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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Einkapselung von Zellen in Agarose und Kollagen, gefolgt von Beschichten
mit Agarose, therapeutische Verfahren, welche die Zellmaterialien
verwenden, und die Herstellung davon.
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Hintergrund
und Stand der Technik
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Die Einkapselung von verschiedenen
biologischen Materialien in biologisch kompatiblen Materialien ist
eine Technik, die während
einiger Zeit verwendet worden ist, wenn auch mit beschränktem Erfolg.
Beispiele für
den Stand der Technik sind US Patent Nr. 5,227,298 (Weber et al.);
5,053,332 (Cook et al.); 4,997,443 (Walthall et al.); 4,971,83 (Larsson
et al.); 4,902,295 (Walthall et al.); 4,798,786 (Tice et al.); 4,673,566
(Gooser et al.); 4,647,536 (Mosbach et al.); 4,409,331 (Lim); 4,392,909
(Lim); 4,352,883 (Lim) und 4,663,286 (Tsang et al.). Ebenfalls von
Interesse ist
US 5,643,569 (Jain
et al.), eingereicht am 7. Juni 1995, und WO-A-95/19430, Jain et
al., diskutiert in gewisser Ausführlichkeit
das Einkapseln von sekretorischen Zellen in verschiedenen biokompatiblen
Materialien. Wie darin diskutiert, sind sekretorische Zellen Zellen,
die biologische Produkte sezernieren. Im Allgemeinen besitzen sekretorische
Zellen mindestens manche Eigenschaften von endokrinen Zellen, und
können
im Allgemeinen als äquivalent
zu Zellen, die endokriner Natur sind, behandelt werden. Die ebenfalls
anhängige
Anmeldung diskutiert z. B. die Einkapselung von Insulin-produzierenden
Zellen, bevorzugt in der Form von Inseln, in Agarose-Kollagen-Kügelchen,
die auch mit Agarose beschichtet sind. Die resultierenden Produkte
sind nützlich
bei der Behandlung von Zuständen,
bei denen ein Lebewesen eine Insulin-Therapie benötigt, wie
etwa Diabetes.
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Die Anmeldung von Jain et al. diskutiert
etwas detailliert die früheren
Ansätze,
die in der Technik in Transplantationstherapie unternommen worden
sind. Diese werden ebenso hierin zusammengefasst.
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Es sind fünf Hauptansätze bekannt, um das transplantierte
Gewebe von der Immunreaktion des Wirts zu schützen. Alle beinhalten Versuche,
das transplantierte Gewebe vom Immunsystem des Wirts zu isolieren. Die
bisher verwendeten Immunisolationstechniken umfassen: extravaskuläre Diffusionskammern,
intravaskuläre
Diffusionskammern, intravaskuläre
Ultrafiltrationskammern, Mikroeinkapselung und Makroeinkapselung. Alle
diese Techniken haben jedoch aufgrund eines oder mehrerer der nachstehenden
Probleme versagt: einer fibrotischen Reaktion des Wirts gegen das
implantierte Material, Instabilität des implantierten Materials,
begrenzte Diffusion von Nährstoffen über semi-permeable
Membranen, Permeabilität
von sekretfördernden
Mitteln und Produkt, und Dauer der Diffusionsverzögerung über semi-permeable
Membranbarrieren.
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Beispielsweise wurde 1978 von Lim
ein Mikroeinkapselungsverfahren zum Einschließen von lebenden Zellen, Geweben
und anderen labilen Membranen innerhalb einer semi-permeablen Membran
entwickelt (Lim, Research report to Damon Corporation (1978)). Lim
verwendete Mikrokapseln aus Alginat und poly-L-Lysin zur Einkapselung von Langerhans'schen Inseln. 1980
wurde die erste erfolgreiche in vivo Anwendung dieser neuen Technik
in der Diabetesforschung veröffentlicht
(Lim et al., Science 210: 908 (1980)). Die Implantation dieser mikroeingekapselten
Langerhans'schen
Inseln führte
dazu, dass in diabetischen Tieren ein normaler Blutglucosegehalt
lange aufrechterhalten wurde. Andere Forscher, die diese Experimente
wiederholten, fanden jedoch heraus, dass Alginat eine Gewebereaktion
hervorrief und konnten die Ergebnisse von Lim et al. nicht reproduzieren
(Lamberti et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101
(1984); Dupuy et al., J. Biomed. Material and Res. 2-2: 1061 (1988);
Weber et al., Transplantation 49: 396 (1990); und Doon-shiong et
al., Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). Es wird nunmehr
angenommen, dass die Wasserlöslichkeit
dieser Polymere für
die begrenzte Stabilität
und Biokompatibilität
dieser Mikrokapseln in vivo verantwortlich ist (Dupuy et al., oben,
Weber et al., oben, Doon-shiong, oben, und Smidsrod, Faraday Discussion
of Chemical Society 57: 263 (1974)).
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Vor kurzem verwendeten Iwata et al.
(Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)) Agarose
zur Mikroeinkapselung von allogenen pankreatischen Inseln und fanden
heraus, dass sie als ein Medium zur Herstellung von Mikrokügelchen
verwendet werden könnte.
In ihrer Untersuchung wurden 1500-2000 Inseln einzeln in 5% Agarose mikroeingekapselt
und in Streptozotocininduzierte diabetische Mäuse implantiert. Das Implantat überlebte
einen langen Zeitraum, und die Empfänger hielten einen normalen
Blutglucosegehalt auf unbestimmte Zeit.
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Ihr Verfahren weist jedoch eine Anzahl
von Nachteilen auf. Es ist beschwerlich und ungenau. Beispielsweise
bleiben viele Kügelchen
partiell beschichtet, und mehrere hundert Kügelchen aus leerer Agarose werden
gebildet. Somit ist zusätzliche
Zeit erforderlich, um eingekapselte Inseln von leeren Kügelchen
abzutrennen. Darüber
hinaus sammeln sich die meisten der implantierten Mikrokügelchen
in der Beckenhöhle,
und es ist eine große
Anzahl von Inseln in vollständig
beschichteten individuellen Kügelchen
erforderlich, um einen normalen Blutglucosegehalt zu erreichen.
Darüber
hinaus sind die transplantierten Kügelchen schwierig wiederzugewinnen,
tendieren dazu, zerbrechlich zu sein, und setzen nach geringfügiger Beschädigung leicht
Inseln frei.
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Ein Makroeinkapselungsverfahren ist
ebenfalls getestet worden. Makrokapseln aus verschiedenen unterschiedlichen
Materialien, wie etwa poly-2-Hydroxyethylmethacrylat,
Polyvinylchlorid-c-acrylsäure
und Celluloseacetat wurden für
die Immunisolation von Langerhans'schen Inseln hergestellt (Siehe Altman
et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman et al., Transplantation:
American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984); Ronel
et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp
et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865–871 (1983)).
In all diesen Untersuchungen wurde nur eine vorübergehende Normalisierung des
Blutglucosegehalts erreicht.
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Archer et al., Journal of Surgical
Research 28: 77 (1980), verwendeten Acrylsäurecopolymer-Hohlfasern um
vorübergehend
die Abstoßung
von Insel-Xenotransplantaten
zu verhindern. Sie berichteten, dass dispergierte neonatale Pankreastransplantate
aus Maus in Hohlfasern nach Transplantation in diabetische Hamster
lange Zeit überlebten.
Vor kurzem bestätigten
Lacy et al., Science 254: 1782–1784
(1991), deren Ergebnisse, fanden aber heraus, dass der normale Blutglucosegehalt
eine vorübergehende
Phase ist. Sie fanden heraus, dass wenn die Inseln in die Faser
injiziert werden, sie innerhalb der Hohlfaser aggregieren, mit resultierender
Nekrose im Zentralbereich der Inselmassen. Die zentrale Nekrose
schloss eine längere
Lebensdauer des Transplantats aus. Zur Lösung dieses Problems verwendeten
sie Alginat um die Inseln in der Faser zu dispergieren. Dieses Experiment
wurde jedoch nicht umfassend wiederholt. Daher ist die Funktion
der Membran als ein Transplantationsmedium für Inseln in Menschen fraglich.
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Es bestand somit ein Bedarf, die
Transplantation von sekretorischen Zellen zu erreichen, und insbesondere
das Überleben
von Allotransplantaten und Xenotransplantaten von pankreatischen
Inseln ohne die Verwendung von chronisch immunsupprimierenden Mitteln.
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In den oben diskutierten Arbeiten
von Jain et al. berichteten die Erfinder, dass die Einkapselung
von sekretorischen Zellen in einem hydrophilen Gelmaterial zu einem
funktionellen, nicht-immunogenen Material führt, das in Tiere transplantiert
werden kann und lange Zeiträume
aufbewahrt werden kann. Die Einkapselung der sekretorischen Zellen
stellte eine wirksamere und besser beherrschbare Technik für die Transplantation von
sekretorischen Zellen bereit. Die Einkapselungstechnik wurde beschrieben
als geeignet zur Einkapselung von anderen biologischen Materialien,
wie etwa Enzymen, Mikroorganismen, trophischen Mitteln, umfassend rekombinant
produzierten trophischen Mitteln, cytotoxischen Mitteln und chemotherapeutischen
Mitteln. Es wurde diskutiert, dass die eingekapselten biologischen
Mittel zur Behandlung von Zuständen
geeignet sind, welche bekanntermaßen auf das biologische Mittel
ansprechen.
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Die Anmeldung diskutiert nicht in
irgendeiner Weise den Einbau von Zellen, die biologische Materialien produzieren,
welche diffundieren können,
wobei die letzteren in einem therapeutischen Kontext nützlich sind. Es
wird hierin ein Unterschied gemacht zwischen sekretorischen Zellen,
und Zellen, die biologische Materialien produzieren, welche diffundieren
können.
Die ersteren beziehen sich, gemäß den Beispielen
in der Anmeldung von Jain, im Allgemeinen auf Produkte wie etwa
Hormone, Zellsignalsubstanzen, etc., die im Allgemeinen als biologische "Botenstoffe" erachtet werden.
Im Gegensatz dazu bezeichnen biologische Materialien, die diffundieren
können,
Materialien wie etwa MHC-präsentierte
Peptide, Zellexpressionsregulatoren, wie etwa Suppressoren, Promotoren,
Induktoren und so weiter. Dieser Unterschied wird auf dem Gebiet
der Onkologie erkannt werden, z. B. mittels der nachfolgenden Diskussion.
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Umfassende Studien in der Krebsforschung
haben Arbeiten mit heterogenen Zellextrakten und verschiedenen zellulären Komponenten
umfasst. Über
die Verwendung von monoklonalen Antikörpern hat die Technik relevante,
mit Krebs assoziierte Antigene identifiziert, z. B. GM2, TF, STn,
MUC-1, und verschiedene davon abgeleitete Epitope. Die derzeitige
Theorie postuliert, dass Epitope, die von diesen verschiedenen Tumormarkern
abgeleitet sind, nicht-kovalent mit MHC-Molekülen komplexieren, wodurch von
spezifischen cytolytischen T-Zellen ein Agrotyp gebildet wird. Dieser
Mechanismus ist den verschiedenen Mechanismen, die an der biologischen
Reaktion gegen virale Infektionen beteiligt sind, nicht unähnlich.
Siehe diesbezüglich
Van der Bruggen et al., Science 254: 1643–1647 (1991); Boon et al.,
5,405,940, und Boon et al., 5,342,774.
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Zusätzliche Forschung, parallel
zu den Arbeiten über
die Identifizierung der so genannten Krebsepitope, hat sich auf
die Regulation der Krebsproliferation konzentriert, wie etwa über Suppression
oder allgemeiner Biomodulation. Siehe z. B. Mitchell, J. Clin. Pharmacol.
32: 2–9
(1992); Maclean et al., Can. J. Oncol. 4: 249–254 (1994). Das Ziel, das
alle diese verschiedenen Ansätze
gegen Krebs eint, ist die Modifizierung der Immunreaktion des Wirts,
um so eine gewisse Verbesserung des Zustands des Patienten hervorzubringen.
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Der Schlüssel zu all diesen Ansätzen ist
die Aktivität
von einem oder mehreren biologischen Produkten, die diffundieren
können,
und die mit anderen Materialien zusammenwirken um die Immunreaktion
zu modulieren. Beispielsweise offenbaren Boon et al. und van der
Bruggen et al. kleine Peptidmoleküle. Mitchell diskutiert größere Moleküle, die
z. B. als Suppressoren wirken.
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Ein Problem mit allen therapeutischen
Ansätzen,
welche diese Materialien verwenden, ist deren Ablieferung in einer
sicheren, wirksamen Form. Dies wird nicht leicht erreicht. Es wurde
nunmehr überraschenderweise
festgestellt, dass die Techniken von Jain et al., die bei der Entwicklung
von Therapien für
Zustände, welche
Produkte von sekretorischen Zellen benötigen, so nützlich waren, nunmehr in anderen
Gebieten verwendet werden können.
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Wie dies erreicht wird, ist der Gegenstand
der Erfindung, deren ausführliche
Beschreibung folgt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Beispiel 1
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Dieses Beispiel, und diejenigen die
folgen, verwenden RENCA Zellen. Diese sind spontane Nierenadenokarzinomzellen
aus BALB/C-Mäusen,
die weithin verfügbar
sind und sowohl in vitro als auch in vivo in Kultur gehalten wurden.
Siehe Franco et al., Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181–193 (1994).
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Proben von gefrorenen RENCA Zellen
wurden bei 37°C
aufgetaut und danach in Gewebekulturkolben gegeben, die Dulbecco's Modified Medium
(D-MEM) enthielten, das mit 10% Rinderserum, Penicillin (100 u/ml) und
Streptomycin (50 μg/ml)
ergänzt
worden war, wobei erhalten wird, was nachstehend hierin als "Komplettmedium" bezeichnet wird.
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Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen
gelassen und danach mit Trypsin behandelt, gefolgt von Waschen mit
Hank's Balanced
Salt Solution und danach mit dem oben angegebenen Komplettmedium.
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Um zu bestimmen, ob die RENCA Zellen
effizient Tumoren produzieren wurden zwei BALB/C-Mäusen 106 dieser Zellen intraperitoneal injiziert.
Die Mäuse
wurden über
einen Zeitraum von 3–4
Wochen beobachtet. Vom klinischen Standpunkt her erschienen sie
während
der ersten zwei Wochen gesund und sie zeigten normale Aktivität. Danach
wurden die klinischen Manifestationen von Krebs offensichtlich.
Eine Maus starb nach 23 Tagen und die zweite nach 25 Tagen. Nach
dem Tod wurden die Mäuse
untersucht, und es wurden zahlreiche Tumoren verschiedener Größen festgestellt.
Manche der Tumoren zeigten auch Blutungen.
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Eine Probe eines Tumors, die aus
einer der Mäuse
entnommen worden war, wurde für
spätere
histologische Untersuchung in 10% Formalin fixiert.
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Beispiel 2
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Nachdem gezeigt worden war, dass
die RENCA Zellen in vivo wuchsen, wurden Studien ausgeführt um zu
bestimmen, ob diese Zellen in erfindungsgemäßen Kügelchen wachsen.
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RENCA Zellen wurden bis zur Konfluenz
wachsen gelassen, wie vorstehend beschrieben, mit Trypsin behandelt
und gewaschen, ebenfalls wie vorstehend beschrieben. Danach wurden
Proben von zwischen 60.000 und 90.000 Zellen hergestellt. Die Zellen
wurden danach bei 750 UpM zentrifugiert und Fluid wurde entfernt.
Die Zellen wurden danach in Lösungen
von 1% unvollständig
entwickeltem Kollagen suspendiert, in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei
einem pH-Wert von 6,5.
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Eine Lösung von 1% Agarose mit niedriger
Viskosität
wurde in Minimalessentialmedium (MEM, minimal essential Medium)
hergestellt, bei 60°C
gehalten und danach wurden 100 μl
davon zu der oben beschriebenen Suspension von RENCA Zellen und
unvollständig
entwickeltem Kollagen zugegeben. Die Materialien wurden danach unverzüglich als
ein einziger großer
Tropfen in steriles Mineralöl
bei Raumtemperatur transferiert. Das Gemisch bildete ein einziges,
glattes semi-festes Kügelchen.
Dieses Verfahren wurde wiederholt um eine Anzahl von Kügelchen
herzustellen.
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Nach einer Minute wurden die Kügelchen
in Komplettmedium, wie oben beschrieben, bei 37°C transferiert. Die Kügelchen
wurden danach dreimal in Minimalessentialmedium, das die oben aufgelisteten
Antibiotika enthielt, gewaschen. Die Kügelchen wurden danach über Nacht
bei 37°C
in einer angefeuchteten Atmosphäre
aus Luft und 5% CO2 inkubiert. Nach der
Inkubation wurden die nunmehr festen Kügelchen zu einem sterilen Löffel transferiert,
der 1 ml 5% Agarose in Minimalessentialmedium enthielt. Die Kügelchen
wurden 2–3 Mal
in der Lösung
gerollt um sie gleichförmig
mit Agarose zu beschichten. Bevor die Agarose fest wurde, wurden
die Kügelchen
in Mineralöl
transferiert um eine glatte Außenoberfläche zu erhalten.
Nach 60 Sekunden wurden die Kügelchen
fünfmal
mit Komplettmedium bei 37°C
gewaschen um das Öl
zu entfernen. Es folgt Inkubation über Nacht (37°C, angefeuchtete
Atmosphäre
aus Luft, 5% CO2).
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Diese RENCA-enthaltenden Kügelchen
wurden in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
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Beispiel 3
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Vor einer Durchführung von in vivo Untersuchungen
war es notwendig, zu bestimmen, ob die RENCA Zellen in den Kügelchen,
hergestellt in der oben beschriebenen Weise, wachsen würden.
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Dazu wurden Kügelchen, hergestellt wie in
Beispiel 2 diskutiert, in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium
während
eines Zeitraums von drei Wochen unter den aufgelisteten Bedingungen
inkubiert. Drei von den Kügelchen
wurden danach in kleine Stücke
geschnitten und in Standardkulturkolben kultiviert, bei direktem
Kontakt sowohl mit dem Kolben als auch mit dem Kulturmedium.
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Beobachtung dieser Kulturen zeigte,
dass die Zellen wuchsen und Standard-RENCA-Kolonien bildeten. Dies zeigte,
dass die Zellen in den Kügelchen
lebensfähig
geblieben waren.
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Beispiel 4
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Danach wurden in vivo Experimente
ausgeführt.
In diesen Experimenten wurden die Kügelchen sieben Tage bei 37°C inkubiert.
Danach empfingen Mäuse
Kügelchentransplantate.
Dazu wurde bei vier Mäusen jeweils
ein Mittenlinieneinschnitt gemacht, der intraperitoneal ausgeführt wurde.
Drei Kügelchen,
von denen jedes 60.000 RENCA Zellen enthielt, wurden transplantiert.
Die Einschnitte wurden danach verschlossen (zweilagiger Verschluss),
unter Verwendung eines absorbierbaren Nähmaterials. Die vier Mäuse (BALB/C)
waren normale männliche
Mäuse,
die zwischen 24–26
Gramm wogen und gesund zu sein schienen. Es wurden zwei Sätze Kontrollen
durchgeführt.
Beim ersten Satz empfingen zwei Mäuse drei Kügelchen, die keine RENCA Zellen
enthielten, und beim zweiten waren zwei Mäuse völlig unbehandelt.
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Drei Wochen nach der Implantation
empfingen alle Mäuse
intraperitoneale Injektionen von 106 RENCA Zellen.
Achtzehn Tage später
starb eine Kontrollmaus. Alle restlichen Mäuse wurden geopfert und untersucht.
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Kontrollmäuse zeigten zahlreiche Tumoren,
während
die Mäuse,
welche die Implantate von in Kügelchen
eingekapselten Zellen empfangen hatten, über die gesamte Bauchhöhle hinweg
nur zufällige
Knoten zeigten.
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Diese ermutigenden Ergebnisse legten
die Planung der Experimente, welche im nachfolgenden Beispiel angegeben
sind, nahe.
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Beispiel 5
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In diesen Experimenten wurde etablierter
Krebs simuliert, indem RENCA Zellen unter jeweils eine Nierenkapsel
von sechs BALB/C Mäusen
injiziert wurden. Fünfzehn
Tage später
wurden die Mäuse
in zwei Gruppen eingeteilt. Die drei Mäuse in der ersten Gruppe empfingen
jeweils drei Kügelchen,
wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Die zweite Gruppe (die Kontrollgruppe)
empfing Kügelchen,
die keine RENCA Zellen enthielten.
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Nach 4–5 Tagen erschienen Mäuse, die
RENCA Zellen-enthaltende Implantate empfangen hatten lethargisch
und ihr Fell war stachelig geworden, während die Kontrollgruppe energisch
blieb, ohne eine Veränderung
des Zustandes des Fells.
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Zehn Tage nach Implantation (25 Tage
nach Injektion von RENCA Zellen) wurden die Kontrollmäuse jedoch
träge und
wiesen aufgeblähte
Bäuche
auf. Eine der drei Kontrollmäuse
starb am Tag vierzehn nach Transplantation der Kügelchen. Es folgte Opferung
der Mäuse.
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Die Körperhöhlen der Kontrollmäuse zeigten
reichliche Blutungen, mit zahlreichen Tumoren über den Ernährungskanal, die Leber, den
Magen und die Lungen. Die gesamte Bauchhöhle war aufgrund von üppigem Tumorwachstum
nicht mehr wahrzunehmen. Die Mäuse,
die Kügelchen
mit eingekapselten RENCA Zellen empfangen hatten, zeigten jedoch
keine Blutungen und nur ein paar Knoten auf den Ernährungskrebsgeschwüren. Ein
Vergleich der Test- und Kontrollgruppen zeigte, dass sich in der
Testgruppe Knoten nicht weiterentwickelt hatten.
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Beispiel 6
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Das Wachstum von frei angeimpften
RENCA Zellen wird inhibiert, wenn sie zusammen mit eingekapselten
RENCA Zellen inkubiert werden. Es wurde ein weiterer Satz an Experimenten
ausgeführt,
um zu bestimmen, ob diese Wirkung mit anderen Zellen beobachtet
werden kann.
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Eine Adenokarzinomzelllinie, d. h.
MMT (mouse mammary tumor) wurde von der American Type Culture Collection
erhalten. Eingekapselte MMT Zellen wurden, wie oben beschrieben,
mit MMT Zellen hergestellt, wobei Kügelchen mit 120.000 oder 240.000
Zellen pro Kügelchen
produziert wurden. Nach der Herstellung der Kügelchen wurden sie verwendet
um zu bestimmen, ob sie Proliferation von RENCA Zellen in vitro inhibieren
würden.
In genaueren Worten wurden zwei Petrischalen mit sechs Vertiefungen
vorbereitet, mittels Animpfen mit 1 × 104 RENCA
Zellen pro Vertiefung in 4 ml Medium. In jeder Schale dienten drei
Vertiefungen als Kontrolle und drei als Test. Eine der drei Kontrollvertiefungen
in jeder Schale empfing ein Kügelchen.
Jede der anderen Vertiefungen empfing entweder zwei oder drei leere
Kügelchen.
Die zweite Vertiefung wurde ähnlich
behandelt, wobei die Vertiefungen ein, zwei oder drei Kügelchen,
die 120.000 oder 240.000 MMT Zellen enthielten, empfingen. Die Vertiefungen
wurden eine Woche bei 37°C
inkubiert, wonach RENCA Zellen mit Trypsin behandelt, gewaschen
und unter Verwendung einer Zählkammer
ausgezählt
wurden. Die Ergebnisse sind wie folgt:
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Beispiel 7
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Den Ergebnissen von Beispiel 6 folgend
wurden die gleichen Experimente durchgeführt, unter Verwendung von 1 × 104 MMT Zellen anstelle von RENCA Zellen. Das
Experiment wurde genau gleich wie Beispiel 6 durchgeführt. Die
Ergebnisse sind nachstehend angegeben.
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Diese Ergebnisse ermutigten zu einem
in vivo Experiment. Dieses wird in Beispiel 8 erläutert.
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Beispiel 8
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RENCA Zellen, wie in den vorstehenden
Beispielen verwendet, sind Nierenkrebszellen. Um die allgemeine
Wirksamkeit der Erfindung vollständiger
zu zeigen, wurden Arbeiten unter Verwendung eines unterschiedlichen
Typs von Krebszellen ausgeführt.
In genaueren Worten wurden Adenokarzinomzellen verwendet.
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Eine Maus-Brusttumor-Zelllinie (MMT)
wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Unter Verwendung
der oben angegebenen Protokolle wurden Implantate hergestellt, die
120.000 Zellen pro Kügelchen
und 240.000 Zellen pro Kügelchen
enthielten.
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Das verwendete Versuchsmodell war
das Mausmodell, oben. Zweiundzwanzig Mäuse wurden in Gruppen von 4,
9 und 9 eingeteilt. Die erste Gruppe, d. h. die Kontrollen, wurden
weiter in drei Gruppen von zwei, eins und eins eingeteilt. Die erste
Untergruppe empfing Implantate aus einem Kügelchen, das keine Zellen enthielt.
Eine Maus empfing zwei leere Kügelchen
und eine empfing drei leere Kügelchen.
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In der Versuchsgruppe A (9 Tiere)
enthielten die Kügelchen
120.000 Zellen, während
in Gruppe B die Kügelchen
240.000 Zellen enthielten. Innerhalb der Gruppen "A" und "B" gab
es je drei Untergruppen, von denen jede drei Mäuse enthielt. Die Untergruppen
empfingen ein, zwei oder drei Kügelchen
mit MMT Zellen.
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Einundzwanzig Tage nach der Implantation
empfingen alle Tiere Injektionen von 40.000 RENCA Zellen. Unmittelbar
nach der Injektion waren die Mäuse
lethargisch, mit stacheligem Haar. Dies hielt etwa fünf Tage
an, wonach normales Verhalten beobachtet wurde.
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Nach zwanzig Tagen wiesen Kontrollmäuse aufgeblähte Bäuche und
extrem stacheliges Haar auf. Eine Kontrollmaus starb 25 Tage nach
der Injektion, während
die restlichen Kontrollmäuse
als im Endstadium befindlich erschienen. Alle Mäuse wurden geopfert und die
Tumorentwicklung wurde beobachtet. Diese Beobachtungen sind nachstehend
aufgezeichnet:
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Diese Ergebnisse zeigen, dass von
achtzehn getesteten Mäusen
dreizehn keine Erkrankung zeigten. Von den Mäusen in Gruppe (A) wies eine
Maus ein paar Knoten auf und eine andere Maus wies ein paar Tumoren
auf. Eine Maus, die zwei Kügelchen
empfangen hatte, wies ein paar Tumoren auf.
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In Gruppe B wiesen eine Maus, die
ein Kügelchen
empfangen hatte, und eine Maus, die zwei Kügelchen empfangen hatte, ein
paar Tumoren auf, die mit Därmen
verheddert waren. Eine der Mäuse,
die drei Kügelchen
empfangen hatte, hatte einen großen festen Tumor entwickelt
und war anscheinend sehr krank.
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Nichtsdestoweniger zeigten die Ergebnisse
insgesamt, dass die eingekapselten Maus-Brustkrebszellen die Tumorbildung
inhibierten.
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Beispiel 9
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Wie oben nahe gelegt, führt die
Praxis der Erfindung zur Produktion irgendeines Materials oder Faktors,
das bzw. der die Tumorzellproliferation inhibiert und/oder verhindert.
Dies wurde in dem nachfolgenden Experiment weiter untersucht.
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Zusätzliche Kügelchen wurden hergestellt
wie oben in Beispiel 2 beschrieben, außer dass unvollständig entwickeltes
Kollagen nicht aufgenommen wurde. Diese Kügelchen sind daher Agarose/Agarose-Kügelchen.
RENCA Zellen, wie oben beschrieben, wurden in diese Kügelchen
eingebaut, wiederum wie oben beschrieben.
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Zwei Sätze von drei Platten mit je
sechs Vertiefungen wurden danach als Kontrolle und Versuchsgruppen
verwendet. In der Kontrollgruppe wurden die Vertiefungen mit 4 ml
RPMI Komplettmedium (10% fötales Kälberserum
und 11 ml/l Penicillin) gefüllt.
Jede Kontrollgruppe wurde danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
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In der Versuchsgruppe war das RPMI
Komplettmedium konditioniert, durch Zugabe von Material, welches
erhalten worden war durch Inkubation von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden
Kügelchen (120.000
Zellen pro Kügelchen)
in einer 35 × 100
mm Petrischale, enthaltend 50 ml RPMI Komplettmedium. Nach fünftägiger Inkubation
wurde Medium von diesen Schalen gesammelt, und 4 ml davon wurden
in jede Testvertiefung gegeben. Diese Vertiefungen wurden danach
mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
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Alle Platten (sowohl Kontrollen als
auch Versuche) wurden fünf
Tage bei 37°C
inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurden die Zellen mit Trypsin
behandelt, gewaschen und unter Verwendung einer Zählkammer
ausgezählt.
Die Zellen jeder Vertiefung in den Schalen wurden nach der Trypsinbehandlung
gepoolt und ausgezählt,
das Ergebnis war wie folgt.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Zellen, wenn sie in z. B. den Kügelchen
der Erfindung restringiert sind, irgendeinen Faktor produzieren,
der zu einer Suppression der Tumorzellproliferation führt. Dieser
Restriktionsinhibitionsfaktor wird von den Zellen aufgrund ihres
Einschlusses in dem Kügelchen
produziert und unterscheidet sich von anderen Materialien, wie etwa
einem Kontaktinhibitionsfaktor, welche produziert werden, wenn Zellen
einander kontaktieren.
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Beispiel 10
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Das oben angegebene Experiment zeigte,
dass das Wachstum von RENCA Zellen in konditioniertem Medium etwa
die Hälfte
des Wachstums der Zellen in Kontrollmedium betrug. Die hierin angegebenen
Experimente untersuchten, ob der wachstumsinhibierende Faktor nach
Einfrieren des konditionierten Mediums aktiv bleiben würde.
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Konditioniertes RENCA Medium wurde
hergestellt durch fünftägige Inkubation
von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden Kügelchen. Die Inkubation erfolgte
in 35 × 100
mm Petrischalen mit 50 ml RPMI Komplettmedium bei 37°C. Nach der
Inkubation wurde das Medium gesammelt und bei –20°C aufbewahrt. Konditioniertes
Medium wurde hergestellt durch Inkubation von immunisolierten Zellen,
die MMT (mouse mammary tumor) Zellen enthielten. Die Kügelchen
enthielten 240.000 Zellen pro Kügelchen,
alle anderen Bedingungen waren gleich.
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Eingefrorenes Medium wurde bei 37°C aufgetaut
und danach in den nachfolgenden Tests verwendet. Drei Schalen mit
sechs Vertiefungen wurden für
jede Behandlung verwendet, d. h. (1) RPMI Kontrollmedium, (2) eingefrorenes
konditioniertes RENCA Medium, und (3) eingefrorenes konditioniertes
MMT Medium. Insgesamt wurden 4 ml Medium in jede Vertiefung pipettiert.
Alle Vertiefungen wurden danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft
und fünf
Tage bei 37°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurden zwei Probenschalen von jeder Vertiefung
genommen, mit Trypsin behandelt, gepoolt und in einer Zählkammer
ausgezählt.
Nach acht Tagen wurden die restlichen drei Schalen jeder Vertiefung
auf die gleiche Weise getestet.
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Die Ergebnisse folgen:
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Wenn diese Ergebnisse mit denen von
Beispiel 6, oben, verglichen werden, wird erkannt werden, dass während eingefrorenes/aufgetautes
konditioniertes RENCA Medium das Wachstum nicht im gleichen Ausmaß inhibierte
wie nichteingefrorenes Medium (vergleiche die Beispiel 6 und 7),
es nichtsdestoweniger das Wachstum inhibierte. Eingefrorenes konditioniertes
Medium unter Verwendung von MMT Zellen inhibierte das Wachstum sogar
stärker
als nicht-eingefrorenes konditioniertes MMT Medium. Diese Ergebnisse
zeigen, dass von achtzehn getesteten Mäusen dreizehn keine Erkrankung
zeigten. Von den Mäusen
in Gruppe (A) wies eine Maus ein paar Knoten auf und eine andere
Maus wies ein paar Tumoren auf.
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Das Vorstehende beschreibt die Herstellung
von implantierbaren Kügelchen,
welche einen oder mehrere Typen von Zellen enthalten, welche ein
biologisches Produkt erzeugen, das diffundieren kann, wie dieser Ausdruck
hierin definiert ist. Das biologische Produkt, das diffundieren
kann, ist eines, welches eine Wirkung auf das Lebewesen hat, in
welches das Kügelchen
implantiert wird. Bevorzugt ist diese Wirkung eine Immunmodulation,
wie etwa die Stimulation einer Immunreaktion oder die Suppression
einer Reaktion. Im Falle von Krebs kann das biologische Produkt,
das diffundieren kann, beispielsweise ein Peptid sein, das mit MHC-Molekülen auf
Krebszellen in einem Lebewesen komplexiert, wodurch eine CTL-Reaktion
dagegen hervorgerufen wird, die wiederum zu einer Verringerung der
Tumorbelastung in dem Lebewesen führt. Das Produkt, das diffundieren
kann, kann auch ein Suppressor von Tumorwachstum sein. In Verbindung
mit dieser Form einer Therapie ist es möglich, wenn auch nicht notwendigerweise
bevorzugt, die implantierten Kügelchen
in einem oder in der Nähe
eines identifizierten Tumors zu positionieren.
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"Biologisches
Produkt, das diffundieren kann",
wie hierin verwendet, bezeichnet Materialien wie etwa Proteine,
Glycoproteine, Lipoproteine, Kohlehydrate, Lipide, Glycolipide und
Peptide. In genaueren Worten, sind Materialien wie etwa Antikörper, Cytokine,
Hormone, Enzyme und so weiter beispielhaft, aber keinesfalls der
einzige Typ an aufgenommenen Materialien. Ausgeschlossen sind die
gut bekannten "Endprodukte" von zellulären Vorgängen, wie
etwa CO2 und H2O.
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Wie die Experimente zeigen, können die
implantierbaren Kügelchen
auch prophylaktisch verwendet werden. Es ist gut bekannt, dass zumindest
ein Teil der Population der Krebspatienten für ein erneutes Auftreten des
Zustandes anfällig
ist. Die hierin beschriebenen Experimente zeigen, dass die Implantate
das Auftreten oder das erneute Auftreten von Krebs verhindern können, über die
biologische Wirkung, welche das Produkt, das diffundieren kann,
auf das System des Lebewesens ausübt.
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Die Diskussion der Erfindung hat
sich auf in vivo Ansätze
konzentriert. Es muss jedoch auch verstanden werden, dass es viele
in vitro Ansätze
für die
Erfindung gibt, von denen manche nachstehend hierin diskutiert werden.
Beispielsweise ist es gut bekannt, dass viele Zellen, welche erwünschte Produkte
produzieren, bei Kultivierung in vitro die Gegenwart von Nährzellen
benötigen.
Mit derartigen Nährzellen
gibt es immer wieder Probleme. Sie können schneller wachsen als
die erwünschten
Zellen, was de facto zu einer "Strangulierung" der interessierenden
Materialien führt.
Weiterhin kann es ein Problem geben mit verschiedenen toxischen
Produkten, die von den Lagen von Nährzellen produziert werden.
Die implantierbaren Kügelchen
der Erfindung wirken praktisch als zelluläre Inkubatoren, wobei sie die
eingebauten Zellen schützen,
während
sie ermöglichen,
dass die Produkte, die diffundieren können, sich in ein Kulturmedium
hinein bewegen, wo sie z. B. gesammelt werden können.
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Wie oben angegeben, erfordert die
Zubereitung der implantierbaren Kügelchen zunächst das Suspendieren der Zellen
in Lösung,
bevorzugt in einer wässrigen
Lösung
von Kollagen. Bevorzugt ist das Kollagen unvollständig entwickelts
Kollagen, in einer Lösung
von etwa 0,5 bis etwa 2%. In Abhängigkeit
des Typs der verwendeten Zellen wird die Anzahl an Zellen in der
Lösung
zu einem gegebenen Zeitpunkt, und somit die Anzahl an Zellen in
einem Kügelchen,
variieren. Bevorzugt werden von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen
pro Kügelchen
verwendet, stärker
bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000. Am meisten bevorzugt
werden etwa 40.000 bis etwa 60.000 Zellen verwendet.
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Nach dem Suspendieren der Zellen
in der Kollagenlösung
wird eine Agaroselösung
zugegeben. Bevorzugt liegt diese Agaroselösung in einem Bereich von etwa
0,5% bis etwa 5%, bevorzugt um 1%. Bei tropfenweiser Zugabe dieses
Gemisches auf oder in inerte Materialien wie etwa TEFLON® oder
Mineralöl
bildet sich ein Kügelchen.
Dieses Kügelchen
ist semi-fest. Das semi-feste Kügelchen
wird danach in ein steriles Medium transferiert, bevorzugt eines,
das Antibiotika enthält,
gewaschen, und zur Polymerisation von Kollagen inkubiert. Die Polymerisation
von Kollagen ist ein gut untersuchtes Phänomen, und die Bedingungen,
unter denen sie stattfindet, brauchen hierin nicht genau dargelegt
werden.
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Nach dem Festwerden des Kügelchens
wird es danach mit Agarose beschichtet, bevorzugt indem es in einer
Agaroselösung
gerollt wird. Eine bevorzugte Weise, um dies zu bewirken ist ein
einfacher, mit TEFLON®-beschichteter Löffel, der
eine Agaroselösung,
bevorzugt 5% bis 10%, enthält.
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Die vorstehende Diskussion bezüglich biologischer
Produkte, die diffundieren können,
sollte nicht als eingeschränkt
auf Wildtypmaterialien ausgelegt werden. Man kann beispielsweise
genauso einfach transformierte oder transfizierte Wirtszellen einbauen,
wie etwa eukaryontische Zellen (z. B. 293 Zellen, CHO Zellen, COS
Zellen) oder auch prokaryontische Zellen (z. B. E. coli), die behandelt
wurden um heterogenes Protein zu produzieren, oder modifiziert wurden, über z. B.
homologe Rekombination, um erhöhte
Mengen von gewünschten
biologischen Produkten zu produzieren. Andere Materialien, wie etwa
Hybridome, können
ebenfalls verwendet werden, wobei das biologische Produkt, das diffundieren
kann, ein monoklonaler Antikörper
ist.
