CN107629110A - 一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质 - Google Patents

Abstract

本案涉及一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质，以多孔陶瓷微球为内核，在多孔陶瓷微球的孔道中填充有琼脂糖、壳寡糖、乙二胺四甲叉膦酸钠；所述乙二胺四甲叉膦酸钠螯合钙离子和锰离子形成第一桥基；所述内核表面连接烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚与氨基三乙酸键合，氨基三乙酸螯合钙离子和锰离子形成第二桥基；所述第一桥基和第二桥基通过螯合作用固载刀豆凝集素A于内核表面。本发明所制备的亲和层析介质能够专一地分离纯化含有α‑甘露糖或者α‑葡萄糖的蛋白质，其中采用双重桥基固载配基刀豆凝集素A增加了亲和层析介质的稳定性，并使其具有较好的机械性能和分离效率。

Description

一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质

技术领域

本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质。

背景技术

蛋白质的糖基化是天然蛋白质的最重要修饰之一，生物体中50％以上的蛋白质是糖基化的，糖蛋白参与了细胞免疫、信号传导、蛋白质的翻译调控、癌症等生理过程，在生命体中起着重要的作用，同时糖蛋白的独特免疫原性使其在抗肿瘤、抗艾滋病等方面具有显著效果。为了精确研究糖蛋白的分子结构、组成、物理化学性质，并应用其生物学功能，必须将目标糖蛋白纯化到足够程度并获得足够的量。分离纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和性等。

研究发现糖蛋白能够被凝集素识别，并且一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。人们逐渐将凝集素发展成强有力的工具来纯化、分离、分析糖蛋白，并将其用于分析组织、细胞和蛋白质的糖结构。将凝集素作为特异性配基负载于介质表面制备亲和层析介质，是分离纯化糖蛋白的一种有效方式，但是基于亲和层析介质基质与凝集素的键合方式、基质的非特异性吸附、介质表面的电荷作用等问题，致使对糖蛋白的分离效率较低，并且亲和层析介质的使用寿命较短，制备过程冗繁。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质。

本发明的技术方案概述如下：

以多孔陶瓷微球为内核，所述多孔陶瓷微球的孔道中填充有琼脂糖、壳寡糖、乙二胺四甲叉膦酸钠；所述乙二胺四甲叉膦酸钠螯合钙离子和锰离子形成第一桥基；所述内核表面连接烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚与氨基三乙酸键合；所述氨基三乙酸螯合钙离子和锰离子形成第二桥基；所述第一桥基和第二桥基通过螯合作用固载刀豆凝集素A于内核表面。

优选的是，所述琼脂糖、壳寡糖、乙二胺四甲叉磷酸钠三组分的质量分数如下：

琼脂糖 70～76wt％；

壳寡糖 16～20wt％；

乙二胺四甲叉磷酸钠 8～10wt％。

优选的是，乙二胺四甲叉膦酸钠所螯合钙离子和锰离子的物质的量之比为1∶0.8～1。

优选的是，氨基三乙酸螯合钙离子和锰离子的物质的量之比为1∶0.8～1。

优选的是，所述多孔陶瓷微球的粒径为30～100μm，孔道直径大于50nm。

优选的是，所述壳寡糖的聚合度为2～20。

优选的是，所述刀豆凝集素A能够与含有α-甘露糖或者α-葡萄糖的糖蛋白专一地结合。

本发明的有益效果是：本案采用多孔陶瓷作为亲和层析介质内核，其具有一定的吸附能力，有助于进行介质内部孔道填充和表面化学修饰，从而实现对多糖蛋白的亲和吸附；多孔陶瓷微球的孔道中所填充琼脂糖，是为了增加微球的生物亲和性、亲水性，同时降低多孔陶瓷微球的非特异性吸附；壳寡糖是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖，乙二胺四甲叉膦酸钠是带负电荷阴离子型金属螯合剂，两者通过静电吸引稳固螯合剂，进而增大第一桥基的稳定性；壳寡糖与琼脂糖融合性好，且具有羟基、氨基等活性基团，能够增强与微球内核的结合力，同时活性基团可以与烯丙基缩水甘油醚键合，有利于构建第二桥基。

刀豆凝集素A是含有四个亚基的球蛋白。每个亚基含有237个氨基酸残基，同时结合了一个钙离子和一个锰离子，存在有一个糖结合位点，能够专一地结合α-甘露糖或者α-葡萄糖以及含有α-甘露糖或者α-葡萄糖的蛋白质。刀豆凝集素A常用于特定糖蛋白的分离和富集，通常采用化学键和物理吸附法固载刀豆凝集素A，其中化学键作用力较强，会造成凝集素变性或活性降低，而物理吸附法的作用力较弱，导致凝集素在实验过程中出现泄漏的情况。本发明所采用的螯合作用力较之常用的化学键和物理吸附法，同时保证了凝集素的活性和固载量；乙二胺四甲叉膦酸钠和氨基三乙酸与钙离子和锰离子的螯合稳定系数大，螯合能力强，同时刀豆凝胶素A也与钙离子和锰离子之间有较强的螯合作用力，本发明所制备亲和层析介质在固载配基刀豆凝集素A时采用双重桥基增加了亲和层析介质的稳定性，有较好的机械性能和分离效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。发明提供了一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质，通过下述实施例以及对比例具体阐述。

实施例1

制备过程如下：

(1)将20g粒径在30～100μm、孔径大于50nm的多孔陶瓷微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在100～105℃下搅拌2～3小时使多孔陶瓷微球活化，真空干燥12小时；

(2)向56g琼脂糖、16g壳寡糖、8g乙二胺四甲叉膦酸钠中加入250mL体积分数为5％的氨水溶液，在30℃下剧烈搅拌并超声形成混合溶液；将多孔陶瓷微球从真空干燥炉中取出后迅速置于该混合溶液中，在85～90℃下搅拌4～5小时，过滤后用去离子水冲洗并干燥得到孔道被填充的多孔陶瓷微球内核；

(3)将步骤(2)所得的微球内核置于50mL浓度为到0.2mol/L的NaOH溶液中，同时加入8g烯丙基缩水甘油醚和4g硫酸钠，氮气保护下在55～60℃下搅拌6小时，反应结束后过滤并且真空干燥；

(4)向步骤(3)所得微球内核中加入4g氨基三乙酸、50mL乙醇和1.5g氢氧化钠，在65～70℃下搅拌反应4～5小时，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；

(5)将步骤(4)所得微球内核加入pH为4～5的含有2mol/L氯化钙和2mol/L氯化锰的溶液中，在40℃下搅拌12小时，过滤并用去离子水洗涤；

(6)将步骤(5)所得微球内核加入浓度为10mg/mL的刀豆凝集素A溶液，室温下震荡2～3小时，过滤并用去离子水洗涤制得以伴刀凝集素A为配基能够用于分离纯化糖蛋白的亲和层析介质。

实施例2

制备过程如下：

将实施例1的步骤(5)中氯化锰的浓度变为1.6mol/L，其余制备过程与实施例1相同。

对比例1

制备过程如下：

将实施例1的步骤(2)中16g壳寡糖用相同质量的葡萄糖代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例2

制备过程如下：

将实施例1的步骤(2)中8g乙二胺四甲叉膦酸钠用相同物质的量乙二胺四乙酸二钠代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例3

制备过程如下：

实施例1的步骤(2)中不加入乙二胺四甲叉膦酸钠，意味着不能形成螯合钙离子和锰离子的第一桥基，其余制备过程与实施例1相同。

对比例4

制备过程如下：

略去实施例1的步骤(3)和步骤(4)，直接将步骤(2)中所得的孔道被填充的多孔陶瓷微球内核进行步骤(5)操作，意味着不形成螯合钙离子和锰离子的第二桥基，其余制备过程与实施例1相同。

对比例5

制备过程如下：

实施例1的步骤(5)中2mol/L氯化钙和2mol/L氯化锰的溶液用4mol/L氯化钙溶液代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例6

制备过程如下：

实施例1的步骤(5)中2mol/L氯化钙和2mol/L氯化锰的溶液用4mol/L氯化锰溶液代替，其余制备过程与实施例1相同。

为了测试本发明所制备的亲和层析介质对糖蛋白亲和层析效果，进行下述测试。首先，将实施例1～2和对比例1～6所制备的亲和层析介质装填于3.0×150mm色谱柱中，连接在AKTA Purifier 100层析系统。然后，分别用甘露糖型的糖蛋白牛胰蛋白核糖核苷酶(RNaseB)和非糖蛋白人血清蛋白(HSA)两种样品评价色谱柱的亲和能力，配制样品浓度为2mg/mL，在流速0.2mL/min下，持续不断的进样至色谱柱中，紫外检测进样浓度和流出色谱柱的样品浓度，当两者的浓度相同时，认为色谱柱已经达到吸收饱和，此时将流动相替换为含有糖的竞争性洗脱溶剂，将蛋白质洗脱，紫外检测洗脱蛋白质的量，可以计算出色谱柱对相应蛋白质的载量，表1分别记载了各亲和层析柱对糖蛋白RNaseB和非糖蛋白HSA的载样量。

根据表1的数据能够分析出，实施例1和实施例2对甘露糖蛋白RNaseB的固载量远远大于非糖蛋白HSA的固载量，说明本发明所制备的以刀豆凝集素A为配体的亲和层析介质对特定糖蛋白具有较好的选择性吸附，而对非糖蛋白不存在非特异性吸附；对比例1中壳聚糖被葡萄糖所代替，葡萄糖中不存在氨基，活性基团种类单一，不利于混合物与多孔陶瓷的吸附结合，同时所键合烯丙基缩水甘油醚较少，固载配体刀豆凝集素A量少，进而致使对比例1亲和吸附糖蛋白RNaseB量较少；对比例2中螯合剂乙二胺四甲叉膦酸钠被乙二胺四乙酸二钠所代替，后者对钙离子和锰离子的络合效果比前者差，进而导致对比例2亲和吸附糖蛋白RNaseB量较少；对比例3和对比例4分别只形成了一重桥基，通过测试数据可以得知，单重桥基对配基刀豆凝集素A的结合强度低、固载量少，因此其对目标糖蛋白吸附亲和吸附量少，而对非糖蛋白的非特异性吸附较大；由实施例1和对比例5～6的实验结果可以得知，选用钙离子和锰离子同时作为螯合金属离子能够较多的固载配基刀豆凝集素A，进而可以较多亲和吸附目标糖蛋白，而单独使用一种金属离子所构成桥基固载配基后，亲和吸附目标蛋白量较少。

表1

亲和层析介质	对RNaseB的固载量(mg/mL)	对HSA的固载量(mg/mL)
			实施例1	73.56	0.14
实施例2	72.31	0.22
			对比例1	66.87	0.87
对比例2	67.94	0.73
			对比例3	56.38	6.55
对比例4	60.45	5.98
			对比例5	63.76	2.31
对比例6	64.26	2.26

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种用于糖蛋白分离纯化的亲和层析介质，其特征在于，以多孔陶瓷微球为内核，所述多孔陶瓷微球的孔道中填充有琼脂糖、壳寡糖、乙二胺四甲叉膦酸钠；所述乙二胺四甲叉膦酸钠螯合钙离子和锰离子形成第一桥基；所述内核表面连接烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚与氨基三乙酸键合；所述氨基三乙酸螯合钙离子和锰离子形成第二桥基；所述第一桥基和第二桥基通过螯合作用固载刀豆凝集素A于内核表面。

2.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述琼脂糖、壳寡糖、乙二胺四甲叉磷酸钠三组分的质量分数如下：

琼脂糖 70～76wt％；

壳寡糖 16～20wt％；

乙二胺四甲叉磷酸钠 8～10wt％。

3.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，乙二胺四甲叉膦酸钠所螯合钙离子和锰离子的物质的量之比为1∶0.8～1。

4.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，氨基三乙酸所螯合钙离子和锰离子的物质的量之比为1∶0.8～1。

5.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述多孔陶瓷微球的粒径为30～100μm，孔道直径大于50nm。

6.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述壳寡糖的聚合度为2～20。

7.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述刀豆凝集素A能够与含有α-甘露糖或者α-葡萄糖的糖蛋白专一地结合。