JPH01139599A

JPH01139599A - 新規レクチン及びその製造方法

Info

Publication number: JPH01139599A
Application number: JP15113688A
Authority: JP
Inventors: Naohisa Kochibe; 巨智部　直久
Original assignee: Nichirei Corp
Current assignee: Nichirei Corp
Priority date: 1987-08-27
Filing date: 1988-06-21
Publication date: 1989-06-01
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: JP2630431B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、新規なレクチン及びその製造方法に関する
。この発明のレクチンは臨床診断試薬及び分離精製試薬
としての用途を有する。

［従来技術及びその欠点］従来より、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（以下Ｇｌ
ｃＮＡｃと記載する）に特異的に結合する一群のレクチ
ンか知られている。従来から知られているＧｌｃＮＡｃ
特異的レクチンの多くはキチンタイプ（ＧｌｃＮＡｃβ
ｌ→４）ｎの糖鎖を識別して結合する。一方、　Ｇｌｃ
ＮＡｃβｌ　→４　ＧｌｃＮＡｃは血清中の糖タンパク
質及び細胞膜マーカーの糖鎖の根元部分の基本構造を形
成しており、生体に広く存在する。

従って、従来から知られているＧｌｃＮＡｃ特異的レク
チンを臨床診断薬として用いることは行われていない、
また、血清、細胞又は組織に出現する病変か側鎖に存在
するＧｌｃＮＡｃβｌ→４以外の結合様式１例えばβ１
→６結合やβ１→３結合に基づく可能性もあるか、これ
らの結合を検出することに従来のβｌ→４結合特異的レ
クチンを用いることはできない。

［９，明か解決しようとする問題点］従って、この発明の目的は、ＧｌｃＮＡｃに対し高い親
和性を有し、特にＧｌｃＮＡｃβｌ→６及びＧｌｃＮ八
Ｃβへ→３に対して高い親和性を有し、臨床＃断と、こ
れらの構造を有する糖鎖の分離に用いることかできる新
規なレクチン及びその製造方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］本願発明者は鋭意研究の結果、ムシナタケ（ＰｓａＬｈ
ｙｒｅｌｌａ　ｖｅｌｕｔｉｎａ）の子実体から上記目
的を達成することかできる新規なレクチンを見出しこの
発明を完成した。

すなわち、この発明はムジナタケの子実体中に存在し、
分子ｉ−１が約４万ダルトンのｔｉｔ　ｌｉ１体であり
、ＧｌｃＮＡｃに対する親和定数かＫ。−６，４Ｘ　ｌ
Ｏ１０ｆｆ宜である結合基を４個持ち、等電点か９以上
であり、ＧｌｃＮＡｃ＞　（ＧｌｃＮＡｃ）＊≧（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）ｚ　、　ＧｌｃＮＡｃβ１　→６　、　Ｇｌ
ｃＮＡｃβ１−＝　３　＞　ＧｌｃＮＡｃβ１→４、Ｒ
１→６ＧＩｃ　ＮＡｃ　＞Ｒｌ−＋３ＧｌｃＮＡｃ、　
Ｒ１−＋４ＧｌｃＮＡｃ（ただしＲはＧｌｃＮＡｃ以外
の糖を示す）の反応性を有し、下肥大１に示すアミノ酸
組成を有する新規レクチン及びその類似体を提供する。

表１残ノ、（モル％　　　残基　モル％Ａｓｘ　　Ｉ：１．７　　　　　Ｍｅｔ　　　１．ＯＴ
ｔ＋ｒ　　　７．６　　　　１１ｅ　　　５．ｌ５ｃｒ
　　　４．９　　　　　Ｌｅｕ　　　７．４Ｇｌｘ　　
　６．７　　　　　Ｔｙｒ　　　２．９Ｐｒｏ　　　４
１　　　　　Ｐｈｅ　　　６．５Ｇｌｙ　　１１．６　
　　　　ｌ１ｉｓ　　　２．ＩＡｌａ　　　７．６　　
　　　Ｌｙｓ　　　４．５Ｃｙｓ　　　Ｏ，７Ｔｒｐ　
　　Ｏ，４Ｖａｌ　　　６．３　　　　　Ａｒｇ　　　
５．７（ただし、Ａｓｘは＾ｓｎ及びＡｓｐ　、　Ｇｌ
ｘはＧｌｎ及びＧＩＬＩを示す、）さらにまた、この９．明は、ムジナタケの子実体を水系
媒体で抽出し、キチン又はキチンをさらにＮ−アセチル
化したものを固定化したアフィニティークロマトグラフ
ィーに該抽出物を架け、ＧｌｃＮＡｃて溶離し、溶離液
を二価又は三価のアルコールの存在丁で限外ろ過するこ
とを含む上記レクチンの製造方法を提供する。

［発明の効果］この発明のレクチンは、ＧｌｃＮＡｃに対して従来のレ
クチンよりも高い親和性を示し、０にＧｌｃＮＡｃβ１
→４結合よりもＧｌｃＮＡｃβｌ→６結合及びＧｌｃＮ
Ａｃβｌ→３結合に高い親和性を有するのて、このレク
チンを酵素、ビオチン又は蛍光色素のような適当なマー
カーで標識してＧｌｃＮＡｃを有する特定の糖鎖構造を
有する物質の高感度検出用臨床試薬として用いることか
できる。さらにまた、この発明のｔ／クチンを固相化し
たアフィニティクロマトグラフイーな用いてＧｌｃＮＡ
ｃを有する糖鎖を精製することもできる。

［発明の詳細な説明］この発明の新規レクチンは、ムシナタケ（Ｐ５ａｔｈｙ
ｒｅｌｌａ　ｖｅｌｕＬｉｎａ）の子実体中に存在する
。

ムジナタケは標高１００■ないし１０００ｍの野外裸地
項七に生ニしている。

この発明のレクチンの単漬体の分子量は、ゲルろ適法、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のいずれの方
法によって調べても約４万ダルトンである。また、この
発ＩＪ１のレクチンは、等電点が９以ヒてあり、上肥大
１に示したアミノ酸組成を有する。

この発明のレクチンは、以下のような結合特異性を有す
る。

（＋）オリゴ糖を用いた結合反応阻害試験から、Ｇｌｃ
ＮＡｃ＞　（ＧｌｃＮＡｃ）２≧（ＧｌｃＮＡｃ）ｚの
順に結合性を有する。

（２）オリゴ糖を用いた結合反応阻害試験から。

ＧｌｃＮＡｃβ１−＋　６　、　ＧｌｃＮＡｃβ１−３
　＞　ＧｌｃＮＡｃβｌ−＋４の順に結合性を有する。

（３）オリゴ糖を用いた結合反応阻害試験から、Ｒ１→
６ＧｌｃＮＡｃ＞Ｒｌ−＋３ＧｌｃＮＡｃ、　Ｒ１−＝
４ＧｌｃＮＡｃ　　（ただしＲはＧ　１ｃＮＡｃ以外の
糖を示す）の順に結合性を有する。

１−記３つの結合特異性は従来より知られているＧｌｃ
ＮＡｃ特異的レクチンの結合特異性とは著しく異なるも
のである。

（４）　ＧｌｃＮＡｃに対する親和定数かに０＝　６．
４　ｘ　１０’Ｍ−’である。

（５）同−糖鎖に２つの非；元末端ＧｌｃＮＡｃか存在
すると結合か強まる。

（６）いわゆるｒ　ｚｏｎｅ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　
Ｊ　　（ｙｏｎｅｐｌ＋ｅｎｏｓｅｎｏｎとは抗体（本
願発明の場合はレクチン）又は抗原濃度が著しく高いと
きに、抗体（レクチン）と抗原の結合反応か阻害される
ことをいう０文献：「免疫化学」山村、石板、朝倉占店
）を示す、また、　ＧｌｃＮＡｃ特異的で他の糖（ＧＩ
ＣＮ１１２　。

Ｇｌｃ、　Ｍａｎ、Ｇａ１ＮＡｃ等）とは見かけ上全く
結合しない。

この発ＩＪＪのレクチンは以下のようにして得ることか
できる。なお、この発明のレクチンは水溶液中で不溶化
しやすいので、従来からレクチンの精製法において常用
されている塩析や透析を適用することができない、以下
に述べるこの発明のレクチンの精製方法は、この問題を
解決するために本願発明者によって開発されたものであ
り、レクチンの精製法として画期的なものである。

まず、ムジナタケの子実体を水系媒体で抽出する。水系
媒体としては生理食塩水にトリス緩衝液やリン酸Ｍ衝液
のような緩衝液を加えたものか好ましい、また、抽出は
、濃度０．１ないし０．２　ｍＭ程度のフェニルメチル
スルフォニルフルオライドの存在下で行うことが抽出液
に含まれるタンパク分解酵素による自己消化防止のため
好ましい。

一方、キチン又はキチンなＮ−アセチル化したものを用
いたカラム（キチンカラム）を用意する。キチンは市販
のものを用いることかてきる。

またキチンをさらにＮ−アセチル化したキチンカラムは
例えば市販キチンを酸、アルカリで数回洗った後、飽和
炭酸水素ナトリウム液中で無水酢酸を加えることにより
Ｎ−アセチル化し、これを適当なガラス製クロマトグラ
ム用カラムに充填することによって調製することができ
る。

このキチンカラムを前記抽出に用いた溶液で予めモ衡化
しておき、上記ムジナタケの抽出液を通す。次に、吸着
されたレクチン画分を例えば５０ｍ−の濃度のＧｌｃＮ
Ａｃで溶離する。

次に、得られた溶離物を低分子量の二価又は三価のアル
コールの存在下で限外ろ過し、濃縮する。この際に用い
るアルコールの好ましい例として１０％ないし２０％の
グリセリン又はエチレングリコールを挙げることかでき
る。限外ろ過は例えば限外ろ過膜Ａｄｖａｎｔｅｃ　Ｑ
ＯＩＯ口（商品名、東洋口紙社製）を用いて行うことか
てきる。

このようにして、この発明のレクチンを得ることができ
るが、レクチンの純度をさらに高めたい場合には、以下
のようにしてさらに精製を進めることができる。なお、
用いる溶液は全て１０％グリセリンを含んでいる。

Ｌ記濃縮液をＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社
製）又はＤＥＡＥ−セルロースカラムに架けて素通り画
分を集め、ＣＭ−セファロース（ファルマシア社製）に
吸着させる。カラムから例えば０．４１のＮａＣｌで溶
出させ、上記と同様の限外ろ過で濃縮し、上記キチンカ
ラムで再度吸着、溶出を行い、溶出液を上記限外ろ適法
てｅｉ縮し、これに溶離剤（Ｇ　ｌ　ｃＮＮａ）を含ま
ない生食緩衝液を加えて濃縮することを４〜５回繰り返
して透析の目的を果たす。

このようにして得られるレクチン標品は凍結保存するこ
とかできる。

上記精製法による精製度は十分安定しており、ｔｏｏ　
ｇのムジナタケから約２５１ｇのこの発明のレクチンを
得ることができる。

なお、一般に生理活性を有するタンパク質において、そ
の生理活性を示す構造は一通りに特定されるのではなく
、実質上同一の生理活性を示すためにある範囲の構造的
相違が許容されることは当業者により広く認識されてい
るところである。

従って、上記したこの発明のレクチンを４Ｒ１＆するア
ミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換され、除去され又は
他のアミノ酸が付加されたタンパク質でなおこの発明の
レクチンの上記結合特異性を有するものもこの発明の範
囲に含まれる。このようなものを特許請求の範囲におい
て「類似体」と呼んでいる。また、分子量４万のＬＱ体
であるこの発明のレクチンか複数個重合したものもこの
発明の範囲に含まれる。

この発明のレクチンはＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖を有する
物質を検出するための臨床１診断試薬及び上記物質を精
製するための試薬としての用途を有する。この発ＩＩの
レクチンはＮ−ヒトロキシルサクシンイミト基を持つゲ
ル（例えばアフィゲルＩＯ１米国バイオラット社製）と
常温で反応させることにより容易にカップリングして固
相化てきる。また、Ｎ−ヒトロキシルサクシンイミ１へ
化したビオチンと常温で反応させることによって容易に
カップリングしてビオチン標識レクチンを得ることがで
きる。同様にタンパク質の化学修飾として一般的に知ら
れている蛍光標識、酵素標識等が可能である。従って、
この発明のレクチンは診断試薬又は分離精製試薬として
容易に用いることがてきる。また、この発１１のレクチ
ンの結合特性を利用して糖鎖基部に汀遍的なＧｌｃＮＡ
ｃβｌ→４構造の存在にかかわりなく、末端部に露出し
たＧｌｃＮＡｃβｌ→６とＧｌｃＮＡｃβｌ−３ＪＪｉ
造、　　Ｒ１→６　ＧＩｃＮ八ｃ構へを識別することに
応用することか可能てあり、このようなことは本発明に
より初めて［可能になったことである。

次にこの発明に関する各種特性の測定方法についてまと
めて示す。

（＋）分子量（ゲルろ適法）生化学実験講座ｌ、タンパク賀の化学Ｉ、［１本生化学
会編、東京化学同人（＋９７６）に記載された原理方法
に基づき、トヨバール１１ｗ５５（東洋曹達製）をゲル
ろ６剤とし、１０％グリセリン及び１０　ｍＭ　Ｇｌｃ
ＮＡｃを含む生食緩衝液を用いて行なった。

（２）分子ｒ４１（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法）ト記文献に記載された原理方法に基づき、１０％ポリア
クリルアミドゲルを作製して行なった。

（：ｌ）　ＧｌｃＮＡｃに対する親和定数Ｋ。

ＪＨ−ＧｌｃＮＡｃを用いた平衡透析の結果を５ｃａＬ
ｃｈａｒｄの式にあてはめてプロットし、グラフ上から
読み取った。（文献：　ｐｉＢｋａｒｄ。

”！１ａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　　Ｉａ＋ｓｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ。

１、　　［：ｈａｐｔｅｒ　　１７．　　Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ　　５ｃｉｅｎＬｉｒｉｃ　　Ｐｕｂｌ。

（４）　ＧｌｃＮＡｃに対する結合基数ＧｌｃＮＡｃに
対する結合ノ＾数はＬ記（３）て得られたグラフｌ―か
ら読み取った。（文献は（３）と同じ）（５）等゛心意上記生化学実験講座に記載された原理方法に基づき、ポ
リアクリルアミドゲルＬで等電点電気泳動を行なった。

（６）オリゴ糖を用いた結合阻害反応試験Ｊ、Ｌ、Ｇｕ
ｅｓｄｏｎ、　Ｔ、Ｔｅｒｎｙｎｃｋ　ａｎｄ　Ｓ、　
Ａｖｒａｍｃａｓ。

”Ｊ、　１ｌｉｓＬｏｃｈｅａ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、
”　２７．　１１：１ｌ−１１３９（１９７９）に記載
され、たアビジン−ビオチン結合反応を利用した酵稟抗
体法（ＥＬＩＳ＾）を応用して行なった。すなわち、固
相化した抗原にビオチン化該レクチン、アビジンとビオ
チン化酵素の混合溶液、蛍光性酵素基質を逐次加えて、
蛍光強度（結合した該レクチン罎に相当）を測定する。

このとき、２倍系列希釈した阻害オリゴ糖（下記表２）
と該レクチンとを反応させてから加えると蛍光強度か変
化する。そこで、オリゴ糖を含まない対照実験に対する
相対蛍光強度を、オリゴ糖濃度に対してプロウドするこ
とにより、該レクチン結合を５０％阻害するのに必要な
濃度を知ることかできる。

これは、該レクチンの各種糖ｔｒＪ４Ｒ造に対する結合
特性を反映した値で、小さい数はど結合が強い。

（７）アミノ酸組成続生化学実験講座２　タンパク質の化学上。

日本生化学全編、東京化学同人、に記載された方法によ
り行なった。すなわち、該レクチンの６Ｍ１ｔ！酸加水
分解物を高速液体クロマトグラフィー（品性製作所、Ｌ
Ｃ６＾）で分離し、ボストカラム法で同定、定量した。

また、トリプトファンについては非加水分解試料の分光
学的測定により（文献Ｅｄｅｌｈｏｃｈ、　Ｉｆ、　　
１９６７　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　’ｇ　１９４８
〜＋９５４）同定、定量した。

［発明の実施例］群馬県榛名山及び赤城山の標高５００■〜６υＯｍの地
上に生りしているムシナタケの子実体を採取し、これを
濃度０．１−Ｍのフェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド衝液（ｐＨ７、５　）で１時間，４℃で抽出した。

一方、市販キチン（生化学Ｔ業社製）を酸。

アルカリで数回洗った後、飽和炭酸水素ナトリウム液中
で無水酢酸を加えることによりＮ−アセチル化し、これ
を適当なガラス製クロマトグラム用カラムに充填するこ
とによってキチンをＮ−アセチル化したものを用いてカ
ラム（キチンカラム）を調製した。

このキチンカラムを上記抽出に用いた溶液て予め平衡化
し、ムジナタケの上記抽出液をカラムに通した。カラム
に吸着したレクチン画分を５０ｍＭＧｌｃＮＡｃで溶出
し、レクチンを含む溶出液を限外ろ過膜（　Ａｄｖａｎ
ｔｅｃ　ＱＯ１００東洋口紙社製）を用いた限外ろ過に
より濃縮した．濃縮液をＤＥＡＥ−セファロース（ファ
ルマシア社製）に架け、素通り画分を集め．ＣＭ−セフ
ァロース（ファルマシア社製）に吸着させた。カラムか
ら０．４　Ｍ　ＮａＣＩで溶出させ、上記限外ろ過膜を
用いて濃縮し、上記キチンカラムを用いて上記と同様に
吸着、溶出を行なった．溶出液を上記限外ろ過膜で限外
ろ過して濃縮し，この濃縮液に溶離剤を含まない溶液を
加えてざらにＣ縮することにより透析し，この発明のレ
クチンを得た。

レクチンの物理化学的性質上記のようにして得られたレクチンの？ｌ’．　ｆｆｉ
体の分子着を上記したゲルろ適法及びＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法てそれぞれ測定したところい
ずれも約４万ダルトンであった．また、上記した方法に
より等重点を測定したところ９以してあった．さらに、
上記方状によりアミノ酸組成を調べたところ下記表１に
示すアミノ酸組成を有していた．さらに、上記方法によ
りＧｌｃＮＡｃに対する親和定数を測定したところ　Ｋ
。−６．４×ｔｏ’Ｍ−’であった。また、アミノ酸分
析により。

ヘキソサミンを含まないこと、及び中性納金１もＫＷＡ
程度であることから、レクチンか実質的にアミノ糖を含
まないことか確かめられた。

レクチンの結合特異性下記表２に示す種々のオリゴ糖を用い、上記したようビ
して結合反応阻害試験を行なった。結果を同表に示す。

なお、表中の「活性」はレクチン結合を５０％阻害（×
■は４０％）するオリゴ糖の濃度を示す。

この実験から該レクチンの糖結合特性として以下のこと
かわかる。

（１）実験１．Ｖ、■の比較からＧｌｃＮＡｃ＞（ＧＩ
ＣＮ八Ｃ）へ≧（ＧｌｃＮＡｃ）：＋であること。

（２）実験Ｖ、■、■、■、■、Ｘ、Ｘ［、■、　ＸＶ
Ｉの比較からＧｌｃＮＡｃβ１→６　、　ＧｌｃＮＡｃ
βｌ→３＞ＧｌｃＮＡｃβｌ→４であること。

（３）実験■、店、Ｘｌｌ１．ＸＶ、ＸＶＩ［（７）比
較からＲ１→６　ＧｌｃＮＡｃ＞　Ｒ１−３ＧｌｃＮＡ
ｃ、　Ｒ１−４ＧｌｃＮＡｃ　（ただしＲはＧｌｃＮＡ
ｃ以外の糖）であること。

（４）実験・×■、　Ｘ■から、同−鎖に２測置りのＧ
ｌｃＮＡｃか存在するとＺしく結合が強まること。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ムジナタケの子実体中に存在し、分子量が約４万
ダルトンの単量体であり、ＧｌｃＮＡｃに対する親和定
数がＫｏ＝６．４×１０＾３Ｍ＾−＾１である結合基を
４個持ち、アミノ糖を含まず、等電点が９以上であり、
ＧｌｃＮＡｃ＞（ＧｌｃＮＡｃ）＿２≧（ＧｌｃＮＡｃ
）＿３、ＧｌｃＮＡｃβ１→６，ＧｌｃＮＡｃβ１→３
＞ＧｌｃＮＡｃβ１→４、Ｒ１→６Ｇ１ｃＮＡｃ＞Ｒ１
→３ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ１→４ＧｌｃＮＡｃ（ただしＲは
ＧｌｃＮＡｃ以外の糖を示す）の反応性を有し、下記ア
ミノ酸組成を有する新規レクチン及びその類似体。残基：モル％：残基：モル％Ａｓｘ：１３．７：Ｍｅｔ：１．０Ｔｈｒ：７．６：Ｉｌｅ：５．１Ｓｅｒ：４．９：Ｌｅｕ：７．４Ｇｌｘ：６．７：Ｔｙｒ：２．９Ｐｒｏ：４．３：Ｐｈｅ：６．５Ｇｌｙ：１１．６：Ｈｉｓ：２．１Ａｌａ：７．６：Ｌｙｓ：４．５Ｃｙｓ：０．７：Ｔｒｐ：０．４Ｖａｌ：６．３：Ａｒｇ：６．７（ただし、ＡｓｘはＡｓｎ及びＡｓｐ、ＧｌｘはＧｌｎ
及びＧｌｕを示す。）
（２）ムジナタケの子実体を水系媒体で抽出し、キチン
又はキチンをさらにＮ−アセチル化したものを用いたア
フィニティークロマトグラフィーに該抽出物を架け、Ｇ
ｌｃＮＡｃで溶離し、溶離液を二価又は三価のアルコー
ルの存在下で限外ろ過することを含むレクチンの製造方
法。