CN110252440B - 一种外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法，包括外离心管、内离心管、第一滤膜和第二滤膜；内离心管置于外离心管内腔；内离心管的上端面插设有注入管，注入管穿过外离心管的上端面，实现内离心管的内腔与装置外界相连通；内离心管的下端面设有排出口；多张孔径大小不同的第一滤膜等间距布置于内离心管的内腔，并且多张第一滤膜按照孔径由大到小的顺序，以注入管至排出口的方向依次设于内离心管的内腔；第二滤膜架设于内离心管的外侧壁与外离心管的内侧壁之间，并且第二滤膜围绕内离心管的外侧壁一周设置；外离心管的底端设有取料口，以提出一种保证无菌环境并且使得外泌体过滤提取简单易操作的外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法。

Description

一种外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法

技术领域

本发明涉及外泌体提取技术领域，尤其涉及一种外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法。

背景技术

细胞外囊泡(EVs)是一种高度保守的细胞间通讯系统，通过该系统，细胞可以以脂质、蛋白质或核酸的形式进行信息交换。EVs最初被发现参与骨矿化以及血小板功能，被称为“血小板粉尘”。鉴于它们极其广泛的生物学功能及其在细胞间穿梭大分子的能力，EVs为开发一类新的治疗方法提供了独特的平台。

外泌体(Exos)是EVs的一个亚型，存在于所有的体液中，是一种通过多泡内体途径从人体内所有细胞内部释放的小囊泡(30nm-150nm)。外泌体是EVs中最有用于治疗前景的类型。

外泌体的来源常用的有体外培养的细胞和来源于人的体液。来源于细胞的外泌体最大的问题就是，用他人的细胞涉及到伦理；用自己的细胞培养周期太长，不确定因素太多。来源于人的体液的外泌体就可以很好的规避这些问题，来源于患者自己的体液，经过分离和处理提取外泌体，再用于患者自身，就不存在伦理方面的问题。

体液中最常用的是血液。血清外泌体，不仅含有血液中的外泌体，还含有血小板来源的外泌体，具有很好的临床前景。各种体液来源的外泌体，包括血清外泌体和来自富血小板血浆的外泌体，已有相当多的文献证实它们促进组织修复和组织保护功能。我们前期的研究中也发现，这些体液来源的外泌体具有很好的促进组织修复，预防各种原因造成的组织器官损伤的功能，具有很好的临床应用前景。

但是传统的外泌体的提取方法在临床中使用是具有不足点的。现在大部分的外泌体提取方法主要是在实验室中使用的。需要大型的仪器，需要无菌的操作间，需要经过专业培训的工作人员进行操作。如果外泌体投入临床使用，必须要简化流程，还有降低准入门槛，不可能匹配如此多的经过专业训练的人才来做外泌体的临床上使用的提取工作。

总的来说，我们需要的在临床上使用的产品必须具备两个特征：容易操作和保持无菌。

在实验室研究中，比较公认且操作相对简单的是超滤法。但即使是超滤法，在实验室中，无菌是通过专业技术人员在超净台中，使用移液器、无菌枪头和各种无菌耗材实现的，这不仅对硬件条件有要求，对相关操作人员的技术也有要求。为了能够在临床推广，我们要尽量避免使用移液器等设备，减少操作，在一根管子中完成绝大部分的操作，不仅可以保证在临床运用中保持无菌，同时还能降低学习成本。相关操作人员仅需短期的培训，便可掌握无菌获取治疗用外泌体的技能。

发明内容

本发明的目的在于提出一种保证无菌环境并且使得外泌体过滤提取简单易操作的外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法。

为达到上述目的，本发明提出一种外泌体过滤提取装置，包括外离心管、内离心管、第一滤膜和第二滤膜；所述内离心管置于所述外离心管内腔；所述内离心管的上端面插设有注入管，所述注入管穿过所述外离心管的上端面，实现所述内离心管的内腔与装置外界相连通；所述内离心管的下端面设有排出口；

多张孔径大小不同的所述第一滤膜等间距布置于所述内离心管的内腔，并且多张所述第一滤膜按照孔径由大到小的顺序，以所述注入管至所述排出口的方向依次设于所述内离心管的内腔；

所述第二滤膜架设于所述内离心管的外侧壁与所述外离心管的内侧壁之间，并且所述第二滤膜围绕所述内离心管的外侧壁一周设置；所述外离心管的底端设有取料口。

优选的，所述第一滤膜为四张，孔径分别为10μm、5μm、1μm和200nm。

优选的，所述第一滤膜的外周与所述内离心管的内侧壁的一周相互抵触，避免所述第一滤膜与所述内离心管的内侧壁之间出现间隙。

优选的，所述第二滤膜的竖截面为槽沟状；所述第二滤膜的槽沟面向所述取料口设置；所述槽沟两侧的侧边分别与所述内离心管的外侧壁和所述外离心管的内侧壁相互抵触，避免所述第二滤膜与所述内离心管的外侧壁和所述外离心管的内侧壁之间出现间隙。

优选的，还包括毛细管，所述毛细管通过所述取料口伸入所述外离心管内腔，将所述第二滤膜上的外泌体吸出。

优选的，还包括一个圆锥状的底座；所述底座的底面与所述外离心管的上下端面配合连接。

优选的，所述注入管和取料口均设有可卸的密封塞。

优选的，所述外离心管和所述内离心管均为圆柱体。

本发明还提出一种外泌体提取方法，包括以下步骤：

步骤1：取一个密封的外泌体过滤提取装置；

步骤2：取出注入管上的密封塞，将体液通过注入管注入内离心管内腔；

步骤3：盖上所述注入管上的密封塞；

步骤4：将外泌体过滤提取装置置于离心机内离心；

步骤5：离心后取出所述外泌体过滤提取装置，并且倒置所述外泌体过滤提取装置；

步骤6：将倒置后的所述外泌体过滤提取装置置于离心机内离心；

步骤7：离心后取出所述外泌体过滤提取装置，打开排出口密封塞；

步骤8：取毛细管从所述排出口伸入所述外离心管内腔，取出第二滤膜上的外泌体。

优选的，在步骤4中，将圆锥状底座的底面与所述外离心管的下端面配合连接，从而将所述外离心管置于所述离心机内离心；

在步骤6中，将所述底座从所述外离心管的下端面取下，与所述外离心管的上端面配合连接，从而将所述外离心管倒置于所述离心机内离心；

在步骤7中，离心后取出所述外泌体过滤提取装置，并且将所述底座从所述外离心管上取下，打开所述排出口密封塞。

与现有技术相比，本发明的优势之处在于：本发明的外泌体过滤提取装置使得体液进行两次过滤，从而在外泌体过滤提取装置中一次性即可获得指定规格的外泌体，摒弃了传统的超滤法中采用多种器械来进行过滤提取等操作步骤，保证了无菌的环境，提高了外泌体过滤提取的质量。同时操作步骤以及使用器材的减少，也降低了外泌体提取的操作难度，整套流程简单易操作，容易掌握，不需要专业人员去进行操作，降低了人员配置的难度，便于在临床使用及推广。

附图说明

图1为本发明一实施例中外泌体过滤提取装置的结构示意图；

图2为本发明一实施例中外泌体过滤提取装置下端面与圆锥状的底座结合的结构示意图；

图3为本发明一实施例中外泌体过滤提取装置上端面与圆锥状的底座结合的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案作进一步地说明。

如图1所示，本发明的目的在于提出一种保证无菌环境并且使得外泌体过滤提取简单易操作的外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法。

为达到上述目的，本发明提出一种外泌体过滤提取装置，包括外离心管1、内离心管2、第一滤膜5和第二滤膜6；内离心管2置于外离心管1内腔；内离心管2的上端面插设有注入管3，注入管3穿过外离心管1的上端面，实现内离心管2的内腔与装置外界相连通；内离心管2的下端面设有排出口；

多张孔径大小不同的第一滤膜5等间距布置于内离心管2的内腔，并且多张第一滤膜5按照孔径由大到小的顺序，以注入管3至排出口的方向依次设于内离心管2的内腔；

第二滤膜6架设于内离心管2的外侧壁与外离心管1的内侧壁之间，并且第二滤膜6围绕内离心管2的外侧壁一周设置；外离心管1的底端设有取料口4。

在本实施例中，第一滤膜5为四张，孔径分别为10μm、5μm、1μm和200nm。

在本实施例中，第一滤膜5的外周与内离心管2的内侧壁的一周相互抵触，避免第一滤膜5与内离心管2的内侧壁之间出现间隙，导致第一滤膜5的过滤效果不佳，使得体液中大直径颗粒进入外离心管1内腔。

在本实施例中，第二滤膜6的竖截面为槽沟状；第二滤膜6的槽沟面向取料口4设置；槽沟两侧的侧边分别与内离心管2的外侧壁和外离心管1的内侧壁相互抵触，避免第二滤膜6与内离心管2的外侧壁和外离心管1的内侧壁之间出现间隙，使得在规定规格内的外泌体从系统排出，降低收获效率；槽沟状的设计，使得在规定规格内的外泌体可以被收集集中在槽沟内，便于毛细管8的进一步收集。

在本实施例中，还包括毛细管8，毛细管8通过取料口4伸入外离心管1内腔，将第二滤膜6上的外泌体吸出。

在本实施例中，如图2和图3所示，还包括一个圆锥状的底座7；底座7的底面与外离心管1的上下端面配合连接，上下端面的侧壁上可以相应的设置一些外螺纹，底座7内表面可以相应的设置一些内螺纹，通过内螺纹与外螺纹的配合，底座7与外离心管1实现可拆卸配合连接；可拆卸圆锥状的底座7便于将外离心管1与离心机内的底座配合固定，从而将外离心管1定位于离心机内，在离心的过程中，防止外离心管1在离心机内发生错位。

在本实施例中，注入管3和取料口4均设有可卸的密封塞。

在本实施例中，外离心管1和内离心管2均为圆柱体。

一种外泌体提取方法，包括以下步骤：

本发明还提出一种外泌体提取方法，包括以下步骤：

步骤1：取一个密封的外泌体过滤提取装置；保证外泌体过滤提取装置内起初即为无菌环境；

步骤2：取出注入管3上的密封塞，将体液通过注入管3注入内离心管2内腔；

步骤3：盖上注入管3上的密封塞；

步骤4：将圆锥状底座的底面与外离心管1的下端面配合连接，从而将外离心管1置于离心机内离心；打开离心机后，使得体液依次经过10μm、5μm、1μm和200nm的第一滤膜5进行过滤；将体液中大颗粒以及大杂质去除，使得直径小于200nm的体液进入外离心管1的内腔，如图2所示。

步骤5：离心后取出外泌体过滤提取装置，并且倒置外泌体过滤提取装置；

步骤6：将底座从外离心管1的下端面取下，与外离心管1的上端面配合连接，从而将外离心管1倒置于离心机内离心；打开离心机后，使得直径小于200nm而大于30nm的外泌体过滤在第二滤膜6表面，进而滤掉水分和直径较小的蛋白，如图3所示。

步骤7：离心后取出外泌体过滤提取装置，并且将底座从外离心管1上取下，打开排出口密封塞；

步骤8：取毛细管8从排出口伸入外离心管1内腔，取出第二滤膜6上的外泌体，保证整个离心过滤以及提取步骤均在一个装置中完成，液体基本始终与外界保持隔离状态，从而充分保证装置以及整个操作过程的无菌。

在步骤7中，离心后取出外泌体过滤提取装置，并且将底座从外离心管1上取下，打开排出口密封塞。

在本实施例中，本发明的外泌体过滤提取装置使得体液进行两次过滤，从而在外泌体过滤提取装置中一次性即可获得指定规格的外泌体，摒弃了传统的超滤法中采用多种器械来进行过滤提取等操作步骤，本发明整个操作在一个装置中完成，集多层过滤与一体设置，保证了无菌的环境，提高了外泌体过滤提取的质量，同时操作步骤以及使用器材的减少，也降低了外泌体提取的操作难度，整套流程简单易操作，容易掌握，不需要专业人员去进行操作，便于在临床使用及推广。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种外泌体过滤提取装置，其特征在于，包括外离心管、内离心管、第一滤膜和第二滤膜；所述内离心管置于所述外离心管内腔；所述内离心管的上端面插设有注入管，所述注入管穿过所述外离心管的上端面，实现所述内离心管的内腔与装置外界相连通；所述内离心管的下端面设有排出口；

多张孔径大小不同的所述第一滤膜等间距布置于所述内离心管的内腔，并且多张所述第一滤膜按照孔径由大到小的顺序，以所述注入管至所述排出口的方向依次设于所述内离心管的内腔；

所述第二滤膜架为环状，且架设于所述内离心管的外侧壁与所述外离心管的内侧壁之间，并且所述第二滤膜围绕所述内离心管的外侧壁一周设置；所述外离心管的底端设有取料口；

所述第一滤膜为四张，孔径分别为10μm、5μm、1μm和200nm；

所述第二滤膜的竖截面为槽沟状；所述第二滤膜的槽沟面向所述取料口设置；所述槽沟两侧的侧边分别与所述内离心管的外侧壁和所述外离心管的内侧壁相互抵触，避免所述第二滤膜与所述内离心管的外侧壁和所述外离心管的内侧壁之间出现间隙。

2.根据权利要求1所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，所述第一滤膜的外周与所述内离心管的内侧壁的一周相互抵触，避免所述第一滤膜与所述内离心管的内侧壁之间出现间隙。

3.根据权利要求1所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，还包括毛细管，所述毛细管通过所述取料口伸入所述外离心管内腔，将所述第二滤膜上的外泌体吸出。

4.根据权利要求1所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，还包括一个圆锥状的底座；所述底座的底面与所述外离心管的上下端面配合连接。

5.根据权利要求1所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，所述注入管和取料口均设有可卸的密封塞。

6.根据权利要求1所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，所述外离心管和所述内离心管均为圆柱体。

7.一种外泌体提取方法，使用如权利要求1-6任意一项所述的外泌体过滤提取装置，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：取一个密封的外泌体过滤提取装置；

步骤2：取出注入管上的密封塞，将体液通过注入管注入内离心管内腔；

步骤3：盖上所述注入管上的密封塞；

步骤4：将外泌体过滤提取装置置于离心机内离心；

步骤5：离心后取出所述外泌体过滤提取装置，并且倒置所述外泌体过滤提取装置；

步骤6：将倒置后的所述外泌体过滤提取装置置于离心机内离心；

步骤7：离心后取出所述外泌体过滤提取装置，打开取料口密封塞；

步骤8：取毛细管从所述排出口伸入所述外离心管内腔，取出第二滤膜上的外泌体。

8.根据权利要求7所述的外泌体提取方法，其特征在于，在步骤4中，将圆锥状底座的底面与所述外离心管的下端面配合连接，从而将所述外离心管置于所述离心机内离心；

在步骤6中，将所述底座从所述外离心管的下端面取下，与所述外离心管的上端面配合连接，从而将所述外离心管倒置于所述离心机内离心；

在步骤7中，离心后取出所述外泌体过滤提取装置，并且将所述底座从所述外离心管上取下，打开所述取料口密封塞。