CN115003316A - 含胰岛胶囊的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供经改良的含胰岛胶囊的制造方法。一种含胰岛胶囊的制造方法，其包括下述工序：工序(a)，制备以10,000IEQ/mL以上的浓度含有胰岛的海藻酸钠溶液A；工序(b)，将该海藻酸钠溶液滴加至二价阳离子溶液中，回收经凝胶化而成的粒子；工序(c)，将工序(b)中回收的粒子添加至聚L‑鸟氨酸溶液A中，进行搅拌后，回收粒子；工序(d)，将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中，进行搅拌后，回收粒子；以及工序(e)，将工序(d)中回收的粒子添加至柠檬酸钠溶液中，进行搅拌后，回收粒子。
Description
技术领域
公开了关于胶囊化胰岛的技术。
背景技术
胰岛移植是对人体的负担较小的糖尿病的治疗手段，但为了使所移植的胰岛长期成活，有时需要强效的免疫抑制。研究了将大量的微小的微胶囊化胰岛向腹腔内移植的方法，在该情况下，无需免疫抑制，但尚未获得充分的治疗成果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2001/052871
非专利文献
非专利文献1：METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法),VOL.137,575-580,1988
非专利文献2：TRANSPLANTATION(移植),Vol.53,1180-1183,No.6,1992年6月
非专利文献3：Bioartificial Pancreas(生物人工胰腺),Vol.,98,No.6,1996,1417-1422
非专利文献4：Drug Delivery System(药物传递系统),Vol.,12,No.2,1997
非专利文献5：JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B:APPLIEDBIOMATERIALS(生物医学材料研究杂志，B辑：应用生物材料),2013VOL.,101B,第2期,258-268
发明内容
发明所要解决的课题
课题之一是提供经改良的含胰岛胶囊的制造方法。
用于解决课题的手段
作为所述课题的解决手段，提供了包括下述项的发明。
项1.
含胰岛胶囊的制造方法，其包括下述工序：
工序(a)，制备以10,000IEQ/mL以上的浓度含有胰岛的海藻酸钠溶液A；
工序(b)，将该海藻酸钠溶液滴加至二价阳离子溶液中，回收经凝胶化而成的粒子；
工序(c)，将工序(b)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液A中，进行搅拌后，回收粒子；
工序(d)，将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中，进行搅拌后，回收粒子；以及
工序(e)，将工序(d)中回收的粒子添加至柠檬酸钠溶液中，进行搅拌后，回收粒子。
项2.
如项1所述的方法，其中，胰岛为从出生后1～3周龄的幼猪取得的胰岛。
项3.
如项1或2所述的方法，其中，含胰岛胶囊的平均直径为550～750μm。
项4.
如项1～3中任一项所述的方法，其中，海藻酸钠溶液A的海藻酸钠浓度为1w/v％以上3w/v％以下。
项5.
如项1～4中任一项所述的方法，其中，聚L-鸟氨酸溶液A的聚L-鸟氨酸浓度为0.05w/v％以上3w/v％以下。
项6.
如项1～5中任一项所述的方法，其中，海藻酸钠溶液B的海藻酸钠浓度为0.1w/v％以上0.3w/v％以下。
项7.
如项1～6中任一项所述的方法，其中，在工序(d)中，将工序(c)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液B中，进行搅拌后，进行回收，然后添加至海藻酸钠溶液B中。
项8.
如项7所述的方法，其中，聚L-鸟氨酸溶液B的聚L-鸟氨酸浓度为0.01w/v％以上且低于0.1w/v％。
发明效果
提供了糖响应性得到改善的胶囊化胰岛。
附图说明
[图1]示出刚刚胶囊化之后的胰岛及胶囊化后培养了25天的胰岛的显微镜照片。a～d为刚刚胶囊化之后，e～h为培养25天后。a及e是使用8,000IEQ/mL的胰岛制作的，b及f是使用12,000IEQ/mL的胰岛制作的，c及g是使用16,000IEQ/mL的胰岛制作的，d及h是使用20,000IEQ/mL的胰岛制作的。
[图2]示出对胶囊化后培养了25天的胰岛的糖响应性进行测定而得的结果。
[图3]将针对胶囊化后培养了25天的胰岛测得的糖响应性以刺激指数(Stimulation Index，SI)的形式示出。
[图4]示出针对尺寸不同的含胰岛胶囊测定糖响应性而得的结果。
[图5]示出针对尺寸不同的含胰岛胶囊测定SI而得的结果。
具体实施方式
含胰岛胶囊的制造方法优选包括下述的工序(a)～(e)：
工序(a)，制备以10,000IEQ/mL以上的浓度含有胰岛的海藻酸钠溶液A；
工序(b)，将该海藻酸钠溶液滴加至二价阳离子溶液中，回收经凝胶化而成的粒子；
工序(c)，将工序(b)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液A中，进行搅拌后，回收粒子；
工序(d)，将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中，搅拌后进行回收；以及
工序(e)，将工序(d)中回收的粒子添加至柠檬酸钠溶液中，搅拌后进行回收。
工序(a)中使用的胰岛优选包含产生胰岛素的β细胞、含有胰高血糖素的α细胞、分泌生长抑素的δ细胞、及含有胰多肽的细胞(PP细胞)。对于胰岛而言，优选其大部分为产生胰岛素的β细胞。
胰岛的来源没有特别限制，但优选为人、猪、小鼠、大鼠、猴、或犬。一个实施方式中，胰岛优选来源于猪，优选为幼猪(例如，出生后3天～4周或出生后7天～3周)的胰岛。胰岛可以通过任意地采用本技术领域中已知的方法而得到。例如，可以优选采用使用Liberase作为消化酶的方法(T.J.Cavanagh等.Transplantation Proceedings(移植学会会报),30,367(1998))。
胰岛的尺寸优选为50μm以上400μm以下。胰岛的尺寸可以使用显微镜的测微计来测定。作为特性而言，优选胰岛包含10％以上的β细胞。β细胞的比例的上限并不特别存在，例如为80％。
构成海藻酸钠溶液A的海藻酸钠的物性没有特别限定。
海藻酸钠溶液A的海藻酸钠浓度没有特别限制，例如，优选为1w/v％以上3w/v％以下。
从使胶囊化后的胰岛的糖响应性良好这样的观点考虑，海藻酸钠溶液A以10,000IEQ/mL以上的浓度含有胰岛是优选的。此处，所谓IEQ，是指以直径150μm为基准的胰岛的数目。胰岛浓度优选为11,000IEQ/mL以上、或12,000IEQ/mL以上。胰岛浓度的上限没有特别限制，例如，可以设定为30,000IEQ/mL以下、25,000IEQ/mL以下。
海藻酸钠溶液A只要按以如上所述的浓度含有胰岛的方式制备即可，其具体的制备方法没有限制。例如，可以在生理盐水中溶解适量的海藻酸钠，向其中适量地添加胰岛，根据需要进行搅拌，由此得到海藻酸钠溶液A。
工序(b)中使用的二价阳离子溶液没有限制，只要可通过向其中滴加海藻酸钠溶液A而得到包含胰岛的凝胶化粒子(胶囊)即可。作为构成这样的二价阳离子溶液的二价阳离子，可以举出在水溶液中游离出二价的金属离子的盐(例如，氯化钙、乳酸钙、氯化钡、及氯化锶等)。一个实施方式中，优选的盐为氯化钙，优选的二价阳离子溶液为氯化钙溶液。
二价阳离子溶液的二价阳离子的浓度没有特别限制，例如，可以在50～500mM的范围内设定。
海藻酸钠溶液A向二价阳离子溶液中的滴加方式没有限制，只要可得到包含胰岛的凝胶化粒子即可。一个实施方式中，优选将海藻酸钠溶液A通过适当大小的针(needle)滴加至二价阳离子溶液中。
凝胶化粒子的回收是任意的，例如，可以通过下述方式实施：使形成了凝胶化粒子的二价阳离子溶液静置一定时间并将上清液除去，或者重复上述操作。
工序(c)中使用的聚L-鸟氨酸溶液A只要能够将工序(b)所形成的凝胶化粒子包覆即可，没有特别限制。例如，可以通过将聚L-鸟氨酸溶解于生理盐水来制备。
聚L-鸟氨酸溶液A中的聚L-鸟氨酸的浓度没有特别限制，例如，可以制备成0.05w/v％以上3.0w/v％以下。一个实施方式中，聚L-鸟氨酸溶液A中的聚L-鸟氨酸的浓度优选为0.1w/v％以上2.0w/v％以下。
工序(c)的“将工序(b)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液A中”也包括向工序(b)中回收的凝胶化粒子中添加聚L-鸟氨酸溶液A的方式。工序(c)中的搅拌的速度及时间是任意的，例如，优选以20～300rpm进行1分钟～20分钟。
工序(c)中的凝胶化粒子的回收方式是任意的，例如，可以使聚L-鸟氨酸溶液A静置一定时间并将上清液除去，由此回收凝胶化粒子。所回收的凝胶化粒子优选具有利用海藻酸形成的凝胶化层的表面被聚L-鸟氨酸包覆的结构。
工序(d)中使用的海藻酸钠溶液B与工序(a)中使用的海藻酸钠溶液A可以为相同浓度，也可以是不同的。一个实施方式中，从包覆操作的容易性这样的观点考虑，优选海藻酸钠溶液B的海藻酸钠浓度比海藻酸钠溶液A的海藻酸钠浓度低。例如，海藻酸钠溶液A的海藻酸钠浓度为1w/v％以上3w/v％以下的情况下，优选海藻酸钠溶液B的海藻酸钠浓度为0.1w/v％以上0.3w/v％以下。
工序(d)的“将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中”也包括向工序(c)中回收的凝胶化粒子中添加海藻酸钠溶液B的方式。工序(d)中的搅拌的速度及时间是任意的，例如，优选以20～300rpm进行1分钟～15分钟搅拌。
工序(d)中的凝胶化粒子的回收方式是任意的，例如，可以使海藻酸钠溶液B静置一定时间并将上清液除去，由此回收凝胶化粒子。对于所回收的凝胶化粒子而言，优选的是，利用海藻酸形成的凝胶化层的表面被聚L-鸟氨酸包覆，并进一步在其上具有利用海藻酸形成的凝胶化层。
一个实施方式中，优选的是，在将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中之前，添加至聚L-鸟氨酸溶液B中，进行搅拌后，回收粒子，将其添加至工序(d)的海藻酸钠溶液B中。此处，聚L-鸟氨酸溶液B的浓度可以与聚L-鸟氨酸溶液A相同或不同。一个实施方式中，优选聚L-鸟氨酸溶液B的聚L-鸟氨酸浓度比聚L-鸟氨酸溶液A的聚L-鸟氨酸浓度低。例如，聚L-鸟氨酸溶液B的聚L-鸟氨酸浓度优选为0.01w/v％以上且低于0.1w/v％。
工序(e)中使用的柠檬酸钠溶液优选以0.5～3w/v％的浓度含有柠檬酸钠。出于通过使凝胶化粒子内的阳离子螯合并从凝胶变得接近于液态从而促进胰岛素释放的目的，添加柠檬酸钠溶液。
工序(e)的“将工序(d)中回收的粒子添加至柠檬酸钠溶液中”也包括向工序(d)中回收的凝胶化粒子中添加柠檬酸钠溶液的方式。工序(e)中的搅拌的速度及时间是任意的，例如，优选以20～300rpm进行1分钟～15分钟。
工序(e)中的凝胶化粒子的回收方式是任意的，例如，可以使柠檬酸钠溶液静置一定时间并将上清液除去，由此回收凝胶化粒子。认为所回收的凝胶化粒子的内部更接近于液态。
如上所述地得到的含胰岛胶囊具有优异的糖响应性，而且稳定地保持其糖响应性。一个实施方式中，对于工序(e)中所回收的凝胶化粒子(含胰岛胶囊)而言，从显示出良好的糖响应性这样的观点考虑，其平均直径优选为2000μm以下，更优选为1500μm以下或1000μm以下。含胰岛胶囊的尺寸的下限没有特别限制，例如为100μm以上、200μm以上、300μm以上、400μm以上、或500μm以上。所谓平均直径，是利用显微镜的测微计针对20～50个含胰岛胶囊来测定尺寸并算出其平均值而得到的值。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于此。
1.胶囊化胰岛的制作
以8,000IEQ/mL、12,000IEQ/mL、16,000IEQ/mL、或20,000IEQ/mL的浓度，将从出生后14日龄的猪分离出的源自幼猪的胰岛悬浮于1.7w/v％海藻酸钠溶液(Pronova)中。将其通入针中，一边利用气流切割悬浮液一边滴加至109mM氯化钙溶液中。从氯化钙溶液中回收固化而成的海藻酸珠，添加至0.075w/v％的聚L-鸟氨酸(PLO)(分子量为5,000～15,000)溶液中，搅拌10分钟。对珠进行回收，进一步添加至0.038w/v％PLO溶液中，搅拌6分钟并进行回收，添加至0.17w/v％海藻酸钠溶液中，搅拌6分钟，最后添加至1.6％柠檬酸钠溶液中，搅拌2分钟，得到胶囊化胰岛。在CO2培养箱中，于37℃将所得到的胶囊化胰岛培养25天。
在刚刚胶囊化之后及培养25天后，从烧瓶中取出少量的胶囊化胰岛，移至35mm培养皿中。利用倒置显微镜(4倍率)对培养皿进行观察，对胶囊化胰岛进行拍摄(图1)。图1的a～d为刚刚胶囊化之后，e～h为培养25天后。a及e是使用8,000IEQ/mL的胰岛制作的，b及f是使用12,000IEQ/mL的胰岛制作的，c及g是使用16,000IEQ/mL的胰岛制作的，d及h是使用20,000IEQ/mL的胰岛制作的。胶囊直径以平均值计为约600μm。
2.糖响应性评价
将进行胶囊化后在培养基(其是向RPMI1640培养基中添加2％猪血清、10mM烟酰胺、及抗生素而得到的)中培养25天之后的各胶囊化胰岛500IEQ装入74μm Netwell嵌套(insert)(Corning公司制)中。进行清洗后，使装有胰岛的嵌套在500mg/L低葡萄糖培养基中静置1小时，其后回收培养基。接着，使装有胶囊化胰岛的嵌套在3750mg/L高葡萄糖培养基中静置1小时，其后回收培养基。采用ELISA法对所回收的培养基中的胰岛素浓度进行测定(图2)。另外，算出相对于低葡萄糖培养基中胰岛素浓度而言的高葡萄糖培养基中胰岛素浓度比作为刺激指数(SI)(图3)。如图2所示的那样，判明了与由8,000IEQ/mL的胰岛制成的胶囊相比，使用更高浓度的胰岛制成的胶囊显示出更高的糖响应性。
3.胶囊尺寸与糖响应性
利用与上述1.同样的步骤，通过调整气流的速度而制作了直径为约500～1800μm的胶囊化胰岛。3000μm的胶囊化胰岛是在注射器上连接18G SURFLO的外筒并进行滴加而制作的。使用含有16,000IEQ/mL的源自幼猪的胰岛的悬浮液，制作了含胰岛胶囊。
将与上述2同样地针对所得到的含胰岛胶囊评价糖响应性而得的结果示于图4及图5。由这些结果判明，胶囊的直径为2000μm以下、1800μm以下、或1500μm以下时，对糖响应性而言是理想的。
Claims (8)
1.含胰岛胶囊的制造方法，其包括下述工序：
工序(a)，制备以10,000IEQ/mL以上的浓度含有胰岛的海藻酸钠溶液A；
工序(b)，将该海藻酸钠溶液滴加至二价阳离子溶液中，回收经凝胶化而成的粒子；
工序(c)，将工序(b)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液A中，进行搅拌后，回收粒子；
工序(d)，将工序(c)中回收的粒子添加至海藻酸钠溶液B中，进行搅拌后，回收粒子；以及
工序(e)，将工序(d)中回收的粒子添加至柠檬酸钠溶液中，进行搅拌后，回收粒子。
2.如权利要求1所述的方法，其中，胰岛为从出生后1～3周龄的幼猪取得的胰岛。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，含胰岛胶囊的平均直径为550～750μm。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，海藻酸钠溶液A的海藻酸钠浓度为1w/v％以上3w/v％以下。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，聚L-鸟氨酸溶液A的聚L-鸟氨酸浓度为0.05w/v％以上3w/v％以下。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，海藻酸钠溶液B的海藻酸钠浓度为0.1w/v％以上0.3w/v％以下。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在工序(d)中，将工序(c)中回收的粒子添加至聚L-鸟氨酸溶液B中，进行搅拌后，进行回收，然后添加至海藻酸钠溶液B中。
8.如权利要求7所述的方法，其中，聚L-鸟氨酸溶液B的聚L-鸟氨酸浓度为0.01w/v％以上且低于0.1w/v％。
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