TWI787697B - 外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法,所述膠體粒子用於分離外泌體,包括2 wt%至6 wt%的瓊脂糖,粒徑大小為25 μm至500 μm,且表面修飾有生物相容性分子。生物相容性分子包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合。
Description
本揭露是關於一種分離方法、膠體粒子及其製備方法,且特別是關於外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法。
外泌體(Extracellular vesicles, EVs)為各種具有膜結構的囊泡統稱,其直徑大小從30 nm至40 nm至8 μm至9 μm不等,會由多種類的細胞分泌至周遭的環境中,在血液、尿液、唾液及其他體液中皆可發現它的存在。目前,細胞外囊泡的功能仍没有完全闡明,已知文獻認為它們能夠調節宿主與病原體的相互作用,參與傳染性、神經疾病和癌症等多種的病理過程,同時在正常的生理過程中也發揮著傳導细胞間通訊的重要功能。細胞外囊泡在臨床醫學中也有諸多的應用潛力,主要是因為它們含有豐富的生物標記物,可用於監測臨床狀態、治療反應、疾病進展等,同時具備遞送生物分子的功能,對於發展臨床藥物載體也極具潛力。
習知分離外泌體的黃金標準方法為超高速離心法,需耗費至少12小時,且在極高速下離心的回收率最高只有20%,雖能得到高純度的外泌體,回收率卻很低。近年來,各類文獻或專利開發了許多分離外泌體的方法或裝置,例如:聚二醇沉澱法、免疫磁珠純化法、微流道純化裝置等,但都無法同時滿足高回收率、省時、高純度的需求。
因此,開發一種能夠同時兼具高回收率、省時且高純度的外泌體分離方法顯得日趨重要。
本揭露提供一種外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法,利用化學合成膠體粒子填充成一分離管柱,對外泌體進行分離,以同時兼具高回收率、省時、高純度。
本揭露之膠體粒子的製備方法包括以下步驟。以水與瓊脂糖製備濃度為2 wt%至6 wt%的瓊脂糖溶液並加熱至90℃至100℃,再將濃度為5 wt%至20 wt%的介面活性劑及濃度為50 wt%至60 wt%的礦物油加入瓊脂糖溶液進行乳化,以形成第一膠體材料。之後,以篩網篩選第一膠體材料,以獲得粒徑範圍為25 μm至500 μm的第二膠體材料,並以清潔劑清洗第二膠體材料,以去除油污與雜質。接下來,將濃度為0.1 M至0.5 M的交聯劑加入經清洗的第二膠體材料,攪拌以形成第三膠體材料。最後,以有機溶劑清洗第三膠體材料,再以修飾溶液對第三膠體材料進行表面修飾,以獲得表面修飾有生物相容性分子的膠體粒子。修飾溶液包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合。
本揭露之膠體粒子用於分離外泌體,包括2 wt%至6 wt%的瓊脂糖,粒徑大小為25 μm至500 μm,且表面修飾有生物相容性分子。生物相容性分子包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合。
本揭露之外泌體的分離方法包括以下步驟。提供上述膠體粒子,將膠體粒子充填至管柱,並以篩板輕壓膠體粒子使其表面貼齊。之後,以PBS緩衝液潤洗數次後,將生物樣品加入管柱中,且使生物樣品與管柱內的膠體粒子於溫度18℃至24℃下作用。接下來,將PBS緩衝液加入所述管柱以進行沖提及/或離心,收集中段沖提液,所述中段沖提液中包含有外泌體。
基於上述,本揭露之膠體粒子可用於分離外泌體,其中包括2 wt%至6 wt%的瓊脂糖,粒徑大小為25 μm至500 μm,且表面修飾有生物相容性分子,將本揭露之膠體粒子充填至管柱,對外泌體進行分離,可在短時間之內得到高回收率且高純度的外泌體,以同時兼具高回收率、省時、高純度。
為讓本揭露的上述特徵和優點能更明顯易懂,下文特舉實施例,並配合所附圖式作詳細說明如下。
下文列舉實施例並配合附圖來進行詳細地說明,但所提供的實施例並非用以限制本揭露所涵蓋的範圍。此外,關於文中所使用「包含」、「包括」、「具有」等等用語,均為開放性的用語,也就是指「包含但不限於」。
本揭露提供一種膠體粒子的製備方法,所製成的膠體粒子主要用於分離外泌體。圖1為依照本揭露一實施例之膠體粒子的製備方法之流程示意圖。以下,將以圖1詳細描述本揭露一實施例之膠體粒子的製備方法。
請參照圖1,首先,進行步驟S10,以水與瓊脂糖(agarose)製備濃度例如是2 wt%至6 wt%的瓊脂糖溶液並加熱至約90℃至100℃(例如可使用微波爐或高壓滅菌鍋加熱),再將濃度例如是5 wt%至20 wt%的介面活性劑及濃度例如是50 wt%至60 wt%的礦物油(mineral oil)加入瓊脂糖溶液進行乳化(emulsification),以形成第一膠體材料。更詳細而言,介面活性劑可包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Span 80或其組合。
在上述本揭露之實施例的步驟S10中,調整水與瓊脂糖的比例可製備出不同百分比濃度的瓊脂糖溶液進而產生不同孔洞大小的瓊脂糖凝膠(agarose gel),而調整乳化劑的種類與比例可調整膠體粒子的大小。理論上而言,瓊脂糖溶液的百分比濃度越高,則孔洞越小,但不同的瓊脂糖凝膠硬度及分子量也會對孔洞大小造成影響,目前適用於分離外泌體的孔洞範圍大約是採用濃度為2 wt%至6 wt%的瓊脂糖溶液,例如是約2.2 wt%至5.8 wt%、約2.5 wt%至5.5 wt%、約2.8 wt%至5.3 wt%、約3 wt%至5 wt%、約3.3 wt%至4.7 wt%、約3.5 wt%至4.5 wt%、約2.25 wt%至2.75 wt%、約2.75 wt%至3.25 wt%、約3.25 wt%至3.75 wt%、約3.75 wt%至4.25 wt%、約4.25 wt%至4.75 wt%、約4.75 wt%至5.25 wt%、約5.25 wt%至5.75 wt%等,但不限於此。
在上述本揭露之實施例的步驟S10中,將製備好之瓊脂糖溶液加熱的方式可包括使用微波爐或高壓滅菌鍋加熱,但不限於此。而加熱的溫度可為約90℃至100℃,例如約90℃至92℃、約92℃至95℃、約95℃至98℃、約98℃至100℃、約93℃、約97℃、約99℃,但不限於此。
在上述本揭露之實施例的步驟S10中,所使用的介面活性劑可包括Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚,2-(2-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenoxy]ethoxy)ethanol)、Tween 20(聚山梨酯20,polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、Tween 80 (聚山梨酯80,polyoxyethylene sorbitan monooleate)、Span 80(山梨糖醇酐油酸酯,sorbitan monooleate)或前述之組合,但不限於此。而所使用之介面活性劑的濃度可為約5 wt%至20 wt%,例如可為約6 wt%至18 wt%、約8 wt%至16 wt%、約10 wt%至15 wt%等,但不限於此。
在上述本揭露之實施例的步驟S10中,所使用的礦物油可包括石蠟油、環烷烴油或芳香烴油,但不限於此。而所使用之礦物油的濃度可為約50 wt%至60 wt%,例如可為約52wt%至55 wt%、約55wt%至58 wt%、約53 wt%、約56 wt%或約59 wt%,但不限於此。
在上述本揭露之實施例的步驟S12中,所使用的清潔劑可包括SDS (十二烷基硫酸鈉,sodium dodecyl sulfate)、DOC (脫氧膽酸鈉,sodium deoxycholate)、CTAB(溴化十六烷基三甲銨,cetyltrimethylammonium bromide)或其組合。清洗可以一定量之上述清潔劑一次或多次施加至第二膠體材料中,而所使用之清潔劑尚可搭配有機溶劑一起清洗,以將油污清洗得更乾淨,所搭配使用之有機溶劑可包括正己烷、酒精溶液等或其組合,但不限於此。舉例而言,若反應使用80 ml的第二膠體材料,則可先以250 ml 1% SDS水溶液清洗油汙,再以100 ml的正己烷清洗油汙,過濾後以80 ml 20%酒精溶液清洗再3次,最後以80 ml清水清洗3次。
接下來,請繼續參照圖1,進行步驟S14,將濃度為約0.1 M至0.5 M的交聯劑加入經清洗的第二膠體材料,攪拌以形成第三膠體材料。更詳細而言,交聯劑可包括環氧氯丙烷(epichlorohydrin)、DCP(1,3-二氯-2-丙醇,1,3-dichloro-2-propanol)、2,3-二溴丙醇(2,3-dibromopropanol)、雙乙烯碸(divinyl sulfone)、雙環氧乙烷(bis-oxiranes)或其組合。
在上述本揭露之實施例的步驟S14中,所使用之交聯劑的濃度例如可為約0.15 M至0.45 M、約0.2 M至0.4 M、約0.25 M至0.35 M 等,但不限於此。
最後,請繼續參照圖1,進行步驟S16,以有機溶劑清洗第三膠體材料,再以修飾溶液對第三膠體材料進行表面修飾,以獲得表面修飾有生物相容性分子的膠體粒子。更詳細而言,所使用的有機溶劑係以一定量一次或多次施加至第三膠體材料中,有機溶劑可包括丙酮(acetone)、乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)或其組合,其中乙醇濃度例如是20%至75%、甲醇濃度例如是20%至75%、丙酮濃度例如是20%至75%。舉例而言,若反應使用80 ml的第三膠體材料,則先以80 ml 20%酒精溶液清洗3次,再以80 ml的清水清洗3次。丙酮使用量較少,大約40 ml第三膠體材料只需以濃度為75% 10 ml之丙酮清洗。使用甲醇清洗的方式則類似於乙醇,使用濃度可為25%至75%,使用量約是40 ml第三膠體材料以40 ml甲醇清洗3次。
在上述本揭露之實施例的步驟S16中,修飾溶液可包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合。更詳細而言,牛血清白蛋白(BSA)及胎牛血清(FBS)等蛋白質類為具有生物相容性的大分子,適用分子量範圍例如是3 kDa至150 kDa;甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)及麩胺酸(glutamic acid)等胺基酸類為具有生物相容性的小分子,適用分子量範圍例如是1 Da至500 Da;CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)及MC(甲基纖維素,methyl cellulose)為具有生物相容性的高分子,適用分子量範圍例如是10 kDa至500 kDa。
在上述本揭露之實施例的步驟S16中,表面修飾方法可包括吸附法或共價鍵結法。吸附法為在第三膠體材料經過交聯反應後,直接通過管柱,以使生物相容性分子吸附在膠體粒子表面。共價鍵結法為在第三膠體材料經過交聯反應後,將連接子(linker)裸露出來的官能基以共價鍵結的方式接上生物相容性分子。在本實施例中,吸附法可適用於上述具有生物相容性的大分子或小分子,上述高分子則由於溶解度的關係不適用吸附法。共價鍵結法則可適用於上述具有生物相容性的大分子、小分子或高分子。
又,修飾溶液中所包括的生物相容性分子可依所欲分離外泌體之生物樣品而有不同選擇。例如修飾溶液中包括具有生物相容性的大分子者,對於生物樣本為細胞培養液或血漿樣品皆有大幅提升外泌體回收率的效果。修飾溶液中包括具有生物相容性的小分子者,對於生物樣本為細胞培養液則具有較中等的外泌體回收率,但所回收之外泌體的純度高。而若針對生物樣本為血漿樣品,則選用修飾溶液中包括具有生物相容性的高分子者,對於外泌體的回收率可優於修飾溶液中包括具有生物相容性的小分子者。
再者,上述本揭露之實施例的步驟S16中,於以修飾溶液對第三膠體材料進行表面修飾時,修飾溶液中所包括的生物相容性分子濃度可為約0.1 M至0.5 M,例如可為約0.15 M至0.45 M、約0.2 M至0.4 M、約0.25 M至0.35 M、約0.13 M、約0.26 M、約0.33 M、約0.46 M等,但不限於此。藉由包括有生物相容性分子之修飾溶液對第三膠體材料進行表面修飾,可增加外泌體的回收率。
本揭露也提供一種由上述膠體粒子的製備方法所製成之膠體粒子,可用於分離外泌體,所述膠體粒子可包括約2 wt%至6 wt%的瓊脂糖,粒徑大小例如是25 μm至500 μm,且表面修飾有生物相容性分子,生物相容性分子可包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合。由於本揭露的膠體粒子表面修飾有生物相容性分子,因此,可有效地提高回收率。
又,上述本揭露之實施例所提供的膠體粒子,其瓊脂糖製備濃度、加熱條件、介面活性劑與礦物油使用濃度、以篩網所篩選獲得之第二膠體材料的粒徑範圍、所用於清洗第二膠體材料之清潔劑、所施加於第二膠體材料之交聯劑、交聯劑使用濃度、所用於清洗第三膠體材料之有機溶劑、適用於修飾第三膠體材料表面的生物相容性分子、修飾溶液的適用濃度以及膠體粒子表面修飾程度等,皆與上述用於分離外泌體之膠體粒子的製備方法中所記載的範圍或內容相近或相同,於此不再贅述。
本揭露也提供一種使用上述膠體粒子進行外泌體分離的方法。圖2為依照本揭露一實施例之外泌體的分離方法之流程示意圖。以下,將以圖2詳細描述本揭露一實施例之外泌體的分離方法。
請參照圖2,首先,進行步驟S20,提供膠體粒子,所述膠體粒子由上文中圖1描述的製備方法製成,且具備上文中提到的粒徑大小及組成,且表面修飾有生物相容性分子。由於上文中已進行詳盡說明,故在此不予贅述。
接著,請繼續參照圖2,進行步驟S22,將膠體粒子充填至管柱,並以篩板輕壓膠體粒子使其表面貼齊。在本實施例中,管柱可以是重力層析管柱、離心管柱或加壓管柱。
之後,請繼續參照圖2,進行步驟S24,以PBS緩衝液潤洗數次後,將生物樣品加入管柱中,且使生物樣品與管柱內的膠體粒子於溫度約18℃至24℃下作用,例如可於溫度約19℃、20℃、21℃、22℃、23℃下作用,但不限於此。
在本實施例中,生物樣品可包括細胞培養液、血漿、血清、尿液、腦脊液(cerebrospinal fluid)或羊水(amniotic fluid),但本揭露並不以此為限。更詳細而言,應用於細胞培養液時,較佳例如是使用含有6 wt%瓊脂糖且粒徑大小為74 μm至500 μm的膠體粒子,且膠體粒子表面修飾有具有生物相容性的小分子,並較佳例如是在加壓條件下操作。應用於血漿時,較佳例如是使用含有5 wt%瓊脂糖且粒徑大小為37 μm至125 μm的膠體粒子,且膠體粒子表面修飾有具有生物相容性的高分子,並較佳例如是在非加壓條件下操作。
接下來,請繼續參照圖2,進行步驟S26,將PBS緩衝液加入管柱以進行沖提及/或離心,收集中段沖提液,中段沖提液中包含有外泌體。如此一來,即完成本揭露之外泌體的分離方法。本揭露之外泌體的分離方法回收率可大於50%,例如可大於60%、大於70%、大於80%,甚至可大於90%,並可移除99%以上的蛋白質,使蛋白質的殘留量小於1%,流速例如可控制於約475 μl/min,操作時間可小於1小時,具有高分離效率。此外,在加壓的操作條件下,可使外泌體通過管柱加速,以縮小稀釋倍率,並提高外泌體回收率。
以下,藉由實驗例來詳細說明上述本揭露所提出的膠體粒子以及外泌體的分離方法。然而,下述實驗例並非用以限制本揭露。實驗例
為了證明本揭露的膠體粒子能夠有效地對外泌體進行分離,以下特別作此實驗例。實驗例 1 :膠體粒子製備
(1) 製備瓊脂糖粒子
將80 ml水與4.8 g瓊脂糖混和,以微波爐或高壓滅菌鍋加熱,以90℃加熱2小時使其完全溶解,以配製出6%瓊脂糖溶液。然後,將13.5 ml Span 80、1.5 ml Triton X-100和85 ml礦物油混和均勻並加熱到95℃,再將6%瓊脂糖溶液加入其中進行30分鐘的乳化反應。反應完成後,將其反應溫度降溫至室溫。之後,以1% SDS水溶液清洗油汙,並且過濾收集74 μm至250 μm瓊脂糖粒子。以100 ml正己烷及80 ml 20%酒精清洗三次,再以80 ml二次水清洗三次,得到40 ml之74 μm至250 μm的6%瓊脂糖粒子(相當於前述之第二膠體材料)。
(2) 交聯反應
將上述40 ml瓊脂糖粒子在最終濃度為0.5 N的氫氧化鈉溶液中與5 ml環氧氯丙烷(epichlorohydrin)反應,加熱至60℃反應並且攪拌過夜,以進行交聯反應,獲得相當於前述之第三膠體材料。
(3) 表面修飾生物相容性分子
於交聯反應完成後,直接在60℃溫度下,再次對膠體材料加入5 ml環氧氯丙烷(epichlorohydrin)反應3小時,以活化更多官能基。之後過濾並以二次水清洗膠體3次,以移除未反應之環氧氯丙烷。將已活化官能基的瓊脂糖粒子(經活化官能基之第三膠體材料)於最終濃度為1 N的氫氧化鈉溶液中,加入0.8 g之生物相容性分子CMC固體以及最終濃度為0.2 M的甘氨酸(glycine)溶液,在60℃溫度下反應過夜。之後將反應溫度降至室溫,以40 ml二次水過濾清洗3次,再以40 ml酒精清洗3次,最後再以40 ml二次水清洗三次後,收集已修飾好生物相容性分子CMC的6%瓊脂糖粒子(相當於前述之膠體粒子),以備後續分離外泌體之用。實驗例 2 :癌細胞培養液之外泌體純化
(1) 填充層析管柱
將直徑8 mm、長度70 mm、總體積約為3.5 ml管柱底部放入篩版,先以PBS緩衝液潤洗,再以滴管吸取實驗例1合成的膠體粒子填充至管柱中。待膠體粒子沉降至欲填充的高度(70 mm),以篩板貼其表面完成膠體填充,再以10 ml PBS緩衝液沖提平衡管柱。
(2) 分離外泌體
將人類乳腺癌細胞之細胞株SKBr3的培養液樣品100 μl注入管柱上方,待液面下降至篩版以下則進樣完成。以PBS緩衝液沖提樣品,收集前、中、後段之沖提液,其中中段含有高純度的外泌體,每管收集200 μL,一共收集24管。
(3) 樣品純度及回收率分析
將樣品以奈米粒子追蹤分析儀(nanoparticle tracking analysis, NTA)計算濃度及回收率,並且以ELISA方法確認粒子皆具CD9/CD9抗體活性,其中CD9抗體購自BioLegend。以microBCA鑑定其蛋白質殘留量。分析結果如圖3及表1所示。
圖3為以本揭露所提供之膠體粒子分離外泌體的層析圖。請同時參照圖3以及表1,其中外泌體訊號是以ELISA量測CD9/CD9的訊號,蛋白質殘留量則以microBCA量測。與純化前的癌細胞培養液比對,一方面計算藉由ELISA所獲得之CD9/CD9訊號值以計算回收率,另方面確認膠體粒子皆具CD9/CD9的抗體活性。其中,所收集之前段沖提液fraction 1-5為空白樣品,fraction 6-9有ELISA pair CD9/CD9吸收光450 nm的訊號,而fraction 10-20有microBCA吸收光562 nm的蛋白質訊號。又,由表1可知,以本揭露所提供之膠體粒子分離外泌體回收率可達約85%,殘留的蛋白質則約0.072%。表 1
實驗例 3 :神經膠質細胞及幹細胞培養液之外泌體純化
Fraction | 外泌體訊號 | 蛋白質訊號 | 外泌體回收濃度 (particles/ml) | 蛋白質殘留量 (μg/ml) |
6 | 0.8974 | 0.0882 | 1.60E+08 | 0.00 |
7 | 2.0904 | 0.1053 | 1.03E+09 | 0.09 |
8 | 1.5889 | 0.1020 | 4.17E+08 | 2.23 |
9 | 0.3027 | 0.1441 | 3.68E+07 | 3.48 |
(1) 填充層析管柱
將直徑8 mm、長度70 mm、總體積約為3.5 ml管柱底部放入篩版,先以PBS緩衝液潤洗,再以滴管吸取實驗例1合成的膠體粒子填充至管柱中。待膠體粒子沉降至欲填充的高度(70 mm),以篩板貼其表面完成膠體填充,再以10 ml PBS緩衝液沖提平衡管柱。
(2) 分離外泌體
將神經膠質細胞株HCN-2及幹細胞株iPSC-derived Mesenchymal Stem Cells (MSC)的培養液100 μl分別注入管柱上方,待液面下降至篩版以下則進樣完成。以PBS緩衝液沖提樣品,收集前、中、後段之沖提液,其中中段含有高純度的外泌體,每管收集200 μL,一共收集24管。
(3) 樣品分析
由於神經膠質細胞的外泌體訊號一般較低,因此以靈敏度較高之抗體磁珠輔助回收並確認其回收率。所採用磁珠的主要成份包括氧化鐵與二氧化矽,大小約為180 nm,不同抗體可相互搭配,例如CD63抗體可與CD81抗體搭配使用(CD63/CD81),如進一步與磁珠接合即成為抗體磁珠(MP-CD63/CD81)。前述CD63抗體購自BD Pharmingen,CD81抗體購自BioVision。經由不同的抗體磁珠配對篩選後,同樣與純化前的細胞培養液比對,分別篩選出訊號最強的MP-CD63/CD81 (實例1:神經膠質細胞)及MP-CD81/CD81 (實例2:幹細胞)訊號值,再分別計算回收率並且確認粒子皆具抗體活性。同時以microBCA鑑定其蛋白質殘留量。分析結果如表2所示。
表2中列示實例1及實例2的外泌體回收率以及殘留的蛋白質百分比。由表2可得知,使用本揭露的膠體粒子分離外泌體,可顯著提高回收率,且同時可維持小於1%的蛋白質殘留量。表 2
實驗例 4 :小體積和大體積樣品皆適用
樣品來源 / 體積 | 外泌體標記 | 回收率 | 蛋白質殘留量 (μg/ml) | |
實例 1 | 神經膠質細胞100 μl | MP-CD63/CD81 | 67% | 3.94(~0.08%) |
實例 2 | 幹細胞100 μl | MP-CD81/CD81 | 74% | 2.5(~0.39%) |
實例3的實驗操作條件與流程基本上與上文表2的實例2相同,不同之處在於樣品分析上並非使用抗體磁珠法,而是藉由ELISA所檢測之CD9/CD9訊號值,與純化前的細胞培養液比對且推算外泌體之回收率,同時確認膠體粒子皆具CD9/CD9的抗體活性。
關於實例4的實驗操作細節如下:
(1) 填充層析管柱
將直徑30 mm、長度130 mm、總體積約為92 ml的管柱底部放入篩版,先以PBS緩衝液潤洗,以滴管吸取實驗例1合成的膠體粒子填充至管柱中,待其膠體粒子沉降至欲填充的高度(130 mm),以篩板貼其表面完成膠體填充,再以270 mL PBS緩衝液沖提平衡管柱。
(2) 分離外泌體
將幹細胞株iPSC-derived Mesenchymal Stem Cells (MSC)之培養液樣品10 ml注入管柱上方,待液面下降至篩版以下則進樣完成。以PBS緩衝液沖提樣品,收集前、中、後段之沖提液,其中中段含有高純度的外泌體,每管收集200 μL,一共收集24管。
(3) 樣品分析
與純化前的細胞培養液比對由ELISA所檢測之CD9/CD9訊號值且計算外泌體之回收率,並且確認膠體粒子皆具CD9/CD9的抗體活性,其中CD9抗體購自BioLegend。以microBCA鑑定其蛋白質殘留量。分析結果如表3所示。
表3中列示實例3及實例4的外泌體回收率以及殘留的蛋白質百分比。由表3可得知,使用本揭露的膠體粒子分離外泌體,無論是用於小體積和大體積樣品,皆有高於60%的回收率,大體積樣品甚至可達高於90%的回收率,且同時可維持小於1%的蛋白質殘留量。表 3
實驗例 5 :血漿樣品之外泌體純化
樣品來源 / 體積 | 外泌體標記 | 回收率 | 蛋白質殘留量 (μg/ml) | |
實例 3 | 幹細胞100 μl | CD63/CD81 | 61% | 2.5(~0.39%) |
實例 4 | 幹細胞10 ml | CD81/CD9 | 93.7% | 10.5(<1%) |
(1) 填充層析管柱
填充層析管柱:將直徑8 mm、長度70 mm、總體積約為3.5 ml管柱底部放入篩版,先以PBS緩衝液潤洗,再以滴管吸取實驗例1合成的膠體粒子(實例5)或沒有經過表面修飾的膠體粒子(比較例1)填充至管柱中。待膠體粒子沉降至欲填充的高度(70 mm),以篩板貼其表面完成膠體填充,再以10 ml PBS緩衝液沖提平衡管柱。
(2) 分離外泌體
將血漿樣品100 μl注入管柱上方,待液面下降至篩版以下則進樣完成。以PBS緩衝液沖提樣品,收集前、中、後段之沖提液,其中中段含有高純度的外泌體,每管收集200 μL,一共收集24管。
(3) 樣品分析
以抗體磁珠法(MP-CD9/CD9)確認所收集到的外泌體皆具抗體活性,抗體磁珠的製備方式同上方所述,於此不再贅述。同時以microBCA鑑定其蛋白質的殘留量。分析結果如表4所示。
必須說明的是,樣品來源不同,所帶的生物標記也不同,必須在樣品分離前經過多種配對的篩選,選擇表現量較高的配對。一般而言,癌細胞的CD9/CD9表現量較高,幹細胞以CD81系列的表現多。至於血漿,則是由於蛋白質雜質高,相對外泌體的訊號較低,因此選用抗體磁珠法輔助以提高偵測靈敏度。然而,抗體磁珠法不局限於血漿樣品,其他來源的樣品同樣適用。
表4中列示實例5以及比較例1的外泌體回收率以及殘留的蛋白質百分比。由表5可得知,相較於使用沒有經過表面修飾的膠體粒子比較例1,使用本揭露所提供之表面修飾有生物相容性分子的膠體粒子的實例5具有顯著較高的回收率,且回收程度幾乎可為未經表面修飾者之2倍以上,同時蛋白質的殘留量也較低。表 4
樣品來源 | 外泌體標記 | 回收率 | 蛋白質殘留量 (μg/ml) | |
比較例 1 | 血漿 | MP-CD9/CD9 | 41% | 105(~0.14%) |
實例 5 | 血漿 | MP-CD9/CD9 | 94% | 88(~0.12%) |
綜上所述,本揭露提供一種膠體粒子的製備方法,所製成的膠體粒子可用於分離外泌體,其中包括2 wt%至6 wt%的瓊脂糖,粒徑大小為25 μm至500 μm,且表面修飾有生物相容性分子,將本揭露之膠體粒子充填至管柱,對外泌體進行分離,可在短時間之內得到高回收率且高純度的外泌體,同時達成高回收率、省時且高純度之目的。此外,此膠體粒子可廣泛應用於重力層析管柱、離心管柱或加壓管柱,可在20分鐘內得到大於50%回收率,甚至是大於90%回收率的外泌體,並可移除99%以上的蛋白質,使蛋白質的殘留量小於1%。
S10、S12、S14、S16、S20、S22、S24、S26:步驟
圖1為依照本揭露一實施例之膠體粒子的製備方法之流程示意圖。
圖2為依照本揭露一實施例之外泌體的分離方法之流程示意圖。
圖3為以本揭露所提供之膠體粒子分離外泌體的層析圖。
S10、S12、S14、S16:步驟
Claims (14)
- 一種膠體粒子的製備方法,所述膠體粒子用於分離外泌體,包括:以水與瓊脂糖製備濃度為2wt%至6wt%的瓊脂糖溶液並加熱至90℃至100℃,再將濃度為5wt%至20wt%的介面活性劑及濃度為50wt%至60wt%的礦物油加入所述瓊脂糖溶液進行乳化,以形成第一膠體材料;以篩網篩選所述第一膠體材料,以獲得粒徑範圍為25μm至500μm的第二膠體材料,並以清潔劑清洗所述第二膠體材料,以去除油污與雜質;將濃度為0.1M至0.5M的交聯劑加入經清洗的所述第二膠體材料,攪拌以形成第三膠體材料;以及以有機溶劑清洗所述第三膠體材料,再以修飾溶液對所述第三膠體材料進行表面修飾,以獲得表面修飾有生物相容性分子的膠體粒子,其中所述修飾溶液包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、甘胺酸(glycine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)或其組合,所述修飾溶液包括所述生物相容性分子,所述生物相容性分子的濃度為0.1M至0.5M。
- 如請求項1所述之膠體粒子的製備方法,其中所述介面活性劑包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Span80或其組合。
- 如請求項1所述之膠體粒子的製備方法,其中所述清潔劑包括SDS(十二烷基硫酸鈉,sodium dodecyl sulfate)、DOC(脫氧膽酸鈉,sodium deoxycholate)、CTAB(溴化十六烷基三甲銨,cetyltrimethylammonium bromide)或其組合。
- 如請求項1所述之膠體粒子的製備方法,其中所述交聯劑包括環氧氯丙烷(epichlorohydrin)、DCP(1,3-二氯-2-丙醇,1,3-dichloro-2-propanol)、2,3-二溴丙醇(2,3-dibromopropanol)、雙乙烯碸(divinyl sulfone)、雙環氧乙烷(bis-oxiranes)或其組合。
- 如請求項1所述之膠體粒子的製備方法,其中所述有機溶劑包括丙酮(acetone)、乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)或其組合。
- 如請求項5所述之膠體粒子的製備方法,其中乙醇的使用濃度為20%至75%,丙酮的使用濃度為20%至75%,甲醇的使用濃度為20%至75%。
- 一種膠體粒子,用於分離外泌體,由如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之膠體粒子的製備方法所製備,所述膠體粒子包括2wt%至6wt%的瓊脂糖,所述膠體粒子的粒徑大小為25μm至500μm,且所述膠體粒子的表面修飾有生物相容性分 子,所述生物相容性分子包括CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)、天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)、胎牛血清(FBS)或其組合。
- 如請求項7所述之膠體粒子,其中用於分離細胞培養液中的外泌體時,所述膠體粒子包含有4wt%至6wt%的所述瓊脂糖,且所述膠體粒子的粒徑大小為74μm至250μm。
- 如請求項8所述之膠體粒子,其中所述膠體粒子的表面修飾有天門冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸(glutamic acid)或其組合。
- 如請求項7所述之膠體粒子,其中用於分離血漿中的外泌體時,所述膠體粒子包含有3wt%至5wt%的所述瓊脂糖,且所述膠體粒子的粒徑大小為37μm至125μm。
- 如請求項10所述之膠體粒子,其中所述膠體粒子的表面修飾有CMC(羧甲基纖維素鈉,sodium carboxymethyl cellulose)、MC(甲基纖維素,methyl cellulose)或其組合。
- 一種外泌體的分離方法,包括:提供如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之膠體粒子的製備方法所製備的膠體粒子或申請專利範圍第7項至第11項中任一項所述之膠體粒子;將所述膠體粒子充填至管柱,並以篩板輕壓所述膠體粒子使其表面貼齊; 以PBS緩衝液潤洗數次後,將生物樣品加入所述管柱中,且使所述生物樣品與所述管柱內的所述膠體粒子於溫度18℃至24℃下作用;以及將PBS緩衝液加入所述管柱以進行沖提及/或離心,收集中段沖提液,所述中段沖提液中包含有外泌體。
- 如請求項12所述之外泌體的分離方法,其中所述生物樣品包括細胞培養液、血漿、血清、尿液、腦脊液(cerebrospinal fluid)或羊水(amniotic fluid)。
- 如請求項12所述之外泌體的分離方法,其中所述管柱為重力層析管柱、離心管柱或加壓管柱。
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