung der die Zelladhäsion fördern­ den Substanzen, insbesondere der RGD-Peptide oder Proteine. Die Bindung dieser Substanzen an die synthetischen Innenwände wird gezielt über die in regelmäßigen Abständen angeordneten Aldehyd­ funktionen der zweiten Beschichtungskomponenten erreicht. Die dadurch resultierende größere Dichte und Beständigkeit der bio­ logisch aktiven Peptide oder Proteine führt gleichzeitig zu einer Steigerung der Zellenbesiedlung und Zellenretention. Die erhöhte Zellenbesiedlung an den Gefäßinnenwänden wirkt einem Verschluß des Gefäßsystems entgegen. Die metabolischen Eigen­ schaften der künstlichen Gefäßsysteme werden erheblich ver­ bessert.

Aufgrund der erhöhten Zellenadhäsion und -retention eignet sich insbesondere das erfindungsgemäße künstliche Blutgefäßsystem als Ersatz für natürliche arterielle Gefäßsysteme. Diese künstlichen Blutgefäßsysteme können beispielsweise unter Verwendung des er­ finderischen Verfahrens hergestellt werden. Das künstliche Blut­ gefäßsystem besteht aus einem synthetischen Material, wie Poly­ tetrafluorethylen (PTFE), Polyurethan, Silicon und dergleichen. Die erfindungsgemäßen künstlichen Blutgefäßsysteme enthalten eine innere vorbeschichtete Oberfläche, auf die eine Substanz mit Zellenadhäsionseigenschaften aufgebracht ist. Die Beschich­ tung der inneren Oberfläche umfaßt zwei miteinander umgesetzte Komponenten, nämlich eine erste makromolekulare Komponente mit mehr als einer primären Aminogruppe, und eine zweite Komponente, die mindestens zwei reaktive Gruppen, davon mindestens eine Al­ dehydgruppe aufweist. Besonders geeignet ist die Verwendung eines Poly-lysin-hydrohalogenids, vorzugsweise ein Poly-L-hydro­ halogenid und insbesondere ein Poly-L-lysin-hydrobromid. Vor­ zugsweise wird Glutardialdehyd als zweite Komponente eingesetzt. Die auf der vorbeschichteten, inneren Oberfläche aufgebrachte Substanz, die die Zellenadhäsion fördert, ist ein Oligosaccha­ rid, -peptid oder -protein. Diese Substanzen weisen mindestens eine RGD-Sequenz auf. Über diese RGD-Sequenz werden Zellrezepto­ ren, insbesondere Endothelzellrezeptoren gebunden. Die erfin­ dungsgemäßen künstlichen Blutgefäße bewirken gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten künstlichen Blutgefäßsystemen eine erhöhte Zellenbesiedlung und -retention aufgrund der hohen Dichte der adhäsionsfördernden Substanzen. Dadurch verläuft der Blutfluß und die Blutgerinnung störungsfrei. Nachteilige Auswir­ kungen, z. B. ein Verschluß der künstlichen Blutgefäßsysteme, werden wirksam vermieden. Die erfindungsgemäßen künstlichen Ge­ fäßsysteme eignen sich insbesondere in der Herz- und Gefäßchi­ rurgie als Ersatz für natürliche Gefäßsysteme.

Das folgende Ausführungsbeispiel erläutert die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.

Ausführungsbeispiel 1. Herstellung des künstlichen Gefäßsystems

Das PTFE-Transplantat (n = 5) wird im Verfahrensschritt a) mit 40 µm/ml Poly-L-lysin-hydrobromid in PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung) gefüllt und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang inkubiert, um eine Adsorption des Polypeptids am PTFE-Material zu ermöglichen. Nach dem Spülen des Transplantats mit PBS wird im Verfah­ rensschritt b) eine Lösung von 0,2% Glutardialdehyd in PBS in die Transplantate in­ stilliert und 10 Minuten stehengelassen. Das Transplantat wird erneut mit PBS gespült. Das derartig vorbeschichtete Transplantat wird im Verfahrensschritt c) vollständig mit 100 µg/ml eines synthetischen, die Adhäsion von Endothel­ zellen fördernden Peptids in PBS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro- Lys), das die RGD-Sequenz enthält, gefüllt und 60 Minuten lang stehen gelassen. Nach Entfernen der Peptidlösung wird eine Lösung mit 1% Rinderserumalbumin in PBS in die Transplantate 30 Minuten lang eingebracht, um mögliche ungebundene Aldehydstellen zu be­ setzen. Anschließend wird das Transplantat mit PBS gewa­ schen.

2. Endothelzellenbesiedlung

Auf dem RGD-Peptid-beschichteten Gefäßsystem wird eine En­ dothelzellenkultur angelegt, die aus einer Oberflächenvene, z. B. aus der Saphene eines Erwachsenen (AHSVEC), gewonnen wird. Endothelzellen der zweiten bis dritten Kulturpassage werden mit Trypsin behandelt, zentrifugiert und im voll­ ständigen Nährmedium resuspendiert. Ein aliquoter Teil wird zur Zellzählung in einem Hemocytometer verwendet und die Zellsuspension auf eine Zelldichte von 1,2 × 10⁵ Endothel­ zellen/cm² (EC/cm²) eingestellt, um die verfügbare Prothesenoberflä­ che von 6,3 cm² zu bedecken. Das Transplantat wird mittels einer Spritze mit der Endothelzellensuspension gefüllt, an beiden Enden verschlossen und 30 Minuten lang in einem be­ feuchteten Inkubator in einer Atmosphäre aus 5% Kohlen­ dioxid/95% Luft bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach 15 Minuten werden die Transplantatsegmente einmal um 180° gedreht. Am Ende des Besiedlungsvorgangs werden die Transplantate mit dem Nährmedium gespült.

Vergleichsversuche

Es wurde ein Vergleich der Endothelzellenadhäsion und -retention auf unbeschichteten, mit Plasmaproteinen beschichteten und er­ findungsgemäß beschichteten PTFE-Gefäßsystemen durchgeführt.

Die Gruppe 1 stellt ein unbeschichtetes PTFE-Gefäßsystem dar. Ein mit Humanfibronektin beschichtetes PTFE-Transplantat wird als Gruppe 2 bezeichnet. Die Vergleichsgruppen 1 und 2 sind nach den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt worden.

Gruppe 3 ist ein erfindungsgemäßes vorbeschichtetes Blutgefäß­ system, das wie im Ausführungsbeispiel beschrieben hergestellt wurde.

• 1. Versuche zur Bestimmung der Endothelzellenadhäsion und -retention an den Gefäßinnenwänden vor und nach Perfusion
• PTFE-Gefäßsysteme der Gruppe 1, 2 und 3 wurden, wie im er­ finderischen Ausführungsbeispiel unter 2. beschrieben, mit Endothelzellen besiedelt. Am Ende des Besiedlungsvorganges wurden die Transplantate der Gruppen 1, 2 und 3 kurz mit Nährmedium gespült. Anschließend wurde jeweils ein Luer- Verbindungsstück entfernt und ein definiertes Segment einer Länge von 1 cm der Gruppen 1, 2 und 3 für eine Untersuchung im Rasterelektronenmikroskop (REM) präpariert.
• Dann wurden die Luer-Verbindungsstücke ersetzt, und die Transplantate in einen künstlichen Strömungskreislauf ein­ gesetzt, um den Widerstand gegen Scherspannung sowie die Zellretention einer angelegten Endothelzellensaat auf den PTFE-Oberflächen zu bestimmen (siehe Fig. 2). Ein pulsie­ render Fluß wurde unter Verwendung einer Walzenpumpe eines Kardiotomiebehälters, ausgestattet mit einem Perfusionsmediumfilter und einem Luftblasenfilter und eines extrakorpo­ ralen Standard-Perfusionsschlauches in einem geschlossenen, sterilen System erzeugt. Die mit einer Zellkultur versehenen PTFE-Transplantate, die in einem speziell entwickelten Glasrohr eingeschlossen waren, wurden über die vorher eingefügten Luer-Verbindungsstücke in den Kreislauf integriert. Das System wurde mit 500 ml Nährmedium M-199 V, (Nährstandard für Endothelzellen) 10% Humanserum und Antibiotika gefüllt. Dem Perfusionsmedium wurden keine Endothelzellenwachstums­ faktoren zugegeben und die Temperatur wurde während der Durchführung mittels eines Wasserbades auf 37°c gehalten. Vor der Verwendung des Systems wurde das Perfusionsmedium bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂/95% Raumluft in­ kubiert. Der Druck wurde eingestellt und konstant auf 4665,5/666,5 N/cm² (35/5 mm Quecksilber (Hg)) gehalten, was 30 Pulsierungen pro Mi­ nute ergab. Gemessen wurde der Druck mit einem Membranmeß­ wandler und einem Druckmonitor. Die Geschwindigkeit des Strömungskreislaufs betrug 100 ml/Minute, die eine Stunde lang beibehalten wurde. Nach der Perfusion wurden beide Luer-Verbindungsstücke aus den jeweiligen Transplantaten der Gruppen 1, 2 und 3 entfernt, ein bestimmtes Transplantat-Segment herausgeschnitten und für die Rasterelektronenmikroskopie präpariert.
• 2. Präparierung der entnommenen Transplantat-Segmente für die Rasterelektronenmikroskopie (REM)
• 1 cm lange Proben von durchströmten Transplantaten enthal­ tend die Zellsaat werden mittels Rasterelektronenmikrosko­ pie bezüglich ihrer Quantifizierung und Morphologie unter­ sucht.
• Gleich nach der Präparierung aus den künstlichen Gefäßsy­ stemen werden die Proben mindestens 4 Stunden lang in 3,5 % Glutardialdehyd fixiert und mit Phosphatpufferlösung ge­ spült. Anschließend erfolgt eine Nachfixierung von 2 Stun­ den in 2% Osmiumtetroxid in Pufferlösung. Nach Dehydrati­ sierung mittels verschiedener Ethanollösungen werden die Proben mit flüssigem CO₂ bis zu ihrem kritischen Punkt ge­ trocknet, in einem Vakuumverdampfer mit Gold/Palladium sputterbeschichtet und mit einem Rasterelektronenmikroskop das bei einer Beschleuni­ gungsspannung von 25 kV betrieben wurde, untersucht.

Ergebnisse der Vergleichsversuche

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Rasterelektronenmikro­ skopie ist in den Fig. 3 bis 5 dargestellt.

Die Ergebnisse der Vergleichsversuche zeigen, daß die Endothel­ zelladhäsion und -retention auf erfindungsgemäß vorbeschichteten PTFE-Gefäßprothesen nach erfolgter Besiedlung (Fig. 3a, 4a, 5a) und Perfusion (Fig. 3b, 4b, 5b) in einem künstlichen Strömungs­ kreislauf gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten un­ beschichteten und beschichteten PTFE-Gefäßprothesen erheblich gesteigert und verbessert werden.

Zelladhäsion und -retention auf den Transplantaten vor und nach der Perfusion

Gruppe 1

In unbeschichteten PTFE-Gefäßsystemen waren 30 Minuten nach der Zellbesiedlung von 1,2 × 10⁵ AHSVEC / cm² 14,9% ± 3,1% der Fläche mit Endothelzellen bedeckt. Nach der Perfusion be­ trug die Endothelzelladhäsion 2,0% ± 1,0%. Die Zellretention betrug 13,9% ± 7,9% (siehe Fig. 6 und 7).

Gruppe 2

Durch die Vorbeschichtung von PTFE-Transplantaten mit Humanfibronektin ergab sich eine Endothelzelladhäsion nach der Endothelzellenbesiedlung von 26,0% ± 3,3%. Nach der Perfusion im künstlichen Stromkreislauf betrug die Endothelzelladhäsion 11,8% ± 1,6%. Die berechnete Zellretention betrug 45,5% ± 2,1 %. Sowohl die Endothelzelladhäsion als auch die -retention waren im Vergleich zu Gruppe 1 erheblich höher (siehe Fig. 6 und 7).

Gruppe 3

Bei den erfindungsgemäß vorbehandelten PTFE-Gefäß­ systemen wurde eine Endothelzelladhäsion von 30,6% ± 2,1% beobachtet. Die Perfusion der PTFE-Transplantate führte zu einer Endothelzelladhäsion von 19,3% ± 2,8%. Die Endothelzellreten­ tion betrug 62,9% ± 7,5%. Im Vergleich zu Gruppe 1 und Gruppe 2 (siehe Fig. 6 und 7) ergab sich somit eine weitere erhebliche Steigerung der Endothelzelladhäsion und -retention. Primär ist dieses bessere Ergebnis auf die erfindungsgemäße Vorbe­ schichtungstechnik zurückzuführen. In dem von Sank et al. durch­ geführten Verfahren werden die RGD-Peptide ohne Vorbeschichtung direkt auf das PTFE-Material aufgebracht. Weitere untergeordnete Unterschiede bestehen darin, daß Sank et al. ein anderes RGD- Peptid in einer geringeren Konzentration unter Verwendung von PTFE-Patch anstatt Rohrprothesen eingesetzt haben. Die geringere Peptidkonzentration und die Verwendung eines PTFE-Patch führen auch zu dem von Sank et al. festgestellten Ergebnis, daß eine Endothelzellenadhäsion auf RGD-Peptid beschichtetem PTFE gering­ fügig niedriger ist, als auf Fibronektin-beschichtetem PTFE. Die Ergebnisse bezüglich der Zelladhäsion der Gruppe 1 und 2 der be­ schriebenen Vergleichsversuche stehen im Gegensatz dazu.

Die verbesserten Ergebnisse bezüglich der Zelladhäsion und Zell­ retention der erfindungsgemäßen künstlichen Gefäßsysteme sind auf das Vorbeschichtungsverfahren der Erfindung zurückzuführen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei Zwischenschritte angewandt, um die zelladhäsionsfördernde Substanz mit der Innen­ wand der Gefäßsystemoberfläche zu verbinden. Dies führt zu einer starken biochemischen Bindung der adhäsionsfördernden Substanz mit dem Transplantat und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit ge­ genüber Scherspannung. Die adhäsionsfördernde Substanz wird über die noch verfügbare Aldehydgruppe der zweiten Komponente an die künstlichen Innenwände gebunden. Proteine und Peptide mit minde­ stens einer RGD-Sequenz werden beispielsweise über primäre Ami­ nogruppen an die zweite Beschichtungskomponente gebunden.

Der Vergleich der Gruppen 1, 2 und 3 zeigt, daß die Gruppe 3, die den erfindungsgemäßen künstlichen Blutgefäßsystemen ent­ spricht, eine höhere Widerstandsfähigkeit gegenüber Scherspan­ nung aufweist. Diese erhöhte Widerstandsfähigkeit wurde anhand des Ausmaßes der Endothelzelladhäsion und -retention nach der Perfusion in dem künstlichen stromkreislauf ermittelt. Während auf den mit RGD-Peptid-beschichteten erfindungsgemäßen Tran­ splantaten 19,3% ± 2,8% Endothelzelladhäsion nach der Perfu­ sion festgestellt wurde, betrug diese bei Fibronektin-beschich­ teten Transplantaten nur 11,8% ± 1,6%. Auf unbeschichteten Transplantaten betrug die Endothelzelladhäsion nach der Perfu­ sion 2,0% ± 1,0%.

Bei unbeschichteten Transplantaten waren nach einer einstündigen Scherspannung nur noch 13,9% ± 7,9% der ursprünglich anhaften­ den Endothelzellen vorhanden. Auf Fibronektin-beschichteten Transplantaten wurde eine Endothelzellretention von 45,5% ± 2,1 % gemessen. Die bei weitem höchste Endothelzellretention von 62,9% ± 7,5% zeigte sich wiederum bei PTFE-Transplantaten, die erfindungsgemäß vorbeschichtet waren.

Gegenüber dem Stand der Technik ist die Zelladhäsion und -reten­ tion von Endothelzellen auf erfindungsgemäß beschichteten Gefäß­ systemen erheblich erhöht. Die erfindungsgemäßen beschichteten Gefäßsysteme verringern bzw. vermeiden aufgrund ihrer verbesser­ ten metabolischen Eigenschaften Störungen und Nebeneffekte, die beispielsweise durch Kontakt des zirkulierenden Blutstromes mit dem Kunststoffmaterial entstehen. Die gegenüber dem Stand der Technik verbesserten metabolischen Eigenschaften sind auf eine erhöhte Dichte der biologisch aktiven Substanzen, die die Zell­ adhäsion fördern, zurückzuführen. Die erfinderischen Gefäßsyste­ me ersetzen insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie die na­ türlichen Gefäße im Herz und Kreislaufsystem.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Schematische Darstellung biochemischer Reaktionen im erfindungsgemäßen Verfahren. Glutardialdehyd bindet sich über Aldehydfunktionen an die primäre Aminogruppe von Polylysin, mit welchem das PTFE-Material vorbeschichtet ist (a). Die verfügba­ ren Aldehydfunktionen des derivatisierten Polylysin können pri­ märe Aminogruppen der synthetischen, adhäsionsfördernden RGD- Peptide (b) binden. Endothelzellen interagieren durch die Inte­ grinfamilie von Zell-Matrix-Rezeptoren mit der an die Innenwand des Gefäßsystems gebundenen RGD-Sequenz und haften an dem PTFE- Transplantat (c) an.

Fig. 2: Schematische Darstellung des künstlichen Stromkreis­ laufs. Kardiotomiebehälter (1) mit Luftblasenfilter (2), Per­ fusionsmediumfilter (3), Wasserbad (4), extrakorporalem Per­ fusionsschlauch (5), Membranmeßwandler (6), Druck- und Tempe­ raturmonitor (7), Glasrohr, welches das Transplantat umschließt, mit Ein- und Auslaß für das umgebende Medium (8), mit Zellen be­ siedeltes PTFE-Transplantat (9), Temperaturmeßwandler (10), Wal­ zenpumpe (11), Durchströmungsnährmedium (12), Einlaß für CO₂- Einstellung (13), Einlaß für Nährmedium (14). Die Pfeile zeigen in die Flußrichtung.

Fig. 3: Rasterelektronenmikrographie eines unbeschichteten PTFE-Transplantats nach einer 30-minütigen Endothelzellenbe­ siedlung (1,2 × 10⁵ EC/cm²) (Fig. 3 a) und nach einer einstün­ digen Perfusion in einem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 3 b). Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Fig. 4: Rasterelektronenmikrographie eines mit Fibronektin-be­ schichteten PTFE-Transplantats nach 30 Minuten Endothelzellen­ besiedlung (1,2 × 10⁵ EC/cm²) (Fig. 4 a) und nach einer einstün­ digen Perfusion in dem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 4 b). Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Fig. 5: Rasterelektronenmikrographie eines PTFE-Transplantats, das mit adhäsionsförderndem RGD-Peptid beschichtet ist, 30 Mi­ nuten nach Endothelzellenbesiedlung (1,2 × 10⁵ EC/cm²) (Fig. 5 a) und nach einer Stunde Perfusion in dem Strömungskreislauf (100 ml/Min.) (Fig. 5 b). Ursprüngliche Vergrößerung x 618.

Fig. 6: Vergleich der Endothelzelladhäsion auf unbeschichteten, mit Fibronektin (HFN) beschichteten und mit adhäsionsförderndem RGD-Peptid (RGD) beschichteten PTFE-Transplantaten. Die mit EC bedeckte Fläche (%) 30 Minuten nach Endothelzellenbesiedlung (1,2 × 10⁵ EC/cm²) und nach Perfusion in einem Flußkreislauf (100 ml/Min.) . Berechnete Standardabweichung in Klammern.

Fig. 7: Vergleich der EC-Retention (adhärente Zellen nach Per­ fusion / ursprüngliche adhärente Zellen nach der Besiedlung) auf unbeschichteten, mit Fibronektin (HFN) beschichteten und mit ad­ häsionsförderndem RGD-Peptid (RGD) beschichteten PTFE-Transplan­ taten. Berechnete Standardabweichung in Klammern.

Claims (14)

1. Künstliches Blutgefäßsystem umfassend eine innere beschich­ tete Oberfläche, auf die eine Substanz mit Zelladhäsion aufgebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß die innere vorbeschichtete Oberfläche zwei miteinander um­ gesetzte Komponenten enthält, nämlich eine makromolekulare Komponente enthaltend mehr als eine primäre Aminogruppe und eine Komponente, die mindestens zwei reaktive Gruppen, davon mindestens eine Aldehydgruppe aufweist, und die Substanz mit Zelladhäsion ein Oligosaccharid, -peptid, oder -protein ist.

2. Künstliches Blutgefäßsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit Zelladhäsion ein Peptid, Saccharid oder Protein mit mindestens einer RGD (Arginin-Glycin- Asparagin)-Aminosäuresequenz ist.

3. Künstliches Blutgefäßsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Gefäßsystem aus einem synthetischen Material, insbesondere Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyurethan, Silicon besteht.

4. Künstliches Blutgefäßsystem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das mindestens eine RGD (Arginin-Glycin-Asparagin)- Aminosäuresequenz enthaltendes Protein, Saccharid oder Peptid von Zellrezeptoren, insbesondere von Endothel­ zellrezeptoren, gebunden wird.

5. Künstliches Blutgefäßsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die primären Aminogruppen der ersten makromolekularen Kom­ ponente der beschichteten inneren Oberfläche in Seitenket­ ten angeordnet sind.

6. Künstliches Blutgefäßsystem nach einem der Ansprüche 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Oberflächenbeschichtung die erste makromolekulare Komponente Poly-lysin-hydrohalogenid, vorzugsweise ein Poly-L-lysin-hydrohalogenid und insbesondere Poly-L-lysin­ hydrobromid, ist.

7. Künstliches Blutgefäßsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Oberflächenbeschichtung die zweite Komponente Glutardialdehyd ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems, bestehend aus einem synthetischen Material, indem die innere Oberfläche vorbeschichtet wird und anschließend eine Substanz aufgebracht wird, die von Zelladhäsionsrezeptoren erkannt und gebunden wird, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• a) das künstliche Gefäßsystem wird mit einer ersten makromolekularen Komponente beschichtet, die mehr als eine primäre Aminogruppe enthält
• b) die primäre Aminogruppen enthaltende makromolekulare Komponente wird mit einer zweiten Komponente umge­ setzt, die mindestens zwei reaktive Gruppen, davon mindestens eine Aldehydgruppe, enthält
• c) das durch die Schritte a) und b) vorbeschichtete künstliche Gefäßsystem wird mit einem Oligosaccharid, -peptid, oder -protein umgesetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt c) das durch die Schritte a) und b) vorbeschichtete künstliche Gefäßsystem mit einem Peptid, Saccharid oder Protein, das mindestens eine RGD (Arginin- Glycin-Asparagin) -Aminosäuresequenz aufweist, umgesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß für das künstliche Gefäßsystem ein synthetisches Material, insbesondere Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyurethan, Silicon verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die primären Aminogruppen der makromolekularen Komponente des Verfahrensschrittes a) in Seitenketten angeordnet sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als makromolekulare Komponente ein Poly-lysin-hydrohalo­ genid, vorzugsweise ein Poly-L-lysin-hydrohalogenid und insbesondere Poly-L-lysin-hydrobromid, verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Komponente mit Glutardialdehyd als zweite Komponente im Verfahrensschritt b) umgesetzt wird, wobei die zweite Komponente in einer molaren Menge ein­ gesetzt wird, die geeignet ist, sämtliche NH₂-Gruppen der ersten Komponente zu funktionalisieren.

14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das mindestens eine RGD-Sequenz enthaltendes Protein, Saccharid oder Peptid von Zellrezeptoren, insbesondere von Endothelzellrezeptoren, gebunden wird.