CN104744585B - 一种扩张床吸附(eba)技术制备纤维蛋白原的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备纤维蛋白原的方法,包括下述步骤:1)以琼脂糖碳化钨‑DEAE离子交换介质为柱层析填料,制备扩张床作用层析柱;2)将血浆过步骤1)所述的层析柱进行初步纯化,收集纤维蛋白原初品;3)将步骤2)获得的纤维蛋白原初品进行酸沉去除杂质;4)将步骤3)获得的去除杂质的纤维蛋白原去除病毒;5)用MacroCap Q柱层析进一步纯化步骤4)去除病毒后的纤维蛋白原,获得目标纤维蛋白原溶液。本发明的工艺连续性和自动化程度提高,使残留的化学物质大大减少,提高产品的安全性和质量。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质的制备方法,具体涉及制备纤维蛋白原的方法。
背景技术
血液制品(boold products),是指由健康人血浆或经特异免疫的人血浆,经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分,以及血液细胞有形成份。目前,按照血液制品不同作用,可将其分为人血白蛋白、免疫球蛋白类、凝血因子类、特殊蛋白及微量蛋白和纤维蛋白粘合剂五大类。而促成以上各类产品不同市场占有率,除了受市场供需因素外,另一个重要的因素就是分离技术。
二战时期,由Cohn研发的低温乙醇法正式开启了血液制品分离纯化的先河,并对后续血液制品纯化产生了深远的影响,是世界血浆蛋白分离工业化生产的基础。但是,随着科技的进步以及社会多元化需求,要不断有新的技术加入到血液制品分离纯化中,如离心法、辛酸盐沉淀法、压滤法、层析法、超滤法等。其中以层析技术的加入,从根本上改变了原有技术分离时间长、步骤繁琐、分离效果差、产品种类少、自动化程度低等缺点,有效的提高了原料血浆的利用度及使用安全性,丰富了产品的种类。据报道,国外已能从血浆中有效分离出近20余种产品,并有10余种处于研发或临床试验阶段,而我国因分离技术起步晚,虽然多数企业也在血液制品分离纯化中引入层析技术,但多处于实验阶段,并未运用于大规模工业化生产中。目前,我国血液制品制备仍以低温乙醇法为主,且产品局限于血浆中含量较大且易纯化的白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、凝血VIII因子等10余种产品。因此,如何通过层析技术改变我国分离技术薄弱局面,从而提高分离效果,增加分离组分是我国血液组分分离工作创新重点。
纤维蛋白原是一个分子量340000,长度约46nm的纤维状蛋白。纤维蛋白原是二聚的蛋白质,每个分子含有6条两两相同的肽键,分别称为α链、β链和γ链,每一半由称为Aα、Bβ和γ的二硫键合成的多肽链组成,由29个二硫键将6条肽键交联成一个对称分子,肽链的N末端部分集中在中间,它们的C末端对称地分步在分子的两端。其主要形式是分泌到循环中,在其从肝中分泌之后,所述蛋白不但存在于血浆中,而且存在于淋巴和组织间隙液中。
一般在健康的人体中,纤维蛋白原主要由肝脏实质细胞合成,大部分存在于血浆中,只有15%存在于血管外,在血浆中的浓度为4~10μM,但是当在生理应激反应期间,其浓度可以增加至多400%,半衰期为96-144小时。生理止血需要量为正常水平的25-50%。临床上主要用于止血和凝血,广泛用于先天性纤维蛋白原减少和缺乏症;获得性纤维蛋白原减少症、如肝损伤,产后大出血,肝硬化,外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏造成的凝血障碍。
凝血因子类蛋白中,除纤维蛋白原外,其他凝血酶原、凝血因子VII、VIII、 IX、XI、XIII等含量均较少,大致为1-10mg/dl,且常温下化学性质也不稳定,因此,以往通过改良的Cohn法或Kistler-Nitschmann法不能高效分离出大多数凝血因子类产品,另外即使获得了高纯度产品,因工艺问题会使其安全性存在一定隐患。如德国CSL公司采用氢氧化铝吸附剂甘氨酸沉淀虽获得高纯度Fg,但产品因引入Al,而限制了其使用。而层析技术的加入,尤其是亲和层析及离子交换层析技术,对于该类蛋白的纯化起到了重要的作用,它们或使原有的纯化条件更为温,或另辟新径的开发出新的产品,提高了产品的活性及纯度,并减少了时间投入及经济成本。
对于凝血酶原复合物(prothrombin complex concentrate,PCC)分离,层析技术依然占有主要地位,如包正琦(微生物学免疫学进展,2013,41(4):79-84.)等指出,目前DEAE Sephadex A-50凝胶仍是国内外纯化PCC的首选工艺。因此,曹海军(中国输血杂志,2012,25(7):655-660)等对可能影DEAE-Sephadex A50 吸附能力各三个因素进行探讨,并发现在柠檬酸钠(0.02-0.028)mol/L,氯化钠 (0.02-0.06)mol/L,pH6.6-6.9时,介质的吸附效果最佳。而刘欣晏(中国生化药物杂志,2008,29(1):26-29)等认为若一次无法有效分离,可进行二次分离即进行两次DEAE-Sephadex A50及S/D法病毒灭活操作,在保证各凝血因子回收率为70%-80%同时,提高了产品的纯度。另外,GE公司指出,也可将两步 DEAE-Sephadex A50中第二步介质改为高流速Capto Q介质,即将冷沉淀上清按DEAE-SephadexA50吸附、S/D处理、Capto Q吸附处理,该工艺通过提高工艺载量及处理速度,从而显著提高生产效率。何淑琴等(安徽农业科学,2013, 41(17):7420-7422)采用DEAE-Sephadex A50凝胶、DEAE-Sepharose Fast Flow 凝胶、DEAE-纤维素对PCC提取工艺进行改进,并对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ回收率进行分析,分别为84.9%、76.4%、82.8%和78.7%。
此外,对于纤维蛋白原(Analytical biochemistry,2010,399(1):102-109),凝血酶、von Willebrand因子复合物、凝血因子IX分离中,均因为层析技术的加入,使得产品在活性及纯度上有明显的提高。但是,并不是只有经层析技术即可分离出高收率及高活性的蛋白,如法国LFB公司的Clottafact工艺,是以乙醇冷沉淀组分I为起始,经S/D灭活病毒、DEAE吸附,并经35nm膜过滤获得纤维蛋白原成品,但该法收率较低,仅回收了40%。因此,对于纯化工艺仍需按照待分离组分进行条件摸索并中和分析和衡量各种因素,才能使分离效果达到最优化。
中国专利申请CN200810046747.5公开了人纤维蛋白原制剂的制备方法,该专利采用的基本是传统的低温乙醇沉淀技术,只是增加了一个高温(99.5℃)的干热灭活病毒工艺。中国专利申请CN201110078557.3公开了柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法,但该方法的原料从组分I开始,还是依靠低温乙醇沉淀技术,工艺在传统工艺基础上最后一步采用一次柱层析技术(DEAE-650M介质)。中国专利申请CN201110188019.X公开的纤维蛋白原的制备方法也主要是以传统的低温乙醇技术为核心,创新处是加入了助剂,如抗凝剂:柠檬酸三钠或草酸钾;如灭活剂:磷酸三丁脂和吐温80;如溶解剂:磷酸氢二钠缓冲液体系、碳酸缓冲液体系、柠檬酸缓冲液体系,该工艺没有采用柱层析技术作为纯化步骤。中国专利申请CN201310285991.8公开了从人组分沉淀中提取人凝血因子VIII 和人纤维蛋白原的工艺,该工艺是从组分I即传统的低温乙醇工艺为核心技术,创新之处为可将凝血因子VIII和组纤维蛋白原共沉淀,更好的利用了原料血浆。中国专利申请CN201410524351.2公布了一种从冷沉淀中提取凝血因子VIII的废料中提取人纤维蛋白原的制备工艺,创新处是结合乙醇沉淀技术和离子交换层析(DEAE介质),并采用AT-III灭活凝血酶、EDTA除Ca2+及纳米滤膜过滤去除病毒,以上措施虽然有助于减少纤维蛋白原激活为纤维蛋白及避免化学试剂的使用,提高了产品使用的安全性及活性,但仍以冷沉淀为起始分离物,且以二次低温乙醇沉淀为核心技术仍未有改变。
发明内容
本发明的目的是应用扩张床吸附层析技术(EBA)从血浆中制备纤维蛋白原,实验合成的阴离子交换介质作为填料,原料血浆不用处理直接经过EBA层析技术作为纯化工艺第一步骤,通过该步骤后可以将原料血浆初步分成四个组分:非吸附血浆组分和析出液含有α-1蛋白酶抑制剂(α-1-PI);洗脱组分1主要是白蛋白(Albumin)组分;洗脱组分2主要是免疫球蛋白(IgG);洗脱组分 3主要是纤维蛋白原(Fibrinogen),与传统工艺和以上专利公布的工艺比较较大提高了原料血浆的综合利用度。再经过酸沉除杂、S/D灭活病毒、MacroCap Q 柱层析、过滤工艺纯化纤维蛋白原。
根据本发明的一方面,一种制备纤维蛋白原的方法,包括下述步骤:
1)以琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质为柱层析填料,制备扩张床作用层析柱;
2)将血浆过步骤1)所述的层析柱进行初步纯化,收集纤维蛋白原初品;
3)将步骤2)获得的纤维蛋白原初品进行酸沉去除杂质;
4)将步骤3)获得的去除杂质的纤维蛋白原去除病毒;
5)用MacroCap Q柱层析进一步纯化步骤4)去除病毒后的纤维蛋白原,获得目标纤维蛋白原溶液。
本发明所述的方法,其中步骤1)所述的琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质按照下述方法制备:
a)将琼脂糖与碳化钨反应制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,再将所述琼脂糖- 碳化钨复合物珠粒与交联剂环氧氯丙烷反应制备交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒;其中琼脂糖用量为3%~9%重量,在90~95℃条件下,熔融共混琼脂糖和碳化钨,碳化钨和琼脂糖的质量比为1:0.2-~1:2,交联剂环氧氯丙烷添加量为 0.1-0.3mL/mL凝胶;
b)通过烯丙基化、氧化和溴化分步反应活化步骤a)制备的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒;
c)在步骤b)活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上偶联2-氯三乙胺配基,形成所述琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质。
本发明所述的方法,其中优选的是
所述步骤a)中,以反相悬浮液热再生方式制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,其中使用的油相有机溶剂为石蜡、石油醚、氯苯、真空油或其中两种的混合物,包裹的介质和有机溶剂的比例为6:1~2:1;
所述步骤b)中,通过添加烯丙基缩水甘油醚开环联接烯丙基,烯丙基缩水甘油醚的添加量为1~4mmol/mL凝胶,以三氟化硼乙醚为催化剂,二氧六环为溶剂反应;交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒内孔联接的烯丙基以油相保护,交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒外表层联接烯丙基以KMO4、H2O2水相氧化,油相保护使用的有机溶剂为苯、甲苯、乙苯、丙苯或者其中两种的混合物;
烯丙基化、氧化后的溴化过程中,滴加Br2的量为0.03-0.1mL/ml凝胶;
1、所述步骤c)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联2-氯三乙胺配基过程中,将活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒经过2.5-3.5mol/L NaOH溶液处理后偶联2-氯三乙胺,2-氯三乙胺的添加量为6-9mmoL/mL凝胶。
本发明所述的方法,其中步骤2)中层析缓冲液为柠檬酸钠缓冲溶液,洗脱液为含辛酸钠的柠檬酸钠缓冲溶液,上样量为1.0-2.0L血浆/L琼脂糖碳化钨 -DEAE离子交换介质。
其中优选层析缓冲液为40mM柠檬酸钠p H5.0,洗脱液顺序包括:洗脱液 A:10mM柠檬酸钠p H5.0;洗脱液B:洗脱液A+5g/L辛酸钠/HCl pH6.0;洗脱液C:1M柠檬酸钠p H8.0+0.3M氯化钠pH8.0;洗脱液D:20mM柠檬酸钠 +0.1M氯化钠pH8.0,柱床高度50cm。
本发明所述的方法,其中步骤3)中以醋酸调整纤维蛋白原初品溶液的pH,步骤为用0.5mol醋酸将溶液的pH调至6.0,离心4℃,4000rpm/min,10min离心获得沉淀,按沉淀重量的5倍体积加入磷酸盐缓冲液:40mM PB,15mM Gly pH 为7.2,再以0.5mol醋酸将溶液的pH调至6.9,离心4℃,4000rpm/min,10min 去除不溶物,放于4℃,4h;随后再以4℃,4000rpm/min,10min,进行离心,缓慢吸取上清液。
本发明所述的方法,其中步骤4)中用于灭活病毒的灭活剂终浓度为10mg/mlTween-80及3mg/mlTnBP,放于恒温磁力搅拌器上,25℃,6h,随后将液体放于4℃保存。
本发明所述的方法,其中步骤5)中以磷酸盐缓冲液平衡层析柱后纯化灭活病毒后的纤维蛋白原溶液,样品以流速1.5cm/min进行上样,随后以磷酸盐缓冲液进行洗脱。
本发明所述的方法,其中进一步包括将获得的目标纤维蛋白原溶液进行过滤纯化的步骤。
本发明的工艺没有使用传统的低温乙醇沉淀工艺,消除了安全低的因素。全部采用柱层析纯化技术,工艺连续性和自动化程度提高,同时减少产品的灭活步骤中使用S/D灭活次数,并在柱层析过程中使用含辛酸钠的柠檬酸钠缓冲溶液,该溶液经过验证可同时起到灭活病毒的作用,使整个工艺的病毒灭活过程缩短,并且由于减少使用S/D灭活次数,使残留的化学物质大大减少,提高产品的安全性和质量。
本发明是全部应用柱层析技术纯化纤维蛋白原的工艺和方法。原料血浆不用处理直接经过EBA层析扩张床吸附层析技术(EBA),再经过酸沉除杂、S/D 灭活病毒、MacroCap Q柱层析、过滤工艺纯化纤维蛋白原。EBA技术应用自行合成的阴离子交换介质作为填料,作为纯化工艺第一步骤,该步骤将原料血浆初步分成四个组分:非吸附血浆组分和析出液含有α-1蛋白酶抑制剂(α-1-PI);洗脱组分1主要是白蛋白(Albumin)组分;洗脱组分2主要是免疫球蛋白(IgG);洗脱组分3主要是纤维蛋白原(Fibrinogen),大大提高了血浆的综合利用度。组分3中的主要成分为纤维蛋白原,再经过酸沉除杂、S/D灭活病毒、MacroCap Q 柱层析、过滤工艺。整个工艺没有使用传统的低温乙醇沉淀工艺,消除了工艺中安全性低的因素。全部采用柱层析纯化技术,工艺连续性和自动化程度提高,同时产品的灭活步骤减少使用S/D灭活次数,通过柱层析过程中使用含辛酸钠的柠檬酸钠缓冲溶液,该溶液经过验证可同时起到灭活病毒的作用,使整个工艺的病毒灭活过程缩短,同时由于减少使用S/D灭活次数,使残留的化学物质大大减少,提高产品的安全性和质量。通过经过研究的工艺流程和层析中各种缓冲液组成、层析流速、介质在柱中的比例等工艺参数的确定,以柱层析技术纯化纤维蛋白原的工艺和方法,纯化的纤维蛋白原达到《中华人民共和国药典》三部(2010版)中对该生物制品的质量要求。
附图简述
图1为烯丙基化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒示意图;
图2为部分氧化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上烯丙基示意图;
图3为介质的膨胀率(E)与流速的关系图;
图4为介质的Bo准数与流速的关系图;
图5为介质的轴向扩散系数与线性流速的关系图;
图6为第六次的血浆层析图谱;
图7为第三次层析各组分的非还原SDS-PAGE电泳分析结果,其中:
样品1:血浆原液条带;2:非结合组分(流穿液)(Alpha-1-PI);3:洗脱液1(白蛋白Albumin);4:洗脱液1(免疫球蛋白IgG);5:洗脱液3(纤维蛋白原Fibrinogen);
图8为第六次层析后各组分的SDS-PAGE结果,其中:
样品1:血浆原液条带;2:非结合组分(流穿液)(Alpha-1-PI);3:洗脱液1(白蛋白Albumin);4:洗脱液1(免疫球蛋白IgG);5:洗脱液3(]纤维蛋白原Fibrinogen);
图9为每次层析的洗脱2的RID测定结果,其中:
孔号1:血浆原液,未稀释=100%,2:血浆原液,稀释到80%,3:血浆原液,稀释到60%,4:血浆原液,稀释到40%,5:血浆原液,稀释到20%,6:血浆原液,稀释到10%,7:第1次层析样品,8:第2次层析样品,9:第3次层析样品,10:第4次层析样品,11:第5次层析样品,12:第6次层析样品。
具体实施方式
通过以下较佳实施方式的详细描述,进一步说明但不限制本发明。
所有材料如无特别说明均为商业购买。
实施例1 制备用于扩张床(EBA)的离子交换层析介质
1、交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒的制备
取2g抽干的琼脂糖凝胶、0.5g NaCl制成4%(W/W)琼脂糖-水悬浮液。按照反相悬浮液热再生的传统方法,将50g 4%琼脂糖-水悬浮液转移至烧瓶中,室温下搅拌混合15分钟,添加一系列不同量的碳化钨(xlwc100,潮州翔鹭钨业,中国,平均颗粒大小9-11μm),添加碳化钨和琼脂糖凝胶的质量比分别为 0.2,0.4,0.6,0.8,1和2,600rpm搅拌混合物15min,加热至93℃保持60min,作为水相备用。然后,将200mL石蜡和石油醚(10:1,V/V)、4%乳化剂 (Span80:Tween80=10:4)混合液超声5~10min,93℃水浴中预热作为油相备用。趁热将预热好的油相加入到水相中,3000rpm转速下搅拌30min,之后140-180 rpm低速搅拌,缓慢降至室温(每分钟2℃),再继续将温度降至10℃以下。过滤收集琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,用大量石油醚、无水乙醇、去离子水冲洗产物。
将洗净过滤的琼脂糖-碳化钨复合物珠粒加入到等体积的二甲基亚砜的水溶液中,加入10mL环氧氯丙烷,20℃水浴条件下,150rpm搅拌30min。向反应体系中缓慢加入2gNaOH和0.2g NaBH4,将温度升到45℃,150rpm搅拌 12h,反应完成后,搅拌降至室温,过滤收集交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,用大量丙酮、去离子水冲洗产物,以标准筛过筛,分离得粒径为50-250μm交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,20%乙醇、4℃保存。
2、交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒的烯丙基化
将50mL交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒水洗抽干,依次用30%、70%丙酮和100%二氧六环洗涤,抽干后转移至500mL具塞三角瓶中,加入50mL二氧六环、10g烯丙基缩水甘油醚(东京化成工业株式会社)和1.5mL三氟化硼乙醚,水浴摇床35℃、140rpm搅拌反应45min,反应产物依次用大量30%、70%丙酮和大量去离子水冲洗产物。反应式见图1。
取1mL制备的烯丙基化产物、添加过量韦氏(Wijs)试剂,超声15min后放置1h,加入碘化钾和水,用硫代硫酸钠溶液滴定,根据试样消耗硫代硫酸钠的量计算交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒联接烯丙基的含量。在一般情况下,烯丙基含量范围从170μmol/mL gel-230μmol/mL gel。
3、交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上烯丙基的部分氧化
将50mL制备的丙基化产物依次用乙醇(99.5%)、甲苯(99%)洗涤,除掉复合物珠粒上部分甲苯并转移至烧瓶内,添加50mL去离子水,搅拌悬浮液。添加0.81g KMnO4,反应混合物变成紫色,持续搅拌15分钟。添加20mL 50%氢氧化钠水溶液,反应混合物立刻变成了褐色,室温条件下,持续搅拌1h。添加约10mL浓醋酸,调溶液pH=5。小心地添加2mL 30%过氧化氢水溶液,使反应混合物变成灰色。反应产物依次用大量去离子水、乙醇(99.5%)、去离子水冲洗产物。氧化反应过程见图2。
采用2所述方法测定部分氧化后复合物珠粒中烯丙基含量,与初始的烯丙基含量比较,部分氧化反应后复合物珠粒中烯丙基含量下降了8至25%。
4、溴化交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上残留烯丙基
将10mL 1%NaAc转移至烧瓶中,添加40mL上述3制备的部分氧化产物和40mL去离子水,快速搅拌15min。在室温条件下,将约2mL Br2以滴加的方式添加到烧瓶中直到悬浊液保持黄色,持续搅拌15min。添加甲酸钠溶液至悬浊液黄色消失,用大量去离子水冲洗。反应产物直接用于衍生离子交换介质。
5、衍生离子交换介质的制备
偶联2-氯三乙胺(DEAE)
diethylchloroethylamine hydrochloride(DEAE)
通常情况下,将50mL上述4制备的溴化产物、150mL 3mol/L NaOH溶液分别转移至烧瓶中,65℃条件下,快速搅拌1h。添加130mL 2.5mol/L盐酸2-氯三乙胺(diethylchloroethylamine hydrochloride,DEAE,美国Sigma公司),65℃、搅拌条件下反应进行2h。冷却至室温,用3mol/L盐酸水溶液中和反应混合物,分别用大量去离子水、1mol/L NaCl水溶液冲洗产物。
DEAE凝胶离子交换介质容量范围从111μmol/mL gel-154μmol/mL gel。
6、加入不同比例碳化钨对介质理化性质的影响
加入不同比例碳化钨对介质(4%琼脂糖)理化性质的影响结果见表1。介质的湿真密度(Wet density)指单位体积湿态微球的质量,随碳化钨添加量的增多,添加碳化钨的密度(15.5g mL1)远大于琼脂糖密度,介质的湿真密度明显增大。介质含水率(Watercontent)指湿态微球所含水分质量占介质总质量的百分率,随碳化钨添加量的增多,碳化钨不溶于水,介质含水率明显降低。平均粒径(mean partical sizes)指介质微球的直径,随碳化钨添加量的增多,粒径无明显变化,介质粒径基本不受碳化钨添加量的影响。孔度(Porosity)指微球内部孔隙占微球体积的百分率,孔度表征基质内部的孔道空间,随碳化钨添加量的增多,孔度降低。
表1 介质的理化性质
碳化钨/琼脂糖(W/W) | 湿真密度/(g·mL-1) | 介质含水率/% | 平均粒径/μm | 孔度/% |
0.2 | 1.07 | 88.3 | 119.2 | 80.3 |
0.4 | 1.10 | 84.8 | 120.1 | 79.2 |
0.6 | 1.15 | 79.9 | 121.4 | 79.4 |
0.8 | 1.21 | 74.2 | 119.6 | 79.1 |
1.0 | 1.28 | 68.8 | 120.6 | 78.7 |
2.0 | 1.61 | 51.2 | 119.7 | 77.1 |
加入不同比例碳化钨对介质球体大小的影响见表2。
表2 碳化钨的加入对球体大小的影响
由表2可见,六种介质的粒径分布在100-140μm范围内变化不大,为此介质粒径大小筛选范围确定为50-250μm。六种介质的粒径分布趋势是非常相似的,碳化钨的添加量的大小对介质粒径几乎没有影响。
7、加入不同比例碳化钨对介质扩张特性的影响
扩张床内介质的稳定分级分布是分离效率的重要保证,探讨介质的扩张特性(膨胀特性),评价床层稳定性,十分必要。测定介质装填高度(H0),改变流速,测定床层的膨胀高度H,计算膨胀率E=H/H0。图3是六种介质在不同流速下的膨胀率(E)的比较。
在相同流动相,相同流速的条件下,随着介质中碳化钨添加比例的增加,床层扩张率(E)显著下降,说明较高密度的吸附剂可以适应高流速的操作需要。由于泵等原因造成液相流速的小幅变化时,密度较大介质的膨胀率变化小于密度较小介质,也就是说,较高密度的介质能够承受的流速扰动范围也较大,实际应用中较容易控制。
8、加入不同比例碳化钨对介质流体混合性质的影响
床层稳定性通常由扩张床内的流体混合性能来表征,主要有Bodenstein准数(Bo)和轴向混合系数(Dax)。Bo表示轴向对流传递速率与轴向扩散传递速率的相对大小,一般认为Bo值在40以上,床内的流动近似为平推流。图4给出了六种介质的Bo随流速的变化情况。
为了消除床层高度的差异对Bo准数的影响,以Bo/H0对线性流速(U)作图(见图4)。从图4中可以看出,六种介质的Bo随流速的变化情况。随着线性流速的增加,密度大的介质的Bo值先增大,达到最大值之后又迅速减小,而随着流速的增加,Bo值随介质密度的增加而下降。可以看出,Bo值均大于40(H0大于10),液流轴向混合小,床层稳定。
Dax表征轴向扩散程度,其值愈大,反混程度越大。图5给出了六种介质的轴向扩散系数与线性流速的关系。由图5可见,流速越大,Dax越大,床层轴向扩散系数几乎与介质的密度无关,而相对于流速呈近视线性关系增加。
实施例2 EBA层析的液体配制、介质的处理和装柱
层析介质:琼脂糖(碳化钨)-DEAE按照实施例1的方法合成;XP 2*60层析柱、STREAMLINE 100,10*100购自GE公司。
层析缓冲液:A平衡液(40mM柠檬酸钠p H5.0),B洗脱液(10mM柠檬酸钠p H5.0),B1洗脱液1(B+5g/L辛酸钠/HCl pH6.0),B2洗脱液2(1M柠檬酸钠p H8.0+0.3M氯化钠pH8.0),B3洗脱液3(20mM柠檬酸钠+0.1M氯化钠pH8.0),C 再生液(1M NaOH)均按照常规自行配制。
将琼脂糖(碳化钨)-DEAE介质用1:1(V/V)双蒸水冲洗,当介质完全沉淀并与水分层后,倾倒上清液,重复三遍。经由柱底部排空气泡,并添加水浸过底面,再将介质用水稀释(1:1(V/V))后,从柱的上端慢慢填装到柱中,装填过程不易过快以免进入气泡,随后安装上盖及相应管道和压力表。最后通过蠕动泵慢慢从下面管道进水,直到柱上端的少量空气被水全部赶出,柱中充满水,加水过程控制速度,避免将介质冲到顶端。
实施例3 扩张床作用柱层析(EBA)分离原料血浆(柱床25cm高)
柱平衡(A平衡液2.5CV)→血浆准备(稀释×3,用HCl调到pH5.0)→上样(从柱的下端进样)(1.5L血浆/L吸附剂的量)→非吸附血浆组分和析出液(2.5CV)→洗脱组分1(1CV)→洗脱组分2(1CV)→洗脱组分 3(1CV)→CIP(1CV)/平衡/第一次洗出(紫外分光光度计调为280nm)
实验用XP 2*60柱,(柱床25cm高),用线速度5cm/min进行一次层析,用线速度10cm/min进行一次层析。将原料血浆(液态)稀释三倍后直接上样,按照1.5L血浆/L吸附剂的量(已经稀释和调整完pH)/进样,两次层析的实验结果见表3。
表3 EBA两次(1和2次)层析的实验结果
从表3第一批次和第二批次的实验表明,在综合考虑高产率和低缓冲液体积的基础上,5cm/min的线速度比较合适。因为在10cm/min的线速度下产率略有下降,同时线速度从5cm/min到10cm/min的变化中,缓冲液体积由小变大,增加比例虽然不大,但这还会增加层析周期的时间。
实施例4 扩张床作用柱层析(EBA)分离原料血浆(柱床50cm高)
其它工艺流程和实施例3相同,改变柱床高度为50cm,用线速度5cm/min 进行一次层析,用线速度10cm/min进行一次层析。将原料血浆(液态)稀释三倍后直接上样,按照1.5L血浆/L吸附剂的量(已经稀释和调整完pH)/进样,两次层析的实验结果见表4。
表4 EBA两次(3和4次)层析的实验结果
表4结果表明,改变柱高度其它条件不变情况下的验证结果表明,柱床高度对不同组分体积和成分的分离效果具有重要影响。当柱高增加到50cm,第三次层析和第一次层析比较总的液体体积从19.7减少到19(线速度5cm/min);第四次层析和第二次层析比较液体体积从22.3减少到21.1(线速度10cm/min)。第三次层析流速从5cm/min增加到第四次层析的10cm/min,流过柱子的总体积从 19.0CV(线速度5cm/min)增加到21.1CV(线速度10cm/min),相应的总体积增加了 11%;而且,较高流速下所需的吸附剂量却远小于较低流速下所需吸附剂量。因此,在柱高为50cm时,流速大时分离效果更好。以上结果说明柱床高度是重要因素,而柱的直径并非影响最后总体积的决定因素。其中第三次的样品进行非还原SDS—PAGE分析,结果见图7。
实施例5 扩张床作用柱层析(EBA)分离原料血浆(柱床50cm高)
其它工艺流程和实施例3相同,为验证柱直径对结果的影响,该次改变柱直径,从2cm增加到10cm,,使用XP 10*100柱(柱床50cm),用线速度5cm/min 进行一次层析,用线速度10cm/min进行一次层析。将原料血浆(液态)稀释三倍后直接上样,按照1.5L血浆/L吸附剂的量(已经稀释和调整完pH)/进样,两次层析的实验结果见表5。
表5 EBA两次(5和6次)层析的实验结果
第六次的层析图谱见图6,第六次样品进行非还原SDS-PAGE分析结果见图8。
从层析图谱可见(见图6)流穿峰、洗脱1、洗脱2和洗脱3分别在280nm处有组分峰,通过与图7、图8的非还原SDS-PAGE分析结果表明,非吸附血浆组分和析出液含有α-1蛋白酶抑制剂(α-1-PI);洗脱组分1主要是白蛋白(Albumin)组分;洗脱组分2主要是免疫球蛋白(IgG);洗脱组分3主要是纤维蛋白原 (Fibrinogen),即每个组分中定性的蛋白组成基本是相同的。
第六次层析实验样品的SDS-PAGE电泳分析结果,分析EBA技术的工艺有效性及各有效成分蛋白在不同的洗脱组分的分布量差异发现,该技术在放大过程中具有较好的重复性。
前面四次小试实验每次层析中使用的总buffer体积平均在20.5个柱床体积,变化系数在7.2%。同时也发现每个组分损失的系数变化在7.5%-17%之间。
后面两次实验每次层析中使用的总buffer体积平均在79.85个柱床体积,变化系数在6.7%。同时也发现每个组分损失的系数变化在3.5-7.1%之间。
实施例6 扩张床作用柱层析(EBA)洗脱液的分析
通过免疫扩散分析每次层析的各个洗脱组分,分析白蛋白、免疫球蛋白和纤维蛋白原在每次层析中各个组分中的分布,每次层析的洗脱2的RID测定结果见图9,每个循环层析的产率见表6.
表6.每个循环层析的产率(产率作为消失单位表示)
虽然只通过一种RID’S的检测,可见所有过程中白蛋白在非结合流出的组分和洗脱2中占有率不超过6%,同时在洗脱1中产率在90%-100%。对于IgG,RID’S 的结果表明,在非结合流出组分和洗脱1中共占有率少于6%,在组分3中占有率 10%;在组分2中占有率80%-90%。
实施例7 酸沉除杂
取EBA洗脱组分III,加入终浓度8IU/ml肝素钠,以0.5mol醋酸将溶液的pH调至6.0,离心4℃,4000rpm/min,10min离心获得沉淀,按沉淀重量的5 倍体积加入磷酸盐缓冲液(8IU/ml Heparin,40mM PB,15mM Gly pH为7.2),再以0.5mol醋酸将溶液的pH调至特定pH值后,离心4℃,4000rpm/min,10min 去除不溶物,放于4℃,4h;随后再以4℃,4000rpm/min,10min,进行离心,缓慢吸取上清液。采用Image-Pro Plus对蛋白电泳结果进行灰度分析可知,其中 pH6.8时酸沉效果最佳,蛋白纯度最高可达78.7%见表7
表7 不同pH值下杂蛋白去除效果
取一定量经过酸沉后的蛋白溶液,加入终浓度为10mg/ml Tween-80及 3mg/mlTnBP,放于恒温磁力搅拌器上,将条件设置为25℃,6h,随后将处理后液体(C2)放于4℃
实施例8 MacroCap Q柱层析
层析缓冲液:A平衡液(40mM PB,15mM Gly pH为6.9),B1洗脱液(平衡液+0.05MNaCl PH7.2),B2洗脱液(平衡液+0.15M NaCl PH7.2),C再生液 (平衡液+1M NaCl PH7.2)。以上液体均自行配置,结果见表8。
表8 不同层析条件对洗脱组分的影响
由结果可知,洗脱组分2是目的蛋白,而在3个条件中,以条件1结果最优,其收率约为51.3%。参照条件1,进行3次层析,并通过Image-Pro Plus对 SDS-PAGE电泳图进行灰度分析,其结果显示,条件以下,蛋白纯度可达 (89.2±0.7)%。结果见下表9。
表9 纤维蛋白原分离的重复性结果分析
将以经过实施例8后样品通过0.22μm滤膜过滤后,收集分装即为产品,并取供试品20141101、20141102、20141103三批样品与国家药品标准物质纤维蛋白原进行凝固活性检查,其结果显示,采用本专利所述方法所得的Fg,其凝固时间更短,表示其具有更好的生理活性,见下表10。
表10 凝固活性比较
实施例9 扩张床作用柱层析(EBA)分离原料血浆的病毒挑战实验
采用VSV病毒挑战实验检测柱层析纯化步骤去除病毒的效果,依据过柱前后体积比,将其他待测样品均稀释至同等体积后,测得原始VSV病毒滴度为 TCID5010-3.51/0.1ml,而经过柱层析后VSV病毒滴度平均降至TCID5010-2.33/0.1ml,差异具有统计学意义(t=12.02,p<0.01),结果见表11.
表11 不同处理方式对病毒去除效果比较
*注:该法最低检测限为0.5logTCID50/0.1ml
以上结果显示,EBA技术具有分离条件温和,操作时间短,具有一定的病毒清除效果等优点,但相对于巴氏消毒法,该法去除病毒的效果仍有待加强。
Claims (7)
1.一种制备纤维蛋白原的方法,包括下述步骤:
1)以琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质为柱层析填料,制备扩张床作用层析柱;
2)将血浆过步骤1)所述的层析柱进行初步纯化,收集纤维蛋白原初品;
3)将步骤2)获得的纤维蛋白原初品用酸沉淀去除杂质;
4)将步骤3)获得的去除杂质的纤维蛋白原去除病毒;
5)用MacroCap Q柱层析进一步纯化步骤4)去除病毒后的纤维蛋白原,获得目标纤维蛋白原溶液;
其中步骤1)所述的琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质按照下述方法制备:
a)将琼脂糖与碳化钨反应制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,再将所述琼脂糖-碳化钨复合物珠粒与交联剂环氧氯丙烷反应制备交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒;其中琼脂糖用量为3%~9%重量,在90~95℃条件下,熔融共混琼脂糖和碳化钨,碳化钨和琼脂糖的质量比为1:0.2-~1:2,交联剂环氧氯丙烷添加量为0.1-0.3mL/mL凝胶;
b)通过烯丙基化、氧化和溴化分步反应活化步骤a)制备的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒;
c)在步骤b)活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒上偶联2-氯三乙胺配基,获得所述琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质;
其中所述步骤a)中,以反相悬浮液热再生方式制备琼脂糖-碳化钨复合物珠粒,其中使用的油相有机溶剂为石蜡、石油醚、氯苯、真空油或其中两种的混合物,琼脂糖水溶液和有机溶剂的体积比为6:1~2:1;
所述步骤b)中,通过添加烯丙基缩水甘油醚开环联接烯丙基,烯丙基缩水甘油醚的添加量为1~4mmol/mL凝胶,以三氟化硼乙醚为催化剂,二氧六环为溶剂反应;交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒内孔联接的烯丙基以油相保护,交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒外表层联接烯丙基以KMO4、H2O2水相氧化,油相保护使用的有机溶剂为苯、甲苯、乙苯、丙苯或者其中两种的混合物;
烯丙基化、氧化后的溴化过程中,滴加Br2的量为0.03-0.1mL/ml凝胶;
所述步骤c)中活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒偶联2-氯三乙胺配基过程中,将活化的交联琼脂糖-碳化钨复合物珠粒经过2.5-3.5mol/L NaOH溶液处理后偶联2-氯三乙胺,2-氯三乙胺的添加量为6-9mmoL/mL凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤2)中层析缓冲液为柠檬酸钠缓冲溶液,洗脱液为含辛酸钠的柠檬酸钠缓冲溶液,上样量为1.0-2.0L血浆/L琼脂糖碳化钨-DEAE离子交换介质。
3.根据权利要求2所述的方法,其中层析缓冲液为40mM柠檬酸钠缓冲液p H5.0,洗脱液顺序包括:洗脱液A:10mM柠檬酸钠缓冲液p H5.0;洗脱液B:洗脱液A+5g/L辛酸钠/HClpH6.0;洗脱液C:1M柠檬酸钠缓冲液p H8.0+0.3M氯化钠pH8.0;洗脱液D:20mM柠檬酸钠缓冲液+0.1M氯化钠pH8.0,柱床高度50cm。
4.根据权利要求1所述的方法,其中步骤3)中以醋酸调整纤维蛋白原初品溶液的pH,步骤包括用0.5M醋酸将溶液的pH调至6.0,离心4℃,4000rpm,10min离心获得沉淀,按沉淀重量的5倍体积加入磷酸盐缓冲液:40mM PB,15mM Gly,pH为7.2,再以0.5M醋酸将溶液的pH调至6.9,离心4℃,4000rpm,10min去除不溶物,放于4℃,4h;随后再以4℃,4000rpm,10min,进行离心,缓慢吸取上清液。
5.根据权利要求1所述的方法,其中步骤4)中用于灭活病毒的灭活剂终浓度为10mg/ml的Tween-80及3mg/ml的TnBP,置于恒温磁力搅拌器上,25℃,6h,随后将液体于4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法,其中步骤5)中以磷酸盐缓冲液平衡层析柱后纯化灭活病毒后的纤维蛋白原溶液,样品以流速1.5cm/min进行上样,随后以磷酸盐缓冲液进行洗脱。
7.根据权利要求1所述的方法,其中进一步包括将获得的目标纤维蛋白原溶液进行过滤纯化的步骤。
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