DE3837669C2 - Verfahren zur Herstellung von Material für die Zelltherapie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Material für die Zelltherapie, wobei in kleinste Partikel zerteiltes Hautgewebe in einer Kulturflüssig­ keit aufgenommen und die Hautgewebezellen unter steri­ len Bedingungen in der Kulturflüssigkeit explantiert werden und eine Kultur von Einzelzellen gebildet wird, denen ein Wirkstoff zugefügt wird.

In der deutschen Auslegeschrift 12 377 30 ist ein Krebs­ mittel als Mischung aus Bindegewebszellen mit den Wirk­ stoffen Heparin und Dextran in isotonischer Lösung be­ schrieben. Dabei werden die Bindegewebszellen als Frischzellen aus Tieren, vorzugsweise aus der Nabel­ schnur von Schafen gewonnen.

Die Verwendung von körpereigenen Fibroblasten ist in US 4485096 beschrieben. Dabei wird zur Behandlung von Hautverbrennungen ein hydradisiertes Collagengitter in die lebenden Zellen eingelegt; ein Wirkstoff ist nicht vorhanden.

In US 4299819 ist die Verwendung von körpereigenen Epi­ dermiszellen zum Testen von arzneilichen Wirkstoffen und/oder Carcinogenen beschrieben. Neben dem Test auf Abstoßungsreaktionen ist in diesem Zusammenhang jedoch keine therapeutische Wirkung genannt.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art bereitzustel­ len, mit dem Material für die Zelltherapie gewonnen werden kann, das nebenwirkungsfrei und nicht mit Viren kontaminiert ist und sich für die Zuführung von Wirk­ stoffen mit tolerabler Dosierung eignet.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verfahrensschritte gemäß dem Kennzeichen von Anspruch 1.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das körpereigene Gewebe in möglichst kleine Partikel unter sterilen Be­ dingen zerteilt und als Zellkultur aus Epidermiszellen, Fibroblasten und Basalzellen angesetzt, denen ein Wirk­ stoff zugeführt wird. Mit dieser "Zellfütterung" wird erreicht, daß nur jene Wirkstoffdosis aufgenommen wird (Metabolisation), die von Körperzellen auch vertragen werden kann, so daß das Problem der Überdosierung ent­ fällt. Das gleiche gilt auch für den Schutz vor Virus- Kontamination. Eine Körperzelle, die in vitro, also in der Kulturflasche mit virus-kontaminiertem Material be­ stückt wird, stirbt ab. Sie kann somit nicht mehr zur jeweiligen Therapie hergenommen werden. Der Schutz des zu therapierenden Organismus ist damit gewährleistet.

Die Aufbringung verschiedener Wirkstoffe in Kosmetika auf die Haut ist nur für die Hornschicht von Bedeutung. Aufgrund der besonderen Hautstruktur, die mit einer schützenden Basalmembran versehen ist, gelangen übli­ cherweise lokal applizierte Präparationen nicht bzw. nur unter ganz besonderer Lösungsvermittlung in die noch lebenden Zellen der Haut bzw. in das darunterlie­ gende Gewebe.

Dies führt entweder zur Wirkungslosigkeit oder aber zur hohen Nebenwirkungsrate, soweit unkontrollierte Anwen­ dung besteht.

Mit der "Zellfütterung" wird die Dosis so niedrig ge­ halten, daß keine Nebenwirkungen provoziert werden kön­ nen. Die Behandlung soll nur mit noch lebenden Zellen erfolgen, d. h. mit Zellen, die noch lebend in die Prä­ paration eingehen; durch Überdosis abgetötetes Zellma­ terial kann nicht verwendet werden.

Die Wirkung ist dabei insbesondere deswegen hochgradig und kann auch zur Penetration der Basalmembran führen, da körpereigene Zellstrukturen (somit körpereigenes und gewebeartseigenes Eiweiß) mit Wirkstoff gekoppelt, auf die Haut aufgetragen werden.

Ähnlich wie bei der Eigenblutinjektion sollen lebende Zellen der Haut, die dem Organismus vorher entnommen wurden und extrakorporal vermehrt wurden, wieder reim­ plantiert werden. Bei Fibroblasten z. B. wird durch die­ se Behandlungsform nicht nur Collagen in die Haut ge­ bracht, sondern auch die Zelle, die Collagen produzie­ ren kann.

Der Gegenstand der Erfindung besteht also mit anderen Worten darin, körpereigene Zellen der Haut außerhalb des Körpers zu züchten, und die körpereigenen Zellen der Haut wiederaufbereitet, gefüttert oder verändert, noch lebend in den Organismus zurückzuführen, oder auf diesen aufzubringen. Gegebenenfalls nach vorheriger De­ struktion kann das gewonnene Material in Cremes, Lotio­ nen, Emulsionen etc. (also Externa) oder in Ampullen verschlossen oder direkt aus dem Kulturmedium aufgear­ beitet, auf der Haut aufgetragen bzw. in den Körper eingebracht werden.

Die vorteilhafte Wirkung der Erfindung liegt insbeson­ dere in der sicheren und somit nebenwirkungsfreien An­ wendung bestimmter Substanzen und Therapeutika, die ex­ trakorporal in die Zelle eingebracht, nur so geringgra­ dig dosiert werden, als sie von der sehr empfindlichen Einzelzelle in vitro auch toleriert werden. So kann auch individuell unterschiedlichen Tolerabilitäten je nach Empfängerorganismus Rechnung getragen werden.

Die bisherigen Anwendungsformen sind immer nur dosisab­ hängig und können berechnet werden aus Erfahrungswer­ ten. Mit der vorliegenden extrakorporalen Zelltherapie kann jedoch insbesondere bei sehr nebenwirkungsreichen Substanzen die individuelle Dosis gefahrlos appliziert werden.

Die bisherige Frischzellentherapie hat neben der Schockgefahr auch die Virus-Kontamination als Nebenwir­ kung zu fürchten. Mit der extrakorporalen Therapie der körpereigenen Zellen der Haut wird automatisch die Vi­ rus-Kontamination des zu therapierenden Organismus ver­ hindert. Schließlich benutzt man ja gerade beispiels­ weise, um die Virus-Kontamination sicher ausschließen zu können, die Zellkultur als Prüfmethode. Virus­ kontaminiertes Material ist auch in großer Verdünnung in der Lage, Zellkulturen abzutöten.

Wird nun Viruskontaminiertes Material der Zellkultur gefüttert, mit der dann behandelt werden soll, so wird das Zellmaterial vernichtet. Eine Behandlung mit diesem Material ist dann nicht mehr möglich. Somit ist ein zu­ sätzlicher Sicherheitsfaktor mittels dieses Verfahrens eingebaut.

Für die Lokalbehandlung ist die Zellpermeabilität im Hautorgan von großer Bedeutung. Die lebende Zelle ist durch ihre Zellmembran vor bestimmten äußerlich auf­ tragbaren Substanzen geschützt. Dieser Schutz betrifft insbesondere die Basalmembran. So können bestimmte Vit­ amine, Mineralien etc. der Haut nicht tatsächlich zuge­ führt werden, sondern führen nach den bisherigen Ver­ fahren allenfalls dazu, die Hornschicht der Haut, wel­ che aus abgestorbenem Zellmaterial besteht, aufzuloc­ kern bzw. aufzuweichen. Die durch körpereigene Zellen der Haut vermittelte Wirkstoffzugabe erreicht jedoch im Gegensatz zu den bisherigen Verfahren, daß durch die ideale, da körpereigene Eiweißstruktur, eine bessere Penetration erzielt wird, als dies bisher möglich war. Hierdurch können zumindest die Hornschichten besser durchdrungen werden, und die Zusatzstoffe in die noch lebenden Zellen der Haut gebracht werden. Durch geeig­ nete Kombination von Epidermiszellen- und Fibroblasten- Kombination kann aber auch die Basalmembran erreicht werden, so daß körpereigenes Collagen zumindest bis na­ he an die Basalzellen bzw. an die Basalmembran gebracht werden kann.

Bisher in Cremes eingebrachtes Collagen vermag aus­ schließlich durch seine besondere Feuchtigkeitsbindung mehr Feuchtigkeit der Hornschicht der Haut zuzuführen, so daß eine bessere Geschmeidigkeit der Haut erzielt wird. Im Gegensatz hierzu wird mit dem beschriebenen Verfahren jedoch eine echte Zufuhr von Collagen, wel­ ches aus den körpereigenen Fibroblasten stammt, wie oben erläutert durchgeführt.

Die bisherige Collagen-Implantation ist ein Verfahren, mittels welchem körperfremdes Collagen, welches aus Rindercollagen produziert wird, und so weitgehend dena­ turiert ist, daß es nur minimale Allergien provozieren kann, intraepidermal eingebracht wird, also in die Haut direkt. Durch die Implantation oberhalb der Basalmem­ bran kommt es zu einer geringeren Abbaurate, als ob in das subcutane Fettgewebe oder unterhalb der Basalmem­ bran implantiert wird. Nach 1-2 Jahren baut sich dieses Collagen ab. Wird dieses Collagen unterhalb der Basal­ membran injiziert, so kommt es zu weitaus rascherem Ab­ bau. Es können daher nur kleine Hautfältchen mittels dieser Methode korrigiert werden. Gleichwohl kommt es aber immer wieder gelegentlich zu Allergien, nachdem es sich ja um körperfremdes Material handelt. Eine Aller­ gietestung ist daher auf jeden Fall prinzipiell erfor­ derlich, und ein sechswöchiges Intervall bis zum Ab­ schluß des Allergietests ist vorgegeben. Auch kann mit der bisherigen Methode nur begrenzt Collagen zugeführt werden, nachdem es sich ja immerhin um körperfremdes Material handelt.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es statt dessen aber möglich, nicht nur Collagen direkt in die Haut einzu­ bringen, sondern auch collagenproduzierende Zellen dorthin zu bringen, wo sie Collagen produzieren sollen. Es wird also nicht immer wieder abgebaut werden, son­ dern collagenproduzierende körpereigene Zellen der Haut werden dorthin gebracht, wo Collagen produziert werden soll. Für größere Faltenbildung und Narben aber auch für son­ stige Defekte eignet sich dieses Verfahren besonders gut, da die anzuwendende Menge nicht limitiert zu wer­ den braucht, nachdem es sich schließlich um körpereige­ ne Zellen handelt, die ihrerseits ja Collagen produzie­ ren.

Die körpereigenen Zellen der Haut werden unter sterilen Bedingungen vom jeweiligen Säugetierorganismus (Mensch oder Tier) entnommen und in vitro (also in der Zellkul­ tur) explantiert. Die Explantation von Hautgewebe ist hinreichend bekannt. Sie soll daher nur kurz beschrie­ ben werden:
Es wird das Hautgewebe in möglichst kleinste Partikel ebenfalls unter sterilen Bedingungen zerteilt und in einer Suspension in das Zellkulturgefäß gegeben. In der Folge wachsen dann Einzelzellen aus diesem Gewebemate­ rial aus, die dann durch Subkultivierung und Separie­ rungen in Fibroblastenkulturen, Basalzellkulturen bzw. in Epidermiszellkulturen überführt werden können.

Mittels geeigneter Methoden ist es möglich, eine große Anzahl solcher Einzelzellen zu produzieren. In einem zweiten Verfahren wird jetzt das jeweilige Material den Zellen in einer Konzentration zugeführt, die gerade so hoch ist, daß die Zellen nicht durch den zytotoxischen Effekt der zu hohen Konzentration absterben.

In einem weiteren Schritt werden die Zellen jetzt von Zellkulturflüssigkeit getrennt, gereinigt und in eine isotonische Kochsalzlösung gegeben. Diese Lösung kann aber auch beispielsweise durch Serum (autolog) ersetzt werden.

Bei der Vorbereitung für Zellmaterial zum Aufbringen auf die Haut, also zum Einwirken in Emulsionen, Lotio­ nen, Cremes etc. (Externa) kann die Zugabe von isotoni­ scher Kochsalzlösung entfallen. Vielmehr kann durch beispielsweise hypotone Lösung das "Zerplatzen" der Einzelzellen provoziert werden, damit eine möglichst gute und gleichmäßige Verteilung innerhalb dieser Lö­ sung erzielt werden kann. Wahlweise kann, um nur ein Verfahren zu nennen, aber auch das Zellmaterial direkt in die Externa eingebracht werden, nachdem durch das Einbringen der lebenden Zellen in das Externum, welches mit Konservierungsmittel versetzt ist, zum Absterben kommen, gleich der Wirkungsweise wie in der hypotonen Kochsalzlösung. Eine entsprechende Verteilung ist zu gewährleisten.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Material für die Zelltherapie, wobei in kleinste Partikel zerteiltes Hautgewebe in einer Kulturflüssigkeit aufgenommen und die Hautgewebezellen unter sterilen Bedingungen in der Kulturflüssigkeit explantiert werden und eine Kultur von Einzelzellen gebildet wird, denen ein Wirkstoff zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Einzelzellen körpereigene Epidermiszellen, Fibro­ blasten oder Basalzellen entnommen und für das Ver­ fahren eingesetzt werden und daß die Konzentration des Wirkstoffes so hoch ist, daß die Zellen nicht durch den zytotoxischen Effekt der zu hohen Konzen­ tration absterben und daß die von der Kulturflüssig­ keit abgetrennten und gereinigten Zellen in eine isotonische Kochsalzlösung oder hypotone Lösung auf­ genommen und lysiert werden.

2. Material für die Zelltherapie, erhalten nach einem Verfahren nach Anspruch 1.