CN111770931B - 用于分离外泌体的多柱及外泌体分离方法 - Google Patents

用于分离外泌体的多柱及外泌体分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于从混合脂蛋白、水溶性蛋白质及外泌体等杂质的生物样品中分离外泌体的多柱及外泌体的分离方法。

Description

用于分离外泌体的多柱及外泌体分离方法
技术领域
本发明涉及一种用于从多种生物分子及外泌体混合的生物样品中高纯度分离外泌体的多柱及外泌体分离方法。
背景技术
胞外囊泡(extracellular vesicle)包括由细胞释放或分泌的外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微泡(microvesicle)及凋亡小体(apoptotic body)，其中外泌体的尺寸为20-150nm，是由细胞内的多泡体(MVB，Multi vesicular bodies)产生的生物纳米粒子。
这些胞外囊泡可以相对容易地从血液、淋巴液、脑脊液、尿液、羊水、母乳、唾液、精液等各种生物流体(biofluid)中分离出来，并根据来源的细胞，被称为dexosome(树突状细胞源)、癌小体(oncosome；癌细胞源)、前列腺小体(prostasome；前列腺细胞源)、心肌小体(cardiosome；心肌细胞源)等。胞外囊泡根据其来源细胞或细胞内的细胞器，含有各种核苷酸或标记蛋白质。例如，癌小体是来源于癌细胞的胞外囊泡，含有诱导癌细胞生长的基因的mRNA，而来源于抗原呈递细胞(antigen-presenting cell)的胞外囊泡则含有主要组织亲合性复合体(major histocompatibilit complex)。因此，胞外囊泡含有高浓度的生物材料，如细胞特异性蛋白质或核苷酸，因此在一般的生物液中它约占总蛋白体的0.01％，由此，通过传统分析方法难以检测到的蛋白质和核苷酸也可以相对容易地在胞外囊泡中发现。并且，虽然胞外囊泡中存在的蛋白质或核苷酸类型只是整体的一小部分，但胞外囊泡的物质却能表现出其来源细胞的独特特性，因此外泌体分析对于诊断特定疾病非常有用，最近对此的研究也很活跃。
在利用外泌体的诊断或治疗方法中，获得高纯度的外泌体尤为重要。关于外泌体的分离，包括韩国公开专利第10-2016-0115988号在内，人们已开始研究各种方法。其例子包括超速离心机(ultracentrifuge)、密度离心机(density centrifuge)、柱(column)的使用、PEG沉淀法(包括使用ExoQuickTM、全外泌体分离TM等)、色谱法(chromatography)、免疫磁分离(IMS，immuno-magnetic separation)及声音分离(acoustic separation，acousticpurification)等。在柱色谱法中，由于可以在短时间内获得相对高纯度的外泌体，近年来备受关注。
然而，当使用现有的柱色谱来分离外泌体时，存在以下问题：脂蛋白(lipoprotein)与外泌体一起被洗脱，或在执行两个以上的分离步骤而导致丢失外泌体或需要较长时间。现有的柱色谱法研究主要集中在外泌体洗脱区段，对脂蛋白的洗脱几乎没有进行深入的分析。然而，由于大小和密度与外泌体相似的脂蛋白总是一起存在于细胞培养液或血液中，因此在外泌体研究中分离脂蛋白至关重要。
在此背景下，本发明人试图开发一种从生物样品中分离与外泌体一起分离的各种杂质(如，脂蛋白和水溶性蛋白质)的方法，并且，通过优化从杂质中分离外泌体的条件并确定使用该方法获得纯外泌体的方法来完成本发明。
先行技术文献
专利文献
韩国公开专利第10-2016-0115988号
非专利文献
Joanne Louise Welton,Jason Paul Webber,Laur-Alexandru Botos,MichaelJones&Aled Clayton(2015)Ready-made chromatography columns for extracellularvesicle isolation from plasma,Journal of Extracellular Vesicles,4:1,DOI:10.3402/jev.v4.27269
发明内容
要解决的技术问题
在此背景下，本发明者通过发现当两种珠以特定顺序和比例堆叠时外泌体的分离效率显著优异，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供一种用于从脂蛋白和水溶性蛋白质中分离包括在生物样品的外泌体的多柱以及使用其的外泌体分离方法。
然而，本发明要解决的问题并非受限于上述言及的问题，未言及的其他问题能够通过以下记载由本领域普通技术人员所明确理解。
解决问题的技术方法
根据本发明的一实施例，提供一种用于分离外泌体的多柱，其包括：孔隙为20nm至100nm的多孔珠a)；堆叠在所述多孔珠a)上且孔隙为20nm以下的多孔珠b)；以及位于所述多孔珠a)和所述多孔珠b)之间的隔膜，所述多孔珠a)分离生物样品中的外泌体和脂蛋白，所述多孔珠b)分离生物样品中的外泌体和水溶性蛋白质。
根据一侧，所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比可以为95:5至5:95。
根据一侧，所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比可以为5:5之至1:9。
根据一侧，所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比可以为3:7至1:9。
根据一侧，所述多孔珠a)的表面负电荷值可以高于所述多孔珠b)的表面负电荷值。
根据一侧，所述多孔珠可以由从琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、硅胶、葡聚糖、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺及聚苯乙烯选择的一种以上的材料组成。
根据一侧，所述生物样品可以是从由血液、淋巴液、脑脊液、尿液、羊水、母乳、唾液、精液及细胞培养液组成的群组中选择的一种以上。
根据本发明的另一实施例，提供一种使用多柱的外泌体分离方法，其中，所述多柱包括包括孔隙为20nm至100nm的多孔珠a)、堆叠在所述多孔珠a)上且孔隙为20nm以下的多孔珠b)以及位于所述多孔珠a)和所述多孔珠b)之间的隔膜，所述方法包括以下步骤：使含有外泌体的生物样品通过多孔珠b)来分离外泌体和水溶性蛋白质；以及使通过所述多孔珠b)的生物样品通过多孔珠a)来分离外泌体和脂蛋白。
发明的效果
本发明的用于分离外泌体的多柱及使用其分离方法可以大大减少生物样品中所含的脂蛋白、水溶性蛋白质等杂质的含量，从而提高分离出的外泌体的纯度。
尤其，当使用本发明的多柱来执行尺寸排除色谱法时，由于外泌体的分离效率比脂蛋白优异，因此可以有效地用于仅分离样品中的外泌体。
通过所描述的实施例可获得的效果并不限于上述效果，并且，应当理解为包括可以从用于执行下面描述的发明的详细内容或权利要求中描述的本发明的配置推断出的所有效果。
附图说明
图1为显示根据本发明一实施例的多柱的示意图。
图2a及图2b为显示使用现有的单柱和本发明的多柱的分离外泌体的结果(2B:2B单柱；双柱：本发明的多柱)的附图，其中，图2a为每个柱的分馏样品的吸光度；图2b为通过动态光散射(DLS，dynamic light scattering)来确定的每个柱的分馏样品的粒子的Z平均尺寸。
图3a至图3c为显示使用本发明多柱来分离的血清样品的实际分馏中外泌体和脂蛋白的检测结果的附图(ApoB：脂蛋白；CD63：外泌体标记蛋白质；9-15：柱分馏号码#9-#15)。
图3a：SDS-PAGE
图3b：蛋白印迹法(Western blot)
图3c：脂蛋白和外泌体的相对检测强度
图4a至图4c为显示使用现有的单柱和本发明的多柱来分离的血清样品的每个分馏的外泌体和脂蛋白的检测结果的附图(血清：未单独处理的血清；标记：用于鉴定分子量的标准标记；ExoQuick：ExoQuick分离方法；2B柱：2B单柱；双柱：本发明的多柱)。
图4a：分馏中总蛋白质的定量结果
图4b：SDS-PAGE
图4c：蛋白印迹法(Western blot)
图5为显示对使用现有的单柱和本发明的多柱来分离的血清样品的分馏中脂蛋白与外泌体的相对比率进行比较的附图(ExoQuick：ExoQuick分离方法；2B柱：2B单柱；双柱：本发明的多柱)。
图6a及图6b为显示使用琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)200-HR的堆叠顺序各不相同的多柱来检测外泌体和脂蛋白的结果的附图。
图7为显示在血清样品的分馏中检测到的作为水溶性蛋白质的白蛋白的数量的附图。
图8为显示使用通过改变琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的体积比而制备的多柱来检测外泌体和脂蛋白的结果的附图。
图9为显示根据琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的体积比在血清样品的分馏第11至12区段中检测到的外泌体和脂蛋白的数量的附图。
图10为显示根据琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的体积比在血清样品的分馏第11至12区段中检测到的CD63密度(％)/ApoB密度(％)的附图。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的实施例进行详细说明。除非另有说明，否则显示在各附图中的相同的附图标记表示相同的结构要素。
可以对以下实施例进行多种变更。本申请的权利范围并非受到以下实施例的限制或限定，对所有实施例的全部更改、其等同物乃至其替代物均包括在权利要求范围。
实施利中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定实施例。在内容中没有特别说明的情况下，单数表达包括复数含义。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除还具有一个或以上的其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，或者附加功能。
在没有其他定义的情况下，包括技术或者科学术语在内的在此使用的全部术语，都具有本领域普通技术人员所理解的通常的含义。通常使用的与词典定义相同的术语，应理解为与相关技术的通常的内容相一致的含义，在本申请中没有明确言及的情况下，不能过度理想化或解释为形式上的含义。
并且，在参照附图进行说明的过程中，与附图标记无关，相同的构成要素赋予相同的附图标记，并省略对此的重复的说明。在说明实施例的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆实施例时，省略对其详细说明。
在本说明书中，术语“外泌体(exosome)”是指从包括细胞培养物在内的许多类型的细胞分泌的直径为20nm至150nm的细胞来源囊泡(vesicle)，它被人们熟知为扮演着各种角色，例如转运膜成分、蛋白质和RNA。
根据本发明的一实施例，提供一种用于分离外泌体的多柱，所述用于分离外泌体的多柱包括：孔隙为20nm至100nm的多孔珠a)、堆叠在所述多孔珠a)上且孔隙为20nm以下的多孔珠b)以及位于所述多孔珠a)和所述多孔珠b)之间的隔膜，所述多孔珠a)分离生物样品中的外泌体和脂蛋白，所述多孔珠b)分离生物样品中的外泌体和水溶性蛋白质。
所述多孔珠a)用于分离生物样品中的外泌体和脂蛋白，可以分离尺寸为10MDa以下的分子，所述多孔珠b)用于分离生物样品中的外泌体和水溶性蛋白质，可以分离尺寸为500MDa以下的分子，并且优选地，各个珠具有负电荷值。此外，为了使首先到达柱的下部的脂蛋白在电荷的影响下更快地被洗脱，优选地，堆叠在下部的多孔珠a)比堆叠在上部的多孔珠b)具有更低的平均表面电荷(参见实施例5)。
所述隔膜位于所述多孔珠a)及b)之间，以便在柱容器中连续填充各种类型的珠时，不同类型的珠互不混合。所述隔膜可以由聚乙烯或聚丙烯等树脂制成，但并不限于此。
填充在本发明的多柱的多孔珠可以由从琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、硅胶、葡聚糖、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺及聚苯乙烯选择的一种以上的材料组成，但并不限于此。
所述多孔珠的具体例子可以包括琼脂糖凝胶(Sepharose)2B、4B、6B、CL-2B、CL-4B及CL-6B；丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)S-200HR、S-300HR、S-400HR及S-500HR；以及ToyopearlHW-55、HW-65及HW-75及Superdex75，优选地，是琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR。
另外，多孔珠a)及多孔珠b)体积比可以为95:5至5:95，优选地，体积比可以为5:5至1:9，更优选地，体积比可以为3:7至1:9。
如上所述，当使用通过以特定体积比填充具有不同孔隙和表面负电荷值的两种类型的珠而制备的多柱来执行尺寸排除色谱法时，可以根据脂蛋白、外泌体及水溶性蛋白质的每种的洗脱速率来高纯度分离外泌体。
含有外泌体的生物样品可以是从由血液、淋巴液、脑脊液、尿液、羊水、母乳、唾液、精液及细胞培养液组成的群组中选择的一种以上，但并不限于此。
外泌体可以包括在所述尺寸排除色谱法后的总洗脱液的20％至80％区段中，但并不限于此，根据本发明的外泌体分离方法，脂蛋白与外泌体的比率在29％至57％区段中较高。
根据本发明的另一实施例，提供一种使用多柱的外泌体分离方法，其中，所述多柱包括包括孔隙为20nm至100nm的多孔珠a)、堆叠在所述多孔珠a)上且孔隙为20nm以下的多孔珠b)以及位于所述多孔珠a)和所述多孔珠b)之间的隔膜，所述方法包括以下步骤：使含有外泌体的生物样品通过多孔珠b)来分离外泌体和水溶性蛋白质；以及使通过所述多孔珠b)的生物样品通过多孔珠a)来分离外泌体和脂蛋白。
在所述外泌体分离方法中使用的多柱的描述与上述描述相同。
在本发明的具体实施例中，如图1所示的多柱馏分(fraction)中的外泌体出现在第9至15区段中，尤其在第10至12区段中，与脂蛋白和水溶性蛋白质相比，外泌体含量相对较高(图3)。在使用所述多柱的情况下，通过使用PEG沉淀的分馏方法可以获得比单柱更高纯度的外泌体馏分，并且蛋白质产率与传统单柱相当，因此可用于外泌体分离。
以下，参照实施例对本发明进行具体说明。然而，下述实施例及实验例仅用于说明本发明，本发明并不受到下述实施例及实验例的限制。
实施例1：多柱的制备
将琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-6B以70％(v/v)填充在用于色谱的柱的下部(直径：10mm，高度：50mm)后，将丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)200-HR以30％(v/v)填充在其上部，从而制备出了多柱，以使下部和上部的高度比为7:3。在此，琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的平均表面电荷值分别为-30和-7。
实施例2：从现有的柱条件中确认外泌体分离能力
使用了以珠填充的用于色谱的柱(直径：10mm，高度：50mm)，作为样品，使用了在10000rcf、4℃下离心30分钟后产生的上清液血清。为了确定通过现有的单柱和多柱的材料的分离效果，对所述样品执行了尺寸排除色谱法(SEC，Size Exclusion Chromatography)。
具体地，作为填充在柱中的珠，使用了琼脂糖凝胶CL-2B用作单柱(2B)、在实施例1中制备的(双柱，Dual column)用作多柱。在装载(loading)样品之前，清洗(washing)了填充有300ml PBS的珠，并当流动相缓冲液(除了填充的柱珠外)耗尽时，及时加载了准备的样品。装载在柱上的样品的体积不得超过填充珠总体积的5％，将0.3至0.5ml的样品装载到所述柱上。在2至4Pa下施加了流动相的压力。将接收从装载样品的时间点开始流出的洗脱液0.5ml的溶液区段定义为1区段，对收集的洗脱液在280nm处进行了吸光度检查，并使用动态光散射(DLS，dynamic light scattering)来测量了Z平均尺寸(Z-Average size)，并显示在图2。所有所述样品在第25至30区段内被洗脱。
结果，吸光度(图2a)及DLS分析(图2b)表明，不容易区分馏分中的外泌体、脂蛋白及水溶性蛋白质。
实施例3：外泌体和脂蛋白在血清中洗脱趋势的比较
为了在血清样品中比较每个区段的外泌体、脂蛋白及水溶性蛋白质的洗脱，使用实施例1的多柱并通过实施例2所述的方法来进行了馏分，并对每个馏分执行了SDS-PAGE及蛋白印迹法(Western blot)。作为一级抗体，将作为外泌体标记蛋白质的抗CD63的抗体(由Santa Cruz制造的sc-15363)以1:500进行稀释、作为脂蛋白抗体的ApoB-100抗体(由SantaCruz制造的sc-25542)以1:1000进行稀释，然后使用稀释后的抗体来确认了其洗脱与否。
结果，在第13区段以后检测到作为水溶性蛋白质的白蛋白(～65kDa)(图3)，脂蛋白在第9区段中出现得最明显，然后被检测直到第11区段。在第9区段中检测到少量的外泌体，并在第11及第12区段中检测到最强烈的外泌体后，检测到的数量逐渐减少(图3b)。对第9至15区段的各区段的分馏中脂蛋白和外泌体的含量进行了比较，脂蛋白主要出现在第9区段(#9)，但从第10区段开始检出的外泌体多于脂蛋白，在第11区段(#11)中，分馏中外泌体出现最多，在第12区段(#12)的分馏中几乎没有检测到脂蛋白，而从第13区段(#13)开始检测到水溶性蛋白质。由此，确定了第10至12区段(#10-#12)更适合获得外泌体(图3c)。
实施例4：根据分离方法和柱确定外泌体及脂蛋白的分离效率
对实施例2中描述的血清样品，分别执行了使用离心的沉淀法(Exoquick)、使用现有的单柱的尺寸排除色谱法(2B柱)以及使用本发明的多柱的尺寸排除色谱法(多柱)，并将分离的外泌体和脂蛋白的馏分显示在图4。
具体地，通过添加和离心商业产品ExoQuickTM(System Biosciences，Inc.)来进行了沉淀法；作为现有的单柱使用了填充有琼脂糖凝胶CL-2B的；而多柱使用了公开在实施例1的多柱。对分馏前和分馏后样品中的蛋白质总量进行了定量分析，并使用SDS-PAGE及蛋白印迹法来确定外泌体与脂蛋白的检测量和外泌体与脂蛋白的相对含量之间的差异。与实施例3相同，使用了作为外泌体标记蛋白质的抗CD63的抗体及作为脂蛋白标记蛋白质的抗ApoB-100的抗体，并使用Bio-Rad公司的ChemiDoc图像软件，通过对印迹样品部分的密度测量来计算出CD63密度(％)/ApoB密度(％)。
结果发现，在使用2B柱的情况下，包括在分馏样品的蛋白质总量为最低(图4a)；在使用Exoquick的情况下，发现大量的脂蛋白(图4b)。
然而，蛋白印迹法结果表明，在使用2B柱的分馏中外泌体的检测量最少，而脂蛋白的检测量较高。相反地，在使用实施例1的双柱(Dual column)的实验组中，发现几乎没有检测到脂蛋白(图4c)。尤其，在确定表示外泌体和脂蛋白分离效率的CD63密度(％)/ApoB密度(％)的结果中，使用实施例1的多柱的情况下显示出了最高值(图5)。
即，与传统的单柱相比，本发明的多柱具有优越的去除样品中所含脂蛋白和仅分离外泌体的能力。
实施例5：根据珠的堆叠顺序评估分离效率
为了根据用于填充多柱的珠的堆叠顺序来评估分离效率，将丙烯葡聚糖凝胶200-HR 70％(v/v)堆叠在实施例1的多柱(A)和用于色谱的柱(直径：10mm，高度：50mm)的下部后，准备了在其上部堆叠琼脂糖凝胶CL-6B(v/v)的多柱(B)。
使用两个准备的多柱，通过实施例2中所述的方法来执行了尺寸排除色谱法，并在每个洗脱区段确定了脂蛋白和外泌体的检测量，并显示在图6a及图6b(图6a：多柱(A)，图6b：多柱(B))。结果，实施例1的多柱(A)几乎没有检测到脂蛋白，反而在多柱(B)中，大部分的洗脱区段都检测到脂蛋白，并且，外泌体的检测量多柱(A)多于多柱(B)。
实施例6：根据珠的体积比评估分离效率
为了根据用于填充多柱的珠的体积比来评估分离效率，从用于色谱的柱(直径：10mm，高度：50mm)的下部准备了将琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR以体积比为9:1、7:3、5:5、3:7、1:9的比例依次堆叠的多柱及琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的单柱。
使用准备的柱，通过实施例2中所述的方法来执行了尺寸排除色谱法。结果，在与待填充的珠的体积比无关的情况下，由于分子量低而通过两种类型珠的水溶性蛋白质在第13区段之后被洗脱(图7)，因此将第11至12区段定为ROI，对脂蛋白和外泌体的检测量进行了分析，并显示在图8至图10。
参照图8及图9，当在第11至12区段的感兴趣区域(ROI，Region of interest)琼脂糖凝胶CL-6B和丙烯葡聚糖凝胶200-HR的体积比为3:7时，可以看出，CD63密度(％)和ApoB密度(％)值的差异最大；参照图10可以看出，在体积比为5:5至1:9的区段中，CD63密度(％)/ApoB密度(％)值呈增加的二次函数趋势。
综上，通过有限的实施例及附图对实施例进行了说明，本领域的普通技术人员能够对上述记载进行多种修改与变形。例如，所说明的技术以与所说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的构成要素以与所说明的方法不同的形态结合或组合，或者，由其他构成要素或等同物进行替换或置换也能够获得相同的效果。
由此，其他体现、其他实施例及权利要求范围的均等物全部属于专利权利要求的范围。

Claims (14)

1.一种用于分离外泌体的多柱，包括孔隙为20nm至100nm的多孔珠a)及孔隙为20nm以下的多孔珠b)，其特征在于，
所述多孔珠a)位于生物样品的洗脱液排出的底部，并分离生物样品中的外泌体和脂蛋白，
所述多孔珠b)位于引入生物样品的顶部，并分离生物样品中的外泌体和水溶性蛋白质，
所述多柱包括在多孔珠a)与多孔珠b)之间的由树脂制成的隔膜，使得多孔珠a)和多孔珠b)互不混合。
2.根据权利要求1所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为95:5至5:95。
3.根据权利要求2所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为5:5之至1:9。
4.根据权利要求3所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为3:7至1:9。
5.根据权利要求1所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述多孔珠a)的表面负电荷值高于所述多孔珠b)的表面负电荷值。
6.根据权利要求1所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述多孔珠由从琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、硅胶、葡聚糖、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺及聚苯乙烯选择的一种以上的材料组成。
7.根据权利要求1所述的用于分离外泌体的多柱，其特征在于，
所述生物样品是从由血液、淋巴液、脑脊液、尿液、羊水、母乳、唾液、精液及细胞培养液组成的群组中选择的一种以上。
8.一种使用权利要求1所述的多柱的外泌体分离方法，其特征在于，
包括以下步骤：
使含有外泌体的生物样品通过多孔珠b)来分离外泌体和水溶性蛋白质；以及
使通过所述多孔珠b)的生物样品通过多孔珠a)来分离外泌体和脂蛋白。
9.根据权利要求8所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为95:5至5:95。
10.根据权利要求9所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为5:5至1:9。
11.根据权利要求10所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述多孔珠a)及所述多孔珠b)的体积比为3:7至1:9。
12.根据权利要求8所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述多孔珠a)的表面负电荷值高于所述多孔珠b)的表面负电荷值。
13.根据权利要求8所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述多孔珠由从琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、硅胶、葡聚糖、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺及聚苯乙烯选择的一种以上的材料组成。
14.根据权利要求8所述的外泌体分离方法，其特征在于，
所述生物样品是从由血液、淋巴液、脑脊液、尿液、羊水、母乳、唾液、精液及细胞培养液组成的群组中选择的一种以上。
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