RU2591518C2

RU2591518C2 - Усовершенствованный способ получения макрогранул

Info

Publication number: RU2591518C2
Application number: RU2014133367/10A
Authority: RU
Inventors: Лоуренс ГЭЗДА; Мелисса ЛЭРЭМОР; Тимоти ХЭМИЛТОН; Бэрри Смит
Original assignee: Де Рогозин Инститьют Инк.
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2016-07-20
Also published as: KR20140122742A; CA2851023A1; EP2809782A4; ES2647613T3; BR112014015804B1; RU2014133367A; AU2013202026A1; JP2015510396A; CN103975059B; WO2013116306A1; PL2809782T3; DK2809782T3; CA2851023C; EP2809782B1; IL231834A; BR112014015804A2; US20130202802A1; MX350593B; EP2809782A1; KR101722824B1

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения композиции вещества, содержащей образец живых клеток в грануле. Способ включает смешивание первого образца агарозы с живыми клетками с образованием суспензии, перенос суспензии в первый образец минерального масла для образования гранулы, извлечение гранулы из первого образца, удаление минерального масла с гранулы, перенос гранулы во второй раствор агарозы, покрытие гранулы вторым раствором агарозы, извлечение гранулы из второго раствора и дозирование гранулы с покрытием во второй образец минерального масла. При этом образец минерального масла поддерживают при температурном градиенте, так что указанная гранула перемещается в минеральном масле по направлению от более высокой температуры, от 20 до 30°C, к более низкой температуре, от 0 до -8°C. Изобретение обеспечивает получение гранул с более однородной формой, а также автоматизацию процесса. 9 з.п. ф-лы., 7 ил., 8 пр.

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет по первоначальной заявке США №61/592949, поданной 31 января 2012 года, полностью включенной посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к усовершенствованным способам получения композиции вещества, которая содержит клетки, в частности секреторные клетки, заключенные в проницаемую гранулу или другую структуру, которую затем покрывают агарозой. Гранула может содержать агарозу или состоять из нее. Для гранул особенно предпочтительна агароза Litex.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Показано, что получение композиций вещества, которые содержат жизнеспособные клетки, заключенные в проницаемые среды, является важным в различных областях, таких как терапия диабета, лечение рака и поддержание стволовых клеток. В этом отношении см., например, следующее: заменяющий патент 40555; патенты США №7838291; 6818230; 6808705; 6303151; 6224912; 5888497 и 5643569 и опубликованная заявка на патент 2007/0071732, все из которых включены во всей полноте посредством ссылки.

Способы получения данных композиций вещества, называемых далее в данном документе "инкапсулятами", по существу одинаковы, независимо от типа используемой клетки. После выделения или хранения представляющих интерес клеток их суспендируют в водном растворе агента, такого как агароза, коллаген или их комбинации, или помещают на материал, такой как желатиновая губка. При использовании водных растворов полутвердые гранулы, содержащие представляющие интерес клетки, формуют путем помещения суспензии в минеральное масло. При использовании желатиновой губки продукт, содержащий клетки, сворачивают в сферу, после чего на него заливают агарозу с образованием гранулы.

Затем гранулы приводят в контакт с раствором агарозы, например, в тефлоновой ложке. Гранулы вращаются в смеси с образованием того, что в данной области называется, как указано выше, макрогранулами, покрытых агарозой.

За первоначальными идеями, как показано, например, в RE 40555 и патенте США №5888497, в которых сообщается об инкапсуляции секреторных клеток, таких как инсулинпродуцирующие островки и раковые клетки, последовали усовершенствования, включающие инкапсулирование стволовых клеток, как показано в патенте США №7838291, а также посредством усовершенствований в используемых материалах, как видно, например, из опубликованной заявки на патент 2007/0071732; тем не менее, продолжает существовать необходимость в усовершенствовании методологии получения данных полезных материалов.

Одним усовершенствованием, которое очень желательно в данной области, является способность к автоматизации ручного способа.

В ходе автоматизации способа получения авторы изобретения разработали специальные инструменты, облегчающие способ получения. Помимо этого, авторы изобретения обнаружили, что при завершении способа посредством помещения макрогранул в сосуд с минеральным маслом при температурном градиенте можно получать макрогранулы более однородной формы и даже текстуры, чем считалось возможным.

В последующем описании будет видно, как это выполняют.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показано автоматическое дозирование клеток и агарозы в многолуночную матрицу, которая содержит минеральное масло.

На фиг. 2a-2c представлены разные изображения предпочтительного воплощения "инструмента-воронки" по изобретению.

На фиг. 3 показано второе воплощение инструмента-воронки.

На фиг. 4а и 4b показаны разные воплощения инструмента-соломинки по изобретению.

На фиг. 5 изображено краткое описание способа по изобретению.

На фиг. 6 показано устройство, используемое для поддержания температурного ингредиента при работе с изобретением.

На фиг. 7 изображены уровни продуцирования инсулина из гранул, полученных при использовании разных концентраций и типов агарозы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Сделана ссылка на патенты США, процитированные выше, в которых во всех подробно описаны ручные методики получения макрогранул, которые содержат различные типы клеток, такие как секреторные клетки, как там определено. Изобретение, описанное в данном документе, модифицирует данные способы путем замены конечной стадии приведения покрытых агарозой агарозных гранул в контакт с минеральным маслом в ложке или на тефлоновой поверхности на сосуд, содержащий минеральное масло, поддерживаемый при температурном градиенте, как описано ниже.

Макрогранулы, такие как описаны в данных патентах, могут быть также получены с помощью робота или посредством автоматизации. Один такой подход описан в данном документе.

В одном воплощении, как изображено на фиг. 1, роботизированный дозатор, такой как матрица пипеток, дозирует секреторные клетки в многолуночный планшет, такой как стандартный 96-луночный планшет. Затем в лунки добавляют расплавленную агарозу. Затем клетки и расплавленную агарозу переносят посредством, например, автоматизированных устройств, таких как устройство для одновременного пипетирования нескольких образцов, в устройства, содержащие минеральное масло, такие как однолуночные или многолуночные контейнеры, например 96-луночные планшеты, с образованием гранул.

Затем гранулы извлекают из лунок, предпочтительно посредством использования так называемого "инструмента-воронки", изображенного на фиг. 2а-с и 3. Инструмент-воронка, на котором подробно останавливаются ниже, известен из уровня техники, например из US 20010015372 A1, 23.08.2001. Указанный инструмент сконструирован таким образом, что не нарушает поверхность гранулы.

В другом воплощении на дне лунки расположено устройство выпуска, посредством которого гранулы покидают лунку, и данные гранулы могут быть использованы на последующих стадиях. Еще в одном воплощении гранулы, полученные в результате обсуждаемого выше способа, могут быть перенесены на поверхность минерального масла посредством автоматизированных устройств, таких как подвижная платформа, а также извлечены из устройств, содержащих минеральное масло, посредством автоматизированных систем.

После сбора с помощью инструмента-воронки или прохождения через устройство выпуска и удаления какого-либо прилипшего минерального масла путем промывания соответствующим раствором, таким как сбалансированный солевой раствор, гранулы помещают в лунки, содержащие новую подогретую агарозу. После этого гранулы извлекают вместе с теплой агарозой, предпочтительно используя так называемый "инструмент-соломинку", как показано на фиг. 4а и 4b, применяя протекающее в мягких условиях всасывание, и дозируют в сосуды, содержащие минеральное масло при контролируемом температурном градиенте. Данный инструмент известен из уровня техники, например из US 20080202631 A1, 28.08.2008.

Сосуд, содержащий минеральное масло, может представлять собой, например, пробирку, кювету, химический стакан или любой другой подходящий объект, хотя пробирки и кюветы различных размеров являются предпочтительными. Материал, используемый для изготовления данных контейнеров, то есть пробирок, кювет и т.д., может быть различным. Особенно предпочтительным является стекло, хотя можно использовать другие материалы, например, материалы, покрытые веществом, обеспечивающим гидрофильный слой.

Температурный градиент в сосуде можно поддерживать любым способом, известным в современном уровне техники. Ключевой момент состоит в том, чтобы температура минерального масла наверху сосуда была выше, чем на его дне. Температура и количество градиента будет варьироваться в зависимости от, например, длины сосуда, типа инкапсулированных клеток, типа используемой агарозы и т.д. Факторы, которые важны для установки этих значений, включают, например, температуры, при которых инкапсулированные клетки являются жизнеспособными, температуры, при которых будет затвердевать используемая агароза, и т.д. Температура на старте градиента предпочтительно составляет от 20°C до 80°C, более предпочтительно от 20°C до 50°C и даже более предпочтительно от 20°C до 40°C. В идеале стартовая температура составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 25°C. Температура на дне сосуда может также варьироваться, находясь в диапазоне от, например, 0°C до -10°C, более предпочтительно от 0°C до -8°C и наиболее предпочтительно от приблизительно 0°C до приблизительно -2°C. Общая разница между самой высокой и самой низкой температурами предпочтительно составляет от 20°C до 50°C, более предпочтительно от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C.

Графические материалы, которые являются частью данной заявки, будут прояснять предшествующее описание.

На фиг. 1 показано, как клетки вместе с агарозой дозируют в лунки планшетов. После удаления минерального масла посредством, например, промывания или отсасывания, либо посредством устройства выпуска, обсуждаемого выше, "инструмент-воронку", на который ссылаются выше, и который показан на фиг. 2а - 2c и 3, вводят в лунку таким образом, чтобы извлечь гранулы с заключенными в них клетками. К данному инструменту-воронке с одного конца присоединен источник вакуума, который не нарушает поверхность гранулы, для того, чтобы облегчить ее извлечение.

Гранулу, состоящую из одного слоя агарозы и клеток, помещают посредством так называемого "инструмента-воронки" в новую лунку, заполненную нагретой агарозой, которая служит в качестве второго слоя или покрытия из агарозы. Гранулу извлекают вместе с теплой агарозой, предпочтительно путем использования "инструмента-соломинки", такого как один из инструментов, показанных на фиг. 4а и 4b, предпочтительно с помощью протекающего в мягких условиях всасывания, и гранулу дозируют в сосуд, содержащий минеральное масло при температурном градиенте. Температурный градиент может поддерживаться, например, устройством, показанным на фиг. 5, но специалисту в данной области техники будут знакомы другие варианты. Когда макрогранула проходит сосуд и достигает дна, чтобы извлечь макрогранулы для промывания в среде, можно использовать продолговатую форму инструмента-воронки с всасыванием, или, как отмечено выше, для извлечения гранулы можно использовать устройство выпуска. В этот момент макрогранулы готовы к использованию, хотя в различных ситуациях может быть предпочтительным дать возможность клеткам пролиферировать и/или созревать внутри гранул до тех пор, пока не будет присутствовать их достаточное число, или до тех пор, пока данные клетки не будут экспрессировать определенный продукт. Данный период времени мог бы находиться в диапазоне, например, от недели до нескольких месяцев.

Теперь, что касается графических материалов заявленного изобретения, на фиг. 2а, 2b, 2c и 3 показаны различные изображения устройств согласно изобретению, так называемый "инструмент-воронка".

Что касается фиг. 2а, показан инструмент-воронка 40. Описание инструмента как "инструмента-воронки" происходит от сходства отрицательной конусной секции 41 с воронкой. На одном конце представлен отрицательный конусный сегмент 41, с ободком 42, присоединенным к коническому концу 41. Конический конец 41 соединяется с полой, продольной секцией 43, которая приспособлена для прохода через нее текучей среды, такой как воздух.

Как показано на фиг. 2а, полая продольная секция 43 проходит через все устройство. Видно кольцевое устройство 44, расположенное приблизительно от 2/3 до 3/4 пути вдоль длины инструмента-воронки относительно отрицательного конического конца. Кольцевое устройство 44, а также несколько других характеристик, описанных в данном документе, являются артефактами процесса изготовления и не влияют на функционирование устройства.

Кольцевое устройство 44, тем не менее, отмечает точку, в которой расширяется окружность продольного устройства. Часть устройства, представленная номером 45, соответствует муфтовому концу, который при работе соединяет инструмент с источником текучей среды, например, воздуха, таким как источник вакуума. Соединительное отверстие 46 имеет самую широкую окружность по сравнению с любой частью устройства и служит для осуществления соединения, например, с устройством создания вакуума. Внутренние структуры, такие как представлены на фиг. 2c, предложены для облегчения присоединения устройства создания вакуума. Эти структуры могут варьироваться в зависимости от используемого аппарата.

В устройстве видны гребенчатое устройство 47, а также серия расположенных через равные промежутки выступов 48а, b и с, все из которых являются, как и кольцевое устройство 44, артефактами изготовления; тем не менее, данные выступы также служат для того, чтобы помогать удерживанию собранных инструментов на месте, например, в дозирующем штативе.

Внутренняя часть устройства может быть видна как на фиг. 2b, так и фиг. 2c, где может быть видно, что в действительности устройство является полым по всей своей длине. На изображении отрицательного конического сегмента на фиг. 2c более подробно показано, как он сужается к точке, где окружность несколько меньше, чем объект, который устройство должно захватывать, например, гранула.

При работе устройство 40 соединяется через соединительный конец 46, например, с устройством вакуумного насоса, и располагается вертикально над объектом, который нужно извлечь, таким как гранула. Устройство вакуумного насоса (не показано) удаляет какой-либо воздух внутри инструмента и позволяет захватывать гранулы, например, посредством регулирования силы всасывания, создаваемой вакуумом, конфигурация отрицательного конического конца 41 позволяет извлекать гранулу, такую как полутвердая агарозная гранула, из одного положения и перемещать в другое положение, например, раствор агарозы для покрытия. В этот момент давление вакуума изменяют посредством, например, подачи воздуха в продольное устройство 45, которое служит для вытеснения гранулы в раствор агарозы из конического конца 41 без каких-либо изменений в конфигурации гранулы.

На фиг. 3 показано другое воплощение устройства фиг. 2а-2c. Данное устройство, полученное с помощью средств изготовления, отличающихся от воплощения фиг. 2а-2c, демонстрирует гребенчатое устройство вдоль продольной секции 43. Также следует отметить, что существуют варианты кольцевого устройства, а также гребенчатого устройства 47 и 48а-с. Отрицательный конический конец 41 и его ободок, а также соединительный конец 45 и соединительное отверстие, тем не менее, функционируют таким же образом, как сравнимые структуры фиг. 2а-2c.

На фиг. 4а и 4b изображены воплощения устройства, известного далее как "инструмент-соломинка". Теперь, что касается фиг. 4а, показан инструмент-соломинка 50. Данный инструмент демонстрирует по существу цилиндрическую геометрию вдоль полой продольной оси 51 соединительного конца 52 и приемного конца 53.

Инструмент-соломинка включает углубленное пространство 54, которое простирается вдоль продольной оси 51, открываясь на приемном конце 53.

Приемное пространство 54 простирается вдоль продольной оси, и к нему примыкает секция канала 55, которая может иметь меньший диаметр, чем приемное пространство. Данная секция канала 55 соединяется с соединительным устройством 52, и комбинация "52," "54" и "55" образует рабочий канал, который принимает изменения давления текучей среды, такой как воздух или другой газ. При работе соединительное устройство 52 соединяются с устройством, способным к изменению давления текучей среды в инструменте-соломинке, таким как пневматический насос. Затем инструмент-соломинку располагают над объектом, таким как гранула, и при изменении давления гранулу извлекают с помощью инструмента-соломинки. Следует отметить, что диаметр отверстия на приемном конце 53 достаточно велик, чтобы поднять объект, например, гранулу, и дать возможность грануле двигаться вертикально в продольной полости инструмента. Как только гранула перемещается в нужное положение, второе изменение давления обуславливает сброс гранулы и позволяет повторно использовать инструмент-соломинку.

Фиг. 4а и 4b различаются тем, что конфигурации соединительного устройства 52 являются различными; тем не менее, различие в конфигурациях является результатом процессов изготовления и не влияет на работу устройства.

В каждом устройстве пунктирными линиями показано приспособление инструмента-соломинки к приему выбранного устройства присоединения вакуума. Изображен углубленный канал 56, способный к приему соединительного устройства, такой как расширяемое О-образное кольцо. Характеристикой устройства также является устройство 57 для препятствования продвижению пипетки. Данная "полочка пипетки" задерживает прохождение текучей среды, например, воздуха, в пипетку или другие устройства доставки.

Следующие далее примеры следует воспринимать как типичные, но не ограничивающие изобретение, в том виде, как оно описано в данном документе.

ПРИМЕР 1

Агарозу в виде порошка (Litex HSB-LV) растворяли в минимально обогащенной среде до концентрации, составляющей либо 0,8%, либо 4,5% (мас./об), а затем автоклавировали при 121°C в течение 20 минут. Таким образом получали вязкие расплавленные растворы. Растворы агарозы охлаждали и поддерживали при 51-53°C или 61-63°C соответственно.

В лунку добавляли суммарное количество клеток RENCA (рака почки), составляющее 150000, после чего добавляли 0,25 мл 0,8% раствора агарозы с образованием суспензии, а затем данную суспензию клеток/агарозы дозировали либо в минеральное масло комнатной температуры в пластиковой емкости, либо в 96-луночный пластиковый планшет с глубокими лунками, предварительно заполненный минеральным маслом комнатной температуры.

Формовали агарозные макрогранулы, содержащие клетки RENCA, в виде округлых гранул, с гладкими поверхностями и равномерно распределенными клетками. Затем минеральное масло отсасывали с макрогранул, и макрогранулы промывали клеточной культуральной средой RPMI.

При покрытии макрогранул использовали раствор 4,5% мас./об. Агароза для покрытия была такого же типа, что и агароза, которую использовали для гранул; тем не менее, следует отметить, что они могут отличаться.

Для осуществления ручного способа получения гранул гранулы, полученные выше, вращали в пластиковой ложке, которая содержала 1,0 мл 4,5% агарозы, которую поддерживали при 61-63°C, после чего их капали в минеральное масло комнатной температуры.

В способе по изобретению материал покрытия поддерживали при 61-63°C и переносили в 24-луночный планшет. Затем "инструмент-воронку", показанный на фиг. 2а и рассмотренный выше, использовали для извлечения гранул из минерального масла комнатной температуры и для помещения их в раствор агарозы для второго покрытия после отмывки гранул для удаления минерального масла. Инструмент-соломинку, изображенный на фиг. 4а, использовали вместе с мягким всасыванием для извлечения гранул вместе с 0,5 мл агарозы в сосуд, содержащий минеральное масло, поддерживаемое при температурном градиенте.

Макрогранулы дозировали из инструмента-соломинки сверху градиента минерального масла, которое поддерживали при варьирующих температурах, как рассмотрено ниже. По мере того, как гранула двигалась вниз сквозь минеральное масло, покрытие отвердевало на грануле, с образованием сферы. Температура минерального масла снижалась от верхней части до дна сосуда до низкой температуры на дне, как также описано ниже. Затем агарозно-агарозные макрогранулы извлекали из сосуда, используя инструмент-воронку фиг. 2а, и затем промывали в средах. Затем полученные макрогранулы были готовы для рутинной тканевой культуры.

ПРИМЕР 2

Проводили серию различных экспериментов с использованием описанного выше температурного градиента.

После того, как гранулы извлекали и промывали, как обсуждалось выше, их тестировали на предмет метаболической активности. Данную оценку проводили, используя стандартный анализ с использованием МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид), хорошо известный в данной области техники. Метаболическую активность определяли в сутки 0 для неинкапсулированных клеток и в сутки 7 после получения инкапсулятов. Результаты обобщены ниже.

Результаты показывают, что, несмотря на то, что инкапсулированные клетки выживали независимо от стартовой температуры при попадании в градиент, метаболическая активность была обратно пропорциональна температуре, при которой начинался градиент, то есть, чем выше температура, тем ниже полученная в результате метаболическая активность.

ПРИМЕР 3

С учетом того, что было установлено, что оптимальная стартовая температура градиента минерального масла составляет приблизительно 25°C, а конечная температура составляет приблизительно -2°C, эти значения использовали в серии экспериментов по определению метаболической активности и способности к ингибированию опухоли.

Метаболическую активность определяли таким же способом, как изложено выше.

Ингибирующую активность по отношению к опухоли определяли путем высевания клеток RENCA в 6-луночные планшеты (15000 клеток/лунка) либо в 4 мл свежей культуральной среды, либо в таком же количестве культуральной среды, отобранной из культур инкапсулятов после 5 суток культуры. Свободные клетки RENCA культивировали в среде в течение 5 суток при 37°C и в атмосфере 5% CO₂. Затем клетки RENCA фиксировали метанолом, окрашивали 0,33% (мас./об) нейтрального красного и определяли поглощение при 540 нм, используя 630 нм в качестве референсной длины волны. Ингибирование определяли в виде процентного различия в Abs_{540 нм-630 нм}(поглощение) между обработанной и свежей средами.

Приведенные ниже результаты представляют собой данные по метаболической активности. "Свободная клетка" относится к клеткам RENCA, которые совсем не обрабатывали агарозой, тогда как "1-ое покрытие" относится к гранулам без покрытия.

Эти результаты показывают, что агарозные гранулы, полученные согласно изобретению, во всех релевантных отношениях эквивалентны гранулам, полученным вручную.

ПРИМЕР 4

Гранулы получали согласно изобретению, как описано выше, и ручным способом, представленным посредством цитируемого предшествующего уровня техники. В течение 7-месячного периода случайным образом отбирали десять гранул для определения их диаметров. Результаты, представленные в нижеследующей таблице, показывают, что гранулы, полученные согласно изобретению, имеют более единообразный диаметр и, следовательно, более единообразное покрытие.

Также при исследовании было обнаружено, что способ по изобретению приводил к сниженной клеточной контаминации. Для уточнения, обнаружили, что, в том случае, когда гранулы получают согласно ручному способу предшествующего уровня техники, существует проблема, которая состоит в том, что клетки не становятся полностью инкапсулированными. Когда клетки представляют собой раковые клетки, образуются бляшки или опухолевые колонии, и гранулы в культуре с ними должны быть отброшены вследствие контаминации.

В течение 8-месячного периода 56 партий гранул получали вручную, причем каждая партия содержала ряд культур в чашках Петри. В каждой партии по меньшей мере одна культура была контаминирована. Напротив, за тот же период получали 62 партии, используя способ по изобретению. Только 12 из этих 62 партий демонстрировали какой-либо тип контаминации.

ПРИМЕР 5

В приведенном ниже примере подробно описано получение трех разных групп покрытых агарозой агарозных гранул, содержащих островки.

Островки получали из животных в возрасте старше двух лет с историей многочисленных родов.

Поджелудочные железы животных перфузировали коллагеназой/нейтральной протеазой (либо коллагеназой Р при концентрации 1,0 г/л, либо либеразой MTF/термолизином при концентрации 7,5 ед./г поджелудочной железы) и 0,01 г/л ДНКазы I или 2,5 мг/поджелудочная железа раствора пульмозима, полученного либо в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (GBSS), либо в холодном концентрированном растворе для хранения и очистки.

После количественной оценки островки делили на аликвоты по 2000 IEQ перед ресуспендированием в 0,5 мл раствора одного из следующего: 1,5% Seakem Gold (далее в данном описании "SG"), 0,8% SG или 0,8% Litex (далее в данном описании "Li"). Термин "IEQ", в том виде, как он используется в данном описании, означает островок, имеющий диаметр 150 мкм. Следовательно, островок диаметром 300 мкм представляет собой 2 IEQ, тогда как островок диаметром 75 мкм представляет собой 0,5 IEQ. Агароза Litex обладает следующими свойствами: крепость геля больше или равная 1000 г/см² при 1,5% геле с вязкостью от 5,8 до 8,7 сП (сантипуаз) при использовании 1,5% раствора, температура образования геля 40-43°C для 1,5% раствора, значение ЭЭО (электроэндоосмоса) от 0,06 до 0,12 и содержание сульфата меньше или равное 0,30%. Растворы готовили в минимально обогащенной среде, содержащей 25 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота).

Суспензии проталкивали ниже поверхности стерильного минерального масла с получением четырех сферических гранул по 0,125 мл, приблизительно 5-6 мм в диаметре, каждый из которых содержал 500 IEQ.

Данные непокрытые агарозные гранулы культивировали при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO₂. После 5-7 суток наносили второе покрытие из 5% агарозы SG с получением покрытых агарозой агарозных гранул, содержащих островки, имеющих конечный диаметр 8-9 мм.

Данные гранулы культивировали при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO₂ до использования в экспериментах, описанных ниже. Гранулы помещали в культуральную среду (11 мМ глюкозы с добавлением 2,5% сыворотки свиньи, инактивированной нагреванием, и 1% антибиотика/противогрибкового средства). Культуральную среду заменяли еженедельно, и образцы сред анализировали через 24 часа после замены, каждую неделю, для анализов, описанных ниже.

ПРИМЕР 6

Как отмечено в предшествующем примере, из образцов отбирали образцы культуральных сред и анализировали на содержание инсулина с использованием имеющегося в продаже набора для ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) на инсулин свиньи. Результаты изображены на фиг. 6. Видно, что островки, инкапсулированные в 0,8% Li, превосходили островки, инкапсулированные как в 0,8% SG, так и в 1,5% SG, в отношении продуцирования инсулина.

ПРИМЕР 7

Эксперименты in vitro, представленные выше, были распространены на эксперименты in vivo, как обсуждается в данном описании.

В данных экспериментах использовали взрослых особей (крысы 8-недельного возраста). Животных делили на группы контроля "только инсулин" или реципиентов гранул. Все животные получали 65 мг/кг стрептозотоцина посредством инъекции в хвостовую вену, чтобы индуцировать диабет.

Наличие диабета подтверждали путем анализа крови подопытных животных на уровни глюкозы не натощак. Уровень глюкозы выше 400 мг/дл в течение 3-х суток подряд брали как показатель наличия диабета. Любые животные, у которых не проявлялся диабет в течение 2 недель, получали вторую дозу стрептозотоцина, после чего все животные приобретали диабет.

Животные, выбранные для приема имплантатов, получали гранулы в соответствии со статьей Gazda, et al., Cell Transplant, 16:609-620 (2007), которая полностью включена посредством ссылки. Для уточнения, животных 12-13-недельного возраста анестезировали, используя изофлуран. После срединного надреза вдоль брюшной полости в нее помещали гранулы.

Число гранул, помещенных в каждое животное, варьировалось в зависимости от самой высокой дозы инсулина, данной конкретному животному в течение 3-суточного периода перед помещением имплантата, деленной на среднее продуцирование инсулина на макрогранулу (исходя из инсулина, продуцированного гранулами на протяжении 4-недельного периода перед имплантацией). Мыши получали количество гранул, необходимое для получения точной дозы инсулина, которую они получали до имплантации (1x), или 1,7x этой дозы. Самки и самцы животных получали гранулы, равные 1x, но только самцы получали 1,7x, отчасти в связи с тем, что самцы крыс имеют большую массу, чем самки крыс.

В потребностях в инулине до имплантации не наблюдали значимых различий в отношении разных типов имплантатов (1,5% SG, 0,8% SG, 0,8% Li); тем не менее, большее число макрогранул требовалось для гранул 1,5% SG, и наименьшее число требовалось для 0,8% Li.

После имплантации животных содержали в течение 90 суток при регулярном мониторинге уровня глюкозы в крови и массы тела.

Самки мышей (все в группе 1x) демонстрировали мгновенную, продолжительную нормализацию уровней глюкозы в крови по сравнению с мышами, получающими контрольный инсулин. Самцы крыс в группе 1x демонстрировали мгновенное, но временное улучшение регуляции уровня глюкозы в крови, который возвращался к уровням до имплантации приблизительно к 30 суткам после имплантации.

ПРИМЕР 8

Исследования проводили на макрогранулах после умерщвления животных-реципиентов, и их исследовали на предмет структурной целостности и функциональной способности.

Обширное исследование показало, что только два из 1540 выделенных макрогранул демонстрировали какое-либо повреждение структуры.

В приведенных выше примерах описаны различные характеристики изобретения, которые относятся к агарозным макрогранулам, содержащим секреторные клетки, покрытым агарозой, где агароза, используемая для макрогранул, обладала свойствами агарозы Litex, изложенными выше.

Как изложено в данном документе, термин "макрогранула" относится к структуре, которая является по существу сферической, имеющей диаметр от приблизительно 4 до приблизительно 10-12 мм, наиболее предпочтительно диаметр от приблизительно 6 до приблизительно 8 мм. Толщина второго слоя агарозы предпочтительно составляет от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, наиболее предпочтительно толщина составляет от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 5 мм, даже более предпочтительно от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 3 мм, и наиболее предпочтительно толщина составляет от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 2,0 мм. Второй слой агарозы может представлять собой, но необязательно, такую же агарозу, используемую для получения гранулы.

"Макрогранулы" используют в качестве предпочтительной структуры; тем не менее, любая твердая агарозная структура, которая инкапсулирует секреторные клетки и предпочтительно покрыта вторым слоем агарозы, имеет характеристики по изобретению.

Секреторные клетки могут варьироваться. Можно инкапсулировать любую клетку или органеллу, дающую желаемый секреторный продукт. Островки клетки, раковые клетки и стволовые клетки являются примерами типов материалов, которые можно использовать. Каждая гранула может содержать варьирующее число клеточных органелл, например, в случае островков, составляющее от приблизительно 50 до приблизительно 5000 эквивалентов островков (далее в данном описании «IEQ»), более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 2500 IEQ, даже более предпочтительно от приблизительно 250 до приблизительно 1000, и наиболее предпочтительно от приблизительно 475 до приблизительно 550 IEQ. Особенно наиболее предпочтительным является приблизительно 500 IEQ.

Характеристикой изобретения также является усовершенствованный способ получения макрогранул, независимо от используемой агарозы. Клетки смешивают с агарозой, а затем формуют в суспензию, которую, в свою очередь, используют для образования гранулы. Затем гранулу, например, макрогранулу, покрывают агарозой, после чего полученную гранулу с покрытием дозируют в образец минерального масла при температурном градиенте, так что гранула вступает в контакт с минеральным маслом при более высокой температуре и падает в масло при более низкой температуре. Гранулы могут содержать любой желаемый тип клеток, например, секреторные клетки, раковые клетки, островки, стволовые клетки, такие как плюрипотентные стволовые клетки, и т.д., но, не ограничиваясь ими.

В особенно предпочтительных воплощениях инструменты "воронка" и "соломинка", как описано в данном документе, используют для извлечения гранул без покрытия и с покрытием соответственно.

Температурный градиент минерального масла может варьироваться. Предпочтительно градиент составляет от 20°C до 50°C, то есть разница между самой высокой и самой низкой температурами попадает в пределы данного диапазона. Более предпочтительно эта разница составляет от 20°C до 35°C.

Самая высокая температура масла может варьироваться, но предпочтительно составляет от 20°C до 30°C, более предпочтительно от 20°C до 25°C. Подобным образом, самая низкая температура может варьироваться и изменяется от 0°C до -8°C, и более предпочтительно от 0°C до -2°C.

Другие аспекты изобретения будут понятны специалисту в данной области техники и не требуют дополнительного уточнения.

Использованные термины и выражения используют в качестве терминов описания, а не ограничения, и использование таких терминов и выражений не предназначено для исключения каких-либо эквивалентов представленных и описанных характеристик или их частей, и понятно, что в пределах объема изобретения возможны различные модификации.

Claims

1. Способ получения композиции вещества, содержащей образец живых клеток в грануле, содержащей агарозу, где указанная гранула покрыта агарозой, включающий следующие стадии:
(a) смешивание первого образца агарозы с указанными живыми клетками с образованием суспензии;
(b) перенос указанной суспензии в первый образец минерального масла для образования гранулы из указанной суспензии;
(c) извлечение указанной гранулы из указанного первого образца минерального масла;
(d) удаление минерального масла с указанной гранулы;
(e) перенос указанной гранулы с помощью инструмента для автоматизированного сбора и переноса гранулы во второй раствор агарозы;
(f) покрытие указанной гранулы вторым раствором агарозы;
(g) извлечение указанной гранулы из указанного второго раствора агарозы с помощью инструмента для автоматизированного извлечения гранулы; и
(h) дозирование указанной гранулы с покрытием во второй образец минерального масла, где указанный образец минерального масла поддерживают при температурном градиенте, так что указанная гранула перемещается в минеральном масле по направлению от более высокой температуры, от 20 до 30°C, к более низкой температуре, от 0 до -8°C.

2. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой секреторные клетки.

3. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой раковые клетки.

4. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой раковые стволовые клетки.

5. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой островковые клетки.

6. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой стволовые клетки.

7. Способ по п. 6, где указанные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, не являющиеся эмбриональными стволовыми клетками человека.

8. Способ по п. 1, где указанные клетки представляют собой плюрипотентные клетки.

9. Способ по п. 1, дополнительно включающий извлечение указанной гранулы из указанного первого или второго образца минерального масла инструментом для автоматизированного сбора и переноса гранулы.

10. Способ по п. 1, где указанная более высокая температура составляет от 20°C до 25°C, а указанная более низкая температура составляет от 0°C до -2°C.