CN111961637A - 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法 - Google Patents

一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111961637A
CN111961637A CN202010649797.3A CN202010649797A CN111961637A CN 111961637 A CN111961637 A CN 111961637A CN 202010649797 A CN202010649797 A CN 202010649797A CN 111961637 A CN111961637 A CN 111961637A
Authority
CN
China
Prior art keywords
separation
size exclusion
exclusion chromatography
separation method
sevs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010649797.3A
Other languages
English (en)
Inventor
崔毅峙
吴彩红
王通
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN202010649797.3A priority Critical patent/CN111961637A/zh
Publication of CN111961637A publication Critical patent/CN111961637A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种小细胞外囊泡分离方法，优化了尺寸排阻层析使用的固定相填料，并与超滤法结合作为sEVs的分离方法，克服了现有小细胞外囊泡分离方法中分离过程耗时长、需要专有设备、存在高丰度蛋白质污染、引入其他杂质、产物(sEVs)浓度较低的技术不足。本发明方法不需要采用复杂的仪器设备，大大降低了实验成本，具有更好的普及推广的意义。

Description

一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法
技术领域
本发明涉及小细胞外囊泡分离技术，更具体地，涉及一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的小细胞外囊泡分离方法。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到2000nm不等，通常包裹有生物活性分子，如：蛋白质、核酸等生物大分子。EVs主要由凋亡小体、微囊泡和外泌体组成。EVs表面蛋白质具亚细胞来源特异性，可反映供体细胞类型；此外这些蛋白质赋予EVs对受体细胞的靶向性，并保护EVs在体液循环中免受吞噬清除。其中，外泌体(也被称为小细胞外囊泡，small EVs,sEVs，是200nm以下的EVs)是目前学界研究的热点，sEVs是多种疾病的生物标志物，利用外周血中大量存在的sEVs有望实现癌症、病毒感染等疾病的早期诊断。然而，血清/血浆中含有大量蛋白质，其中部分蛋白质丰度极高，会对sEVs的分离及后续相关蛋白质的检测和分析造成严重干扰。因此分离sEVs和高丰度蛋白质是血清/血浆外泌体纯化技术的关键性能指标。
目前针对sEVs的纯化方法有超速离心、密度梯度离心，超滤[8]，尺寸排阻层析，多聚物沉淀法以及亲和捕捉法等。
1)超速离心法(ultracentrifugation,UC)是目前纯化sEVs的金标准。该方法可实现血清中的sEVs与大部分的蛋白质分离，操作相对简单。但UC分离过程耗时长，依赖于特定设备(超高速离心机)。
2)尺寸排阻层析(size exclusion chromatography,SEC)利用球状凝胶内的筛孔，使不同大小的分子在通过不同的路径流经填料，从而在不同时间段被洗脱：大分子无法进入凝胶筛孔，运行较短路径，较早被洗脱；较小的分子可进入凝胶内的筛孔，运行较长路径，洗脱时间较长。这种分离方法可有效分离sEVs与血清中存在的高丰度蛋白质。但在SEC分离过程中，sEVs随流动相流出柱床的过程必然伴随着sEVs颗粒的稀释，影响样品的后续分析与利用。
3)多聚物沉淀法使用方便，不需要专门设备[13]，适合从大体积样本中分离sEVs，已有相关产品试剂销售。但该方法在分离过程中需要引入非sEVs物质，如聚合物材料等[14]，同时血清/血浆中的高丰度蛋白也可能发生共沉淀，这些杂质既影响sEVs的纯度又会对后续sEVs蛋白质相关的分析造成较大干扰。
4)亲和捕捉法可利用sEVs膜上的蛋白受体与其特异性抗体间的免疫亲和作用来达到分离sEVs的目的。该方法对分离的sEVs具较强特异性，可实现特定sEVs亚群的富集。但由于缺乏泛用性的sEVs特征性抗原，亲和捕捉法无法实现sEVs的全局性分析，应用范围较窄。
5)超滤(ultrafiltration,UF)法是一种基于尺寸差异的sEVs分离技术，血清/血浆中蛋白质等杂质与sEVs在颗粒直径上存在较大差异，可利用特定截留大小的膜过滤器来分离sEVs[15]。相对于UC，UF耗时较短，且不需要特殊设备。但由于高分度蛋白质在离心力作用下的团聚现象影响过滤效率，UF对蛋白质与sEVs的分离效果并不理想。
综上所述，现有分离方法均无法从血清/血浆中快速分离出高纯度sEVs。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结合分子排阻层析和超滤的sEVs分离方法，该方法具以下特点：sEVs分离速度快；分离过程不依赖专有设备；不引入非样品来源杂质；蛋白质杂质容纳能力强且残留量少；sEVs产物浓度高。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种小细胞外囊泡分离方法，包括以下步骤：
S1.样本准备：将血清/血浆样本离心去除细胞，离心去除细胞碎片血小板，得上清液A；
S2.将步骤S1中上清液A进行尺寸排阻层析，收集洗脱液，并依据洗脱顺序将洗脱液合并为一定组分，得粗提小细胞外囊泡溶液B；
S3.将步骤S2所述细胞外囊泡溶液B进行超滤浓缩，得小细胞外囊泡溶液。
优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料应具以下性状：颗粒直径40～200μm，对球形蛋白质的分离范围为10～40000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～20000kDa。
更优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料应具以下性状：颗粒直径40～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10～20000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～5000kDa。
优选地，根据本发明所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析柱的柱床体积不小于10mL，优选为10～11mL。
优选地，根据本发明所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析收集的洗脱液总体积应为尺寸排阻层析柱柱床体积的1.3～1.5倍。
优选地，根据本发明述的分离方法，步骤S2所述尺寸排阻层析收集对应组分的参数范围为：从洗脱开始收集，洗脱液的前42.3％～69.2％为第1组分，剩余的30.8％～57.7％洗脱液为第2组分，其中第1组分为粗提小细胞外囊泡溶液B。
更优选地，根据本发明第一个方面所述的分离方法，步骤S2所述尺寸排阻层析收集对应组分的参数范围为：从洗脱开始收集，洗脱液的前42.3％～53.9％为第1组分，剩余的46.2％～57.7％洗脱液为第2组分，其中第1组分为粗提小细胞外囊泡溶液B。
优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S2所述尺寸排阻层析采用缓冲液为PBS溶液。
优选地，根据本发明所述的分离方法，所述PBS溶液经0.22μm滤膜过滤。
优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S3所述超滤浓缩应使用截留分子量为30-100kDa的超滤膜。
优选地，根据本发明所述的分离方法，超滤浓缩的条件为2800～3300×g，离心13～18min。
优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S1中所述离心去除细胞的条件为280～320×g，离心8～13min。
优选地，根据本发明所述的分离方法，步骤S1中所述离心去除细胞碎片血小板的条件为15000～17500×g，离心18～24min。
本发明的有益效果是：
本发明是将尺寸排阻层析与超滤法结合作为sEVs的分离方法，可分离得到蛋白污染少的高浓度sEVs浓缩液。相对于现有方法，本发明方法具以下优点：1.可从样品中快速分离sEVs；2.不需要超高速离心机等专用设备，分离操作简单；3.在保持sEVs完整形态及功能的前提下，分离得到高纯度sEVs；4.可去除样品中游离蛋白质，且对游离蛋白质承载力强；5.分离过程不引入非样品来源的杂质。
附图说明
图1实施例1中各馏分中蛋白含量/颗粒总数所占各自总量的百分比及累积曲线。A、B、C图分别为固定相为Sepharose CL-2B(CL-2B)、Sepharose CL-4B(CL-4B)及SepharoseCL-6B(CL-6B)所分离的各馏分中蛋白含量/颗粒总数所占各自总量的百分比的累积曲线。
图2不同填料第1组分中所含蛋白含量/颗粒总数占各自总量的百分比。
图3实施例3中第1和第2组分蛋白质含量/颗粒总数所占各自总量的百分比及透射电镜图。A图：第1和第2组分蛋白含量/颗粒总数所占各自总量的百分比，B图：透射电镜图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1 SEC固定相填料选择及分离策略优化
筛选出符合颗粒直径为40～165μm、对球形蛋白质的分离范围为10～20000kDa、对葡萄聚糖的分离范围为10～5000kDa的固定相填料，琼脂糖微球Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B均具合适的物理性状。其具体物理性状见表1。
表1不同固定相填料的物理性状
Figure BDA0002574505110000041
在各种常见sEVs样本中，血清是蛋白质杂质丰度最高、组成最复杂的样本，故本实施例以胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)作为样本，对sEVs分离效果进行测试。
为确定这些固定相填料对SEC对颗粒及蛋白质的分离效果，我们使用SEC柱以PBS为洗脱液将FBS进行分离，每500μL收集为一个馏分，共收集26个馏分，总体积为13mL。然后对各馏分中的颗粒数量和蛋白质丰度分别进行分析，进而根据分离结果对分离策略进行优化。本实验共进行3个生物学重复，结果见附图1。
按照以下步骤，提取血清/血浆样本中的sEVs：
1)样本准备
血清/血浆样本300×g离心10min去除细胞，16000×g离心20min去除细胞碎片及血小板等。
2)SEC柱的制备
分别取15mL的CL-2B、CL-4B和CL-6B填料加入到层析柱空柱管中，待层析柱空柱管下无液滴滴下后，紧贴柱床上方放置筛板，得到柱床体积为10mL的SEC柱。然后加入2倍柱床体积(20mL)的PBS缓冲液(已过0.22μm滤膜，后续提到的PBS缓冲液皆为已过0.22μm滤膜的PBS缓冲液)替换流动相，于4℃垂直静置至少6h。
3)柱平衡
样本分离前，需在制备好的SEC柱内加入2倍柱床体积(20mL)的PBS，以替换SEC柱内流动相，完成柱平衡。
4)在SEC柱表面加入1mL血清样本，待样本完全渗入柱内后立即开始分馏，逐次加入PBS进行洗脱。共收集26个等体积馏分，每馏分体积为0.5mL，依次编号为1～26。
5)分离效果评估
a.BCA(bicinchonininc acid)实验：定量评价蛋白含量；
b.NTA(nanoparticle tracking analysis)实验：评价颗粒数量。
结果显示，符合sEVs特征的颗粒与蛋白质分别集中出现在不同馏分内，大部分颗粒流出时间均早于蛋白质(图1)，证明3种10mL的SEC柱皆可有效从血清样本中分离sEVs颗粒。经过1.3倍柱床体积(13mL)PBS的洗脱，3种SEC柱在26号馏分中残留的颗粒与蛋白质均低于总回收量的2％(图1)，说明1.3倍柱床体积的洗脱液可完成FBS的洗脱。
具体而言，经CL-2B分离柱分离后，sEVs颗粒主要集中在第10-14馏分，蛋白质集中在第17-22馏分(图1中A)；相应地，sEVs颗粒还分别集中在CL-4B分离柱洗脱液的第8-10馏分(图1中B)和CL-6B分离柱洗脱液的第7-9馏分(图1中C)，而蛋白质则分别集中在CL-4B分离柱洗脱液的第16-19馏分(图1中B)和CL-6B分离柱洗脱液的第14-17馏分(图1中C)。故将编号靠前、包含大部分sEVs颗粒的馏分合并可有效缩短分离耗时。根据累积曲线，从洗脱开始，收集sEVs颗粒累积超过90％的馏分，得到3种分离柱的最佳收集体积：CL-2B分离柱的前8mL(前16个馏分，占洗脱液的61.54％)，CL-4B分离柱的前6.5mL(前13个馏分，占洗脱液的50.00％)和CL-6B分离柱的前5.5mL(前11个馏分，占洗脱液的42.31％)。即从洗脱开始，收集并合并洗脱液的前42.3％-69.2％为第1组分，剩余的30.8％-57.7％合并为第2组分，其中第1组分包含样品中绝大部分小细胞外囊泡，为粗提小细胞外囊泡溶液。该策略可在保留绝大部分sEVs颗粒的前提下，尽量去除污染蛋白质，实现sEVs富集的目标。
在3种固定相填料中，符合权利要求3所述(颗粒直径40～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10～20,000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～5,000kDa)的填料CL-4B和CL-6B得到的sEVs颗粒峰宽度比CL-2B所得更窄，同时sEVs颗粒高峰与蛋白质高峰的距离也大于CL-2B所得(图1)。显然用于sEVs分离时，CL-4B/CL-6B的性能优于CL-2B，即颗粒直径40～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10～20,000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～5,000kDa的固定相填料具更优性能。
实施例2 SEC分离结合UF浓缩策略的可行性验证
根据实施例1的结果，合并洗脱液中部分馏分可加速sEVs颗粒的分离。但使用该策略得到的粗提小细胞外囊泡溶液仍对样品存在稀释。为解决这一问题，发明人采用UF法对粗提小细胞外囊泡溶液进行浓缩，以获得高浓度的sEVs溶液。为验证该策略的可行性，此处使用实施例1所述3种SEC分离柱分别对1mL FBS进行分离，根据实施例1的结论将洗脱液最先流出的8mL(CL-2B分离柱)、6.5mL(CL-4B分离柱)和5.5mL(CL-6B分离柱)合并为第1组分，剩余洗脱液合并为第2组分，进而使用超滤管对两个组分分别进行浓缩。最后对各组分浓缩液中的颗粒数量和蛋白质丰度进行分析。本实验共进行3个生物学重复，结果见附图2。
按照以下步骤，提取血清/血浆样本中的sEVs：
1)样本准备
血清/血浆样本300×g离心10min去除细胞，16000×g离心20min去除细胞碎片血小板等。
2)SEC柱的制备
取15mL CL-2B、CL-4B和CL-6B填料加入到层析柱空柱管中，待层析柱空柱管下无液滴滴下后，紧贴柱床上方放置筛板，得到柱床体积为10mL的SEC柱。然后加如2倍柱床体积(20mL)的PBS缓冲液替换流动相，于4℃垂直静置至少6h。
3)柱平衡
样本分离前，需在制备好的SEC柱内加入2倍柱床体积(20mL)的PBS，以替换SEC柱内流动相，完成柱平衡。
4)sEVs收集
在SEC柱表面加入1mL血清样本，待样本完全渗入柱内后立即开始分馏，待样本液面与筛板上表面齐平时，逐次加入PBS缓冲液进行洗脱，将最先流出的8mL(CL-2B分离柱)、6.5mL(CL-4B分离柱)和5.5mL(CL-6B分离柱)洗脱液合并为第1组分，剩余洗脱液合并为第2组分，将两个组分溶液分别进行超滤浓缩，滤膜的截留分子量(MWCO,molecular weightcut off)为100kDa，3000×g离心15min后得到体积为150μL的第1/2组分。
5)分离效果评估
a.BCA实验：定量评价蛋白含量；
b.NTA实验：评价颗粒数量。
经浓缩后CL-4B和CL-6B所得sEVs颗粒在全部洗脱液中占比高于CL-2B所得，其中CL-6B所得sEVs占比最高；而CL-4B和CL-6B所得浓缩液中蛋白质丰度在全部洗脱液中占比低于CL-2B所得，其中CL-4B所得蛋白质占比最低(图2)。若以sEVs颗粒/蛋白质比值作为评价sEVs分离效果的指标，CL-2B、CL-4B和CL-6B所得浓缩液中二者比值分别为2.9、6.7和4(图2)。因此，满足实施例1中要求的固定相填料CL-4B和CL-6B相对于文献中常见的SEC固定相填料CL-2B有更佳的sEVs分离效果，而二者相比效果相当。
综上，本实施例说明SEC分离结合UF浓缩策略可得到高浓度的sEVs溶液；SEC及UF实验不需要特殊实验设备(仅需配备常温离心机)；实验过程也无需加入外源物质。
实施例3 人血清sEVs分离应用实验
为验证上述方法是否适用于人血清的sEVs分离，发明人进行使用上述方法从人血清中尝试分离sEVs。实验步骤和结果分析方法与实施例2一致，并在此基础上使用透射电子显微镜观察所得的sEVs浓缩液。本实验共进行3个生物学重复，结果见附图3。
电镜实验步骤如下：使用上述方法从人血清样本中分离得到sEVs浓缩液(第1组分)后，用4％(w/v)多聚甲醛及1％戊二醛将10μL组分1样本固定于铜网表面，随后使用草酸铀酰及甲基纤维素-乙酸双氧铀二次固定样本。最后，使用100kV透射电子显微镜对载有样本的铜网进行拍摄。
分离结果显示上述方法从人血清中得到的第1组分中包含有样品中的大部分sEVs(72.1％±10.3)，而仅含有极少量的蛋白质(3.1％±1.6)(图3中A)。同时，电镜结果显示上述方法分离得到的第1组分中，包含有直径约为150nm的圆形杯托状颗粒(图3中B)，符合sEVs囊泡结构的典型形态。上述结果说明实施例1、2中方法对物种并无选择性，同时证明上述方法分离得到的sEVs具sEVs典型结构特征。
实施例4 与UC法的sEVs提取效果对比
为评价实施例2中优化后的方法的提取效果，发明人使用相同处理的FBS分别经UC法与上述方法提取sEVs，并检测两种方法得到的sEVs溶液蛋白质、颗粒浓度及颗粒大小分布，结果见下表2所示。
UC分离sEVs过程为：3mL FBS样本，300×g离心10min去除细胞，16000×g离心20min去除细胞碎片血小板等。然后加入4倍体积的PBS缓冲液，120000×g离心18h。
结果显示，使用实施例2中方法与UC法，具近似的蛋白质回收率。而实施例2中方法在颗粒回收率上弱于UC法。
表2与超离法相比sEVs的提取效果
Figure BDA0002574505110000071
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种小细胞外囊泡分离方法，包括以下步骤：
S1.样本准备：将血清/血浆样本离心去除细胞，离心去除细胞碎片血小板，得上清液A；或将细胞培养上清或其他含有小细胞外囊泡的生物体液离心去除残余细胞及细胞碎片，得上清液B；
S2.将步骤S1中上清液A或上清液B进行尺寸排阻层析，收集洗脱液，并依据洗脱顺序将部分洗脱液合并为一定组分，得粗提小细胞外囊泡溶液C；
S3.将步骤S2所述小细胞外囊泡溶液C进行超滤浓缩，得小细胞外囊泡溶液。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料的性状为：颗粒直径40～200μm，对球形蛋白质的分离范围为10～40000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～20000kDa。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料的性状为：颗粒直径40～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10～20000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～5000kDa。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析柱的柱床体积为10～11mL。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析收集的洗脱液总体积应至少为尺寸排阻层析柱柱床体积的1.3～1.5倍。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析收集对应组分的参数范围为：从洗脱开始收集，洗脱液的前42.3％-69.2％为第1组分、剩余的30.8％-57.7％洗脱液为第2组分；优选洗脱液的前42.3％-53.9％为第1组分、剩余的46.2％-57.7％洗脱液为第2组分；其中第1组分为粗小提细胞外囊泡溶液C。
7.根据权利要求1至7任一所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用缓冲液为PBS溶液，所述PBS溶液优选经0.22μm滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S3所述超滤浓缩的截留分子量为30～100kDa的超滤膜。
9.根据权利要求10所述的分离方法，其特征在于，超滤浓缩的条件为2800～7000×g，离心13～18min。
10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S1中所述离心去除细胞碎片血小板的条件为15000～17500×g，离心18～24min。
CN202010649797.3A 2020-07-08 2020-07-08 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法 Pending CN111961637A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010649797.3A CN111961637A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010649797.3A CN111961637A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111961637A true CN111961637A (zh) 2020-11-20

Family

ID=73362150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010649797.3A Pending CN111961637A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111961637A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388520A (zh) * 2021-06-17 2021-09-14 中国科学院城市环境研究所 胞外囊泡纯化方法
CN114134110A (zh) * 2021-12-13 2022-03-04 四川泊麦科技发展股份有限公司 一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法
CN115364521A (zh) * 2022-08-13 2022-11-22 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法
CN115369082A (zh) * 2022-08-26 2022-11-22 多莱泌生物科技(武汉)有限公司 一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法
CN115404241A (zh) * 2022-08-12 2022-11-29 浙江大学医学院附属第一医院 一种基因工程化调节性t细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894062A (zh) * 2015-05-19 2015-09-09 暨南大学 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
CN109609458A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 暨南大学 一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法
CN109929795A (zh) * 2019-03-22 2019-06-25 南昌大学第二附属医院 一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法
CN110283776A (zh) * 2019-06-26 2019-09-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种胞外囊泡的分离方法
CN110511902A (zh) * 2019-05-09 2019-11-29 北京恩泽康泰生物科技有限公司 基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法
CN111065730A (zh) * 2017-07-26 2020-04-24 罗塞塔外排体株式会社 利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法
CN111148828A (zh) * 2017-07-26 2020-05-12 罗塞塔外排体株式会社 利用阳离子分离细胞外囊泡的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894062A (zh) * 2015-05-19 2015-09-09 暨南大学 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
CN111065730A (zh) * 2017-07-26 2020-04-24 罗塞塔外排体株式会社 利用疏水相互作用分离细胞外囊泡的方法
CN111148828A (zh) * 2017-07-26 2020-05-12 罗塞塔外排体株式会社 利用阳离子分离细胞外囊泡的方法
CN109609458A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 暨南大学 一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法
CN109929795A (zh) * 2019-03-22 2019-06-25 南昌大学第二附属医院 一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法
CN110511902A (zh) * 2019-05-09 2019-11-29 北京恩泽康泰生物科技有限公司 基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法
CN110283776A (zh) * 2019-06-26 2019-09-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种胞外囊泡的分离方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘聪慧等: "胞外囊泡分离提取方法的研究进展", 《国际生殖健康/计划生育杂志》 *
贺娇等: "外泌体提取方法及鉴定分析研究进展", 《中华实用诊断与治疗杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388520A (zh) * 2021-06-17 2021-09-14 中国科学院城市环境研究所 胞外囊泡纯化方法
CN113388520B (zh) * 2021-06-17 2023-03-14 中国科学院城市环境研究所 胞外囊泡纯化方法
CN114134110A (zh) * 2021-12-13 2022-03-04 四川泊麦科技发展股份有限公司 一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法
CN114134110B (zh) * 2021-12-13 2024-03-26 四川泊麦科技发展股份有限公司 一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法
CN115404241A (zh) * 2022-08-12 2022-11-29 浙江大学医学院附属第一医院 一种基因工程化调节性t细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其应用
CN115364521A (zh) * 2022-08-13 2022-11-22 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法
CN115364521B (zh) * 2022-08-13 2023-09-15 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法
CN115369082A (zh) * 2022-08-26 2022-11-22 多莱泌生物科技(武汉)有限公司 一种gmp车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111961637A (zh) 一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法
CN113444682A (zh) 一种外泌体分离纯化方法
TW201509432A (zh) 親和層析基質
US4624918A (en) Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof
KR102059535B1 (ko) 생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법
CN113252808A (zh) 人血浆外泌体的快速、高纯分离方法
CN108841777A (zh) 基于静电吸附的胞外囊泡及其内含物的提取方法及装置
Rosado et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection
CN113101737A (zh) 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用
CN113388520B (zh) 胞外囊泡纯化方法
CN115449505A (zh) 一种分离外泌体的纯化方法及外泌体试剂盒
EP2859084A1 (en) Low organic extractable depth filter media processed with solvent extraction method
CN116333987A (zh) 一种外泌体提取方法获得的nk细胞外泌体在抗肿瘤中的应用
EP3757113B1 (en) Multi-column for isolating exosomes and exosome isolation method
CN110551687A (zh) 一种基于固相金属亲和色谱的分离血浆中外泌体的方法
US20230374106A1 (en) Methods and Devices For Complexing Target Entities
CN111153985A (zh) 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法
CN114164203B (zh) 一种细胞外囊泡纯化材料及纯化方法
CN103059149B (zh) 一种prp多糖提取方法
KR20200000792A (ko) 유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법
CN114397388A (zh) 一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用
CN117778309B (zh) 动物干细胞外泌体的分离纯化方法及其应用
WO2024077117A1 (en) Method for making vesicles
CN115094030B (zh) 一种临床级高纯度外泌体纯化方法
CN109867717A (zh) 一种血浆中α1微球蛋白的提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination