ES2325142T3 - Celulas cancerosas procedentes de liquidos corporales que contienen celulas, su aislamiento, uso y agentes que las contienen. - Google Patents

Celulas cancerosas procedentes de liquidos corporales que contienen celulas, su aislamiento, uso y agentes que las contienen. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para el aislamiento de células tumorales diseminadas a partir de líquidos corporales que contienen células, caracterizado porque se hace pasar el líquido corporal que contiene células o partes de él a través de un tamiz con una abertura de malla o de poro de aproximadamente 15 a 30 µm o a través de un tamiz con una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 15 a 30 µm y se obtiene la fracción celular retenida.

Description

Células cancerosas procedentes de líquidos corporales que contienen células, su aislamiento, uso y agentes que las contienen.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de células cancerosas a partir de líquidos corporales que contienen células; a mezclas de células que comprenden células cancerosas aisladas a partir de líquidos corporales; a un procedimiento para el establecimiento de líneas celulares correspondientes o para el aislamiento de componentes celulares correspondientes; a su uso como agentes terapéuticos; y a agentes farmacéuticos o veterinarios que las contienen.
El procedimiento de acuerdo con la invención se basa en que en un líquido corporal que contiene células existen células y agregados celulares de diferentes tamaños y formas. El aislamiento y la caracterización de células cancerosas tienen una gran importancia sobre todo en el campo de la oncología, para resolver cuestiones de diagnóstico, de pronóstico, terapéuticas y científicas tanto en el campo de la experimentación con animales como en el de la medicina humana. El procedimiento de acuerdo con la invención sirve asimismo para la extracción, dado el caso total, de células cancerosas de líquidos que contienen células o de fracciones de ellos que contienen células (aislados). Las células cancerosas aisladas, las líneas celulares establecidas a partir de ellas y los componentes celulares derivados reflejan un estado esencialmente nativo, es decir, biológico, que puede asignarse a las células cancerosas correspondientes en el líquido corporal.
El aislamiento de células cancerosas para la realización de análisis in vitro o ex vivo, por ejemplo, no es problemático cuando se ha localizado un tumor primario y, por lo tanto, se puede analizar una muestra de tejido. En este sentido, la patente de Estados Unidos 5.242.806, por ejemplo, describe un ensayo de quimiosensibilidad con células tumorales procedentes de material biopsiado. También el sistema MTS para ensayar principios activos inactivadores de tumores descrito en la patente de Estados Unidos 5.023.172 parte de material biopsiado. Éste se trata con tripsina y a continuación se añade a una suspensión de células alimentadoras para formar esferoides tumorales multicelulares. En este contexto también cabe mencionar el trabajo metódico de Shantz G.D. y col., Treatment of Metastasis: Problems and Prospects, 1985, 291-294. También en este caso se analizan líneas celulares de melanoma que se establecieron a partir del material celular de un tumor primario. Estas células se hacen pasar a través de un filtro con un diámetro de poro de 10 y 12 \mum, determinándose el tiempo que transcurre hasta que esencialmente todas las células han atravesado el filtro. Puesto que el tiempo necesario para la filtración parece depender de la deformabilidad pasiva de las células de melanoma, se intenta correlacionar dicha deformabilidad con el potencial metastásico de las células de melanoma.
Los problemas surgen cuando, por el contrario, no se ha localizado ningún tumor y, por lo tanto, no se dispone de tejido. Si bien se sabe que en ciertas circunstancias también se pueden detectar células cancerosas en líquidos corporales, los análisis correspondientes son técnicamente muy complicados debido a la baja concentración de células cancerosas presentes en los líquidos corporales. Por este motivo, sobre todo la medicina clásica pone en duda con frecuencia el valor informativo de este tipo de análisis.
Así, en el marco de la identificación y caracterización de células cancerosas diseminadas, entre las cuales se encuentran en particular células tumorales que se han desprendido del tumor primario, de metástasis y/o de recidivas y circulan en los líquidos corporales, el aislamiento de células cancerosas puede tener una importancia decisiva. Si, por ejemplo, se mide la expresión de genes relevantes en las células de un líquido corporal que se ha de estudiar, el aislamiento de las células cancerosas no es necesario si los genes relevantes no se expresan, o sólo lo hacen en muy poca medida, en las células no degeneradas presentes habitualmente en los líquidos corporales (véase, por ejemplo, Pittman K. y col., Annals of Oncology, 7, 1996, 297-301). Si, por el contrario, los genes relevantes también se expresan en las células no degeneradas, es necesario aislar primero las células cancerosas diseminadas y medir después la expresión de los genes relevantes. En este caso, un análisis cuantitativo de la expresión de determinados ácidos nucleicos, por ejemplo de los que son relevantes biológicamente para los tumores (por ejemplo, ligando FAS, receptor de FAS, bax, bcl-2, Ki-67, ciclinas, moléculas de adhesión), brinda la posibilidad de asignar la expresión al aislado tumoral.
Con el fin de la caracterización de las células tumorales resulta útil analizar las alteraciones genómicas de las células tumorales a nivel de ADN. Las determinaciones tales como "la pérdida de heterocigosidad (LOH), mutaciones, amplificaciones, etc." requieren una población extremadamente pura de células tumorales, puesto que las "células de tipo silvestre" contaminantes ocultan posibles alteraciones genómicas, haciendo que ya no sean detectables. Con el presente procedimiento las células contaminantes que expresan el tipo silvestre se eliminan al menos hasta tal punto que se puedan medir las alteraciones genómicas de las células cancerosas. Las células de tipo silvestre, por ejemplo las células CD45-positivas, pueden servir entonces de magnitud de referencia para la medición de, por ejemplo, pérdidas de heterocigosidad, amplificaciones y mutaciones.
Los procedimientos conocidos presentados con fines de aislamiento conducen en muchos casos a un enriquecimiento tan sólo inespecífico de las células cancerosas. Tampoco el procedimiento de la leucoféresis descrito en el documento US-A-5.529.903 (correspondiente al documento EP-A-0584715) ofrece un enriquecimiento específico de células cancerosas, sino que proporciona fracciones que se componen en la mayor parte de células mononucleares como las que también se pueden obtener con gradientes de densidad convencionales.
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El documento DE 4006293 A1 indica un medio de separación formado por una resina de polivinilacetal, con el que se pueden separar células a partir de suspensiones. Este procedimiento es una variante de la purificación de linfocitos T con lana de nilón conocida desde hace tiempo. El principio básico es también aquí la adsorción preferencial de células B y macrófagos/monocitos al medio de separación.
También con el procedimiento descrito en la solicitud de patente europea EP 0448837 A2 las células procedentes de una suspensión se concentran de forma inespecífica sobre un filtro, pudiéndose deducir a partir de la presión aplicada información sobre el número de células.
Para evitar la realización de frotis ginecológicos, el documento EP 0483506 A1 propone filtrar la sangre de la menstruación. El filtro se elige de tal manera que las células sanguíneas rojas y blancas puedan atravesar los poros del filtro. Las demás células, retenidas en el filtro, se someten después a una tinción de Papanicolaou, y se efectúa la valoración citodiagnóstica habitual del cuadro celular para distinguir las células normales de las anormales.
El procedimiento descrito en la patente de Estados Unidos 5.578.459 sirve para recoger y concentrar rápidamente las células de grandes cantidades de líquido, tales como enjuagues bucales. No se expone la separación de mezclas de células. También según el procedimiento descrito en la solicitud japonesa JP-5-252996A se deben reunir todas las células de una solución sobre un filtro. Lo mismo es válido para el procedimiento descrito en el documento JP-07143898A.
En Hirte, H. W. y col., Gynecologic Oncology, 44, 1992, 223-226, se describe el aislamiento de agregados celulares a partir de líquido ascítico de pacientes con carcinomas de ovario. Se trata en este caso de agregados celulares grandes que proceden de un carcinoma de ovario en estadio avanzado y que se encuentran localmente a altas concentraciones en las condiciones allí existentes.
Por el contrario, se sabe que el aislamiento de células cancerosas diseminadas se puede lograr con procedimientos en los que las células cancerosas se marcan de tal manera que puedan distinguirse de las células no degeneradas y separarse en base a ello. Además de la clásica técnica de columnas, también se describen para este fin, por ejemplo, los denominados filtros tangenciales y directos que están cargados con ligandos específicos (por ejemplo en el documento WO 96/06158, que, sin embargo, no se dirige a células tumorales).
La mayor parte de estos procedimientos se basa en una inmunoadsorción específica de antígeno (véase, por ejemplo, Rye, P.D. y col., The American Journal of Pathology, 150, 1997, 99-106). Los anticuerpos contra determinadas moléculas de la superficie celular específicas de tumores o epiteliales se proveen, por ejemplo, de marcadores fluorescentes y, en especial, magnéticos. Estos procedimientos presentan el inconveniente de que por la reticulación transversal de los antígenos de superficie se pueden producir efectos incalculables, tales como apoptosis, anergia, activación y otros cambios de estado de las células. Estos efectos pueden cambiar drásticamente el cuadro de la caracterización siguiente de las células cancerosas aisladas. Así, por ejemplo, el perfil de expresión de una célula puede alterarse en cuestión de unos pocos minutos. Se comprenderá que en aquellos casos no se puede excluir que los resultados del análisis así obtenidos reflejen propiedades aparentes que las células cancerosas diseminadas no presentan en el líquido corporal antes de su aislamiento. Sin embargo, esto sería deseable. Además existe el inconveniente de que los anticuerpos adheridos no se pueden eliminar, o sólo con efectos desfavorables sobre la célula.
Si los anticuerpos se dirigen a componentes intracelulares, se requiere incluso la fijación y perforación de la célula, cuya consecuencia es su muerte. En estas circunstancias, los denominados bioensayos, que trabajan con células vivas y, en especial, capaces de multiplicarse, resultan muy complicados o incluso imposibles. Otro inconveniente de la purificación mediante anticuerpos reside en la reactividad cruzada de determinados epítopos, de manera que también se pueden aislar conjuntamente células "normales". Además, por la formación de agrupaciones con componentes de la sangre, por ejemplo con plaquetas, fibrina y similares, se pueden ocultar, al menos en parte, epítopos importantes para la técnica de aislamiento.
Los requisitos que debe cumplir un procedimiento para el aislamiento de células cancerosas en el marco de la identificación y caracterización de células cancerosas diseminadas son elevados. Además del alto rendimiento y pureza que se exigen habitualmente para el producto del procedimiento, en el presente caso es sobre todo la autenticidad de las células cancerosas aisladas la que determina la utilidad de un procedimiento de aislamiento de este tipo. Las células cancerosas deben poderse aislar del líquido corporal de forma lo más inalterada posible, es decir, sin implicar constructos condicionados por la técnica de aislamiento, tales como perlas de vidrio. Deben poderse cultivar ex vivo y reflejar en los bioensayos una imagen fiable de su estado original en el líquido corporal.
Un procedimiento que cumple estos requisitos aprovecha las ventajas decisivas que se obtienen de la identificación y, sobre todo, de la caracterización de las células cancerosas procedentes de líquidos corporales. Si se comparan las células procedentes de tejido de un tumor primario con las células tumorales diseminadas correspondientes, las células tumorales diseminadas generalmente presentan características genéticas y fisiológicas que difieren de las del tumor primario, por ejemplo pueden generarse a partir de éstas por selección clonal. Estas características proporcionan informaciones importantes, dado el caso, adicionales, para el diagnóstico, el pronóstico, la predicción y otras cuestiones oncológicas.
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El objetivo de la presente invención era, por lo tanto, proporcionar un procedimiento suave para el aislamiento de células cancerosas a partir de líquidos corporales que contienen células que no influyera en el estado de estas células cancerosas, o sólo de forma insignificante.
Sorprendentemente se ha descubierto que se logra aislar células cancerosas a partir de líquidos corporales que contienen células mediante un proceso de separación dependiente del tamaño y/o de la forma.
El objeto de la presente invención es, por lo tanto, un procedimiento para el aislamiento de células cancerosas a partir de líquidos corporales que contienen células, que se caracteriza porque se hace pasar el líquido corporal que contiene células o partes de él a través de un tamiz con una abertura de malla o de poro de aproximadamente 15 a
30 \mum o a través de un tamiz con una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 15 a 30 \mum y se obtiene la fracción celular retenida.
Por aislamiento se entiende de acuerdo con la invención cualquier enriquecimiento de un componente que se ha de aislar a partir de una mezcla que contiene este componente además de al menos otro componente. Así pues, el resultado del aislamiento puede ser perfectamente otra mezcla que, sin embargo, en comparación con la mezcla original contiene el componente que se ha de aislar en una concentración mayor en relación con al menos otro componente.
La expresión célula cancerosa se refiere de acuerdo con la invención a una célula que presenta una o varias modificaciones relacionadas con cáncer, es decir, con degeneración en el sentido general. Esta definición se basa en la idea de que en el caso de la aparición del cáncer se trata de un proceso de alteraciones continuas. Por ejemplo, generalmente se precisa de varias alteraciones, especialmente del material genético y/o de la expresión del material genético de las células, en el camino de una célula normal a una célula cancerosa y, en especial, tumoral. La expresión célula cancerosa comprende por tanto también los precursores de las células cancerosas y, en especial, tumorales con modificaciones cancerosas y/o tumorales. Las células tumorales diseminadas, es decir, las células que se han desprendido del tumor primario y circulan en los líquidos corporales, no se consideran un tumor real en el sentido médico, pero constituyen células cancerosas en el sentido de la invención. De acuerdo con la invención, las células tumorales diseminadas también incluyen células tumorales micrometastatizadas y metastatizantes, siempre que éstas se encuentren en un líquido corporal de acuerdo con la invención.
Por tamiz se entiende de acuerdo con la invención un material que permite realizar un proceso de separación dependiente del tamaño y/o de la forma, es decir, basado en el tamaño celular, la deformabilidad, la formación de agregados o de agrupaciones. En relación con el aislamiento de células cancerosas se entiende por tamiz un medio de separación con el que se pueden separar células cancerosas de células no cancerosas. El proceso de tamizado conduce a una división espacial entre células cancerosas y células no cancerosas; a la formación de al menos dos fracciones celulares; a la asignación preferida de células cancerosas a al menos una fracción celular y a la asignación preferida de células no cancerosas a al menos otra fracción celular; dado el caso a la asignación esencialmente exclusiva de células cancerosas a al menos una fracción celular.
En general, en el residuo de tamizado se encuentran, dependiendo del contenido de células cancerosas presentes en el líquido corporal, hasta 100 células cancerosas por ml de líquido corporal. En comparación con las células no cancerosas presentes en el líquido corporal (en el caso de la sangre especialmente las células mononucleares) se logran en general factores de enriquecimiento de 10^{5} y superiores, preferentemente de al menos 5 x 10^{5}, más preferentemente de al menos 10^{6} y en especial de al menos 5 x 10^{6}. Estos factores se pueden incrementar, dado el caso, mediante procesos de separación adicionales previos y/o posteriores al proceso de tamizado. Así, en la separación de la fracción MNC, que habitualmente es la primera que se efectúa en la sangre, por ejemplo por centrifugación en gradiente de densidad, se alcanzan factores de enriquecimiento de aproximadamente 10^{2}.
Dependiendo del uso posterior de las células cancerosas, los requisitos que debe cumplir la relación entre células cancerosas y células no cancerosas pueden ser diferentes. Los procedimientos de análisis sensibles, tales como la analítica de p53, requieren, por ejemplo, una relación de al menos una célula cancerosa por 1.000 células no cancerosas, mientras que los procedimientos de análisis menos sensibles, tales como la analítica de la pérdida de heterocigosidad, requieren una relación de al menos 1:1.
De acuerdo con la invención se puede elegir un tamiz que justo deja pasar las células no cancerosas del líquido corporal que contiene células. Igualmente adecuado es un tamiz que deja pasar también partículas mayores que las células no cancerosas pero retiene las células cancerosas o al menos una parte de las células cancerosas. Considerando un proceso de separación dependiente del tamaño y/o de la forma se puede optimizar la elección del tamiz, especialmente en función del líquido corporal usado.
En el caso del tamiz generalmente se trata de una estructura laminar con aberturas que también se denominan mallas. Además de los materiales laminares, también son adecuados los elementos porosos, por ejemplo filtros, o los materiales membranosos. La condición previa es, sin embargo, que el tamaño de poro esté bien definido.
Los tamaños de las aberturas de un tamiz se encuentran en general dentro de un determinado intervalo. La indicación de un límite inferior y uno superior no significa que en el tamiz tengan que estar presentes también aberturas con exactamente estos valores límite. Pero una indicación de este tipo sí significa que en el tamiz no están presentes aberturas cuyo tamaño supera o no alcanza estos valores. Preferentemente, los tamaños de las aberturas de un tamiz se encuentran dentro de un intervalo estrechamente definido. En el caso ideal son esencialmente uniformes. Los tamaños de las aberturas de un tamiz se denominan en lo sucesivo abertura de malla o tamaño de poro/abertura de poro.
Un tamiz que se puede usar de acuerdo con la invención presenta en general una abertura de malla o una abertura de poro de 15, en especial de 17 a 30 \mum y con especial preferencia de aproximadamente 20 \mum. Se incluyen tanto tamices cuya abertura de malla o de poro presenta una cierta distribución dentro de los intervalos antes mencionados como también tamices con una abertura de malla o de poro esencialmente uniforme cuyo valor se encuentra dentro de los intervalos antes mencionados.
Los tamices con una abertura de malla o de poro uniforme pueden dar información sobre la capacidad de retención absoluta, es decir, sobre el tamaño de las partículas que todavía pueden pasar. Por el contrario, los tamices con una abertura de poro o de malla irregular permiten únicamente indicar la capacidad de retención nominal, según la cual se retiene el 98% de todas las partículas que son mayores que esta capacidad de retención nominal.
Los tamices que se pueden usar de acuerdo con la invención presentan en general una capacidad de retención absoluta o nominal de 15, en especial de 17 a 30 \mum y en especial de aproximadamente 20 \mum.
La elección del material para los tamices de acuerdo con la invención, que comprenden tanto estructuras laminares, tales como tamices de filtración o filtros de membrana, como elementos porosos, tales como filtros de lecho profundo, tiene una importancia secundaria. Son de mencionar sobre todo materiales formadores de fibras, en especial polímeros orgánicos o fibras inorgánicas, y formadores de matrices microporosas de origen orgánico o inorgánico. Se pueden usar, por ejemplo, resinas, geles, gránulos, materiales sinterizables, vidrios, cerámicas, tamices moleculares, por ejemplo zeolitas, etc. Los polímeros orgánicos pueden ser de origen natural, es decir, animal o vegetal, semisintéticos o completamente sintéticos. Son de mencionar a modo de ejemplo estructuras que contienen queratina, pelo, por ejemplo pelo de camello, lana, angora, seda, estructuras que contienen celulosa, algodón, lino, cáñamo, yute, etc. Cabe mencionar los polímeros semisintéticos basados en celulosa, por ejemplo ésteres de celulosa, en especial acetato de celulosa y nitrocelulosa, así como ésteres de celulosa mixtos. Entre los polímeros completamente sintéticos útiles se encuentran poliolefinas, tales como polietileno (PE), polipropileno (PP), ciclopoliolefinas, poliamidas tales como nilón (GRILON, GRILAMID), nilón 6, nilón 6,6, nilón 11, nilón 12, copoliamidas (GRILON C), aramidas, poli(p-fenilenteraftalamida) (KEVLAR), poliésteres tales como poli(teraftalato de alquileno), en especial poli(teraftalato de etileno) (PETP), polímeros acrílicos tales como poliacrilonitrilo (DRALON) y acrilatos, polímeros vinílicos tales como poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(alcoholes vinílicos), polieterésteres tales como polieteretercetona (PEEK), poliuretanos, epóxidos, polímeros fluorocarbonados tales como poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), poli(tetrafluoroetileno) (PTFE, TEFLON), copolímero de polihexafluoroetilenpropileno (FEP), copolímero de polietilentetrafluoroetileno (ETFE, AFLON), copolímero de polietilenclorotrifluoroetileno (ECTFE, HALAR), policarbonatos tales como PCTE, poli(sulfuros de fenileno) (PPS), polietersulfonas, etc. Como formadores de fibras inorgánicos son de mencionar a modo de ejemplo vidrios, en particular borosilicatos y dióxido de silicio, silicio, metales, cerámicas, carbono y asbesto. También se pueden usar mezclas de los materiales antes mencionados. En caso necesario, los materiales, especialmente las fibras compuestas por ellos, pueden estar modificados, por ejemplo metalizados, hidrofugados, hidrofilizados, por ejemplo con polivinilpirrolidona, dotados de estructuras de refuerzo, reticulados o rodeados de aglutinantes, por ejemplo acrilatos o resinas de melamina.
Para determinadas formas de realización de la invención resultan ventajosos los tamices formados por un material resistente a disolventes. Se prefieren plásticos resistentes a disolventes, tales como polipropileno, politetrafluoroetileno, polímeros altamente fluorados, fluoruro de vinilideno, aminoplásticos, en especial polietileno. En principio también son adecuados metales, vidrios y otros materiales minerales, así como determinadas fibras naturales.
La fabricación de este tipo de tamices se encuentra en el campo del saber hacer del experto, por ejemplo se pueden usar procedimientos de tejer, procedimientos por corrosivo, tanto en seco como al agua fuerte, la estructuración láser, por ejemplo la técnica basada en máscaras RMPD, procedimientos fotolitográficos, LIGA, etc.
Los materiales formadores de fibras pueden presentar diferentes estructuras fibrosas. Son de mencionar a modo de ejemplo formas superficiales lisas, angulosas, onduladas, deshilachadas, fibrosas y similares; formas de la sección transversal circulares, elípticas, osiformes, dentadas, lobulares y similares; formas axiales (textura) rectas, curvadas, helicoidales y similares; en el caso de más de un componente, diferentes distribuciones de las secciones transversales, por ejemplo en las fibras de dos componentes, disposición de los dos componentes uno al lado del otro, como envoltura, recubrimiento, de tipo núcleo-capa o disposiciones de varios núcleos ("islas en el mar").
Preferentemente se trata de tejido formado por hilos, fibras, filamentos o haces de ellos con aberturas de las más diversas geometrías. Se pueden usar fibras mono- y/o multifilamentosas. Las estructuras tejidas posibles se conocen no en último lugar del campo textil. Son ventajosas las estructuras tejidas en las que la parte porcentual del área abierta (área total de todas las aberturas) permita realizar sin problemas un proceso de tamizado. Generalmente se prefieren las estructuras 1:1 y 1:2. También para la superficie de los hilos, las fibras, los filamentos o los haces se consideran diferentes realizaciones. Así, la superficie puede ser regular o irregular, por ejemplo lisa, angulosa, ondulada, deshilachada o peluda. Asimismo son adecuadas las placas perforadas, en las que igualmente son posibles aberturas de las más diversas geometrías y disposiciones.
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El tamiz puede constar de una o varias capas. Para determinadas formas de realización de acuerdo con la invención se prefieren los tamices de una sola capa. También se pueden disponer varios tamices, dado el caso diferentes, uno detrás de otro.
Convenientemente, el tamiz está dispuesto en un dispositivo que permite hacer pasar el líquido que contiene células a través del tamiz y recoger el material que atraviesa el tamiz. El tamiz también debe poderse retirar de este dispositivo para poderlo conducir, junto con el residuo de tamizado, a los pasos de procedimiento posteriores. En caso necesario, también pueden estar previstos medios para la aplicación de presión o presión reducida para facilitar el proceso de tamizado. Si antes del proceso de tamizado se realiza un procesamiento preparativo del líquido corporal que contiene células, puede resultar conveniente acoplar los dispositivos y medios para la realización del proceso de tamizado a dispositivos y medios para la realización del procesamiento, realizándose el proceso de tamizado después del procesamiento. El experto puede prever además medidas adicionales para cumplir los requisitos exigidos habitualmente en el campo de la bioquímica y la biología molecular, tales como la temperatura y la esterilidad.
El procedimiento de acuerdo con la invención se puede aplicar a todos aquellos líquidos corporales que contienen células que presenten células cancerosas y, en especial, células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas. Estos son tanto líquidos corporales nativos que se extraen del cuerpo o que son excretados por éste, como también líquidos no nativos, especialmente líquidos de lavado que contienen células del cuerpo y, en especial, de determinadas partes del cuerpo y órganos. Por ejemplo, el líquido primero se puede introducir en el cuerpo de manera adecuada y después se puede volver a extraer. También se pueden añadir líquidos no nativos a nativos. Son de mencionar a modo de ejemplo linfa, orina, esputo, líquido amniótico, muestras obtenidas por punción, líquidos de lavado de órganos, por ejemplo lavados de colon, pulmón, bronquios o líquido de lavado de la vejiga, heces y, en especial, médula ósea y sangre. Se puede tratar de líquidos corporales de diferentes especies, por ejemplo de mamíferos, en especial de seres humanos, animales de laboratorio y de experimentación, tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, etc. Este tipo de líquidos corporales se pueden conducir directamente al proceso de tamizado. No obstante, en muchos casos resulta ventajoso someter el líquido corporal que contiene células primero a un procesamiento preparativo. Así, por ejemplo, se pueden separar componentes celulares de no celulares. Dado el caso, también los componentes celulares se pueden separar adicionalmente, aislando, por ejemplo, una fracción que contiene células en la que se sabe están contenidas también células cancerosas. Con este fin se ofrecen sobre todo los procedimientos de separación físicos descritos al principio, tales como la centrifugación en gradiente de densidad.
Si se aíslan células cancerosas de la sangre, se prefiere de acuerdo con la invención separar primero las células del cuadro sanguíneo blanco mediante centrifugación en gradiente de densidad. Las células cancerosas se encuentran sobre todo en la fracción que también contiene las células mononucleares, de manera que esta fracción se conduce preferentemente al proceso de tamizado siguiente.
Asimismo es posible modificar las células cancerosas en la suspensión celular antes del proceso de tamizado, por ejemplo marcarlas, adherir partículas, provocar una agregación y/o formación de agrupaciones, por ejemplo mediante anticuerpos, enzimas, lecitinas, otros ligandos y/o receptores adecuados o reactivos entrelazantes, fijarlas e inducir otros estados definidos.
Para que puedan ser conducidos al proceso de tamizado, las fracciones que contienen células aisladas previamente de un líquido corporal (aislados) deben estar presentes en una suspensión. Como medio de suspensión se elige ventajosamente un tampón o un medio de cultivo. El medio de suspensión debería afectar lo menos posible a las propiedades que interesan de las células.
Antes de hacer pasar el líquido corporal que contiene células o los aislados de él a través de un tamiz, resulta ventajoso para la valoración posterior extraer alícuotas del líquido que contiene células. Este tipo de muestras pueden servir de magnitud de referencia para los valores medidos hallados en el residuo de tamizado y en el material que ha atravesado el filtro. Esto permite realizar un ajuste frente a células no cancerosas, por ejemplo linfocitos aislados en forma de células CD45-positivas como control interno propio del paciente, de modo que los análisis de las células cancerosas aisladas se pueden realizar con especial sensibilidad.
El proceso de tamizado ha concluido cuando todo el líquido que contiene células haya atravesado el tamiz. Puede seguir un proceso de lavado en el que se hace pasar líquido adicional, preferentemente tampón o medio de cultivo, a través del tamiz. El líquido de lavado puede añadirse al material antes obtenido que ha atravesado el tamiz o también recogerse por separado y, dado el caso, desecharse.
La fracción celular retenida en el tamiz se puede conducir directamente al uso posterior, por ejemplo a la caracterización de las células, en especial de las células cancerosas, o al almacenamiento. Ventajosamente, sin embargo, las células, especialmente las células cancerosas, se separan primero del tamiz. Con este fin se pueden elegir diferentes modos de proceder, dependiendo del tipo de uso posterior.
Una posibilidad reside en lavar las células retenidas en el tamiz, especialmente las células cancerosas, haciendo pasar un líquido adecuado en sentido opuesto a través del tamiz y obteniendo el líquido de lavado que contiene células. Si se desea, las células desprendidas se pueden sedimentar después en la suspensión de células.
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También es posible desprender las células adheridas al tamiz, especialmente las células cancerosas, aplicando una fuerza. Se pueden usar la fuerza de la gravedad, la fuerza centrífuga y fuerzas eléctricas. Para el experto son habituales para este propósito la sedimentación, la centrifugación, la electroforesis, la dielectroforesis, el uso de una denominada pinza óptica, la electroósmosis y procedimientos similares. Esto se logra, por ejemplo, introduciendo el tamiz en un medio adecuado, generalmente un líquido, de tal manera que las células se puedan sedimentar por centrifugación. De esta forma las células pueden pasar directamente a un medio adecuado para el uso siguiente.
Otra posibilidad adicional, que también conduce al desprendimiento de las células del tamiz, especialmente de las células cancerosas, pero en el que estas células al mismo tiempo se destruyen, consiste en someter el tamiz junto con las células adheridas a los procedimientos que sirven para la obtención de componentes celulares, por ejemplo ácidos nucleicos y proteínas. Si este tipo de medidas requiere el uso de disolventes orgánicos, por ejemplo si se usan las soluciones que contienen isotiocianato de guanidina y fenol, usadas con frecuencia en este campo para el aislamiento de ARN total, ADN y proteínas, se prefieren tamices compuestos por materiales resistentes a disolventes.
El procedimiento de acuerdo con la invención da lugar al aislamiento de células cancerosas a partir de líquidos corporales que contienen células. Por aislamiento de células cancerosas en el sentido de acuerdo con la invención se entiende la preparación de mezclas de células que contienen células cancerosas a partir de líquidos corporales, en el que la relación entre células cancerosas y células no cancerosas es mayor en las mezclas de células preparadas que en los líquidos corporales que contienen células originales. Así pues, aislamiento significa el enriquecimiento de células cancerosas en fracciones que contienen células de líquidos corporales. Se preparan y obtienen fracciones que contienen células con una proporción aumentada de células cancerosas.
En el caso de las fracciones que contienen células se trata preferentemente de mezclas de células con una proporción de células cancerosas de al menos el 50%, más preferentemente de al menos el 80% y en especial de al menos el 90%.
En el sentido de la invención, "aislamiento" también significa la obtención de células cancerosas que esencialmente carecen de células no cancerosas. Éstas se pueden obtener en forma de mezclas de células cancerosas que generalmente son policlonales pero que también pueden presentar perfectamente características comunes. No obstante, también se pueden obtener fracciones de estas mezclas de células cancerosas y también células individuales que presentan características comunes (adicionales) y/o, dado el caso, incluso son monoclonales. Esto requiere en ciertas circunstancias una subtipificación de las células cancerosas aisladas, es decir, enriquecidas, de acuerdo con la invención a partir de líquidos corporales que contienen células, mediante parámetros de estratificación (por ejemplo inmunológicos) y/o una purificación adicional. Son de mencionar a modo de ejemplo la microdisección láser, la micromanipulación, la dielectroforesis, la electroósmosis, la pinza óptica, el FACS y similares después de un direccionamiento específico.
En el sentido de la invención, "aislamiento" también significa la separación de células cancerosas de preparados que contienen células, en especial de líquidos corporales o de partes de ellos, es decir, la reducción de la proporción de células cancerosas en los preparados que contienen células, por ejemplo de la sangre o componentes de la sangre, preferentemente extracorpóreos, de preparados de células madre o de otros preparados para reinfusión, transfusión y trasplante.
Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la invención también se puede usar para la extracción, dado el caso completa, de células cancerosas contaminantes de mezclas de células, es decir, de preparados que contienen células, en especial de líquidos corporales o de aislados de ellos (depleción).
Por lo tanto, el objeto de la presente invención son también procedimientos para la extracción, en especial para la eliminación extracorpórea, de células cancerosas, en especial de células tumorales, de preparados que contienen células, en especial de líquidos corporales o partes de ellos, y también procedimientos para la depleción de preparados de células madre o de otros preparados para reinfusión y/o transfusión para la reducción del contenido en células cancerosas. El propósito de estos procedimientos es, en particular, prevenir las recidivas. Pues las células tumorales diseminadas presentes en líquidos corporales y otros preparados celulares constituyen un factor de riesgo considerable para el desarrollo de recidivas y/o metástasis. La concentración y la composición de las células, además de su disposición genética, influyen en la probabilidad de que se desarrollen metástasis. La disminución de la concentración de células cancerosas, en especial de células tumorales diseminadas, en estos líquidos corporales mediante un procedimiento con el que éstas se eliminan de forma extracorpórea reduce la probabilidad de una recidiva. Por ejemplo, muchos pacientes con tumores reciben tras la radiación y/o quimioterapia aislados celulares autólogos. Estas células, por ejemplo productos de aféresis, células madre aisladas y similares, se pueden separar de manera suave de células cancerosas. De este modo se puede reducir el riesgo de una recidiva por células cancerosas contaminantes.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso del procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal no humano con la finalidad terapéutica de prevenir las recidivas.
La presente invención también se refiere al residuo de tamizado obtenido de acuerdo con la invención, así como a las fracciones derivadas de él, en caso necesario mediante el uso de otras medidas conocidas en sí, en especial a mezclas de células, mezclas de células cancerosas, clones de células cancerosas y/o componentes de células cancerosas. También son objeto, pues, mezclas de células, mezclas de células cancerosas, clones de células cancerosas, líneas celulares establecidas a partir de ellos y/o componentes de células cancerosas, denominados en conjunto material celular canceroso, que se pueden obtener a partir de líquidos corporales con uno de los procedimientos antes descritos.
Las mezclas de células derivadas de líquidos corporales presentan una proporción de células cancerosas de al menos el 50%, preferentemente de al menos el 80% y en especial de al menos el 90%. En el caso de la proporción restante correspondiente se puede tratar de células no cancerosas procedentes del líquido corporal en cuestión.
Se prefieren especialmente las mezclas de células cancerosas derivadas de líquidos corporales que sólo presentan cantidades pequeñas de células no cancerosas, preferentemente ningunas. Estas mezclas generalmente son policlonales. Aunque policlonales, pueden ser homogéneas respecto a al menos una característica, por ejemplo respecto a una disposición genómica determinada o a un parámetro de expresión. Se prefieren las mezclas de células cancerosas que son esencialmente homogéneas en cuanto a al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 ó 15 parámetros que se han de determinar analíticamente. Entre estas determinaciones se encuentran los análisis de detección de cáncer, análisis relevantes desde el punto de vista de la biología de los tumores para la medición de parámetros citofisiológicos, análisis de parámetros farmacológicamente relevantes, bioensayos, análisis citológicos y procedimientos similares, los cuales se explicarán con más detalle a continuación.
Se prefieren especialmente los clones de células cancerosas, es decir, células cancerosas aisladas, o líneas celulares cancerosas monoclonales.
A partir de las mezclas de células, las mezclas de células cancerosas y los clones de células cancerosas antes descritos, sobre todo de las mezclas de células cancerosas y, en especial, los clones de células cancerosas, se pueden establecer líneas celulares. Se puede tratar de líneas celulares tanto de corto plazo como de largo plazo. Estas líneas celulares se pueden establecer de forma profesional; el experto en la materia conoce la metodología adecuada, por ejemplo en cuanto a la selección del medio de cultivo o de las condiciones de cultivo, así como respecto al almacenamiento y/o la conservación. Dado el caso se pueden aprovechar los conocimientos adquiridos sobre las líneas celulares cancerosas ya establecidas, tales como HeLa.
Entre los componentes celulares que derivan de los preparados que contienen células antes descritos se cuentan, por ejemplo, los lisados de células y las fracciones de ellos, es decir, determinados componentes celulares, tales como ácidos nucleicos, proteínas, etc., que se aíslan de manera profesional a partir de los preparados que contienen células obtenidos previamente.
De acuerdo con la invención se logra proporcionar a partir de líquidos corporales células cancerosas aisladas que están exentas del medio de separación usado. Por lo tanto, carecen especialmente de los ligandos usados convencionalmente con fines de aislamiento, tales como anticuerpos, lectinas, etc. Las células cancerosas de acuerdo con la invención se encuentran, por lo tanto, en un estado biológico y no en un estado artificial, como el que se origina habitualmente durante su aislamiento, por ejemplo por fijación y/o marcaje. Un estado biológico en el sentido de la invención es, por tanto, un estado que la célula en cuestión puede adoptar, especialmente respecto a la fisiología, la morfología y/o el perfil de expresión, en un líquido corporal de un individuo humano o animal no humano. Para la descripción de este estado biológico son importantes sobre todo los parámetros relacionados con el ciclo celular, la activación, la proliferación, la apoptosis y similares. Éstos esencialmente no se alteran por el proceso de aislamiento de acuerdo con la invención. Un estado biológico puede estar caracterizado por una o varias de las propiedades siguientes mencionadas a modo de ejemplo: vital, capaz de dividirse, proliferativo, cultivable, preapoptótico, muerto, aislado, agregado, formador de agrupaciones, etc.
Por lo tanto, el objeto de la presente invención son también células cancerosas, especialmente células tumorales diseminadas, aisladas de líquidos corporales e incluidas igualmente bajo la expresión de acuerdo con la invención de material celular canceroso, cuyo estado es biológico, preferentemente vital, dado el caso en mezcla con células no cancerosas, así como líneas celulares establecidas a partir de ellas. Aislado significa en este contexto que la relación entre células cancerosas y células no cancerosas es mayor que en el líquido corporal original. Se prefiere una proporción de células cancerosas de al menos el 50%, preferentemente de al menos al 80% y en especial de al menos el 90%. Se prefieren muy especialmente células cancerosas esencialmente puras que, en una configuración ventajosa, presentan las características de las mezclas de células cancerosas, los clones de células cancerosas y las líneas celulares establecidas a partir de ellos descritos anteriormente.
Un aspecto especial de la presente invención lo constituyen las células cancerosas de acuerdo con la invención que se caracterizan por una combinación de parámetros (patrones) determinada desde los puntos de vista cuantitativo y/o cualitativo. Los parámetros que forman los patrones se refieren sobre todo a disposiciones genómicas y/o perfiles de expresión. Por ejemplo, se obtienen células cancerosas especiales en relación con las combinaciones de determinados genes dadas a conocer en el documento WO 99/10528 para la realización de análisis de expresión multiparamétricos, así como de análisis genómicos respecto a la presencia de oncogenes y/o genes supresores de tumores mutados. Son de mencionar, por ejemplo, células cancerosas que expresan CEA y CK20, dado el caso en combinación con variantes de empalme específicas de tumores del gen MUC1; o MAGE3 y tirosinasa, dado el caso en combinación con Muc18; y/o células cancerosas con al menos dos de las disposiciones genómicas seleccionadas entre mutaciones de p53 y/o pérdidas de heterocigosidad, amplificaciones de erb-B2, amplificaciones de c-myc y mutaciones de K-ras, dado el caso en combinación con pérdidas de heterocigosidad de los genes RB, APC, DCC y/o DPC4; y/o células cancerosas que expresan maspina y/o el receptor de progesterona, dado el caso en combinación con \betahCG, el receptor de estrógenos y/o SC-CA; PSM y/o PSA, dado el caso en combinación con hK2; gastrina, dado el caso en combinación con GIP y/o motilina; o SP-A y SP-C, dado el caso en combinación con \beta-hCG; y/o bFGF, bFGF-R, VEGF-R1 y/o VEGF-R2, dado el caso en combinación con VEGF; MMP, en especial MMP2; y/o que expresan TIMP, en especial TIMP3; y/o que expresan FAS-L y FAS-R, dado el caso ciclinas, en especial ciclina B, D y E en relaciones específicas del ciclo celular, Ki67, bax y/o bcl-2. Una expresión puede significar una expresión cualitativa y también una expresión cuantitativamente aumentada o disminuida en comparación con las células no cancerosas. Los patrones antes descritos también pueden caracterizar a las líneas celulares establecidas a partir de las células cancerosas y a componentes celulares derivados.
Naturalmente se pueden efectuar en las células cancerosas aisladas intervenciones selectivas que transforman el estado biológico en un estado artificial, por ejemplo fijarlas, marcarlas, por ejemplo con radiactividad, con marcas PET, sondas de RMN, etc., o inducir otro estado que también puede corresponder perfectamente a un estado biológico.
La presente invención también se refiere, por lo tanto, a células cancerosas, en especial células tumorales diseminadas, aisladas de líquidos corporales e incluidas igualmente bajo la expresión de acuerdo con la invención de material celular canceroso, cuyo estado es un estado artificial inducido a partir de un estado biológico después del aislamiento, dado el caso en mezcla con células no cancerosas, así como líneas celulares establecidas a partir de ellas. Las configuraciones preferidas de este objeto resultan en analogía a las configuraciones antes descritas de las células cancerosas de acuerdo con la invención en estado biológico.
También los componentes celulares de las células cancerosas de acuerdo con la invención, por ejemplo los lisados y fracciones de ellos, se distinguen en su estructura y/o composición en el sentido de que derivan de los componentes celulares de acuerdo con la invención.
El objeto de la presente invención son también, por lo tanto, componentes celulares (incluidos igualmente bajo la expresión de acuerdo con la invención de material celular canceroso) que derivan de las células cancerosas de acuerdo con la invención en estado biológico o artificial inducido. Estos componentes celulares se pueden preparar de manera conocida en sí a partir de las células correspondientes.
El material celular canceroso de acuerdo con la invención puede estar depositado en forma de bancos de materiales, por ejemplo bancos de células o depósitos biológicos. El experto será capaz de almacenarlo convenientemente, considerando el material que se ha de almacenar. Para el material vivo y/o sensible es especialmente adecuada la crioconservación, por ejemplo bajo nitrógeno. En esta forma, el material celular canceroso puede estar preparado para la explotación industrial respecto a usos posteriores. Los componentes celulares, en cambio, se pueden tratar en determinadas circunstancias como un agente químico (dependiendo de la sensibilidad también a temperaturas aumentadas, dado el caso bajo refrigeración con hielo seco o hielo o incluso a temperatura ambiente en un envase conveniente).
Otro objeto de la presente invención son agentes, por ejemplo agentes farmacéuticos o veterinarios, para el tratamiento diagnóstico y/o terapéutico de seres humanos o seres animales no humanos, que, además de otros componentes convenientes que ha de elegir el experto, en particular coadyuvantes de formulación para la administración, principios activos adicionales y/o componentes de una prueba diagnóstica, contienen el material celular canceroso de acuerdo con la invención. Estos agentes comprenden así células cancerosas aisladas a partir de líquidos corporales, en especial células tumorales diseminadas, cuyo estado es biológico o un estado artificial inducido después del aislamiento, y/o componentes celulares derivados de ellas. A modo de ejemplo son de mencionar aquí aplicaciones tales como la formulación de vacunas autólogas o heterólogas en el ámbito terapéutico o el establecimiento de controles en sistemas de ensayo diagnósticos.
El objeto de la presente invención es también el uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención como agente terapéutico, es decir, para la preparación de agentes farmacéuticos y/o veterinarios para el tratamiento. El material celular canceroso de acuerdo con la invención también se puede usar como diana en los campos de diagnóstico, terapéutico, de experimentación con animales o científico.
Así, el material celular canceroso de acuerdo con la invención se puede usar para caracterizar determinados patrones, en especial disposiciones genómicas y/o perfiles de expresión. Dependiendo del cuadro clínico subyacente, en especial del tipo y curso de una carcinomatosis, dado el caso considerando las medidas terapéuticas ya efectuadas, se pueden proporcionar instrucciones de actuación útiles para procedimientos diagnósticos y/o terapéuticos con el objetivo de un éxito determinado.
El uso como agente terapéutico se refiere en especial a células cancerosas vitales, y con especial preferencia a la elaboración de vacunas. Además de la inmunización heteróloga igualmente posible, este caso implica en especial la inmunización autóloga. Con este fin, el material celular canceroso de acuerdo con la invención se procesa, dado el caso, de manera adecuada, de modo que tras la inyección en forma de una formulación tolerable se generen anticuerpos y/o células inmunorreactivas contra la superficie de las células o contra componentes celulares. Es de mencionar también el uso como vehículo farmacéutico, es decir, como medio de transporte in vivo específico para, en especial, sustancias de efecto terapéutico. En el marco de un uso terapéutico adicional, el material celular canceroso extraído primero se modifica (son de mencionar, por ejemplo, los procedimientos que se conocen bajo las expresiones de moda microinyección, transferencia génica, antisentido, "knock out", etc.) y después se vuelve a introducir en el individuo que se ha de tratar, por ejemplo por reinfusión.
El material celular canceroso de acuerdo con la invención puede usarse como diana en los campos de diagnóstico, terapéutico, de experimentación con animales y científico.
El uso en el campo del diagnóstico se refiere en especial a la caracterización de células cancerosas procedentes de líquidos corporales. La caracterización incluye tanto la identificación y detección de las células cancerosas como tales, como también la determinación de uno o varios parámetros en estas células cancerosas. Respecto a los individuos humanos o animales no humanos, este uso se refiere especialmente al procedimiento descrito en el documento WO 99/10528 para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas mediante ADN y/o ARN.
El objeto de la presente invención es por tanto también un procedimiento para la caracterización de células cancerosas diseminadas y micrometastatizadas y/o metastatizantes mediante ADN y/o ARN, en el que se analizan células cancerosas separadas a partir del líquido corporal de un individuo respecto a la presencia de al menos un gen específico de cáncer mediante el procedimiento de acuerdo con la invención y con la ayuda de ADN y/o ARN y se realiza el mismo análisis con células no cancerosas del mismo individuo como comparación y, dado el caso, también se analizan células obtenidas de manera convencional a partir del líquido corporal de un individuo, generalmente fracciones que contienen células del líquido corporal correspondiente, respecto a la presencia de al menos un gen específico de cáncer con la ayuda de ARNm. Configuraciones y realizaciones especiales de este procedimiento resultan en relación con los procedimientos dados a conocer en las reivindicaciones 1 a 10 del documento WO 99/10528, especialmente considerando los genes mencionados en el glosario y otras combinaciones de determinados genes dadas a conocer en el documento WO 99/10528 para la realización de análisis de expresión multiparamétricos, así como análisis genómicos respecto a la presencia de oncogenes y/o genes supresores de tumores mutados.
Independientemente de y también adicionalmente a la caracterización mediante ADN y/o ARN se pueden analizar en el material celular canceroso de acuerdo con la invención también proteínas, azúcares, estructuras de glucosilación, ribozimas y similares para caracterizar células cancerosas diseminadas y micrometatastizadas y/o metastatizantes.
En particular, la identificación y caracterización de las células cancerosas aisladas comprende la realización de análisis de detección de cáncer, por ejemplo análisis de los ácidos nucleicos respecto a la presencia de mutaciones, inserciones, deleciones, pérdidas de heterocigosidad, amplificaciones, aberraciones en el juego de cromosomas y similares; análisis relevantes para la biología de los tumores para la medición de los más diversos parámetros citofisiológicos que, por ejemplo, están relacionados con la metastatización, el ciclo celular, la proliferación o la apoptosis de células cancerosas; análisis de parámetros relevantes farmacológicamente, en los que las células aisladas se cultivan in vitro en diferentes condiciones, por ejemplo con la adición de citostáticos, antagonistas y similares, de manera que puedan ensayarse diferentes formas terapéuticas in vitro y optimizarse individualmente para cada paciente; bioensayos en los que se pueden medir activaciones, inhibiciones u otras alteraciones de las células cancerosas aisladas mediante moléculas con actividad sobre células, tales como citocinas, quimocinas, hormonas, factores de crecimiento, ligandos, análogos químicos o biológicos, la capacidad de inducir apoptosis de las células cancerosas aisladas o su potencial apoptótico frente a otras células diana o también la sensibilidad de las células cancerosas aisladas para estimar la dosis individual para un paciente; análisis citológicos usando procedimientos conocidos, tales como los de la inmunohistoquímica, tinción de contraste, hibridación in situ con fluorescencia (u otra detección citológica) y procedimientos de tinción. Son de mencionar a modo de ejemplo los siguientes análisis:
- Análisis de ADN/ARN para la detección de cáncer que se refieren a oncogenes y/o genes supresores de tumores, tales como p53, genes de la familia ras, erb-B2, c-myc, mdm2, c-fos, DPC4, FAP, nm23, RET, WT1 y similares, pérdidas de heterocigosidad, por ejemplo respecto a p53, DCC, APC, Rb y similares, así como BRCA1 y BRCA2 en tumores hereditarios, inestabilidad de los microsatélites de MSH2, MLH1, WT1 y similares, ARN tumorales, tales como CEA, citoqueratinas, por ejemplo CK20, MUC1, MAGE3 Muc18, tirosinasa, PSA, PSM, BA46, Mage-1 y similares, o ARN morfogénicos, tales como maspina, HCG, GIP, motilina, hTG, SCCA-1, AR, ÖR, PR, diferentes hormonas y similares;
- Análisis de ARN y proteínas relevantes para la biología de los tumores que se refieren al perfil de metastatización, es decir, a la expresión de moléculas de angiogénesis, motilidad, adhesión y degradación de la matriz, tales como bFGF, bFGF-R, VEGF, VEGF-R, tales como VEGF-R1 o VEGF-R2, E-cadherina, integrinas, selectinas, MMP, TIMP, SF, SF-R y similares, al perfil del ciclo celular y/o de proliferación, tales como ciclinas (por ejemplo la relación de expresión de las ciclinas D, E y B), Ki67, P120, p21, PCNA y similares, o al perfil de apoptosis, tales como FAS (L+R), TNF (L+R), perforina, granzima B, BAX, bcl-2, caspasa 3 y similares.
La realización de este tipo de procedimientos en el marco de procedimientos de cribado, entre otros, es muy adecuada para la detección temprana de tumores y/o la localización de tumores. Asimismo se pueden mencionar aplicaciones específicas, por ejemplo la detección de un carcinoma determinado o de una mutación determinada, esta última, por ejemplo, en los cuidados posteriores, por ejemplo como control de la evolución, en especial respecto a una mutación en base a la cual se ha desarrollado el tumor. Estas aplicaciones específicas se pueden proporcionar ventajosamente en forma de sistemas de ensayo, dado el caso con instrucciones y componentes de ensayo adicionales, tales como cebadores, controles, etc., por ejemplo en forma de kits.
Otros usos en el campo del diagnóstico se refieren al control de calidad de los preparados que contienen células, por ejemplo a la detección de células tumorales en conservas de sangre, en la medicina de trasplantes para el control de preparados de células madre y demás trasplantes, dado el caso después de eliminar las células cancerosas, tanto en preparados autólogos como en preparados heterólogos, que en determinadas circunstancias también pueden contener células cancerosas aun cuando no se haya efectuado todavía la detección de una afección por un tumor sólido. En el campo forense se logra así la identificación del causante en el caso de infecciones tumorales mediadas por conservas de sangre u otros productos de trasplante.
El uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención en terapia se refiere en especial al desarrollo de tratamientos, la elección del tratamiento, el seguimiento del tratamiento y la valoración de resistencias al tratamiento eventualmente presentes.
En el marco del desarrollo de tratamientos es de mencionar, por ejemplo, el direccionamiento de fármacos, en especial el uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención en la identificación de nuevas dianas terapéuticas, la identificación de otro grupo objetivo para medicamentos dado el caso ya autorizados, en el que se valora especialmente la expresión de las dianas y/o los polimorfismos bajo la influencia de determinados agentes terapéuticos, como, por ejemplo, anticuerpos, ligandos y receptores, enzimas, inhibidores, agentes quimioterapéuticos, lectinas, lípidos, sustancias catalíticas, etc., se determinan los efectores, como, por ejemplo, los factores de transducción de señales, o los efectos, como, por ejemplo, la preapoptosis, apoptosis, anergia, otros efectos que afectan al ciclo celular, etc., o se analiza, por ejemplo, la presencia de alteraciones debidas a la selección clonal, dado el caso antes y/o después del tratamiento con determinados principios activos. El uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención se refiere asimismo en el marco del desarrollo de tratamientos a la comprobación de dianas terapéuticas mediante análisis ex vivo, por ejemplo en cultivos celulares y en modelos animales. En el marco del desarrollo de principios activos, el material celular canceroso de acuerdo con la invención se usa en el cribado de principios activos, por ejemplo para la identificación y caracterización de sustancias de referencia, por ejemplo vectores, moléculas antisentido, ribozimas, toxinas, agentes quimioterapéuticos, antihormonas, etc. En general, y sobre todo después de un cribado de alto rendimiento (HTS), se obtienen en el marco de los procesos de descubrimiento de fármacos varios aciertos o sustancias de referencia, y en el material celular canceroso de acuerdo con la invención se pueden limitar adicionalmente las sustancias que se han de seguir ex vivo, in vitro y/o in vivo, por ejemplo en un modelo animal. De este modo se puede establecer una relación con la situación actual del tumor.
En este contexto cabe mencionar especialmente el desarrollo de principios activos contra las estructuras superficiales de las células cancerosas. El experto conoce procedimientos con los que se pueden crear macromoléculas que se unen a determinadas estructuras y en los que la especificidad y afinidad mejoran continuamente mediante procesos autooptimizantes. Las propiedades de unión no deseadas se eliminan mediante procesos de selección. Mediante el uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención como portador de las estructuras deseadas se pueden desarrollar agentes terapéuticos específicos, tales como anticuerpos, aptámeros, etc.
Las células cancerosas de acuerdo con la invención también se usan en el cribado secundario. En general, la sustancias identificadas en el cribado primario todavía deben optimizarse, por ejemplo en cuanto a su fabricabilidad, los costes de síntesis, la estabilidad, las propiedades cinéticas, su comportamiento metabólico y similares. Un factor importante es el efecto óptimo sobre la diana terapéutica. Estos y otros procesos de optimización se pueden realizar ventajosamente mediante análisis ex vivo usando las células tumorales de acuerdo con la invención, puesto que éstas constituyen una de las dianas terapéuticas esenciales. Al usar estas células cancerosas también se puede tener en cuenta en el desarrollo de los principios activos el metabolismo específico de las células cancerosas, lo que es de gran importancia especialmente para el desarrollo de profármacos. Se desea una activación específica en o sobre la célula objetivo, por ejemplo bajo disociación de otros componentes de los conjugados de principios activos que sólo de este modo, por una actividad específica de las células cancerosas, se convierten en una forma eficaz. Otro campo de aplicación de las células cancerosas de acuerdo con la invención reside en el desarrollo y/o comprobación de vectores, por ejemplo para planteamientos de terapia génica, con los que se pueden introducir eficazmente ácidos nucleicos en las células cancerosas. Usando el material celular canceroso de acuerdo con la invención se pueden adaptar vectores a la estructura de la célula diana, en especial a su dotación genética, y se puede comprobar ex vivo la efectividad del proceso de introducción.
El material celular canceroso de acuerdo con la invención se usa asimismo en la determinación del índice terapéutico de un principio activo, comparando in vitro el efecto de un principio activo sobre células cancerosas y células no cancerosas. Por ejemplo, en el caso ideal, un tratamiento citostático debe actuar exclusivamente sobre las células cancerosas. Con esta aplicación se pueden reconocer posibles efectos secundarios.
De las explicaciones anteriores se deduce inmediatamente que el material celular canceroso de acuerdo con la invención también se puede usar para seleccionar un tratamiento adecuado para un caso concreto, que no sólo viene determinado por el tipo de cáncer sino que también depende del individuo correspondiente y del estadio de la enfermedad.
Las células cancerosas de acuerdo con la invención también se usan en el seguimiento del tratamiento, es decir, en la valoración dependiente del tiempo de una medida terapéutica. Esta aplicación es útil en el caso de un tumor sólido existente que puede haber sido diagnosticado o, en un animal, también trasplantado o inducido. También resulta posible transferir el material celular canceroso de acuerdo con la invención a un animal, como ratones, ratas y otros mamíferos, huevos de gallina y similares. Se pueden registrar cinéticas para el curso temporal de la concentración de células cancerosas en el líquido corporal analizado y del desarrollo de los parámetros seleccionados de las células cancerosas.
Mediante el uso del material celular canceroso de acuerdo con la invención se pueden reconocer además resistencias a tratamientos, dado el caso, presentes, por ejemplo, frente a agentes quimioterapéuticos y otros principios activos contra el cáncer. En este caso se ofrecen procedimientos de análisis y sistemas de ensayo tanto in vitro como ex vivo.
El material celular canceroso de acuerdo con la invención también se puede usar para establecer modelos de tumores altamente específicos, por ejemplo para inducir tumores selectivamente o valorar los efectos del material celular canceroso de acuerdo con la invención y su comportamiento en los organismos. Para ello se pueden introducir las células cancerosas, dado el caso en forma marcada, en animales de experimentación adecuados, por ejemplo por reinfusión.
El material celular canceroso de acuerdo con la invención se usa asimismo para el estudio de numerosas cuestiones científicas y prácticas, por ejemplo para la identificación y/o la caracterización de inductores de tumores y potenciadores de tumores, como, por ejemplo, virus, bacterias, parásitos intracelulares, sustancias alquilantes y otras sustancias mutagénicas, etc.; para proporcionar nuevas estructuras, por ejemplo para la identificación y el aislamiento de nuevos genes, productos génicos, proteínas, estructuras de glucosilación, etc., entre otras cosas con vistas a nuevas dianas terapéuticas y/o herramientas diagnósticas; para la inducción de "knock outs" y para análisis funcionales; para la identificación de determinados perfiles de expresión, por ejemplo de patrones de expresión génica alterados en función del estado biológico tumoral de una célula cancerosa, entre otras cosas con vistas a la metastatización, el desarrollo de resistencia antes, durante y/o después del tratamiento, o en comparación con células de tejido normal, de un tumor primario, de un tumor recidivo o de metástasis; para la identificación de determinados polimorfismos o combinaciones; para el estudio de la variabilidad de la información genética, por ejemplo para la identificación de cambios estructurales en ácidos nucleicos, tales como mutaciones, variantes de empalme, etc.; en el campo de la proteómica, tanto de forma analítica como preparativa, dado el caso con aplicaciones subsiguientes, por ejemplo con la ayuda de la microscopía de exploración láser confocal u otros procedimientos, tales como Maldi-Tof (desorción/ionización láser asistida por matriz con detector de tiempo de vuelo), espectrometría de masas en tándem por electropulverización; para el análisis de interacciones célula/ célula, para lo cual se puede incubar, por ejemplo, el material celular canceroso de acuerdo con la invención junto con células asesinas manipuladas; para el aislamiento y la caracterización de componentes de células cancerosas procedentes de células cancerosas tanto cultivadas como no cultivadas, por ejemplo proteínas, tales como lipo-, glucoproteínas, etc., péptidos, lípidos, carbohidratos, etc. Con el material celular canceroso de acuerdo con la invención se pueden esclarecer relaciones entre la generación, el desarrollo y el efecto de planteamientos terapéuticos, y en base a ello se proporcionan nuevos planteamientos terapéuticos, sobre todo también como fundamento para combinaciones de planteamientos terapéuticos.
Si la identificación y caracterización de las células cancerosas requieren un aislamiento previo de ácidos nucleicos, proteínas u otros componentes celulares, el experto conoce un gran número de procedimientos diferentes que le permiten lograrlo. A modo de ejemplo se señalan aquí únicamente unos pocos procedimientos.
Para el aislamiento del ADN genómico se pueden lisar las células, por ejemplo bajo acción de detergentes y/o proteinasas, eliminar las proteínas y aislar el ADN, por ejemplo por precipitación con disolventes orgánicos conocidos. Se prefieren los procedimientos basados en soluciones que contienen isotiocianato de guanidina y fenol. También puede resultar útil una purificación cromatográfica, es decir, una separación de ácidos nucleicos y otros componentes celulares, y/o una separación de distintos tipos de ácidos nucleicos, por ejemplo por extracción en fases sólidas, tales como silicatos y similares, por ejemplo con columnas de centrifugado comerciales. Pueden ser convenientes otros procedimientos conocidos, tales como técnicas de sondas, electroforesis, electroósmosis, choque osmótico. Para el aislamiento de ARN total se usan procedimientos similares. A partir de este ARN total se puede aislar a su vez ARNm, usando, por ejemplo, sistemas basados en oligo-(dT). La elección de un protocolo conveniente concierne al experto.
Los ácidos nucleicos aislados se pueden usar después para la identificación y caracterización posterior en un gran número de aplicaciones. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, la PCR, RT-PCR, DD-RT-PCR, la síntesis de ADNc, la extensión de cebadores, la digestión con enzimas de restricción, la transferencia Southern, reacciones de marcaje y de modificación, la transferencia Northern, la clonación, la secuenciación, la transcripción in vitro o la traducción in vitro. Algunas de las aplicaciones antes mencionadas también se pueden realizar en una o unas pocas células sin aislamiento previo de ácidos nucleicos, en especial la RT-PCR. La elección de la aplicación adecuada no depende sólo del tipo de ácido nucleico sino también de la información genética por medio de la cual se han de identificar y caracterizar las células cancerosas.
Una ventaja especial es la alta pureza resultante de acuerdo con la invención y la integridad no alterada por la técnica de aislamiento de las células cancerosas aisladas. Esto permite realizar determinados ensayos funcionales, por ejemplo respecto a la farmacogenómica (ensayo con determinados principios activos) o a alteraciones en las células tumorales aisladas (terapia génica, sustitución génica). Asimismo se puede realizar, gracias a la pureza de las células, un denominado direccionamiento de fármacos. Así, por ejemplo, en el caso de una amplificación de erb-B2 demostrada está indicado un tratamiento con anticuerpos anti-erb-B2 u otros ligandos; las células tumorales que expresan receptores de progesterona o de estrógenos son accesibles a un denominado tratamiento antihormonal. Si en las células cancerosas se detecta, por ejemplo, una mutación del gen de la \beta-tubulina, esto constituiría una contraindicación para Taxol®. Lo mismo es válido para el tamoxifeno en el caso de detectarse determinadas variantes de empalme del receptor de estrógenos.
La presente invención se refiere asimismo a juegos para el aislamiento y, dado el caso, para la identificación y caracterización siguientes de células cancerosas diseminadas y metastatizadas. También son objeto de la invención los juegos para la depleción de células cancerosas a partir de preparados que contienen células, en especial de líquidos corporales o aislados. Este tipo de juegos deben ser fáciles de manejar y estar esencialmente listos para el uso. Una disposición preferida ofrece los juegos en forma de kits. Un componente esencial de los juegos adecuados es al menos un tamiz de acuerdo con la invención. Este tamiz puede estar ya adaptado al uso correspondiente en el sentido de estar listo para el uso, pero también puede estar incluido en el juego en forma de una especie de materia prima que entonces puede ser adaptada correspondientemente por el usuario a los requisitos correspondientes, por ejemplo ajustada a determinados productos de laboratorio. Adicionalmente pueden estar presentes componentes que permiten
- pasar líquido corporal que contiene células o partes de él a través del tamiz, por ejemplo piezas en forma de columna en las que el tamiz puede disponerse de forma conveniente y, preferentemente, volverse a retirar;
- recoger el material que atraviesa el tamiz;
- desprender las células o los componentes celulares del tamiz y/o suspenderlos después, por ejemplo en soluciones tales como tampones, medios de cultivo o disolventes orgánicos y/o mezclas de disolventes, tales como etanol, cloroformo, alcohol isoamílico, isopropanol, isotiocianato de guanidina, fenol y mezclas de ellos, por ejemplo Trizol®, preferentemente en forma de soluciones o mezclas de disolventes listas para el uso que se pueden ofrecer en recipientes, preferentemente aptos para centrifugación, y también separados de éstos;
- aislar ácidos nucleicos, proteínas u otros componentes celulares de las células cancerosas aisladas o al menos prepararlos para un aislamiento conveniente para los análisis posteriores, por ejemplo las soluciones, columnas de centrifugado con fases sólidas adecuadas, sistemas oligo-dT antes mencionados y similares. Los juegos de este tipo son de uso universal y prácticamente independientes del tipo de procesamiento preparativo del líquido corporal que contiene células que, dado el caso, se ha de realizar y de los usos posteriores, por ejemplo de los análisis que se han de efectuar para la identificación y caracterización de células cancerosas aisladas.
Asimismo pueden estar presentes componentes que permiten
- realizar un procesamiento preparativo del líquido corporal que contiene células, por ejemplo para el aislamiento de células o de determinadas fracciones que contienen células a partir de este líquido corporal;
- realizar los análisis pretendidos para la identificación y caracterización de células cancerosas aisladas, en especial los análisis de los genes y proteínas antes mencionados, por ejemplo cebadores, medios para la amplificación, detección y/o controles. En el caso de los controles puede tratarse también del material celular canceroso de acuerdo con la invención.
Debido a la diversidad de este tipo de medidas, estos componentes generalmente sólo están incluidos, si lo están, de forma limitada en el juego de acuerdo con la invención, es decir, que se dirigen en cada caso a un determinado líquido corporal y/o a uno o unos pocos análisis. Se trata entonces de kits para la realización de una identificación y caracterización de células cancerosas aisladas mediante uno o unos pocos parámetros.
Los siguientes ejemplos deben explicar con más detalle la invención sin limitarla.
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Ejemplo 1
Aislamiento de células cancerosas diseminadas de la sangre
Se centrifugan 10 ml de sangre heparinizada (400 g; 10 min; TA). Se retira el plasma sobrenadante. Las células sedimentadas se suspenden en 12 ml de PBS. Después de una centrifugación en gradiente de densidad (Nycodenz 1.077; 800 g, 30 min, TA) se recogen las células de la interfase (células mononucleares, abreviadas MNC) y se lavan 2 veces en 10 ml de PBS (EDTA 1 mM) (400 g; 10 min; 4ºC). Las MNC se suspenden en 10 ml de PBS (EDTA
1 mM, 0,5% de ASB). Como magnitud de referencia se recoge 1 ml de esta mezcla de células (fracción de control). Los 9 ml restantes de la mezcla de células se pasan por una columna a través de un tamiz tejido con hilos de PE con una abertura de malla de 20 \mum (distribuido por SEFAR AG, Rüschlikon, Suiza) y el material que pasa a través del tamiz se recoge. La columna se lava 5 veces con 10 ml de PBS respectivamente (EDTA 1 mM). El tamiz se retira, se le da la vuelta y se incuba con 0,7 ml de Trizol® en un recipiente de reacción (5 min; TA). El tamiz se coloca en el recipiente de reacción por encima de la solución de Trizol® y se centrifuga (200 g; 30 s; TA). El tamiz seco se retira y la solución de Trizol® se somete al aislamiento de ARN/ADN posterior.
Como alternativa a la incubación del tamiz en Trizol® el tamiz se puede retirar de la columna, dar la vuelta e introducir en PBS (EDTA 1 mM, 0,5% de ASB), y las células se pueden sedimentar por centrifugación (400 g; 10 min, 4ºC).
\newpage
Ejemplo 2
Aislamiento de células CD45-positivas (fracción de control)
Para el aislamiento de linfocitos CD45-positivos como fracciones de control y también para la medición de la pérdida de heterocigosidad se recoge en cada caso 1/10 de las MNC antes y después del proceso de tamizado (véase el ejemplo 1). Éstas se introducen en un recipiente de reacción que contiene 1 ml de PBS (0,5% de ASB,
100 \mug de IgG humana). Se añaden 50 \mul de microperlas anti-CD45 lavadas. La preparación se hace girar durante 20 min a 4ºC. A continuación, el recipiente de reacción se coloca en un listón magnético de tal manera que las microperlas (unidas a MNC CD45-positivas) se depositen en la pared del recipiente. Tras lavar tres veces los agregados perlas/células se obtiene una población pura de linfocitos CD45-positivos, la cual se puede someter después, disuelta en Trizol®, al aislamiento de ácidos nucleicos. Los aislados CD45 de la fracción MNC anteriores al proceso de tamizado se denominan fracción de control A, y los aislados de las MNC posteriores al proceso de tamizado, fracción de
control B.
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Ejemplo 3
Análisis de ADN
El ADN genómico se aísla de manera convencional a partir de las soluciones de Trizol® obtenidas en los ejemplos 1 y 2. El ADN se amplifica después por PCR, usándose los cebadores y parámetros indicados a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Análisis de los alelos de p53, Rb, DCC y APC
Se mezclan los siguientes reactivos por preparación de PCR (\mul):
1
Se usan los siguientes perfiles de temperatura:
2 
\newpage
Como parejas de cebadores se usan:
3
Todos los cebadores se almacenan a una concentración de 20 pmoles/\mul. El ADN normal se usa siempre como control negativo. Todos los productos amplificados por PCR de los análisis de la pérdida de heterocigosidad y de amplificación se miden y valoran con un analizador genético ABI-Prism Genescan.
\global\parskip0.900000\baselineskip
2. Análisis de amplificación de erb-B2 y c-myc
Se mide la coamplificación de erb-B2 (c-myc) frente a \beta-globina.
Se mezclan los siguientes reactivos por preparación de PCR (\mul):
5
Se usa el siguiente perfil de temperaturas:
6
Como parejas de cebadores se usan:
7
Todos los cebadores se almacenan a una concentración de 20 pmoles/\mul. El ADN normal se usa siempre como control negativo, y el ADN (erb-B2/c-myc) amplificado 5 veces, como control positivo. Todos los productos amplificados por PCR de los análisis de las pérdidas de hetercigosidad y de amplificación se miden y valoran con un analizador genético ABI-Prism Genescan.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Aplicación clínica
Se analizaron 14 pacientes con diferentes carcinomas, un paciente con melanoma maligno, seis donantes control y un "donante normal" con un diagnóstico previo sospechoso. Se realizaron análisis de ARN específicos de tumores y asociados a tumores, así como análisis genómicos respecto a la presencia de un desequilibrio alélico (pérdida de heterocigosidad) de los genes p53, Rb, APC y DCC y análisis de amplificación de los oncogenes c-myc y erb-B2.
Según el ejemplo 1 se obtuvieron de la sangre de cada uno de los pacientes la fracción control, el material que atraviesa el tamiz y el residuo de tamizado. Según el ejemplo 2 se aislaron de la fracción control y del material que atraviesa el tamiz células CD45-positivas como "control de tipo silvestre" (fracciones A y B). Los análisis antes mencionados se realizaron en las células CD45-positivas de la fracción control (A; magnitud de referencia), en las células CD45-positivas del material que atraviesa el tamiz (fracción B) y en las células del residuo de tamizado (fracción C).
Los resultados de los análisis genómicos se expresaron para los pacientes y los donantes control como diferencias alélicas relativas respecto a la fracción control CD45 A (magnitud de referencia). Como valor umbral para los análisis de la pérdida de heterocigosidad se fijó como positivo un valor \leq 0,5, respecto al control, es decir, una diferencia de al menos 50%. En los análisis de amplificación se fijó un valor umbral de 2,0.
En cinco de los 15 pacientes analizados con un carcinoma y un melanoma establecidos se pudo demostrar que con el procedimiento de acuerdo con la invención se pueden aislar células cancerosas diseminadas a partir de sangre periférica. Esto mismo también se logró en el caso de un donante control cuyo diagnóstico previo (expresión de ARN de CEA, CK20 y MUC1) apuntaba a la presencia de células cancerosas diseminadas.
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Ejemplo 5
Caracterización del estado biológico de células tumorales diseminadas
Se extrajo una muestra de sangre a una paciente de 53 años de edad con un carcinoma de mama (pT2pN1M0, G3) diagnosticado hace 16 meses y tratado (6xCMF, radiación, tamoxifeno). Se aislaron células tumorales diseminadas según el ejemplo 2. Éstas presentaban una pérdida de heterocigosidad del gen p53, una mutación del gen p53 y una amplificación de c-erbB-2. El análisis cuantitativo y normalizado respecto a GADPH de la expresión de ciclinas dio el siguiente resultado:
Ciclina D: 2,5
Ciclina E: 0
Ciclina B: 0
La expresión exclusiva de la ciclina D apunta a una fase G0/1. Ninguna de las células aisladas se encontraba en un estadio mitótico. Las células tumorales aisladas no eran proliferativas.
Se extrajo una muestra de sangre a un paciente de 64 años de edad con un carcinoma de colon (Dukes C) diagnosticado hace 6 meses y tratado (5-FU). Se aislaron células tumorales diseminadas según el ejemplo 2. Éstas presentaban una pérdida de heterocigosidad del gen DCC, una pérdida de heterocigosidad del gen de la E-cadherina y una amplificación de c-myc. El análisis cuantitativo y normalizado respecto a GADPH de la expresión de ciclinas dio el siguiente resultado:
Ciclina D: 0,7
Ciclina E: 4,3
Ciclina B: 10,3
La expresión de las tres ciclinas apunta a un estado proliferativo de las células tumorales aisladas.

Claims (18)

1. Procedimiento para el aislamiento de células tumorales diseminadas a partir de líquidos corporales que contienen células, caracterizado porque se hace pasar el líquido corporal que contiene células o partes de él a través de un tamiz con una abertura de malla o de poro de aproximadamente 15 a 30 \mum o a través de un tamiz con una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 15 a 30 \mum y se obtiene la fracción celular retenida.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el tamiz presenta una abertura de malla o de poro de aproximadamente 20 \mum o una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 20 \mum.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células tumorales diseminadas retenidas en el tamiz están exentas de un medio de separación que comprende un ligando usado con fines de aislamiento.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque primero se aísla a partir del líquido corporal una fracción que contiene células y a continuación se tamiza.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células tumorales diseminadas retenidas en el tamiz, dado el caso mezcladas con células no cancerosas, se desprenden del tamiz.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se hace pasar un líquido a través del tamiz en sentido opuesto.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como líquido corporal se usa sangre, médula ósea, linfa, orina, esputo, líquido amniótico, muestras obtenidas por punción, lavados de colon, pulmón y bronquios, líquido de lavado de la vejiga o heces.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque como líquido corporal se usa sangre o médula ósea.
9. Procedimiento para la eliminación extracorpórea de células tumorales diseminadas a partir de preparados que contienen células, caracterizado porque el preparado que contiene células se hace pasar a través de un tamiz con una abertura de malla o de poro de aproximadamente 15 a 30 \mum o a través de un tamiz con una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 15 a 30 \mum.
10. Procedimiento para la caracterización de células tumorales diseminadas con la ayuda de ADN y/o ARN, en el que se separan del líquido corporal de un individuo células tumorales diseminadas según un procedimiento de las reivindicaciones 1 a 8 y se analizan con la ayuda de ADN y/o ARNm respecto a la presencia de al menos un gen específico de cáncer y en el que se realiza el mismo análisis con células no cancerosas del mismo individuo como control.
11. Uso de un tamiz con una abertura de malla o de poro de aproximadamente 15 a 30 \mum o de un tamiz con una capacidad de retención absoluta o nominal de aproximadamente 15 a 30 \mum para el aislamiento de células tumorales diseminadas a partir de líquidos corporales que contienen células.
12. Mezcla de células que comprende células tumorales diseminadas, caracterizada por una proporción de células tumorales policlonales de al menos el 50%, que se puede obtener mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8.
13. Mezcla de células según la reivindicación 12, caracterizada por una proporción de células tumorales policlonales de al menos el 90%.
14. Mezcla de células según la reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque las células tumorales están exentas de ligandos usados convencionalmente con fines de aislamiento.
15. Procedimiento para el aislamiento de componentes celulares de células tumorales diseminadas, en el que los componentes celulares se obtienen de manera conocida en sí a partir de al menos una mezcla de células de las reivindicaciones 12 a 14 o de una fracción de ella.
16. Procedimiento para el establecimiento de líneas celulares a partir de células tumorales diseminadas, en el que se cultiva al menos una mezcla de células de las reivindicaciones 12 a 14 o una fracción de ella.
17. Mezcla de células según una de la reivindicaciones 12 a 14 para el uso como agente terapéutico.
18. Agente farmacéutico o veterinario que comprende al menos una mezcla de células según una de las reivindicaciones 12 a 14 y coadyuvantes de formulación, principios activos y/o componentes adicionales de una prueba diagnóstica.
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