JP7357599B2 - 細胞外小胞分離法、コロイド粒子とその調製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、分離方法、コロイド粒子およびその調製方法に関し、特に細胞外小胞の分離方法、コロイド粒子およびその調製方法に関する。
細胞外小胞（Extracellular vesicles, EVs）は、膜構造を持つさまざまな小胞の総称であり、直径は３０ｎｍ～４０ｎｍや８μｍ～９μｍなど様々であり、多種の細胞から周囲の環境に分泌され、血液、尿液、唾液及びその他の体液中のいずれにもその存在が確認される。現在、細胞外小胞の機能は完全には解明されておらず、公知の文献では、それらは宿主と病原体との相互作用を調節し、感染症、神経疾患、癌などのさまざまな病理学的過程に関与し、正常な生理学的過程において細胞間での通信伝達で重要な機能を発揮すると認められている。細胞外小胞は、臨床医学においても多くの潜在的な応用用途があり、主に臨床状態、治療反応、疾患の進行などを監視するために使用できるバイオマーカーを豊富に含んでおり、また同時に生体分子を送達する機能を備えているため、臨床薬物担体の発展においても極めて大きな潜在力を有している。
細胞外小胞を分離するための従来のゴールドスタンダードな方法は、少なくとも１２時間かかる超高速遠心分離であり、超高速での遠心分離の最大回収率はわずか２０％しかなく、高純度の細胞外小胞は得られるものの、回収率は非常に低くなる。近年、ポリグリコール沈殿法、免疫磁気ビーズ精製法、マイクロ流路精製装置など、細胞外小胞を分離するための多くの方法や装置がさまざまな文献や特許で開発されているが、いずれも高回収率、時間節約、高純度の要件を同時に満たすことはできない。
したがって、高い回収率、時間の節約、高純度を同時に達成できる細胞外小胞分離法を開発することがますます重要になっている。
近年、さまざまな文書や特許で細胞外小胞を分離するための多くの方法や装置の開発が進められているが、それらのいずれも高い回収率、時間の節約、そして高純度の要件を同時に満たすことはできない。
本発明は、高回収率、時間節約および高純度を同時に兼ね備える、化学合成したコロイド粒子を分離カラムに充填して、細胞外小胞を分離する、細胞外小胞の分離方法、コロイド粒子およびその調製方法を提供する。
本発明のコロイド粒子の調製方法は、以下のステップを含む。水とアガロースで２ｗｔ％～６ｗｔ％の濃度のアガロース溶液を調製し、９０℃～１００℃に加熱してから、５ｗｔ％～２０ｗｔ％の濃度の界面活性剤と５０ｗｔ％～６０ｗｔ％の濃度の鉱油をアガロース溶液に加えて乳化し、第１コロイド材料を形成する。その後、第１コロイド材料をふるいでふるいにかけ、粒子径範囲が２５μｍ～５００μｍの第２コロイド材料を得て、第２コロイド材料を洗剤で洗浄して、油分や不純物を除去する。次に、洗浄した第２コロイド材料に濃度０．１Ｍ～０．５Ｍの架橋剤を添加し、攪拌して第３コロイド材料を形成する。最後に、第３コロイド材料を有機溶剤で洗浄し、次に第３コロイド材料を修飾溶液で表面修飾して、生体適合性分子で表面が修飾されたコロイド粒子を得る。修飾溶液は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＭＣ（メチルセルロース，ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）またはそれらの組み合わせを含む。
本発明のコロイド粒子は、細胞外小胞を分離するために使用され、２重量％から６重量％のアガロースを含み、粒径は２５μｍから５００μｍであり、表面は生体適合性分子で修飾されている。生体適合性分子は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＭＣ（メチルセルロース，ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）またはそれらの組み合わせを含む。
本発明の細胞外小胞分離法は、以下のステップを含む。上記のコロイド粒子を用意し、コロイド粒子をカラムに充填し、コロイド粒子をふるい板で軽く押してその表面を均す。次に、ＰＢＳバッファで数回すすいだ後、生体サンプルをカラムに加え、生体サンプルとカラム内のコロイド粒子を１８℃～２４℃の温度で作用させる。続いて、ＰＢＳバッファを前記カラムに加えて溶離および／または遠心分離し、中段溶離液を収集し、前記中段溶離液には細胞外小胞が含まれる。
上記に基づいて、本発明のコロイド粒子は、細胞外小胞を分離するために使用することができ、それは２ｗｔ％から６ｗｔ％のアガロースを含み、粒径サイズが２５μｍから５００μｍで、表面は生体適合性分子で修飾されており、本発明のコロイド粒子をカラムに充填し、細胞外小胞を分離して、高回収率かつ高純度の細胞外小胞を短時間で得ることができ、高回収率、時間節約、高純度を同時に実現することができる。
本発明の上記の特徴および利点をより明確かつ理解し易くするために、以下の特定の実施形態を、添付の図面と併せて以下の通り詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施形態によるコロイド粒子の調製方法の概略フローチャートである。 図２は、本発明の一実施形態による細胞外小胞分離法の概略フローチャートである。 図３は、本発明によって提供されるコロイド粒子で分離した細胞外小胞のクロマトグラムである。
以下において実施形態と図面を併せて詳細な説明を行っているが、提供する実施形態は、本発明がカバーする範囲を制限するものではない。また、本文中で使用されている「含む」、「有する」、「備える」などの用語はいずれも開放性の用語であり、即ち「含むがこれらに限定されない」という意味である。
本発明はコロイド粒子の調製方法を提供し、調製されたコロイド粒子は主に細胞外小胞の分離に用いられる。図１は、本発明の一実施形態によるコロイド粒子の調製方法の概略フローチャートである。以下、図１により本発明の一実施形態におけるコロイド粒子の調製方法について詳細に説明する。
図１を参照すると、まず、ステップＳ１０を実行し、水とアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）により、たとえば２ｗｔ％～６ｗｔ％の濃度のアガロース溶液を準備し、約９０℃～１００℃に加熱し（たとえば、マイクロ波オーブンまたはオートクレーブを使用して加熱してもよい）、次に、例えば５ｗｔ％から２０ｗｔ％の濃度の界面活性剤と、例えば５０ｗｔ％から６０ｗｔ％の濃度の鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）をアガロース溶液に加えて乳化（ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）して、第１コロイド材料を形成する。より詳細には、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ 20、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ ８０、またはそれらの組み合わせを含み得る。
上記の本発明の実施例のステップＳ１０では、水とアガロースの比率を調整することで、異なるパーセンテージ濃度のアガロース溶液を調製して、異なる細孔サイズのアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を生成することができ、乳化剤の種類と比率を調整して、コロイド粒子のサイズを調整することができる。理論的には、アガロース溶液の濃度が高いほど細孔は小さくなるが、アガロースゲルの硬度と分子量が異なると細孔のサイズにも影響し、現在のところ細胞外小胞の分離に適した細孔の範囲は、おおよそ濃度２ｗｔ％～６ｗｔ％アガロース溶液、例えば、約２．２ｗｔ％～５．８ｗｔ％、約２．５ｗｔ％～５．５ｗｔ％、約２．８ｗｔ％～５．３ｗｔ％、約３ｗｔ％～５ｗｔ％、約３．３ｗｔ％～４．７ｗｔ％、約３．５ｗｔ％～４．５ｗｔ％、約２．２５ｗｔ％～２．７５ｗｔ％、約２．７５ｗｔ％～３．２５ｗｔ％、約３．２５ｗｔ％～３．７５ｗｔ％、約３．７５ｗｔ％～４．２５ｗｔ％、約４．２５ｗｔ％～４．７５ｗｔ％、約４．７５ｗｔ％～５．２５ｗｔ％、約５．２５ｗｔ％～５．７５ｗｔ％などが採用されるが、これらに限定されない。
上記本発明の実施例のステップＳ１０において、調製されたアガロース溶液を加熱する方法は、マイクロ波オーブンまたはオートクレーブによる加熱を含み得るが、これに限定されない。加熱温度は、約９０℃～１００℃、例えば、約９０℃～９２℃、約９２℃～９５℃、約９５℃～９８℃、約９８℃～１００℃、約９３℃、約９７℃、約９９℃であるが、これに限定されない。
上記の本発明の実施例のステップＳ１０において、使用される界面剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、２－（２－［４－（１，１，３，３－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ］ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈａｎｏｌ）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０，ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０，ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）、Ｓｐａｎ８０（ソルビタンモノオレアート，ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）または前述の組み合わせを含み得るが、これに限定されない。使用される界面活性剤の濃度は、約５ｗｔ％～２０ｗｔ％、例えば、約６ｗｔ％～１８ｗｔ％、約８ｗｔ％～１６ｗｔ％、約１０ｗｔ％～１５ｗｔ％などであり得るが、これらに限定されない。
上記本発明実施形態のステップＳ１０において、使用される鉱油は、パラフィン油、ナフテン系炭化水素油または芳香族炭化水素油を含み得るが、これらに限定されない。使用される鉱油の濃度は、約５０ｗｔ％から６０ｗｔ％、例えば、約５２ｗｔ％から５５ｗｔ％、約５５ｗｔ％から５８ｗｔ％、約５３ｗｔ％、約５６ｗｔ％または約５９ｗｔ％であり得るが、これらに限定されない。
上記の本発明実施形態のステップＳ１２において、使用される洗剤は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム，ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。洗浄には、一定量の上記洗剤を第２コロイド材料に１回以上施すことができ、使用する洗剤は有機溶剤を併せて洗浄して、油汚れをよりきれいに洗浄してもよく、併せて使用する有機溶剤は、ｎ‐ヘキサン、アルコール溶液等またはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。たとえば、８０ｍｌの第２コロイド材料を反応に使用する場合、最初に２５０ｍｌの１％ＳＤＳ水溶液で油汚れを洗浄し、次に１００ｍｌのｎ‐ヘキサンで油汚れを洗浄し、濾過後に８０ｍｌの２０％アルコール溶液で３回洗浄して、最後８０ｍｌの浄水で３回洗浄する。
次に、引き続き図１を参照し、ステップＳ１４を実行し、約０．１Ｍから０．５Ｍの濃度の架橋剤を洗浄した第２コロイド材料に加え入れ、攪拌して第３コロイド材料を形成する。より詳細には、架橋剤には、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）、ＤＣＰ（１，３‐ジクロロ‐２‐プロパノール／１，３－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－２－ｐｒｏｐａｎｏｌ）、２，３‐ジブロモプロパノール（２，３－ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ジビニルスルホン（ｄｉｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ビスオキシラン（ｂｉｓ－ｏｘｉｒａｎｅｓ）またはそれらの組み合わせを含み得る。
上記本発明実施形態のステップＳ１４において、使用される架橋剤の濃度は、例えば、約０．１５Ｍから０．４５Ｍ、約０．２Ｍから０．４Ｍ、約０．２５Ｍから０．３５Ｍなどであり得るが、これらに限定されない。
最後に、引き続き図１を参照し、ステップＳ１６を実行し、第３コロイド材料を有機溶媒で洗浄してから、第３コロイド材料の表面を修飾溶液で修飾して、生体適合性分子で表面修飾されたコロイド粒子を得る。より詳細には、使用される有機溶剤は、第３コロイド材料に１回以上一定量適用され、有機溶剤は、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）またはそれらの組み合わせを含み得る。そのうちエタノールの濃度は、例えば、２０％から７５％であり、メタノールの濃度は、例えば、２０％から７５％であり、アセトンの濃度は、例えば、２０％から７５％である。たとえば、８０ｍｌの第３コロイド材料を反応に使用する場合は、最初に８０ｍｌの２０％アルコール溶液で３回洗浄し、次に８０ｍｌの浄水で３回洗浄する。使用するアセトンの量は少なく、約４０ｍｌの第３コロイド材料では濃度７５％のアセトン１０ｍｌで洗浄するだけで済む。メタノールでの洗浄方法はエタノールと同様で、濃度は２５％～７５％でよく、使用量は約４０ｍｌの第３コロイド材料を４０ｍｌのメタノールで３回洗浄する。
上記の本発明実施形態のステップＳ１６では、修飾溶液は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＭＣ（メチルセルロース，ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。より詳細には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および胎児ウシ血清（ＦＢＳ）などのタンパク質類は、生体適合性を有するマクロ分子であり、適用可能な分子量範囲は、例えば、３ｋＤａから１５０ｋＤａである。グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸類は生体適合性を有する小分子であり、適用可能な分子量の範囲は、例えば、１Ｄａから５００Ｄａである。ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）およびＭＣ（メチルセルロース）は生体適合性を有するポリマーであり、適用可能な分子量範囲は、例えば、１０ｋＤａから５００ｋＤａである。
上記本発明実施形態のステップＳ１６では、表面修飾方法は、吸着法または共有結合法を含み得る。吸着法は、第３コロイド材料を架橋反応させた後、直接カラムに通し、生体適合性分子をコロイド粒子表面に吸着させる方法である。共有結合法は、第３コロイド材料を架橋反応させた後、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）が露出した官能基を生体適合性分子に共有結合方法でつなげる。この実施形態では、吸着法は、上記の生体適合性を有するマクロ分子または小分子に適用することができ、上記のポリマーは、溶解性のために吸着法には適していない。共有結合法は、上記の生体適合性を有するマクロ分子、小分子、またはポリマーに適用できる。
さらに、修飾溶液に含まれる生体適合性分子は、分離しようとする細胞外小胞の生物学的サンプルに応じて異なる選択をすることができる。たとえば、修飾溶液に生体適合性を有するマクロ分子が含まれている場合、生物学的サンプルが細胞培養液や血漿サンプルであれば細胞外小胞の回収率を大幅に向上させることができる。修飾溶液に生体適合性を有する小分子が含まれている場合、生物学的サンプルが細胞培養液であれば、細胞外小胞の回収率は中程度であるが、回収される細胞外小胞の純度は高い。生物学的サンプルが血漿サンプルである場合、修飾溶液に生体適合性ポリマーが含まれているものを選択すると、細胞外小胞の回収率は、生体適合性のある小分子を含む修飾溶液の回収率よりも高くなる可能性がある。
さらに、上記本発明実施形態のステップＳ１６において、修飾溶液で第３コロイド材料を表面修飾するとき、修飾溶液に含まれる生体適合性分子の濃度は、約０．１Ｍから０．５Ｍ、例えば、約０．１５Ｍから約０．４５Ｍ、約０．２Ｍから０．４Ｍ、約０．２５Ｍから０．３５Ｍ、約０．１３Ｍ、約０．２６Ｍ、約０．３３Ｍ、約０．４６Ｍなどであるが、これらに限定されない。生体適合性分子を含む修飾溶液で第３コロイド材料を表面修飾することにより、細胞外小胞の回収率を高めることができる。
本発明はまた、細胞外小胞を分離するために用いることができる、上記のコロイド粒子調製法によって調製されたコロイド粒子を提供し、上記のコロイド粒子は約２ｗｔ％から６ｗｔ％のアガロースを含むことができ、粒径サイズは例えば２５μｍから５００μｍであり、表面が生体適合性分子で修飾され、生体適合性分子は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＭＣ（メチルセルロース，ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明のコロイド粒子表面は生体適合性分子で修飾されているため、回収率を効果的に高めることができる。
さらに、上記の本発明実施形態で提供されるコロイド粒子は、そのアガロース調製濃度、加熱条件、界面活性剤および鉱油使用濃度、ふるいによるふるい分けによって得られる第２コロイド材料の粒径範囲、第２コロイド材料を洗浄するために使用される洗剤、第２コロイド材料に適用される架橋剤、架橋剤の使用濃度、第３コロイド材料の洗浄に使用される有機溶剤、第３コロイド材料の表面を修飾するのに適用する生体適合性分子、修飾溶液の適用濃度、およびコロイド粒子の表面修飾の程度などは、いずれも上記の細胞外小胞を分離するために使用されるコロイド粒子の調製方法に記載されている範囲または内容と類似または同一であり、ここでは繰り返しの説明は行わない。
本発明は、上記のコロイド粒子を使用した細胞外小胞分離の方法も提供する。図２は、本発明の一実施形態による細胞外小胞分離法の概略フローチャートである。以下、図２を用いて、本発明の一実施形態の細胞外小胞分離法について詳細に説明する。
図２を参照すると、まず、ステップＳ２０を実行して、コロイド粒子を準備し、上記コロイド粒子は、上記の図１で説明した調製方法で作成され、上記で言及される粒径サイズと組成を有し、表面は生体適合性分子で修飾される。上記にて詳細に説明されているので、ここでは繰り返しの説明は行わない。
次に、引き続き図２を参照すると、ステップＳ２２を実行し、カラムにコロイド粒子を充填し、ふるい板でコロイド粒子を軽く押してその表面を均す。この実施形態では、カラムは、オープンカラム、遠心分離カラムあるいはフラッシュカラムであり得る。
その後、引き続き図２を参照すると、ステップＳ２４を実行し、ＰＢＳバッファで数回すすぎ、生物学的サンプルをカラムに加え入れ、生物学的サンプルとカラム内のコロイド粒子を約１８℃～２４℃の温度で作用させ、たとえば約１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃の温度で作用させることができるが、これに限定されない。
この実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養液、血漿、血清、尿液、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、または羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）を含み得るが、本発明はこれに限定されない。より詳細には、細胞培養液に適用する場合、例えば、６ｗｔ％のアガロースを含み、７４μｍから５００μｍの粒径サイズを有するコロイド粒子を使用することがより適切であり、コロイド粒子表面は生体適合性小分子で修飾され、好ましくは加圧条件下で操作される。血漿に適用する場合、例えば、５ｗｔ％のアガロースを含み、３７μｍから１２５μｍの粒径サイズを有するコロイド粒子を使用することが好ましく、かつコロイド粒子の表面は生体適合性ポリマーで修飾され、好ましくはたとえば非加圧条件下で操作される。
次に、引き続き図２を参照すると、ステップＳ２６を実行し、カラムにＰＢＳバッファを加え入れて溶離および／または遠心分離を行い、中段溶離液を収集し、中段溶離液には細胞外小胞が含まれている。このようにして、本発明の細胞外小胞の分離方法が完了する。本発明の細胞外小胞の分離法による回収率は、５０％を超えることができ、たとえば、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、または９０％を超えることさえでき、また９９％以上のタンパク質を除去できるため、タンパク質の残留量を１％未満とすることができ、流速は約４７５μｌ／ｍｉｎに制御でき、操作時間は１時間未満とすることができ、高い分離効率を有する。さらに、加圧された操作条件下で、細胞外小胞のカラム通過を加速して、希釈率を下げて、細胞外小胞の回収率を上げることができる。
以下、本発明が提案するコロイド粒子と細胞外小胞の分離方法を実験例により詳しく説明する。ただし、以下の実験例は本発明を制限することを意図したものではない。
実験例
本発明のコロイド粒子が細胞外小胞を効率的に分離できることを証明するために、次の実験を特別に行った。
実験例１：コロイド粒子の調製
（１）アガロース粒子の調製
８０ｍｌの水を４．８ｇのアガロースと混合し、マイクロ波オーブンまたはオートクレーブで加熱し、９０℃で２時間加熱して完全に溶解し、６％アガロース溶液を調製する。次に、１３．５ｍｌのＳｐａｎ８０、１．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、および８５ｍｌの鉱油を均一に混合し、９５℃に加熱した後、６％アガロース溶液を加えて３０分間乳化反応させる。反応終了後、反応温度を室温まで下げる。その後、油汚れを１％ＳＤＳ水溶液で洗浄し、７４μｍから２５０μｍのアガロース粒子をろ過により収集する。１００ｍｌのｎ‐ヘキサンと８０ｍｌの２０％アルコールで３回洗浄し、次に８０ｍｌの二次水で３回洗浄して、４０ｍｌの７４μｍから２５０μｍの６％アガロース粒子（前述の第２コロイド材料に相当）を得る。
（２）架橋反応
上記の４０ｍｌのアガロース粒子を、最終濃度０．５Ｎの水酸化ナトリウム溶液中で５ｍｌのエピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）と反応させ、６０℃に加熱して反応させ、一晩撹拌して架橋反応を実施し、前述の第３コロイド材料に相当する物を得る。
（３）生体適合性分子による表面修飾
架橋反応が完了したら、６０℃の温度下で５ｍｌのエピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）をコロイド材料に直接加え、３時間反応させて、より多くの官能基を活性化する。その後濾過し、コロイドを二次水で３回洗浄して、未反応のエピクロロヒドリンを除去する。官能基が活性化されたアガロース粒子（官能基が活性化された第３コロイド材料）を、最終濃度１Ｎの水酸化ナトリウム溶液中において、０．８ｇの生体適合性分子ＣＭＣ固体および最終濃度０．２Ｍグリシン(ｇｌｙｃｉｎｅ)溶液を加え入れ、６０℃で一晩反応させる。その後、反応温度を室温まで下げ、二次水４０ｍｌで３回濾過洗浄し、次いでアルコール４０ｍｌで３回洗浄し、最後に二次水４０ｍｌで３回洗浄し、生体適合性分子ＣＭＣが修飾されたＣＭＣ６％アガロース粒子（前述のコロイド粒子に相当）を収集して、後続の細胞外小胞の分離に用いるために備える。
実験例２：癌細胞培養液の細胞外小胞精製
（１）クロマトグラフカラムの充填
直径８ｍｍ、長さ７０ｍｍ、総体積約３．５ｍｌのカラムの底部にふるい板を入れ、最初にＰＢＳバッファですすぎ、次にスポイトを使用して実験例１で合成したコロイド粒子を吸い上げ、カラム中に充填する。コロイド粒子が必要とする充填する高さ（７０ｍｍ）まで沈むのを待ち、ふるい板でその表面を押してコロイドの充填を完了し、次にカラムを１０ｍｌのＰＢＳバッファで溶離してカラムバランスを取る。
（２）細胞外小胞の分離
ヒト乳がん細胞の細胞株ＳＫＢｒ３の培養液サンプル１００μｌをカラム上部に注入し、液面がふるい板より下がるのを待ちサンプル注入が完了する。ＰＢＳバッファでサンプルを溶離して、前段、中段、後段の溶離溶液を収集し、そのうち中段には高純度の細胞外小胞が含まれ、１管あたり２００μＬを収集して、合計２４管分を収集する。
（３）サンプルの純度と回収率の分析
ナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＮＴＡ）を使用してサンプルの濃度と回収率を計算し、ＥＬＩＳＡ法を使用して、すべての粒子がＣＤ９／ＣＤ９抗体活性を有することを確認し、そのうちＣＤ９抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ｍｉｃｒｏＢＣＡを使用して、そのタンパク質残留量を測定した。分析結果は図３と表１に示すとおりである。
図３は、本発明によって提供されるコロイド粒子で分離した細胞外小胞のクロマトグラムである。図３および表１を同時に参照すると、細胞外小胞信号はＥＬＩＳＡによってＣＤ９／ＣＤ９の信号が測定され、タンパク質残留量はｍｉｃｒｏＢＣＡによって測定される。精製前のがん細胞培養液と比較し、ＥＬＩＳＡで得られたＣＤ９／ＣＤ９信号値を計算して回収率を算出し、またコロイド粒子すべてにＣＤ９／ＣＤ９抗体活性があることを確認した。そのうち、収集した前段の溶離液ｆｒａｃｔｉｏｎ１－５はブランクサンプルであり、ｆｒａｃｔｉｏｎ６－９はELISA ｐａｉｒ ＣＤ9／ＣＤ9の吸収光４５０ｎｍの信号を有し、ｆｒａｃｔｉｏｎ１０-２０はｍｉｃｒｏＢＣＡの吸収光５６２ｎｍのタンパク質信号を有する。また、表１に示すように、本発明によるコロイド粒子による細胞外小胞の分離回収率は約８５％に達し、残留タンパク質は約０．０７２％である。
実験例３：グリア細胞と幹細胞培養液の細胞外小胞精製
（１）クロマトグラフカラムの充填
直径８ｍｍ、長さ７０ｍｍ、総体積約３．５ｍｌのカラムの底部にふるい板を入れ、まずＰＢＳバッファですすぎ、次にスポイトを使用して実験例１で合成したコロイド粒子を吸い上げ、カラムに充填する。コロイド粒子が必要とする充填高さ（７０ｍｍ）に沈むのを待ち、ふるい板でその表面を押してコロイドの充填を完了し、次に１０ｍｌのＰＢＳバッファで溶離してカラムのバランスを取る。
（２）細胞外小胞の分離
グリア細胞株ＨＣＮ‐２と幹細胞株ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ(ＭＳＣ)の培養液１００μｌをそれぞれカラム上部に注入し、液面がふるい板より下がるのを待ち、サンプル注入が完了する。ＰＢＳバッファでサンプルを溶離して、前段、中段、後段の溶離液を収集し、そのうち中段には高純度の細胞外小胞が含まれ、１管あたり２００μＬを収集して、合計２４管分を収集する。
（３）サンプル分析
グリア細胞の細胞外小胞信号は一般に低いため、感度の高い抗体磁気ビーズを使用して回収を補助し、その回収率を確認する。使用する磁気ビーズの主成分は、酸化鉄と二酸化ケイ素であり、サイズは約１８０ｎｍで、たとえば、ＣＤ６３抗体はＣＤ８１抗体と併せて使用する（ＣＤ６３／ＣＤ８１）ことができるなど、異なる抗体を互いに組み合わせることができ、磁気ビーズと接合させて抗体磁気ビーズ(ＭＰ－ＣＤ６３／ＣＤ８１)とすることができる。前述のＣＤ６３抗体はＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入し、ＣＤ８１抗体はＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した。異なる抗体磁気ビーズをペアリングおよびスクリーニングした後、同様に精製前の細胞培養培液と比較し、それぞれ信号が最も強いＭＰ‐ＣＤ６３／ＣＤ８１（実施例１：グリア細胞）およびＭＰ‐ＣＤ８１／ＣＤ８１（実施例２：幹細胞）の信号値を選び出し、その後それぞれ回収率を計算し、かつすべての粒子が抗体活性を有することを確認した。同時に、ｍｉｃｒｏＢＣＡを使用してそのタンパク質残留量を測定した。分析結果を表２に示す。
表２に、実施例１と実施例２の細胞外小胞回収率、および残留タンパク質の割合を示す。表２に示すとおり、本発明のコロイド粒子を使用して細胞外小胞を分離すると、回収率を顕著に向上させると同時に、タンパク質残留量を１％未満に維持することができる。
実験例４：小体積サンプルと大体積サンプルのいずれにも適用
実施例３の実験操作条件および手順は、基本的に上記表２の実施例２と同じであり、違いは、サンプル分析において抗体磁気ビーズ法を使用していないことにあり、ＥＬＩＳＡで検出されたＣＤ９／ＣＤ９信号値を精製前の細胞培養培液と比較し、かつ細胞外小胞の回収率を推定し、同時にいずれのコロイド粒子もＣＤ９／ＣＤ９抗体活性を有することを確認した。
実施例４の実験操作の詳細は以下の通りである。
（１）クロマトグラフカラムの充填
直径３０ｍｍ、長さ１３０ｍｍ、総体積約９２ｍｌのカラム底部にふるい板を入れ、最初にＰＢＳバッファですすぎ、スポイトを使用して例１で合成したコロイド粒子を吸い上げ、カラムに充填し、コロイド粒子が必要とする充填高さ（１３０ｍｍ）まで沈むのを待ち、ふるい板でその表面を押してコロイドの充填を完了し、次に２７０ｍＬのＰＢＳバッファで溶離してカラムバランスを取る。
（２）細胞外小胞の分離
幹細胞株ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣ）の培養液サンプル１０ｍｌをカラム上部に注入し、液面がふるい板より下がるのを待ち、サンプル注入が完了する。ＰＢＳバッファでサンプルを溶離し、前段、中段、後段の溶離溶液を収集し、そのうち中段には高純度の細胞外小胞が含まれ、１管あたり２００μＬを収集して、合計２４管分を収集する。
（３）サンプル分析
精製前の細胞培養液とＥＬＩＳＡにより検出されたＣＤ９／ＣＤ９信号値を比較し、細胞外小胞の回収率を計算し、いずれのコロイド粒子もＣＤ９／ＣＤ９抗体活性を有することを確認し、そのうちＣＤ９抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質残留量を測定した。分析結果は表３に示すとおりである。
表３に、実施例３と実施例４の細胞外小胞回収率と残留タンパク質の割合を示す。表３から、本発明コロイド粒子を用いた細胞外小胞の分離は、サンプルが小体積であるか大体積であるかに関わらず、回収率はいずれも６０％を超え、大体積サンプルに至っては回収率が９０％を超え、かつ同時に１％未満のタンパク質残留量を維持することができることが分かる。
実験例５：血漿サンプルの細胞外小胞精製
（１）クロマトグラフカラムの充填
クロマトグラフカラムの充填：直径８ｍｍ、長さ７０ｍｍ、総体積約３．５ｍｌのカラム底部にふるい板を入れ、最初にＰＢＳバッファですすぎ、次にスポイトを使用して実験例１で合成したコロイド粒子（実施例５）、あるいは表面修飾されていないコロイド粒子（比較例１）を吸い上げ、カラムに充填する。コロイド粒子が必要とする充填高さ（７０ｍｍ）に沈むのを待ち、ふるい板でその表面を押してコロイドの充填を完了し、次に１０ｍｌのＰＢＳバッファで溶離してカラムのバランスを取る。
（２）細胞外小胞の分離
血漿サンプル１００μｌをカラム上部に注入し、液面がふるい板より下がるのを待ち、サンプル注入が完了する。ＰＢＳバッファでサンプルを溶離して、前段、中段、後段の溶離溶液を収集し、そのうち中段には高純度の細胞外小胞が含まれ、１管あたり２００μＬを収集して、合計２４管分を収集する。
（３）サンプル分析
抗体磁性ビーズ法（ＭＰ‐ＣＤ９／ＣＤ９）により収集した細胞外小胞がいずれも抗体活性を有することを確認し、抗体磁性ビーズの調製方法は上記と同じであるので、繰り返しの説明は行わない。同時に、ｍｉｃｒｏＢＣＡを使用してそのタンパク質の残留量を測定した。分析結果は表４に示すとおりである。
留意すべきは、サンプルソースが異なれば、備わるバイオマーカーも異なるので、サンプル分離の前に複数のマッチングのふるい分けを行い、より高いパフォーマンスのペアを選択する必要がある。一般的に言えば、癌細胞のＣＤ９／ＣＤ９の発現量はより高く、幹細胞はＣＤ８１シリーズでの発現がより多くなる。血漿に関しては、タンパク質不純物が高いと、相対して細胞外小胞の信号は低くなるため、検出感度を高めるために抗体磁性ビーズ法を選択する。ただし、抗体磁性ビーズ法は血漿サンプルに限定されず、他に由来するサンプルも同様に適用可能である。
表４に、実施例５と比較例１の細胞外小胞回収率と残留タンパク質の割合を示す。表５より、表面修飾されていないコロイド粒子を使用した比較例１と比較して、本発明が提供する表面修飾された生体適合性分子を有するコロイド粒子を用いた実施例５は顕著に高い回収率を有し、かつ回収程度は表面修飾されていないもののほぼ２倍以上であり、同時にタンパク質の残留量も低いことが分かる。
まとめると、本発明はコロイド粒子の調製方法を提供し、調製されるコロイド粒子は細胞外小胞を分離するために使用することができ、それは２ｗｔ％から６ｗｔ％のアガロースを含み、粒径サイズが２５μｍから５００μｍで、表面は生体適合性分子で修飾されており、本発明のコロイド粒子をカラムに充填し、細胞外小胞を分離して、高回収率かつ高純度の細胞外小胞を短時間で得ることができ、高回収率、時間節約、高純度を同時に実現することができる。さらに、このコロイド粒子はオープンカラム、遠心分離カラム、フラッシュカラムなど広い範囲に応用でき、２０分以内に５０％以上の回収率が得られ、細胞外小胞の回収率が９０％を超えることも可能であり、また９９％以上のタンパク質を除去してタンパク質残留量を１％未満とすることも可能である。
本発明は化学合成コロイド粒子を使用して分離カラムに充填し、細胞外小胞を分離し、高回収率、時間節約、高純度を同時に兼ね備え、臨床医学に応用できる可能性を有し、臨床ステータス、治療反応性、疾患の進行などの監視に使用することができ、臨床薬物担体の開発にも極めて大きな潜在力を有している。
Ｓ１０、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１６、Ｓ２０、Ｓ２２、Ｓ２４、Ｓ２６:ステップ

Claims (9)

  1. 細胞外小胞の分離に用いるコロイド粒子を調製する方法であり、
    水とアガロースで２ｗｔ％～６ｗｔ％の濃度のアガロース溶液を調製し、９０℃～１００℃に加熱してから、５ｗｔ％～２０ｗｔ％の濃度の界面活性剤と５０ｗｔ％～６０ｗｔ％の濃度の鉱油を前記アガロース溶液に加えて乳化し、第１コロイド材料を形成し、
    前記第１コロイド材料をふるいでふるいにかけ、粒子径範囲が２５μｍ～５００μｍの第２コロイド材料を得て、前記第２コロイド材料を洗剤で洗浄して、油分や不純物を除去し、
    洗浄した前記第２コロイド材料に濃度０．１Ｍ～０．５Ｍの架橋剤を添加し、攪拌して第３コロイド材料を形成し、
    前記第３コロイド材料を有機溶剤で洗浄し、次に前記第３コロイド材料を修飾溶液で表面修飾して、生体適合性分子で表面が修飾されたコロイド粒子を得て、
    そのうち、前記修飾溶液が生体適合性分子を含み、前記修飾溶液に含まれる前記生体適合性分子の濃度は０．１Ｍから０．５Ｍであり、前記生体適合性分子は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ＭＣ（メチルセルロース，ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）またはそれらの組み合わせである、
    コロイド粒子の調製方法。
  2. 前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ ８０、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のコロイド粒子の調製方法。
  3. 前記洗剤が、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム，ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム，ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のコロイド粒子の調製方法。
  4. 前記架橋剤が、エピクロロヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ）、ＤＣＰ（１，３‐ジクロロ‐２‐プロパノール／１，３－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－２－ｐｒｏｐａｎｏｌ）、２，３‐ジブロモプロパノール（２，３－ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ジビニルスルホン（ｄｉｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ビスオキシラン（ｂｉｓ－ｏｘｉｒａｎｅｓ）またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のコロイド粒子の調製方法。
  5. 前記有機溶剤が、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のコロイド粒子の調製方法。
  6. エタノールの使用濃度は２０％から７５％、アセトンの使用濃度は２０％から７５％であり、メタノールの使用濃度は２０％から７５％である、請求項５に記載のコロイド粒子の調製方法。
  7. 請求項１から６のいずれか一項に記載のコロイド粒子の調製方法で調製されたコロイド粒子を準備し、
    前記コロイド粒子をカラムに充填し、ふるい板で前記コロイド粒子を軽く押してその表面を均し、
    ＰＢＳバッファで数回すすいだ後、生物学的サンプルを前記カラムに加え、前記生物学的サンプルとカラム内の前記コロイド粒子を１８℃から２４℃で作用させ、
    ＰＢＳバッファを前記カラムに加え入れて溶離及び／または遠心分離して、中段の溶離溶液を収集し、前記中段の溶離溶液には細胞外小胞が含まれる、細胞外小胞の分離方法。
  8. 前記生物学的サンプルが、細胞培養液、血漿、血清、尿液、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、または羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）を含む、請求項７に記載の細胞外小胞の分離方法。
  9. 前記カラムがオープンカラム、遠心分離カラムあるいはフラッシュカラムである、請求項７に記載の細胞外小胞の分離方法。
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