CN114134110A - 一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，包括样品溶液的获取、样品离心管的制作和外泌体的获取三个步骤。以脐带或者胎盘为原料制作的样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体，同时在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心‑过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体制备领域，特别涉及一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，但由于脂蛋白的尺寸、密度和外泌体囊泡均有重叠，因此在外泌体提取过程中，脂蛋白为主要存在的杂质之一，目前尚没有一种方法可以获得纯的细胞外囊泡，外泌体的提取方法较多，但提取的外泌体含量、纯度、活性均存在一定程度的不同，各有优缺点，目前，普遍采用的方法有离心法、超滤法、沉淀法和免疫法，其中离心法又包含超速离心法和密度梯度离心法，超速离心法是外泌体分离的金标准，耗时少，获得的外泌体产量和纯度高，但重复的超速离心可能会降低外泌体的质量及产量。
因此，在超速离心法的基础上，又提出了超滤离心法，其原理是利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法，但以脐带或者胎盘为原料使用超滤离心法提取间充质干细胞来源的外泌体时，存在两个问题，问题一：使用超滤离心法提取外泌体需要利用特殊的装置，且需要经历多次过滤，操作复杂；问题二：由于如高尔基体、内质网、微小的质膜残片等小于膜孔的非外泌体成分或灵活性好的混杂蛋白可通过滤过膜，从而引起外泌体纯度不足，为此，我们提出一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，以脐带或者胎盘为原料制作的样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体，同时在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心-过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，以去除胎牛血清中含有的蛋白影响，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，以去除上清液中的死细胞和较大的杂质，收集上清液，获得样品溶液；
S2、样品离心管的制作：将步骤S1中所述的样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；
S3、外泌体的获取：将步骤S2中所述的样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，以去除所述的样品溶液中的死细胞和大的细胞碎片及杂质，然后于10000×g环境下离心30min，以去除所述的样品溶液中的小的细胞杂质及碎片，最后于100000×g环境下离心70min，以去除所述的样品溶液中的干扰蛋白质，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。
进一步的，所述的微过滤器为空心圆柱结构，所述的微过滤器内部设有垂直分布的两层超滤膜，且位于上侧的超滤膜的孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%，位于下侧的超滤膜的孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%。
进一步的，所述的专用离心管为组合式结构，所述的专用离心管上部为空心圆柱，下部为圆锥管，且上部与下部之间通过螺纹连接，所述的提取液填充在圆锥管内部。
进一步的，所述的凝胶为体积分数2%琼脂糖凝胶。
进一步的，所述的微过滤器下端与滤膜之间的距离不小于2cm，保证填充在微过滤器与滤膜之间的凝胶有足够的厚度，使得更多的相对分子质量较小的蛋白质分子进入凝胶颗粒内部而被滞留，可以提高获取的外泌体的均匀度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1）样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，在第一阶段以离心力2000×g离心20min，样品溶液通过位于上侧孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%的超滤膜过滤后，可以去除所述的样品溶液中的死细胞和大的细胞碎片及杂质，在第二阶段以离心力10000×g离心30min，样品溶液通过位于下侧孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%的超滤膜过滤后，可以去除所述的样品溶液中的小的细胞杂质及碎片，在第三阶段以离心力10000×g离心70min，样品溶液通过凝胶层，相对分子质量接近且质量较大的外泌体分子和干扰蛋白分子被凝胶颗粒排除在外侧，且能够快速通过凝胶层进入到收集管中，相对分子质量较小的蛋白质分子进入凝胶颗粒内部而被滞留，同时使大部分的非外泌体的细胞外囊泡得以去除，如高尔基体、内质网、很小的质膜碎片等，经提纯后可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体；
2）通过在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心-过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制，为了更好地说明本发明的具体实施方式，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸，对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他具体实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，收集上清液，获得样品溶液；
S2、样品离心管的制作：将步骤S1中样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；
S3、外泌体的获取：将步骤S2中样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，然后于10000×g环境下离心30min，最后于100000×g环境下离心70min，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。
微过滤器为空心圆柱结构，微过滤器内部设有垂直分布的两层超滤膜，且位于上侧的超滤膜的孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%，位于下侧的超滤膜的孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%。
通过采用上述技术方案：样品溶液经过三个连续的离心处理阶段，在第一阶段以离心力2000×g离心20min，样品溶液通过位于上侧孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%的超滤膜过滤后，可以去除所述的样品溶液中的死细胞和大的细胞碎片及杂质，在第二阶段以离心力10000×g离心30min，样品溶液通过位于下侧孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%的超滤膜过滤后，可以去除所述的样品溶液中的小的细胞杂质及碎片，在第三阶段以离心力10000×g离心70min，样品溶液通过凝胶层，相对分子质量接近且质量较大的外泌体分子和干扰蛋白分子被凝胶颗粒排除在外侧，且能够快速通过凝胶层进入到收集管中，相对分子质量较小的蛋白质分子进入凝胶颗粒内部而被滞留，同时使大部分的非外泌体的细胞外囊泡得以去除，如高尔基体、内质网、很小的质膜碎片等，经提纯后可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体。
实施例2
如图1所示，一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，收集上清液，获得样品溶液；
S2、样品离心管的制作：将步骤S1中样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；
S3、外泌体的获取：将步骤S2中样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，然后于10000×g环境下离心30min，最后于100000×g环境下离心70min，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。
专用离心管为组合式结构，专用离心管上部为空心圆柱，下部为圆锥管，且上部与下部之间通过螺纹连接，提取液填充在圆锥管内部
通过采用上述技术方案：通过在现有的离心管基础上进行改进，提出组合式结构的专用离心管和微过滤器，并使用凝胶进行填充制作而成的样品离心管，并使用自制的样品离心管进行外泌体的提取，使得整个提取过程均在离心机里进行，无需再经过离心-过滤再离心等多个流程，简化了提取的操作步骤，便于实现大量提取，提高了外泌体提取效率。
实施例3
如图1所示，一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，收集上清液，获得样品溶液；
S2、样品离心管的制作：将步骤S1中样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；
S3、外泌体的获取：将步骤S2中样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，然后于10000×g环境下离心30min，最后于100000×g环境下离心70min，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。
凝胶为体积分数2%琼脂糖凝胶。
微过滤器下端与滤膜之间的距离不小于2cm。
通过采用上述技术方案：保证填充在微过滤器与滤膜之间的凝胶有足够的厚度，使得更多的相对分子质量较小的蛋白质分子进入凝胶颗粒内部而被滞留，可以提高获取的外泌体的均匀度。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、样品溶液的获取：在无菌工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，使用PBS充分洗涤后，剔除动静脉血管，将华通氏胶接种于培养瓶中，加入足量完全培养基，于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70%-80%融合时，传代培养至第4代，选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，使用PBS溶液冲洗1-2次，继续培养48-72 h后收集条件培养基，将收集所得上清液经过0.22 μm一次性滤器后，收集上清液，获得样品溶液；
S2、样品离心管的制作：将步骤S1中所述的样品溶液添加至微过滤器中，向专用离心管底部填充提取液，使用孔隙为0.22μm的滤膜覆盖在提取液液面上端，将微过滤器放置于专用离心管的中部，使用固定装置将微过滤器的位置进行预固定，在室温条件下向专用离心管与微过滤器之间填充凝胶，并轻微振荡使凝胶完全填充至专用离心管、微过滤器与滤膜之间的缝隙中，待凝胶液面与微过滤器上端水平时，将专用离心管放置于0℃环境下冷藏，待凝胶完全凝固后，使用封口将专用离心管上端开口密封，得到样品离心管；
S3、外泌体的获取：将步骤S2中所述的样品离心管置于超速离心机中，于2000×g环境下离心20min，然后于10000×g环境下离心30min，最后于100000×g环境下离心70min，得到外泌体与提取液的混合液，经提纯后获取形态均匀且高纯度的外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的微过滤器为空心圆柱结构，所述的微过滤器内部设有垂直分布的两层超滤膜，且位于上侧的超滤膜的孔径为0.22μm-0.4μm，孔隙率为80%-95%，位于下侧的超滤膜的孔径为0.1μm-0.2μm，孔隙率为80%-95%。
3.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的专用离心管为组合式结构，所述的专用离心管上部为空心圆柱，下部为圆锥管，且上部与下部之间通过螺纹连接，所述的提取液填充在圆锥管内部。
4.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的凝胶为体积分数2%琼脂糖凝胶。
5.根据权利要求1所述的一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法，其特征在于：所述的微过滤器下端与滤膜之间的距离不小于2cm。
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