KR101722824B1 - 매크로비드의 개선된 제조방법 - Google Patents

매크로비드의 개선된 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101722824B1
KR101722824B1 KR1020147024373A KR20147024373A KR101722824B1 KR 101722824 B1 KR101722824 B1 KR 101722824B1 KR 1020147024373 A KR1020147024373 A KR 1020147024373A KR 20147024373 A KR20147024373 A KR 20147024373A KR 101722824 B1 KR101722824 B1 KR 101722824B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
beads
agarose
cells
mineral oil
sample
Prior art date
Application number
KR1020147024373A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140122742A (ko
Inventor
로렌스 가즈다
멜리사 라라모어
티모시 헤밀턴
베리 스미스
Original Assignee
로고신 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로고신 인스티튜트 filed Critical 로고신 인스티튜트
Publication of KR20140122742A publication Critical patent/KR20140122742A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101722824B1 publication Critical patent/KR101722824B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B25—HAND TOOLS; PORTABLE POWER-DRIVEN TOOLS; MANIPULATORS
    • B25J—MANIPULATORS; CHAMBERS PROVIDED WITH MANIPULATION DEVICES
    • B25J15/00—Gripping heads and other end effectors
    • B25J15/06—Gripping heads and other end effectors with vacuum or magnetic holding means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B25—HAND TOOLS; PORTABLE POWER-DRIVEN TOOLS; MANIPULATORS
    • B25J—MANIPULATORS; CHAMBERS PROVIDED WITH MANIPULATION DEVICES
    • B25J15/00—Gripping heads and other end effectors
    • B25J15/06—Gripping heads and other end effectors with vacuum or magnetic holding means
    • B25J15/0616—Gripping heads and other end effectors with vacuum or magnetic holding means with vacuum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Robotics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

본 발명은 세포를 함유하는 아가로즈 코팅된, 아가로즈 비드를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 바람직하게 자동화된, 상기 방법은, 온도 구배의 광유의 샘플에 제작된 비드를 배치시켜, 상기 비드가 상기 광유를 통하여 움직임에 따라 상기 온도가 떨어지는 배치 단계를 포함한다. 바람직하게는, "트럼펫 툴" 및 "스트로 툴"은 상기 방법에 사용된다.

Description

매크로비드의 개선된 제조방법 {Improved method for manufacture of macrobeads}
본 출원은 2012년 1원 31일에 출원된 미국 가 출원 제61/592,949호의 우선권을 주장하고, 이의 전체적인 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 아가로즈 (agarose)로 코팅된, 투과성 비드 (bead) 또는 다른 구조에 포획된, 세포, 특히 분비 세포 (secretory cells)를 포함하는 조성물 (composition of matter)을 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 상기 비드는 아가로즈를 포함하거나 또는 이루어질 수 있다. 리텍스 (Litex) 아가로즈는 상기 비드로 특히 바람직하다.
투과성 메디아 (permeable media)에 포획된, 독자 생존 가능한 세포 (viable cells)를 함유하는 조성물의 제작은, 당뇨병 치료, 암 치료, 및 줄기 세포 보전 (stem cell maintenance)과 같은, 다양한 분야에 중요한 것으로 나타나고 있다. 이러한 관점에서, 예를 들어, 재발행 (RE) 특허 40,555호; 미국특허 제7,838,291호; 제6,818,230호; 제6,808,705호; 제6,303,151호; 제6,224,912호; 제5,888,497호; 및 제5,643,569호, 및 공개특허 제2007/0071732호를 참조하며, 이들의 전체적인 내용은 참조로서 본 명세서에 혼입된다.
이러한 조성물 (이하, 앤캡슐 (encapsulates)라 한다)을 제조하는 공정은, 사용된 세포의 타입과 상관없이, 필수적으로 동일한 과정으로 제작된다. 관심 세포를 분리 또는 확보한 후에, 이들은 아가로즈, 콜라겐, 또는 이들의 조합과 같은 시약의 수성 용액에 현탁되거나, 또는 겔화 스폰지 (gelatin sponge)와 같은 물질 상에 배치된다. 수성 용액이 사용된 경우, 관심 세포를 함유하는 반-고체 비드는 광유 (mineral oil)에 현탁액 (suspension)을 배치시켜 형성된다. 만약 겔화 스폰지가 사용된 경우, 상기 세포를 함유하는 생산물은, 아가로즈를 붓은 후에, 구형으로 굴려, 비드를 형성한다.
상기 비드는 그 다음, 예를 들어, 테프론 스푼 (Teflon spoon)에서, 아가로즈의 용액에 접촉된다. 상기 비드는 아가로즈-코팅된 매크로비드 (macrobeads)로 앞에서 인용된 기술분야에서 언급된 것들을 형성하기 위해, 혼합물에서 굴린다.
예를 들어, 섬 세포 (islets cells) 및 암 세포를 생산하는 인슐린을 분비하는, 분비 세포의 앤캡슐화를 교시하는, RE 40,555호 및 미국특허 제5,888,497호에 의해 나타난 초기 교시는, 미국특허 제7,838,291호에 나타난 바와 같은, 줄기 세포의 앤캡슐화를 포함하고, 그리고, 예를 들어, 공개특허 제2007/0071732호에서 알 수 있는 바와 같은, 사용된 물질에서 개선을 통하여 개선이 수반되었으나, 이러한 유용한 물질을 만들기 위한 방법론을 개선하기 위한 계속적인 요구가 있다.
이러한 분야에서 매우 바람직한, 하나의 개선은 수동 공정인 것을 자동화할 수 있는 능력이다.
제조 공정을 자동화하는 과정에 있어서, 본 발명자들은 제조 공정을 촉진하기 위한, 특별한 도구를 개발했다. 부가적으로, 본 발명자들은, 온도 구배 (temperature gradient)에서 광유의 용기에 매크로비드를 배치를 통해 공정을 마감하는데 있어서, 가능하다고 믿는 것보다 더욱 균일한 형상 및 균일한 질감 (texture)을 갖는 매크로비드를 생산할 수 있다는 것을 발견하였다.
이것이 달성된 방법은 하기의 개시에서 알 수 있을 것이다.
도 1은 광유를 함유하는 멀티웰 어레이 (multiwell array)로 세포 및 아가로즈의 자동 분배를 나타내는 개략도이다.
도 2a - 2c는 본 발명의 "트럼펫 툴 (trumpet tool)"의 바람직한 구현 예의 다른 관점에서 본 개략도이다.
도 3은 트럼펫 툴의 제2 구현 예의 개략도이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 스트로 툴 (straw tool)의 다른 구현 예를 나타내는 개략도이다.
도 5는 본 발명에 따른 공정의 요약을 나타낸 개략도이다.
도 6은 본 발명의 작동에서 온도 구배를 유지하는데 사용된 장치의 개략도이다.
도 7은 아가로즈의 다른 농도 및 타입으로 만들어진 비드로부터의 인슐린 (insulin) 생산물의 수준을 나타내는 개략도이다.
참조는 상기 예시된 미국 특허에 의해 만들어지고, 이것 모두는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 분비 세포와 같은, 세포의 다른 유형을 함유하는, 매크로비드를 제조하기 위한 수동적 방법을 상세하게 기술한다. 본 명세서에 기재된 발명은 이러한 방법들을, 테프론 (Teflon) 표면상 또는 스푼 (spoon) 내의 광유와 아가로즈 코팅된, 아가로즈 비드를 접촉시키는 최종 단계를, 하기에 기재된 바와 같이, 온도 구배에서 유지되는 광유를 함유하는 용기로 대체시켜 변형시킨다.
이들 특허에서 기재된 바와 같은 매크로비드는 또한 로봇으로 또는 자동화를 통해 만들어질 수 있다. 하나의 이러한 접근법은 본 명세서에 기재된다.
도 1에 예시된 바와 같은, 하나의 구현 예에 있어서, 피펫의 어레이와 같은, 로봇 디스펜서 (dispenser)는 표준 96 웰 플레이트와 같은, 멀티웰 플레이트로 분비 세포를 분배한다. 용융된 아가로즈는 그 다음 상기 웰에 첨가된다. 상기 세포 및 용융 아가로즈는 그 다음 매크로비드를 형성하기 위해, 단일 웰 또는 96 웰 플레이트와 같은, 멀티웰 용기와 같은 광유 함유 수단에, 예를 들어, 멀티-피펫 어레이와 같은 자동화된 수단을 통해 전달된다.
상기 매크로비드는 그 다음 상기 웰로부터 제거, 바람직하게는 "도 2a-c 및 도 3"에 예시된, 소위 "트럼펫"의 사용을 통해 제거된다. 하기에 상세히 설명된 바와 같은, 상기 트럼펫 툴은 상기 매크로비드의 표면을 방해하지 않도록 설계된다.
또 다른 구현 예에 있어서, 출구 수단은 상기 웰의 하부에 제공되고, 이에 의해 상기 매크로비드가 상기 웰을 빠져나오고, 다음의 단계에서 사용될 수 있다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기에서 논의된 공정으로부터 결과하는 매크로비드는, 이동가능한 플랫폼 (platform)과 같은, 자동화 수단을 통해 광유의 상부로 전달될 수 있고, 또한 자동화된 시스템을 통해, 광유 함유 수단으로부터 제거될 수 있다.
상기 트럼펫에 의한 픽업 (pick up), 또는 출구 수단을 통한 통로, 및 균형잡힌 염 용액과 같은 적절한 용액으로 헹구는 수단에 의해 어떤 부착 광유의 제거 후에, 상기 매크로비드는 새롭게, 따듯한 아가로즈를 함유하는 웰에 배치된다. 이 이후에, 상기 매크로비드는, 바람직하게는 온화한 석션 (mild suction)을 사용하는 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같은, 소위 "스트로 툴"을 사용하여, 따듯한 아가로즈와 함께 제거되고, 제어된 온도 구배에서 광유를 함유하는 용기로 분배된다.
상기 광유를 함유하는 용기는, 비록 다양한 크기의 시험관 및 시험 큐벳 (cuvettes)이 바람직할지라도, 예를 들어, 시험관, 큐벳, 비이커, 또는 어떤 다른 적절한 대상일 수 있다. 이들 용기, 즉, 시험관, 큐벳, 등을 제조하기 위해 사용된 재료는 다양할 수 있다. 비록 친수성 층을 제공하기 위한 물질로 코팅된 것과 같은, 다른 물질이 사용될 수 있을지라도, 유리는 특히 바람직하다.
상기 용기에서 온도 구배는 기술분야에서 알려진 어떤 방법에 의해 유지될 수 있다. 중요한 것은 상기 광유의 온도가 이의 하부보다 용기의 상부에서 더 높다는 것이다. 상기 구배의 온도 및 양은, 예를 들어, 상기 용기의 길이, 앤캡슐화된 세포의 타입, 사용된 아가로즈의 타입, 등에 기초하여 변화할 것이다. 이러한 값을 설정하는데 중요한 요인은, 예를 들어, 상기 앤캡슐화된 세포가 생존가능한 온도, 사용된 아가로즈가 고체화되는 온도, 등을 포함한다. 상기 구배의 출발 온도는 20℃ 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 및 더더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃가 바람직하다. 이상적으로, 상기 출발 온도는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 상기 용기의 하부에서 온도는, 예를 들어, 0℃ 내지 -10℃, 좀더 바람직하게는 0℃ 내지 -8℃, 및 가장 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 -2℃의 범위로 다양할 수 있다. 가장 최고 및 가장 최저 온도 사이의 총 차이는 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 좀더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃이다.
본 출원의 일부인 도면은 전술된 설명을 더욱 자세히 서술할 것이다.
도 1은 상기 세포 및 상기 아가로즈 모두가 플레이트의 웰로 분배되는 방법을 나타낸다. 예를 들어, 세척 또는 흡인 (aspiration)을 통해, 또는 전술된 출구 수단을 통해 광유를 제거한 후에, 전술되고, 도 2a - 2c 및 도 3에서 나타낸 바와 같은, "트럼펫 툴"은 포획된 세포 (entrapped cells)를 갖는 매크로비드를 제거하기 위해, 상기 웰에 삽입된다. 이러한 트럼펫 툴은 상기 매크로비드의 제거를 촉진하도록 상기 매크로비드의 표면을 방해하지 않는, 일 측 말단에 부착된 진공 공급원을 갖는다.
아가로즈의 하나의 층 및 세로들로 이루어진 매크로비드는 아가로즈의 제2 층, 또는 코팅으로 제공되는, 가열된 아가로즈로 충진된, 새로운 웰로 소위 "트럼펫 툴"을 통해 침전된다. 상기 매크로비드는, 바람직하게는 온화한 석션의 도움으로, 도 4a 및 4b에서 나타낸 것 중 하나와 같은, "스트로 툴"을 사용하여, 따듯한 아가로즈와 함께 제거되고, 상기 매크로비드는 상기 온도 구배 광유를 함유하는 용기에 분배된다. 상기 온도 구배는, 예를 들어, 도 5에서 나타낸 장치에 의해, 유지될 수 있지만, 당업자들은 다른 선택에도 익숙할 것이다. 상기 매크로비드가 상기 용기를 횡단하여, 상기 하부에 도달된 경우, 신장된 형태의 상기 트럼펫 툴은, 배지에서 세척을 위해 매크로비드를 제거하는데, 석션으로, 사용될 수 있거나, 또는 전술된 바와 같이, 상기 매크로비드의 제거를 위한 출구 수단은 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 비록 다른 상황일지라도, 상기 매크로비드는 사용을 위해 준비되고, 이는 상기 매크로비드 내에서 상기 세포가 충분한 수로 존재하거나 또는 특별한 생산물이 상기 세포에 의해 발현될 때까지 증식 및/또는 성숙하도록 허용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 시간은, 예를 들어, 일주 내지 몇 개월의 범위일 수 있다.
청구된 발명의 도면을 참조하면, 도 2a, 2b, 2c, 및 도 3은 소위 "트럼펫"인, 본 발명에 따른 장치의 다른 시각들을 나타낸다.
도 2a를 참조하면, 트럼펫 툴 (40)은 도시된다. "트럼펫 툴"로서 상기 툴의 기재(description)는 트럼펫과 유사한 역 원뿔부(negative conical section) (41)로부터 유래한다. 일 측 말단에서, 역 원뿔부(41)는 원뿔 말단 (41)에 부착된 림 (rim) (42)과 함께, 제공된다. 상기 원뿔 말단 (41)은 공기와 같은, 이를 통한 유체의 통로를 위해 채택된, 중공의, 종방향 섹션 (43)에 연결된다.
도 2a에서 나타낸 바와 같이, 상기 중공의 종방향 섹션 (43)은 상기 장치의 전체를 따라 이어진다. 칼라 수단 (Collar means) (44)이, 역원뿔 말단에 대하여, 상기 트럼펫의 길이에 따라 약 2/3 내지 3/4에 위치하는 것을 알 수 있다. 본 명세서에 기재된 몇 가지 다른 특색뿐만 아니라, 상기 칼라 수단 (44)은, 제조 공정의 인위 구조이고, 상기 장치의 기능에 영향을 주지 않는다.
그러나, 칼라 수단 (44)은 종방향 수단이 이의 원주를 확장하는 점에서 나타난다. (45)에 의해 나타낸 상기 장치의 일부는, 작동에 있어서, 유체의 공급원, 예를 들어, 진공과 같은, 공기에 툴을 연결하는 연결 말단에 상응한다. 연결 개구 (46)는 상기 장치의 어떤 부분의 가장 넓은 원주를 갖고, 예를 들어, 진공의 수단에 대한 연결을 완성하도록 작용한다. 도 2c에 나타낸 것과 같은, 내부 구조는, 진공 수단의 부착을 촉진하기 위해 제공된다. 이들 구조는 사용될 장치에 기초하여, 다양할 수 있다.
상기 장치에서, 일련의 일정한 간격의 돌출부 (48a, b, 및 c) 뿐만 아니라, 릿지 수단 (ridge means) (47)은 관찰되고, 이들 모두는, 칼라 수단 (44)과 같이, 제조공정의 인위 구조이며; 그러나, 이들 돌출부는 또한, 예를 들어, 분배 랙 (dispensing rack)에 배치된 이들의 연관된 툴을 유지하는 것을 돕도록 제공된다.
상기 장치의 내부는 도 2b 및 2c 모두에서 알 수 있고, 여기서 상기 장치는 이의 전체 길이에 따라 비어 있다는 사실을 알 수 있다. 도 2c에서 역원뿔 부분의 도면은 상기 원주가, 예를 들어, 매크로비드를 맞물도록 설계된 대상보다 다소 더 작은 지점에서 어떻게 줄어드는지를 더욱 상세하게 보여주고 있다.
작동에 있어서, 상기 장치 (40)는, 예를 들어, 진공 펌프 수단에, 연결 말단 (46)을 통해 연결되고, 매크로비드와 같은, 제거되기 위한 대상에 대해 수직으로, 위치된다. 상기 진공 펌프 수단 (도시되지 않음)은, 상기 툴 내에 어떤 공기를 제거하고, 예를 들어, 상기 진공에 의해 생성된 석션의 힘을 조절하여, 상기 매크로비드의 흡수를 허용하고, 상기 역원뿔 말단 (41)의 형상은, 하나의 위치로부터, 반-연성 아가로즈 매크로비드와 같은, 매크로비드의 제거, 및 코팅 아가로즈 용액과 같은, 또 다른 곳으로 이동을 허용한다. 그 점에 있어서, 상기 진공 압력은, 예를 들어, 상기 매크로비드의 형상에 어떤 변화없이 원뿔 말단 (41)으로부터 아가로즈 용액에 상기 매크로비드를 추출하도록 작용하는, 종방향 수단 (45)에 공기를 제공하는 단계를, 통해 변화된다.
도 3은 도 2a-2c의 장치의 또 다른 구현 예를 나타낸다. 도 2a-2c의 구현 예 보다 다른 제조 수단을 통해 제조된, 이러한 장치는 종방향 섹션 (43)에 따라 릿지 수단을 나타낸다. 또한, 상기 릿지 수단 (47 및 48a-c)에서 뿐만 아니라, 상기 칼라 수단에서 변형이 있다는 것이 주목될 것이다. 상기 연결 말단 (45) 및 연결 개구뿐만 아니라, 상기 역원뿔 말단 (41) 및 이의 림은, 그러나, 도 2a-2c의 비교가능한 구조와 같은 동일한 방식에서 기능한다.
도 4a 및 4b는 이하 "스트로 툴"로 알려진 장치의 구현 예를 예시한다. 도 4a를 참조하면, 스트로 툴 (50)은 도시된다. 상기 툴은 중공 종방향 축 (51), 연결 말단 (52), 및 수용 말단 (53)을 따라 필수적으로 실린더형 기하학을 나타낸다.
상기 스트로 툴은 상기 종방향 축 (51)에 따라 확장되고, 수용 말단 (53)에서 개방하는, 매입형 공간 (54)을 포함한다.
수용 공간 (54)은 종방향 축을 따라 확장하고, 상기 수용 공간보다 더 작은 직경을 가질 수 있는, 관 섹션 (canal section) (55)에 붙어있다. 이러한 관 섹션 (55)은 연결 수단 (52)과 연결되고, "52", "54" 및 "55"의 조합은 공기 또는 다른 가스와 같은, 유체의 압력의 변화를 수용하는 작용 채널을 형성한다. 작동에 있어서, 연결 수단 (52)은 공기 펌프와 같은, 스트로 툴에서 유체의 압력을 변화할 수 있는 장치와 연결된다. 상기 스트로 툴은 그 다음 매크로비드와 같은, 대상에 배치되고, 압력에서 변화에 따라, 상기 매크로비드는 상기 스트로 툴에 의해 제거된다. 수용 말단 (53)에서 입구의 직경은 상기 대상, 예를 들어, 상기 매크로비드를 픽업하고, 상기 툴의 종방향 공동 (cavity)에서 상기 매크로비드를 수직으로 이동하도록 충분히 큰 것이 주목될 수 있다. 상기 매크로비드가 원하는 위치로 이동된 때, 압력의 제2 변화는 상기 매크로비드를 떨어뜨리고, 상기 스트로 툴의 재사용을 허용한다.
도 4a 및 4b는 연결 수단 (52)의 형상이 다른 점에서 다르지만; 형상에서 차이는 제조 공정으로부터의 결과이고, 상기 장치의 작동에 영향을 미치지 않는다.
각 장치에 있어서, 점선은 선택된 진공 연결 수단의 수용을 위한 스트로 툴의 채택을 나타낸다. 예시된 오목한 채널 (recessed channel) (56)은 확장가능한 O-링과 같은, 연결 수단을 허용할 수 있다. 또한, 상기 장치의 특색은 피펫의 진행을 지연시키는, 수단 (57)이다. 이러한 "피펫 선반 (pipette shelf)"은 상기 유체, 예를 들어, 공기에 대한 다른 운반 수단 또는 피펫의 통로를 중단시킨다.
하기 실시 예는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 설명을 위한 것이지, 제한을 하는 것은 아니다.
실시 예 1
분말 아가로즈 (Litex HSB-LV)는 0.8% 또는 4.5% (w/v)의 농도로 최소의 필수 배지에 용해되고, 그 다음 20분 동안, 121℃에서 가압멸균된다. 이것은 점성 용융 용액을 생산한다. 상기 아가로즈 용액은 냉각되고, 각각 51-53℃, 또는 61-63℃에서 유지된다.
총 150,000 RENCA (신장 암) 세포는 웰에 첨가되고, 0.25 ml의 0.8% 아가로즈 용액이 현탁액을 형성하기 위해 첨가된 후, 이러한 세포/아가로즈 현탁액은 그 다음 플라스틱 보울에서 실온 광유, 또는 실온 광유로 채워진 딥 웰 96 플라스틱 플레이트에 분배된다.
아가로즈 매크로비드를 함유하는 RENCA 세포는, 매끄러운 표면을 갖고, 균일하게 분포된 세포를 갖는, 둥근 매크로비드로서, 형성된다. 상기 광유는 그 다음 상기 매크로비드로부터 흡입되고, 상기 매크로비드는 RPMI 세포 배양 배지로 세척된다.
상기 매크로비드에 대한 코팅은 4.5% w/v 용액을 사용한다. 상기 코팅에 대한 아가로즈는 상기 매크로비드에 대해 사용된 것과 동일한 타입이지만, 이들이 다를 수 있다는 것이 주목될 것이다.
상기 매크로비드를 제조하기 위한 수동 모드를 수행하기 위하여, 상기에서 제조된 비드는, 61-63℃에 유지되는, 1.0 ml의 4.5% 아가로즈를 함유한 플라스틱 스푼에 굴린 후에, 실온 광유로 떨어뜨린다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 코팅 물질은 61-63℃에 유지되고, 24 웰 플레이트로 전달된다. 도 2a에 도시되고, 전술된 상기 "트럼펫"은 그 다음 실온 광유로부터 비드를 제거하고, 그리고 상기 광유를 제거하기 위해 상기 비드를 세척한 후에 2차 코트, 아가로즈 용액으로 이들을 배치시키기 위해 사용된다. 도 4a에 예시된, 스트로우 툴은, 상기 비드를 제거하기 위해, 조심스러운 석션과 함께, 온도 구배에서 유지된 광유를 함유하는 용기에 0.5 ml의 아가로즈와 함께 사용된다.
매크로비드는, 하기에 논의된 바와 같이, 변화하는 온도에서 유지되는, 상기 광유 구배의 상부로, 스트로 툴로부터 분배된다. 상기 매크로비드가 상기 광유를 통해 내려감에 따라, 상기 코팅은 구형을 형성하는 비드 상에 고체화된다. 상기 광유의 온도는 용기의 상부로부터 하부로, 또한 하기에 논의된 바와 같이, 하부에서 낮은 온도로 감소한다. 상기 아가로즈/아가로즈 매크로비드는 그 다음 도 2a의 트럼펫을 사용하여 용기로부터 제거되고, 그 다음 배지에서 세척된다. 최종 매크로비드는 일상의 조직 배양을 위해 준비된다.
실시 예 2
하기 표 1과 같이 전술된 온도 구배를 사용하는, 일련의 다른 실험은 사용된다.
실험 상부 온도 하부 온도
대조구 RT (실온) RT (실온)
1 25 ℃ -2 ℃
2 30 ℃ -2 ℃
3 40 ℃ -2 ℃
4 RT RT
5 50 ℃ -1.8 ℃
6 60 ℃ -1.6 ℃
7 RT RT
8 70 ℃ 0 ℃
9 25 ℃ -2 ℃
비드가, 상기에서 논의된 바와 같이, 회수되고 세척된 후, 이들은 대사 활성에 대해 시험된다. 이러한 평가는, 기술분야에서 잘 알려진, 표준 MTT 분석을 사용하여 수행된다. 대사 활성은 비-앤캡슐화된 세포에 대해 =0일, 및 앤캡슐화에 대해 7일 후-생산에서 결정된다. 상기 결과는 하기 표 2에 요약하였다.
실험 대조구 1 2 3 4 5 6 7 8 9
유리 세포 0.603 0.682 0.682 0.682 0.669 0723 0.723 0.517 0.686 0.686
앤캡슐 0.507 0.411 0.299 0.279 0.261 0.182 0.173 0.448 0.167 0.415
상기 결과는 상기 앤캡슐화된 세포가 상기 구배로 하강된 경우 출발 온도와 상관없이 생존하는 반면, 대사 활성은 구배가 시작된 온도에 대해 반비례, 즉, 온도가 높을수록, 최종 대사활성이 낮아진다는 것을 나타낸다.
실시 예 3
상기 광유 구배의 최적 출발 온도가 약 25℃로, 말단 온도는 약 -2℃로 설정하여 제공되며, 이것은 대사 활성 및 종양 억제력을 결정하기 위한 일련의 실험에 사용된다.
대사 활성은 상기에서 서술된 동일한 방식으로 결정된다.
종양 억제 활성은 4 ml의 신선한 배양 배지, 또는 배양 5일 후, 앤캡슐화의 배양으로부터 제공된 동일한 양의 배양 배지에서 6 웰 플레이트 (15,000 세포/웰)에 RENCA 세포를 접종하여 결정된다. 자유 RENCA 세포 (free RENCA cells)는 상기 배지에서, 5일 동안, 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 배양된다. 상기 RENCA 세포는 그 다음 메탄올로 고정되고, 0.33% (w/v) 뉴트럴 레드 (neutral red)로 염색되며, 흡광도는 기준 파장으로서 630 nm를 사용하여, 540 nm에서 결정된다. 억제 (Inhibition)는 처리된, 및 신선한 배지 사이의 Abs540nm -630 nm에서 퍼센트 차이로서 정의된다.
결론적으로 상기 결과는 하기 표 3의 대사 활성 데이터이다. "자유 세포"는 아가로즈로 전혀 처리하지 않는 RENCA 세포를 의미하고, 반면에 "1st 코트"는 코팅되지 않은 비드를 의미한다.
연령 (일) 타입 대조
구		 1 대조구 2 2 대조구 3 3 4 대조구 4 5 6 대조구 5 7
0 유리 세포 0.768 0.530 0.378 0.462 0.481 0.532 0.532 0.384 0.518 0.518 0.530 0.553
1 1st
코트		 0.926 1.209 0.912 1.279 1.056 1.120 1.120 1.129 1.002 1.002 1.157 1.711
7 1 주 0.247 0.260 0.332 0.143 0.739 0.801 0.710 0.409 0.390 0.227 1.330 0.697
21 3 주 0.201 0.351 0.328 0.258 0.555 0.560 0.770 0.462 0.531 0.380 0.977 0.555
35 5 주 0.647 n/a 0.856 n/a 1.156 n/a 1.092 1.141 n/a n/a 1.447 n/a
49 7 주 1.080 n/a 1.236 n/a 1.324 n/a 1.066 1.215 n/a n/a 1.926 n/a
84 12 주 1.025 n/a 1.548 n/a 1.623 n/a 1.095 1.725 n/a n/a 1.886 n/a
112 16 주 1.652 n/a 2.440 n/a 2.247 n/a 1.128 1.872 n/a n/a n/a n/a
하기 표 4에 있어서, 상기 종양 억제력은 결정된다:
연령 (일) 타입 대조구 1 대조구 2 대조구 3 4 대조구 5 대조구 6
35 % 29.99% 29.80% 12.78% -11.23% 11.10% 7.54% 17.37% 23.97% 26.20% 33.85% 33.28%
49 % 23.62% 33.53% 26.15% 33.98% 32.70% 29.63% 29.63% 34.54% 40.90% n/a n/a
84 % 33.10% 45.69% 23.41% 33.93% 43.20% 56.02% 56.09% n/a n/a n/a n/a
112 % 50.19% 55.66% 42.21% 46.03% 55.28% 44.84% n/a n/a n/a n/a n/a
상기 결과는 본 발명에 따라 생산된 상기 아가로즈 비드가 수동으로 생산된 비드와 거의 모든 항목에서 동등하다는 것을 나타낸다.
실시 예 4
비드는 전술된 바와 같이 본 발명, 및 인용된 종래의 기술을 통해 나타낸 바와 같은 수동 방법으로 생산된다. 7 개월의 기간에 걸쳐, 10 개의 비드는 이들의 직경을 결정하기 위해 무작위로, 선택된다. 하기 표 5에서 나타낸, 결과는 본 발명에 따라 생산된 비드가 좀더 일정한 직경을 갖고, 따라서 좀더 일정한 코팅을 갖는 것을 알 수 있다.
Figure 112014082816442-pct00001
또한, 실험시, 본 발명의 공정이 감소된 세포내 오염을 결과한다는 것을 확인하였다. 상세히 설명하면, 비드가 종래의 수동 방법에 따라 제조된 경우, 완전하게 앤캡슐화되지 않는 세포는 문제가 된다는 것을 확인하였다. 상기 세포가 암 세포, 플라크 (plaques), 또는 종양 클로니 형태인 경우, 이들을 갖는 배양에서 상기 비드는 오염에 기인하여 반드시 폐기해야 한다.
8-개월의 기간에 걸쳐, 56 배치의 비드는 수동으로 제조되어, 각 배치는 다수의 페트리 디쉬 배양을 함유한다. 적어도 하나의 배양은 각 배치에서 오염된다. 반대로, 62 배치는 본 발명의 방법을 사용하여 동일한 기간 동안 제조된다. 이들 62 배치 중 오직 12 개만이 어떤 타입의 오염을 나타낸다.
실시 예 5
하기 실시 예는 세 개의 다른 군의 섬세포를 함유하는 아가로즈 코팅된, 아가로즈 비드의 생산을 상세히 설명한다.
섬세포는 다수의 출산의 경력이 있는 두 살 된 동물로부터 제조된다.
동물의 췌장은, 콜라겐분해효소/중성 단백질분해효소 (1.0 g/L에서 콜라겐분해효소, 또는 7.5 U/g/췌장에서, Liberase MTF/Thermolysin), 및 Hanks Balanced Salt 용액 (GBSS) 또는 Cold Storage Purification Stock 용액에서 제조된, 0.01 g/L DNase I, 또는 2.5 mg/췌장 폴모자임 (pulmozyme) 용액으로 관류된다 (perfused).
정량화 후, 섬세포는 1.5% Seakem Gold (이하 "SG", 0.8% SG, 또는 0.8% Litex (이하 "Li")) 중 하나의 0.5 ml 용액에 재현탁되기 전에, 2000 IEQ 분취액 (aliquots)으로 분리된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "IEQ"는 150 ㎛의 직경을 갖는 섬세포를 의미한다. 그러므로, 300 ㎛의 직경을 갖는 섬세포는 2 IEQs이고, 75 ㎛ 직경을 갖는 것은 0.5 IEQ이다. 리텍스 (Litex) 아가로즈는 다음의 특성을 소유한다: 1.5% 용액이 사용된 경우, 5.8 내지 8.7 cP의 1.5% 겔에서 ≥ 1000 g/㎠의 겔 강도, 1.5% 용액에 대해 40-43℃의 겔화 온도, 0.06 내지 0.12의 EEO (전기삼투 (electro endosmosis)) 값, 및 ≤ 0.30%의 황산염 함량. 상기 용액은 최소 필수 배지에 25 mM HEPES을 더하여 제조된다.
현탁액은 네 개의, 대략 5-6 mm의 직경이고, 이의 각각은 500 IEQ을 함유하는, 0.125 ml 구형 비드를 산출하기 위해, 멸균 광유의 표면 밑에서 축출된다.
이러한, 미코팅된 아가로즈 비드는 습도 5% CO2 분위기로, 37℃에서 배양된다. 5-7일 후, 2차 코트의 5%, SG 아가로즈는 적용되어, 최종 직경 8-9 mm를 갖는, 아가로즈 비드를 함유하는 아가로즈 코팅된, 섬세포를 산출한다.
이들 비드는 다음의 실험에서 사용될 때까지, 습도 5% CO2 분위기로 37℃에서 배양된다. 이들은 배양 배지 (2.5% 열 불활성 돼지 혈청 (porcine serum), 및 1% 항생성/항진균성 (antibiotic/antismycotic)으로 보충된, 11 mM 글루코스)에 배치된다. 상기 배양 배지는 주마다 변화되고, 배지의 샘플들은 하기에 논의된 분석을 위하여, 매주, 변화 후 24 시간에서 분석된다.
실시 예 6
전술된 실시 예에서 논의된 바와 같이, 배양 배지 샘플은 상기 샘플로부터 얻어지고, 상업적으로 활용가능한 돼지 인슐린 ELISA를 사용하여, 인슐린 함량에 대해 분석된다. 상기 결과는 도 6에 나타낸다. 0.8% Li에서 앤캡슐화된 섬세포는 인슐린 생산과 관련하여 1.5% SG 및 0.8% SG에서 앤캡슐화된 섬세포 모두를 능가한다는 것을 알 수 있을 것이다.
실시 예 7
상기에서 제공된 시험관 실험은, 본 명세서에 논의된 바와 같이, 생체 내 실험으로 확장된다.
성체 (8 주령 렛트)는 이들 실험에 사용된다. 동물들은 "오직 인슐린인" 대조구, 또는 비드 수용체의 군으로 구분된다. 모든 동물은 당뇨병을 유도하기 위해 꼬리 혈관 주사를 통해 65 mg/kg의 스트렙토조신 (streptozotocin)이 주입된다.
당뇨병의 존재는 비-공복 혈당치에 대해 대상이 되는 동물의 혈액을 분석하여 확인된다. 3일 연속으로 글루코스의 400 mg/dL 이상 수준은 당뇨병이 존재하는 것을 나타내는 것으로 받아들인다. 2주 이내에 당뇨병을 나타내지 않는 어떤 동물들은 스트렙토조토신의 2차 복용 후, 모든 동물은 당뇨병을 나타낸다.
이식을 위해 선택된 동물은 Gazda, et al., Cell Transplant, 16:609-620 (2007)에 따라 비드를 받아들이고, 상기 문헌은 참조로서 그 전체적인 내용이 혼입된다. 좀더 상세하게는, 12-13 주령 동물은 이소플루란 (isoflurane)을 사용하여, 마취된다. 복강을 따라 중앙 절개 후, 비드는 그 내부에 배치된다.
이식 전에 3일에 걸쳐 특정한 동물에게 제공된 인슐린의 가장 많은 투여량에 의존하여, 변화된 각각 동물에 배치된 비드의 수는, (이식 전에 4 주 기간에 걸쳐 상기 비드에 의해 생산된 인슐린에 기초하여) 매크로비드 당 평균 인슐린 생산에 의해 나눈다. 쥐는 이들이 이식 전 (1x), 또는 1.7x를 복용한 정확한 인슐린 복용량을 제공하기 위해 필요한 비드의 양을 받는다. 암컷 및 수컷 동물은 1x과 동일한 비드를 제공받지만, 오직 수컷은 1.7x를 제공받는데, 이것은 수컷 쥐가 암컷 쥐보다 체중이 더 나가기 때문이다.
다른 이식 타입 (1.5% SG, 0.8% SG, 0.8% Li)과 관련하여 전-이식 인슐린 요구조건에서 알 수 있는 상당한 차이점이 없지만; 더 많은 매크로비드가 1.5% SG 비드에 대해 요구되고, 더 적은 매크로비드는 0.8% Li에 대해 요구된다.
이식 후, 상기 동물은 정기적으로 혈액 글루코스 및 체중을 관찰하면서, 90일 동안 유지된다.
암컷 쥐 (모두 1x 군)는 인슐린 대조구를 제공받은 쥐와 비교하여 혈액 글루코즈 수준의 직접적인, 지속적 안정화를 나타낸다. 1x 군에서 수컷 쥐는 이식-후 약 30일까지 이식-전 수준으로 되돌아가는, 혈액 글루코즈 조절에서 직접적이지만, 일시적인 개선을 나타낸다.
실시 예 8
연구는 수령 동물이 희생되고, 구조적 완전성 및 기능적 능력에 대해 시험된된 후, 상기 매크로비드 상에서 수행된다.
전체 실험은 회수된 오직 1540 중 두 개의 매크로비드가 어떤 구조적 손상을 나타내는지를 보여준다.
전술된 실시 예는, 아가로즈로 코팅된, 분비 세포-함유 아가로즈 매크로비드에 관한, 본 발명의 다양한 특색을 설명하고, 여기서 상기 매크로비드에 대해 사용된 아가로즈는 상기에서 서술된, 리텍스 (Litex) 아가로즈의 특성을 갖는다.
본 명세서에 서술된 바와 같이, 용어 "매크로비드"는 약 4 내지 약 10-12 mm의 직경, 가장 바람지하게는 약 6 내지 약 8 mm의 직경을 갖는 필수적으로 구형인 구조를 의미한다. 상기 2차 아가로즈 층은 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 mm의 두께, 좀더 바람직하게는 약 0.5 mm 내지 약 5 mm의 두께, 더욱 바람직하게는 약 1.0 mm 내지 약 3 mm, 및 가장 바람직하게는 약 1.0 mm 내지 약 2.0 mm의 두께이다. 상기 2차 아가로즈 층은 상기 비드를 제조하기 위해 사용된 동일한 아가로즈일 수 있지만, 반드시 동일할 필요는 없다.
"매크로비드"는 바람직한 구조로서 사용되지만; 분비세포를 앤캡슐화하고, 바람직하게는 2차, 아가로즈 층으로 코팅된, 어떤 고형의, 아가로즈 구조는 본 발명의 특색이다.
상기 분비 세포는 다양할 수 있다. 바람직한, 분비 생산물을 산출하는 어떤 세포 또는 세포기관 (organelle)은 앤캡슐화될 수 있다. 섬세포, 암세포, 및 줄기 세포는 사용될 수 있는 대표적인 타입의 물질이다. 각각의 비드는 섬세포에 대한, 세포내 세포기관의 다양한 수, 예를 들어, 약 50 내지 약 5000 섬세포 등가물 (이후 "IEQs"), 더욱 바람직하게는, 약 100 내지 약 2500 IEQs, 더더욱 바람직하게는 약 250 내지 약 1000, 및 가장 바람직하게는 약 475 내지 약 550 IEQs를 함유할 수 있다. 약 500 IEQs는 특히 가장 바람직하다.
또한 본 발명의 특색은 사용된 아가로즈와 무관하게, 매크로비드를 제조하는 개선된 방법이다. 세포는 아가로즈와 혼합되고, 그 다음 비드를 형성하기 위해 차례로 사용된 현탁액으로 형성된다. 상기 비드, 예를 들어, 매크로비드가 아가로즈로 코팅된 후에, 상기 비드는 더 높은 온도에서 광유와 접촉하고, 더 낮은 온도에서 오일에 떨어지도록, 최종 코팅된 비드는 온도 구배에서 광유의 샘플로 배분된다. 상기 비드는 분비 세포, 암세포, 섬세포, 다능성 줄기 세포와 같은, 줄기 세포, 등등과 같은, 바람직한 어떤 세포 타입을 함유할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히 바람직한 구현 예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, "트럼펫" 및 "스트로" 툴은 미코팅된, 및 코팅된 비드, 각각을 제거하는데 사용된다.
상기 광유의 온도 구배는 변화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 구배는 20℃ 내지 50℃이고, 즉, 최고 및 최저 온도 사이의 차이는 이러한 범위 내에 있다. 가장 바람직하게는, 상기 차이는 20℃ 내지 35℃이다.
상기 오일의 최고 온도는 변화할 수 있지만, 바람직하게는 20℃ 및 30℃ 사이, 더욱 바람직하게는 20℃ 및 35℃ 사이이다. 유사하게, 최저 온도는 변화할 수 있고, 0℃로부터 -8℃까지, 및 바람직하게는, 0℃로부터 -2℃까지 움직인다.
본 발명의 다른 관점은 당업자에게 명백해 할 것이고, 더욱 자세히 설명할 필요는 없을 것이다.
사용된 용어 및 표현은 설명의 관점으로 사용된 것이지 제한을 의도하는 것은 아니며, 나타내고 설명된 특색의 어떤 균등물 또는 이의 일부를 배제하는 것으로 이러한 용어 및 표현을 사용하려는 의도는 없고, 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 가능하다는 것이 인식될 것이다.

Claims (16)

  1. 비드를 함유하는 아가로즈에서 생세포(live cell) 샘플을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 비드는 아가로즈로 코팅되며, 상기 방법은:
    (a) 아가로즈의 제1 샘플과 생세포 샘플을 혼합시켜 현탁액을 형성하는 단계;
    (b) 상기 현탁액을 광유의 제1 샘플로 이동시켜 상기 현탁액으로부터 비드를 형성시키는 단계;
    (c) 상기 광유의 제1 샘플로부터 상기 비드를 제거하는 단계;
    (d) 상기 비드로부터 상기 광유를 헹구는 단계;
    (e) 트럼펫 툴로 상기 비드를 아가로즈의 제2 용액으로 이동시키는 단계;
    (f) 상기 비드를 상기 아가로즈의 제2 용액으로 코팅시키는 단계;
    (g) 스트로 툴로 상기 아가로즈의 제2 용액으로부터 상기 비드를 제거하는 단계; 및
    (h) 상기 코팅된 비드를 광유의 제2 샘플에 분배하는 단계;
    를 포함하며,
    여기서, 상기 비드가 20℃로부터 30℃까지의 더 높은 온도에서의 광유로부터 0℃로부터 -8℃까지의 더 낮은 온도에서의 광유로 이동하도록 상기 광유의 샘플이 온도 구배에서 유지되는, 비드를 함유하는 아가로즈에서 생세포 샘플을 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 분비 세포인 조성물을 제조하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 암 세포인 조성물을 제조하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 암 줄기세포인 조성물을 제조하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 섬 세포인 조성물을 제조하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 줄기세포인 조성물을 제조하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 세포는 배아 줄기세포인 조성물을 제조하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포는 전분화능 세포인 조성물을 제조하는 방법.
  9. 삭제
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 트럼펫 툴로 상기 광유의 제1 또는 제2 샘플로부터 상기 비드를 제거하는 단계를 더욱 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 더 높은 온도는 20℃로부터 25℃까지이고, 상기 더 낮은 온도는 0℃로부터 -2℃까지인 조성물을 제조하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
KR1020147024373A 2012-01-31 2013-01-30 매크로비드의 개선된 제조방법 KR101722824B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261592949P 2012-01-31 2012-01-31
US61/592,949 2012-01-31
PCT/US2013/023802 WO2013116306A1 (en) 2012-01-31 2013-01-30 Improved method for manufacture of macrobeads

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140122742A KR20140122742A (ko) 2014-10-20
KR101722824B1 true KR101722824B1 (ko) 2017-04-03

Family

ID=48903127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147024373A KR101722824B1 (ko) 2012-01-31 2013-01-30 매크로비드의 개선된 제조방법

Country Status (21)

Country Link
US (2) US9090866B2 (ko)
EP (1) EP2809782B1 (ko)
JP (1) JP5986226B2 (ko)
KR (1) KR101722824B1 (ko)
CN (1) CN103975059B (ko)
AP (1) AP2014007623A0 (ko)
AU (1) AU2013202026B2 (ko)
BR (1) BR112014015804B1 (ko)
CA (1) CA2851023C (ko)
DK (1) DK2809782T3 (ko)
ES (1) ES2647613T3 (ko)
HK (1) HK1199903A1 (ko)
HU (1) HUE034618T2 (ko)
IL (1) IL231834A (ko)
MX (1) MX350593B (ko)
NO (1) NO2904201T3 (ko)
NZ (1) NZ624195A (ko)
PL (1) PL2809782T3 (ko)
PT (1) PT2809782T (ko)
RU (1) RU2591518C2 (ko)
WO (1) WO2013116306A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017020141A1 (es) * 2015-08-03 2017-02-09 Vera Campos Claudio Herramienta, sistema y procedimiento automatizado de toma de muestras
CN109642213B (zh) * 2016-03-01 2023-02-24 牛津大学创新有限公司 载有装载的支架的相转移
DE102017106867B4 (de) * 2017-03-30 2021-12-02 Hamilton Bonaduz Ag Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit
TWI787697B (zh) * 2019-12-30 2022-12-21 財團法人工業技術研究院 外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法
TW202208062A (zh) * 2020-08-20 2022-03-01 財桂生物股份有限公司 微量管上蓋及其組裝裝置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070069408A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-29 Millipore Corporation Method and apparatus for making porous agarose beads

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1418228E (pt) * 1994-01-13 2006-09-29 Rogosin Inst Processo de preparacao de uma biblioteca multicombinatoria de vectores de expressao de genes de anticorpos.
US5888497A (en) 1996-04-03 1999-03-30 The Rogosin Institute Agarose coated agarose beads containing cancer cells that produce material which suppresses cancer cell proliferation
US6303151B1 (en) 1996-04-03 2001-10-16 The Rogosin Institute Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment
US6224912B1 (en) 1996-04-03 2001-05-01 The Rogo Institute Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment
DE69725317T2 (de) * 1996-04-03 2004-07-29 The Rogosin Institute Implantierbare agarose-kollagenkügelchen enthaltende zellen, die ein diffusionsfähiges biologisches produkt bilden und ihre verwendung
US20030012699A1 (en) * 1998-11-18 2003-01-16 Thomas Moore Simultaneous handling of magnetic beads in a two-dimensional arrangement
US6497155B1 (en) 1999-02-09 2002-12-24 Pharmacopeia, Inc. Article comprising a particle retrieval device
US6558665B1 (en) 1999-05-18 2003-05-06 Arch Development Corporation Encapsulating particles with coatings that conform to size and shape of the particles
JP2001168127A (ja) * 1999-12-08 2001-06-22 Japan Em Kk 微小球体移載装置
US20050053586A1 (en) 2003-09-04 2005-03-10 Bryan Conn Entrapped stem cells and uses thereof
JP2005114576A (ja) 2003-10-08 2005-04-28 Hitachi Software Eng Co Ltd 両親媒性分子固定化ビーズ、その製造方法、及びキャピラリビーズアレイのビーズ配列方法
WO2005082214A1 (en) 2004-02-25 2005-09-09 Andhow Innovations, Llc. Leak resistant siphoning device for use in fluid transfer
JP4520359B2 (ja) 2005-05-13 2010-08-04 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 粒子捕捉装置、並びに粒子配列方法及び粒子配列装置
CA2622529C (en) * 2005-09-26 2014-02-18 Lawrence Gazda Secretory cell-containing macrobeads comprising seakem gold agarose, and uses thereof
CN102316988B (zh) 2007-09-29 2014-02-19 Ei频谱有限责任公司 仪表化移液器吸头
WO2010138702A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Corning Incorporated Swellable synthetic microcarriers for culturing cells
USD625429S1 (en) 2009-10-01 2010-10-12 Holger Link Pipette
DE102010040687A1 (de) 2010-09-14 2012-03-15 Hamilton Bonaduz Ag Verfahren zum Herstellen von Wirkstoff-Beads
DE102010040681A1 (de) 2010-09-14 2012-03-15 Hamilton Bonaduz Ag Unterdruckgreifer zur Handhabung von Wirkstoff-Beads mit vorzugsweise konkaver Bead-Kontaktfläche
DE102010040685A1 (de) 2010-09-14 2012-03-15 Hamilton Bonaduz Ag Temperiervorrichtung zur thermischen Verfestigung von Wirkstoff-Beads
DE102010040684A1 (de) 2010-09-14 2012-03-15 Hamilton Bonaduz Ag Röhrenförmiger Unterdruckgreifer zur Handhabung von Rohlingen von Wirkstoff-Beads
DE102011050024A1 (de) 2011-04-29 2012-10-31 Hamilton Bonaduz Ag Analysevorrichtung für eine berührungslose Analyse der Ausformung eines transparenten Körpers und Verfahren zur Durchführung der berührungslosen Analyse

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070069408A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-29 Millipore Corporation Method and apparatus for making porous agarose beads

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
USRE040555 E1*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140122742A (ko) 2014-10-20
CA2851023A1 (en) 2013-08-08
EP2809782A4 (en) 2015-11-04
ES2647613T3 (es) 2017-12-22
BR112014015804B1 (pt) 2022-10-18
RU2591518C2 (ru) 2016-07-20
RU2014133367A (ru) 2016-03-27
AU2013202026A1 (en) 2013-08-15
JP2015510396A (ja) 2015-04-09
CN103975059B (zh) 2016-08-31
WO2013116306A1 (en) 2013-08-08
PL2809782T3 (pl) 2018-04-30
DK2809782T3 (da) 2017-11-20
CA2851023C (en) 2018-03-20
EP2809782B1 (en) 2017-08-23
IL231834A (en) 2016-04-21
BR112014015804A2 (pt) 2021-08-31
US20130202802A1 (en) 2013-08-08
MX350593B (es) 2017-09-11
EP2809782A1 (en) 2014-12-10
USRE47439E1 (en) 2019-06-18
NO2904201T3 (ko) 2018-01-20
HK1199903A1 (en) 2015-07-24
HUE034618T2 (en) 2018-02-28
MX2014009295A (es) 2014-09-11
AU2013202026B2 (en) 2014-05-08
CN103975059A (zh) 2014-08-06
US9090866B2 (en) 2015-07-28
JP5986226B2 (ja) 2016-09-06
NZ624195A (en) 2015-07-31
IL231834A0 (en) 2014-05-28
AP2014007623A0 (en) 2014-05-31
PT2809782T (pt) 2017-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101722824B1 (ko) 매크로비드의 개선된 제조방법
JP2019517808A (ja) 細胞培養装置及び方法
JP2023515749A (ja) 培養乳製品産生のための生細胞構築物およびその使用方法
WO2007114351A1 (ja) 新規細胞培養方法、およびその方法を用いた細胞塊の生産および回収方法
JP2003503021A (ja) スフェロイドの調製
EP3690020A1 (en) Production device, production system and production method for cell structure
CN112326964A (zh) 筛选靶细胞的方法、试剂盒及其用途
CN112326952A (zh) 筛选细胞的方法、试剂盒及其用途
JPH0870847A (ja) 細胞浮遊培養用容器
JP7438179B2 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
US20230365921A1 (en) Method for preparing cellular spheroid and method for producing extracellular vesicles by using cellular spheroid prepared by such method
CN112300938A (zh) 生物培养芯片及其制备和应用
AU2014202102A1 (en) Improved method for manufacture of macrobeads
US20210214662A1 (en) Vascularized In Vitro Arrays of Living Cells
US20220195361A1 (en) Device for seeding cells
CN216303865U (zh) 生物培养芯片及其用于制备所述生物培养芯片的模板
EP3697340A1 (en) Scaffold-free 3d bioprinting of porcine cells
US20220275342A1 (en) Dissolvable and degradable artificial circulation systems for large volume tissues
WO2023031167A1 (en) Perivascular implant
CN116635512A (zh) 具有扩散结构的包含3d细胞培养基材的培养容器
TWI283269B (en) A method of transfecting cells
JP2023510681A (ja) 細胞培養システムおよびその使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200313

Year of fee payment: 4