DE69219606T2 - Verfahren zur herstellung von biologische-vertraeglichen kapseln, enthaltend zellen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von biologische-vertraeglichen kapseln, enthaltend zellen

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch verträglichen Kapseln, die Zellen zur Implantation in einen Körper enthalten, dem die normale Funktion dieser Zellen fehlt.
  • Ein durch die Implantation von fremden Zellen und Gewebe verursachtes allgemein verbreitetes Problem ist das der immunologischen Abstoßung durch den Empfänger. Versuche, dieses Problem zu überwinden, bedingt im allgemeinen die Behandlung eines Patienten mit immunsuppresiven Medikamenten. Jedoch ist das als gefährlich bekannt, weil diese Medikamenttypen viele Nebenwirkungen aufweisen. Alternativ dazu kann das Gewebe in einer Weise behandelt werden, so daß keine Immunreaktion hervorgerufen wird.
  • Unter Berücksichtigung des letzteren wurden Mittel zum Verkapseln van Zellen, insbesondere von Inselzellen, als ein Verfahren des Immunschutzes entwickelt, indem Material verwendet wird, das verhältnismäßig nicht antigenisch ist (Lim and Sum, 1980, Science, 210, 908-910; Lim, US 4,409,331). In ihrem Verfahren wurde eine Suspension aus Inselzellen in einer Natriumalginatlösung in Tröpfchen gebildet und mit Poly-1- Lysin überzogen, um eine für kleine Moleküle wie beispielsweise Glukose oder Insulin durchlässige, aber für große Moleküle wie beispielsweise Immunglobulin und die Zellen des Immunsystems undurchlässige Membran zu bilden. Sun et al.(Sun, M.A. et al., 1985, Biotechnology and Bioengineering, 27: 146-150) offenbaren eine Membran zur Mikroverkapselung von Langerhans- Inseln, welche die Zellen vor dem Immunsystem schützt.
  • Das Verfahren wurde von O'Shea et al. (1984, Biochimica et Biophysica Acta, 804, 133-136) durch Überziehen der Kapseln mit einer zusätzlichen äußeren Schicht aus Natriumalginat modifiziert, um die Entzündungsreaktion weiter zu minimieren.
  • Obwohl einige Transplantationen von verkapselten Zellen ziemlich erfolgreich waren, die einen normalen Zuckergehalt des Blutes in zuckerkranken Mäusen zwei Wochen nach einer Transplantation von verkapselten Inselzellen zeigen (Calafiore et al., Diabetes Research and Clinical Practice, 1988, 5 Nachtrag 1, S334; Tse and Tai, 1982, Transplantation, 33, 563- 564; Ricker and Stockberger, 1986, Diabetes, 35, Nachtrag 1, 61A), zeigten die Kapseln bei Entfernung ein Durchdringen von Monozyten und großen Phagozyten, d.h. eine heftige Entzündungsreaktion.
  • Eine neuere Studie (Clayton et al., Diabetes Research 1990, 14 127-132), welche die Immunreaktion von Ratten auf implantierte leere Kapseln untersucht, zeigte, daß die Zusammensetzung der äußeren Schicht der Kapsel die Heftigkeit der Reaktion bewirkt, wobei M-Alginat (an Mannuronsäure reiches Natriumalginat) die geringste Immunreaktion hervorruft. Jedoch lief selbst diese verminderte Reaktion auf eine Durchdringung von großen Phagozyten und Fibroblasten nach nur drei Wochen hinaus.
  • Die vorliegende Erfindung überwindet oder verringert zumindest die zuvor erwähnten Probleme.
  • Nach der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zellen enthaltenden, biologisch verträglichen Kapseln vorgesehen, das die Schritte umfaßt:
  • i) Suspendieren von Zellen in einem wäßrigen Medium, das ein vordialysiertes wasserlösliches Alginatgummi wie beispielsweise Natriumalginat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Alginat mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, die ein Disulfidbindung reduzierendes Mittel enthält, vordialysiert worden ist, wobei das Alginat mehrzählige anionische Reste hat, aber im wesentlichen proteinfrei ist;
  • ii) Bilden der Suspension in Tröpfchen, welche die Zellen enthalten;
  • iii) Aussetzen der Tröpfchen einer Lösung mehrwertiger physiologisch verträglicher Kationen unter Gelierung der Tröpfchen, welche die Zellen umhüllen;
  • iv) Aussetzen der gelierten Tröpfchen einem Polymeren, welches kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen Gruppen unter Bildung einer semipermeablen Membran quervernetzen;
  • v) Überziehen der halbdurchlässigen Membran mit einer Schicht des vordialysierten wasserlöslichen Gummis.
  • Das wasserlösliche Gummi kann Natriumalginat oder ein anderes wasserlösliches Alginat wie beispielsweise Kaliumalginat sein.
  • Das Alginat kann mit Dithiothreitol (DTT) enthaltender, phosphatgepufferter, physiologischer Kochsalzlösung (PBS) vordialysiert werden, die das Aufspalten von einem zugeordneten Protein unterstützt, indem die darin vorhandenen Disulfid-bindungen aufgespaltet werden. Das Alginat kann mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung vordialysiert werden, welche eine beliebige Chemikalie enthält, die Disulfidbindungen im zugeordneten Protein reduzieren kann, zum Beispiel Dithioerythritol, 2-Mercaptoethanol und dergleichen.
  • "Im wesentlichen proteinfrei" bedeutet in diesem Zusammenhang nicht zwangsläufig, daß das dem Alginat oder einem anderen Gummi zugeordnete Protein völlig entfernt ist. Unerwartet wurde herausgefunden, daß es ausreichend ist, wenn Disulfidbindungen in dem zugeordneten Protein unterbrochen sind.
  • Die Konzentration von Dithiothreitol kann größer sein als 0,1 mg/ml, vorzugsweise 0,6 mg/ml, andere Chemikalien in entsprechenden Mengen.
  • Das Alginat kann mehr als 1 Stunde, vorzugsweise zweimal zwei Stunden gegenüber phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Dithiothreitol oder eine beliebige Chemikalie enthält, die Disulfidverbindungen reduzieren kann, und gegenüber phosphatgepufferter Kochsalzlösung allein mehr als 65 Stunden dialysiert werden, um eine wirksame Entfernung von verunreinigendem antigenischem Protein zu gewährleisten.
  • Die Zellen können in normaler Kochsalzlösung suspendiert sein, die das gereinigte Alginat enthält.
  • Die Zellsuspension kann mehr als 1,0 Gew./Vol.%, vorzugsweise 1,5 Gew./Vol.%, des vordialysierten, gereinigten Alginats enthalten.
  • Die zu verkapselnden Zellen können Zellen eines Säugetiers sein wie beispielsweise die Insulin produzierenden Zellgruppen der Bauchspeicheldrüse (Langerhans-Inseln), die für eine Implantation in zuckerkranke Patienten brauchbar sind.
  • Wenn zur Transplantation Zellgruppen der Bauchspeicheldrüse verwendet werden sollen, können 1 bis 2 ganze Langerhans- Inseln verkapselt werden.
  • Die Suspension aus Zellen und Alginat kann in Tröpfchen zwischen 0,3 und 1,0 mm Durchmesser durch Tropfen aus einer Spritze in eine kationenhaltige Lösung, welche die Tröpfchen geliert, die die Zellen umhüllen, gebildet werden.
  • Die kationenhaltige Lösung kann Kalziumchlorid in einer Konzentration von größer als 0,5 Gew./Vol.%, vorzugsweise 1,1 Gew./Vol.% sein.
  • Das kationengruppenhaltige Polymer, dem die gelierten Tröpfchen ausgesetzt sind, kann Poly-1-Lysinchlorid sein.
  • Das Molekulargewicht des Poly-1-Lysinchlorids kann größer als 3 000, vorzugsweise 20 000, sein.
  • Das Poly-1-Lysinchlorid kann in normaler Kochsalzlösung in einer Konzentration von mehr als 0,01 Gew./Vol.%, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05 Gew./Vol.% gelöst sein.
  • Die gelierten Tröpfchen können der Poly-1-Lysinchloridlösung mehr als 1 Minute, vorzugsweise 6 Minuten lang, unter Bildung einer halbdurchlässigen Membran ausgesetzt werden.
  • Die somit gebildete halbdurchlässige Membran kann mit einer Schicht aus vordialysiertem, wasserlöslichem Gummi überzogen werden, indem die halbdurchlässige Membran mehr als 1 Minute lang einer Lösung ausgesetzt wird, die mehr als 0,1 Gew./Vol.% des Gummis enthält.
  • Die Lösung kann 0,15 Gew./Vol.% vordialysiertes Natriumalginat in normaler Kochsalzlösung enthalten.
  • Die halbdurchlässige Membran kann der Lösung 4 Minuten lang ausgesetzt werden.
  • Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Reinigen von wasserlöslichen Gummis beispielsweise wasserlösliche Alginate, wie Natriumalginat und Kaliumalginat, welches das Vordialysieren des Gummis mit einer Lösung umfaßt, die ein die Disulfidbindung reduzierendes Agens enthält.
  • Mit Reinigung ist in diesem Zusammenhang gemeint das Ausschalten oder wesentliche Reduzieren einer Bioaktivität infolge des zugeordneten eiweißartigen Materials, um das Gummi (wird als an sich biologisch verträglich angenommen) für die beabsichtigte schließliche Verwendung ausreichend biologisch verträglich zu machen.
  • Neben seiner Nützlichkeit zum Verkapseln von Zellgruppen der Bauchspeicheldrüse zur Implantation in zuckerkranke Patienten sind Alginate (oder ein anderes biologisch verträgliches, wasserlösliches Gummi), die durch das Verfahren der Erfindung gereinigt sind, in jeder Situation brauchbar, wo sich ein Alginat in direktem Kontakt mit den Körperflüssigkeiten, einschließlich Blut, befindet.
  • Wenn Verbände, Tupfer, Fäden, Nähte und dergleichen während des chirurgischen Eingriffs in den Körper eingesetzt werden und dort nach der Operation verbleiben, ist das durch das Verfahren der Erfindung gereinigte Alginat besonders nützlich. Aus Alginat-Fasern können Verbände gewebt oder Strickerzeugnisse gestaltet werden. Sie könnten ebenfalls eine nicht gewebte, fabrikmäßige Unterlage, die aus aufgerauhten Alginatfasern wie beispielsweise Baumwolle hergestellt ist, oder ein feuchtes Laken, eine geformte Platte oder eine Form sein, die aus einem Alginatgel oder einer dünnen Alginatschicht hergestellt sind. Tupfer können nicht gewebte Anordnungen von Alginatfasern sein. Fäden und Nähte können aus einem einzelnen oder mehreren Spinnfäden aus Alginat gesponnen sind.
  • Ähnliche Verbände, die zum Abdecken von offenen Flächenwunden verwendet werden, können ebenfalls hergestellt werden, indem Alginat verwendet wird, welches durch das Verfahren der Erfindung gereinigt wurde. Alginatverbände werden als blutstillendes Mittel und zum Handhaben von nässenden Wunden verwendet. Alginat-Puder wird ebenfalls als blutstillendes Mittel für offene Wunden (z.B. zur Förderung des schnellen Gerinnens im Sportgebrauch) verwendet.
  • Verbände und Pflaster, die unter der Haut implantiert werden und aktive Bestandteile enthalten, können ebenfalls hergestellt werden, indem Alginat verwendet wird, welches durch das Verfahren der Erfindung gereinigt wurde.
  • Gesteuerte oder gestützte Freigabevorrichtungen, die in den Körper eher implantiert oder injiziert werden als durch das normale Verdauungssystem gehen, können gleichfalls hergestellt werden, indem Alginat verwendet wird, das durch das Verfahren der Erfindung gereinigt wurde.
  • Alginat enthaltende Kapseln oder andere, einschließlich der in den Körper implantierten Einrichtungen, durch die das Alginat eine Membran erzeugt, um den Fluß der Chemikalien in und aus der Kapsel heraus in molekularer Größe zu sieben und zu steuern, können hergestellt werden, indem ein Alginat verwendet wird, welches durch das Verfahren gereinigt ist.
  • Diese Alginate können auch zum Überziehen von künstlichen Gefäßtransplantaten (z.B. Dacron [RTM] Transplantate) verwendet werden, welche in die Patienten implantiert werden.
  • Die Erfindung wird weiter aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf das hier ausführlich dargestellte Experiment deutlich, das eine Form des die Erfindung verkörpernden Verfahrens zur Herstellung von Zellen enthaltenden, biologisch verträglichen Kapseln nur beispielhaft zeigt.
  • Protokoll zur Herstellung biologisch verträglicher Kapseln, die Zellgruppen der Bauchspeicheldrüse (Langerhans-Inseln) enthalten
    • 1. Reinigung von Natriumalginat
  • Natriumalginat (von Kelco International geliefert) wurde zu einer 1,5 Gew./Vol.% Lösung in normaler Kochsalzlösung (0,9 Gew./Vol.% Natriumchlorid) verarbeitet. 10 ml dieser Lösung wurden in einen Dialysesack (Sigma, Cat. No. 250-11) gegeben, der Proteine mit einem Molekulargewicht von größer als 12 000 zurückhält. Das Natriumalginat wurde 2 Stunden gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 140mM NaCl, 35 mM K&sub2;PO&sub4;, mit pH-Wert 7,5) dialysiert, die Dithiothreitol (DTT) enthält, und weitere 2 Stunden gegen unverbrauchte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und Dithiothreitol dialysiert, wonach es gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung allein eine Gesamtzeit von ungefähr 70 Stunden, mit unverbrauchter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einer Stunde und 65 Stunden gepuffert wurde.
  • Das Natriumalginat wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese auf das Vorhandensein von verunreinigendem antigenischem Protein analysiert. Diese Analyse betätigte, daß das Natriumalginat tatsächlich proteinfrei war. Aus dem Natriumalginat wurde kein Protein entfernt, wenn es gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Dithiothreitol in einem zum oben angegebenen gleichen Verfahren dialysiert wurde. Das läßt darauf schließen, daß das Dithiothreitol wesentlich ist für die wirksame Entfernung von Protein aus Natriumalginat.
    • 2. Protokoll zur Verkapselung
  • Es wurden entweder von Ratten oder Menschen Langerhans-Inseln entnommen und in einer 1,5 Gew./Vol.% Lösung aus gereinigtem (d.h. proteinfreiem) Natriumalginat in normaler Kochsalzlösung in Suspension gehalten. Die Lösung wurde gemischt und über eine Zerstäuberduse in einer 2 ml Spritze aufgezogen und mit einer Infusionspumpe verbunden. Die Infusionspumpe wurde auf eine gewünschte Durchflußmenge, normalerweise 1 ml/min, eingestellt, und die Tropfen der Suspension aus Natriumalginat/Langerhans-Inseln wurden aus einer Höhe von 7 cm in eine 1,1 Gew./Vol.% Lösung aus Kalziumchlorid getropft, so daß die Tropfen beim Eintreten in die Kalziumchloridlösung kugelförmig werden. Beim Eintritt in die Lösung geliert das Natriumalginat, um die Langerhans-Inseln zu verkapseln, wobei normalerweise 1 bis 2 Langerhans-Inseln pro Kapsel enthalten sind und die Kapseln in einem Durchmesserbereich von 0,3 bis 1,0 mm liegen. Die gelierten Kapseln werden mit 25 ml Volumen aus 0,55% CaCl&sub2;; 0,27% CaCl&sub2; und 0,85% NaCl gewaschen. Die Kapseln werden dann 3 Minuten in 0,1% CHES (2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure; pH-Wert 8,2 in NaCl) gelegt, bevor sie in Suspension gehen, und in 25 ml von 0,05% Poly-1-Lysinhydrochlorid (Molekulargewicht 20 000) in NaCl 6 Minuten lang gerührt. Die kationenhaltigen Gruppen im Poly-1-Lysinhydrochlorid vernetzen mit den anionenhaltigen Gruppen der Natriumalginatkapsel, um eine halbdurchlässige Membran zu bilden. Das Molekulargewicht des Poly-1-Lysins wird gewählt, um eine halbdurchlässige Membran gewünschter Durchlässigkeit auszuwählen, die in diesem Falle ausreichend ist, um Insulin herauszulassen aber Imunglobulin und andere Zellen des Immunsystems nicht hineinzulassen.
  • Die Kapseln werden dann mit 25 ml 0,1 Gew./Vol.% CHES und weiteren 25 ml 0,85 Gew./Vol.% NaCl gewaschen, bevor ihnen eine äußere Umhüllung aus gereinigtem Natriumalginat hinzugefügt wird, um ihre biologische Verträglichkeit weiter zu erhöhen. Das wird erreicht, indem die gewaschenen Kapseln 4 Minuten unter Umrühren in einer 0,15 Gew./Vol.% Natriumalginatlösung (in normalem NaCl) in Suspension gehalten werden. Die umhüllten Kaseln werden dann mit 25 ml 0,9 Gew./Vol.% NaCl gewaschen, 6 Minuten in 10 ml von 55 mM Natriumcitrat in Suspension gehalten, wiederum mit 25 ml 0,9 Gew./Vol.% NaCl gewaschen, zweimal mit einem Nährstoff für Zellkulturen gewaschen, bevor es der Implantation vorausgehend in diesem Nährstoff für Zellkulturen in Suspension gehalten wird.
  • Anfängliche Ergebnisse unter Verwendung von implantierten verkapselten Langerhans-Inseln in Ratten bestätigten die stark erhöhte biologische Verträglichkeit der Kapseln, die "gereinigtes" Natriumalginat verwenden. Das gibt große Hoffnung für die zukünftige Implantation von menschlichen Langerhans-Inseln in zuckerkranke Patienten, was bedeuten würde, daß sie ihr eigenes Insulin erzeugen könnten, was die Notwendigkeit täglicher Injektionen beseitigt.
  • Die durch die transplantierten Langerhans-Inseln erzeugte erhöhte Glukoseregelung kann im Vergleich zum injizierten Insulin Komplikationen wie beispielsweise Blindheit und Nierenversagen potentiell verhindern, die eine Ausgewogenheit insulinabhängiger, zuckerkranker Patienten bewirken.

Claims (38)

1. Verfahren zum Herstellen von Zellen, welche biologisch verträgliche Kapseln enthalten, umfassend die Stufen:
i) Suspendieren von Zellen in einem wäßrigen Medium, welches ein vordialysiertes wasserlösliches Alginatgummi wie Natriumalginat enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Alginat mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung, welche ein Disulfidbindung reduzierendes Mittel enthält, vordialysiert worden ist, wobei das Alginat mehrzählige anionische Reste hat, aber im wesentlichen proteinfrei ist;
ii) Bilden der Suspension in Tröpfchen, welche die Zellen enthalten;
iii) Aussetzen der Tröpfchen einer Lösung mehrwertiger physiologisch verträglicher Kationen unter Gelierung der Tröpfchen, welche die Zellen umhüllen;
iv) Aussetzen der gelierten Tröpfchen einem Polymeren, welches kationische Gruppen enthält, die mit den anionischen Gruppen unter Bildung einer semipermeablen Membran quervernetzen;
v) Überziehen der semipermeablen Membran mit einer Schicht des vordialysierten wasserlöslichen Gummis.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel Dithioerythrit enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel 2- Mercaptoethanol enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Dithiothreitolkonzentration größer als 0,1 mg/ml ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Dithiothreitolkonzentration 0,6 mg/ml beträgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Alginat mindestens einmal länger als eine Stunde dialysiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Alginat zweimal dialysiert wird, jedes Mal zwei Stunden.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen in normaler physiologischer Kochsalzlösung, welche 0,9 Gew./Vol% Natriumchlorid enthält, suspendiert werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellsuspension mehr als 1 Gew./Vol.% vordialysiertes Alginat enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Suspension 1,5 Gew./Vol.% vordialysiertes Alginat enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu verkapselnden Zellen Säugetierzellen sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zellen Islets von Langerhanszellen sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei 1 bis 2 Islets zu verkapseln sind.
15. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14, wobei die Suspension in Tröpfchen mit einem Durchmesser zwischen 0,3 und 1,0 mm durch Tropfen aus einer Spritze in eine kationenhaltige Lösung, welche die Tröpfchen geliert, die die Zellen umhüllen, gebildet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die kationenhaltige Lösung Calciumchlorid in einer Konzentration größer als 0,5 Gew./Vol.% ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Calciumchloridlösung 1,1 Gew./Vol.%ig ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kationengruppenhaltige Polymer, dem die gelierten Tröpfchen ausgesetzt werden, Poly-1-Lysinchlorid ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Molekulargewicht des Poly-1-Lysinchlorids größer als 3000 ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Molekulargewicht des Poly-1-Lysinchlorids 20.000 ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-20, wobei das Poly- 1-Lysinchlorid in normaler physiologischer Kochsalzlösung vorliegt, welche 0,9 Gew./Vol.% Natriumchlorid ist und eine Konzentration von mehr als 0,01 Gew./Vol.% hat.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Konzentration von Poly-1-Lysinchlorid 0,05 Gew./Vol.% ist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gelierten Tröpfchen länger als eine Minute der Poly-1- Lysinchloridlösung unter Bildung einer semipermeablen Membran ausgesetzt werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die gelierten Tröpfchen 6 Minuten der Poly-1-Lysinchloridlösung ausgesetzt werden.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die semipermeable Membran mit einer Schicht aus vordialysiertem wasserlöslichem Gummi durch länger als eine Minute Aussetzen der semipermeablen Membranen einer Lösung, welche mehr als 0,1 Gew./Vol.% des Gummis enthält, überzogen wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Lösung 0,15 Gew./Vol.% vordialysiertes Natriumalginat enthält.
27. Verfahren nach Ansprüchen 25 und 26, wobei die semipermeablen Membranen 4 Minuten der Lösung ausgesetzt werden.
28. Verfahren zum Reinigen wasserlöslicher Gummis wie wasserlösliches Alginat wie beispielsweise Natriumalginat und Kaliumalginat, welches Vordialysieren des Gummis mit einer Lösung, die ein Disulfidbindung reduzierendes Agens enthält, umfaßt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das die Disulfidbindung reduzierende Agens in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung enthalten ist.
30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol enthält.
31. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Reduktionsmittel Dithioerythrit enthält.
32. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Reduktionsmittel 2- Mercaptoethanol enthält.
33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Dithiothreitolkonzentration größer als 0,1 mg/ml ist.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Dithiothreitolkonzentration 0,6 mg/ml ist.
35. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Natriumalginat mindestens einmal länger als eine Stunde dialysiert wird.
36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Natriumalginat zweimal jedes Mal 2 Stunden dialysiert wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 36, gefolgt von einer Analyse, die bestätigt, daß das Alginat proteinfrei ist.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Analyse mittels Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt wird.
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