CN108801746A - 一种分离和富集体液成分的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离和富集体液成分的装置，包括分离腔室、集成于所述分离腔室内的多个分离单元、连接在第一分离单元入口处的进样器和连接于所述分离腔室出口处的收样器；其中，每一个所述分离单元包括上层夹具、下层夹具和位于上层夹具与下层夹具之间的多孔滤膜，所述上层夹具中设置有进液口，所述下层夹具中设置有出液口，所述多孔滤膜的孔径直径小于所分离的组分的直径。本发明的装置具有集成度高、通量高、易操作等优势，为各类体外体液样本的快速分离提供一种便捷有效的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离和富集体液成分的装置。
背景技术
由于恶性肿瘤已成为我国死亡率最高的重大疾病之一，90％以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发，癌症早期检测和癌症发展进程检测对于癌症患者的发现和治疗有极其重要的意义。循环肿瘤细胞和外泌体被认为是癌症病人血液中非常有参考价值的肿瘤早期检测和进程检测指标。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤或转移灶脱落，进入外周血血液循环的肿瘤细胞，被认为是肿瘤发生转移的必要前提。当微环境发生改变时，CTCs在远端器官停留生成新的肿瘤，从而导致肿瘤转移。但是CTCs在血液中数量非常稀少，每10mL血液可能仅含有几个到几十个，因此CTCs研究的关键在于从含有大量血细胞的复杂血液样本中准确、高效地将其分离出来。目前分离CTCs的系统已有报道，如CellSearchTM、Rarecell、Abnova、Cytotrack、Apocell、FLUXION等，其中CellSearchTM是唯一被美国FDA批准的产品，可用于如转移性乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌的预后评估。分离原理大致分为两种，一种是利用其物理性质，如密度、大小、变形性等的不同，设置特殊的结构，将其从血细胞中分离出来；另一种是利用其表面标志物与血细胞的差异，在特有的基底上修饰CTCs特有的表面标志物抗体，将其从血细胞中分离。但这些系统都存在捕获纯度低、存在大量非特异性吸附、捕获到的CTCs被固定在芯片表面无法释放等缺点。
外泌体是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其含有蛋白质和RNA等多种组分，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。肿瘤来源或肿瘤相关外泌体在肿瘤发生发展的调控中起重要作用，对肿瘤外泌体的分析和检测可辅助肿瘤早期诊断和预后分析。目前分离外泌体的最主要的方法是传统的密度梯度离心法，该方法繁琐、耗时长，需要昂贵的超速离心机设备。文献中报道的外泌体分离方案主要有两种，一种是利用其物理性质，通过直径小于外泌体的滤膜将其捕获，另一种是利用其表面标志物，在芯片表面修饰外泌体特异性抗体，将其捕获。但目前尚无一种装置和方法，能同时分离血液中的循环肿瘤细胞和外泌体。
鉴于目前分离CTCs和外泌体方法的难点和癌症早期检测的需求，需要提供一种通量高，集成度高以及便携的可实现循环肿瘤细胞和外泌体同时分离的装置和方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离和富集体液成分的装置，该装置具有结构简单、便携式、小型化、高通量等优点，集多种组分分离功能为一体，能快速分离血液中的多种成分，如循环肿瘤细胞、血细胞、外泌体等，出口还可进行血清收集，且分离在全封闭系统内进行，不易混入其他杂质，从而有效防止污染。
为实现上述目的，本发明提供一种分离和富集体液成分的装置，包括分离腔室、集成于所述分离腔室内的多个分离单元、连接在第一分离单元入口处的进样器和连接于所述分离腔室出口处的收样器；
其中，每一个所述分离单元包括上层夹具、下层夹具和位于上层夹具与下层夹具之间的多孔滤膜，所述上层夹具中设置有进液口，所述下层夹具中设置有出液口，所述多孔滤膜的孔径直径小于所分离的组分的直径。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
(1)本发明提供一整套结构完善的体液多组分分离装置和方法，可同时分离血液样本中的循环肿瘤细胞、血细胞以及外泌体，最后得到血清，集成度高；
(2)本发明是在一个分离腔室中集成不同功能的分离单元，整个装置制作简单，成本低，便于实现；
(3)本发明的装置在使用时，将血液样本经过适当比例稀释直接进入分离装置，操作简单，操作人员无需技术培训即可进行使用；
(4)本发明可以将分离后的循环肿瘤细胞和外泌体直接在多孔滤膜上进行免疫染色分析蛋白表达，亦可经过处理做扫描电镜进行形貌观察，便于进行各类后续科学研究；
(5)本发明可以将分离后的循环肿瘤细胞和外泌体逆向冲洗收集，裂解并释放RNA做qPCR，以便进行癌症相关基因表达分析等研究。
附图说明
图1显示本发明一较佳实施方式的整体装置平面示意图。
图2显示图1所示装置的各分离单元的平面示意图。
图3显示图1所示装置在工作过程中，多孔滤膜对细胞进行分离的原理示意图。
图4显示图1所示装置在分离后对细胞进行收集的原理示意图。
【附图标记说明】
第一分离单元 101
第二分离单元 102
第三分离单元 103
第四分离单元 104
第五分离单元 105
进样器 106
分离腔室 107
收样器 108
第一上层夹具 11
封接层 12
第一多孔滤膜 13
第一下层夹具、第二上层夹具 14
第二多孔滤膜 21
第二下层夹具、第三上层夹具 22
第三多孔滤膜 31
第三下层夹具、第四上层夹具 32
第四多孔滤膜 41
第四下层夹具、第五上层夹具 42
第五多孔滤膜 51
第五下层夹具 52
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图详细介绍本发明的具体实施方式和技术路线。但是，必须指出的是，下述具体实施方式仅仅是本发明的一部分实例，并不能作为对本发明保护范围的限制。
本发明提供的分离和富集体液成分的装置是一次性集成化全封闭体液过滤系统，包括分离腔室、进样器，分离单元和收样器。
具体地，本发明的分离和富集体液成分的装置，包括分离腔室、集成于所述分离腔室内的多个分离单元、连接在第一分离单元入口处的进样器和连接于所述分离腔室出口处的收样器；
其中，每一个所述分离单元包括上层夹具、下层夹具和位于上层夹具与下层夹具之间的多孔滤膜，所述上层夹具中设置有进液口，所述下层夹具中设置有出液口，所述多孔滤膜的孔径直径小于所分离的组分的直径。
所述的分离腔室可根据具体要求加工制作，也可集成于现有的医用注射器中。
优选地，所述体液成分包括循环肿瘤细胞和外泌体。
优选地，所述分离单元整体呈圆饼状，横截面为圆形。
优选地，所述多孔滤膜的材料为聚乙烯或氧化铝材料，其中，过滤杂质、分离循环肿瘤细胞和血细胞的多孔滤膜优选由聚乙烯材料制成，过滤较大细胞外囊泡和分离外泌体的多孔滤膜优选为由氧化铝制成的阳极氧化铝薄膜。
优选地，所述多孔滤膜的孔径为20nm～50μm。
优选地，所述分离单元的数量为5。
在本发明一较佳实例中，所述分离单元的数量为5；所述多孔滤膜的孔径自上而下依次为50μm、8μm、3μm、200nm、30nm，以分别实现过滤血液样品中的杂质、循环肿瘤细胞、血细胞、较大的细胞外囊泡和外泌体的功能，即第一分离单元的多孔滤膜孔径为50μm，用于过滤杂质；第二分离单元的多孔滤膜孔径为8μm，用于分离循环肿瘤细胞；第三分离单元的多孔滤膜孔径为3μm，用于分离血细胞；第四分离单元的多孔滤膜孔径为200nm，用于过滤较大的细胞外囊泡；第五分离单元的多孔滤膜孔径为30nm，用于分离外泌体。
优选地，每一个所述分离单元的下层夹具上设置有通孔作为出液口。
更优选地，每一个所述分离单元的下层夹具上设置有数十个通孔作为出液口，所述通孔的直径为500μm～1mm。
优选地，所述多个分离单元被固定在所述分离腔室中，所述多孔滤膜的中心轴在同一条直线上，并与所述分离腔室的中心轴在同一条直线上。
以下详述本发明的一较佳实施方式。
如图1所示，其显示本发明一较佳实施方式的过滤分离装置，该装置用于癌症患者血液样本中多组分的分离和过滤。该装置包括分离腔室107，集成于分离腔室内的五个分离单元，分别为第一分离单元101、第二分离单元102、第三分离单元103、第四分离单元104和第五分离单元105，连接在第一分离单元入口处的进样器106、连接于分离腔室出口处的收样器108。其中，分离腔室使用现有的医用注射器。
图2显示图1装置中各分离单元的结构，其中，每一个分离单元均包括上层夹具、下层夹具和位于上层夹具和下层夹具之间的多孔滤膜。
其中，第一分离单元包括第一上层夹具11、第一下层夹具14以及封接于第一上层夹具和第一下层夹具之间的第一多孔滤膜13，该第一多孔滤膜即形成一封接层12。第一上、下层夹具之间封装第一多孔滤膜用双面胶粘贴或者悬涂PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)即可，有封接层的存在可防止分离单元漏液。进液口设置在第一上层夹具的中间，直径和进样器的直径匹配，用于向第一分离单元中注入血液样本，在第一下层夹具中设有数十个通孔作为出液口，直径可以为500μm到1mm，用于经第一级分离后的样本流出第一分离单元。
第二分离单元包括第二上层夹具14、第二下层夹具22以及封接于第二上层夹具和第二下层夹具之间的第二多孔滤膜21。第二上层夹具14恰好同时作为第一下层夹具，第一分离单元的出液口恰好同时作为第二分离单元的进液口，第一分离单元过滤后的液体恰好流入第二分离单元，二者共用一个夹具，有利于降低装置制备的复杂程度，减少样本丢失，第二分离单元的出液口同样设置在下层夹具中，在第二下层夹具中打数十个通孔，直径可以为500μm到1mm，用于经第二级分离后的样本流出第二分离单元。
第三分离单元包括第三上层夹具22、第三下层夹具32以及封接于第三上层夹具和第三下层夹具之间的第三多孔滤膜31。第三上层夹具22恰好同时作为第二分离单元的下层夹具，第二分离单元的出液口恰好同时作为第三分离单元的进液口，第二分离单元过滤后的液体恰好流入第三分离单元，二者共用一个夹具，出液口同样设置在下层夹具中，在第三下层夹具中打数十个通孔，直径可以为500μm到1mm，用于经第三级分离后的样本流出第三分离单元。
第四分离单元包括第四上层夹具32、第四下层夹具42以及封接于第四上层夹具和第四下层夹具之间的第四多孔滤膜41。第四上层夹具32恰好同时作为第三分离单元的下层夹具，第三分离单元的出液口恰好同时作为第四分离单元的进液口，第三分离单元过滤后的液体恰好流入第四分离单元，二者共用一个夹具，出液口同样设置在下层夹具中，在第四分离单元的下层夹具中打数十个通孔，直径可以为500μm到1mm，用于经第四级分离后的样本流出第四分离单元。
第五分离单元105包括第五上层夹具42、第五下层夹具52以及封接于第五上层夹具和第五下层夹具之间的第五多孔滤膜51。第五上层夹具42恰好同时作为第四分离单元的下层夹具，第四分离单元的出液口恰好为同时作为第五分离单元的进液口，第四分离单元过滤后的液体恰好流入第五分离单元，二者共用一个夹具，同样地，在第五下层夹具中设有数十个通孔作为出液口，直径为500μm到1mm，用于经第五级分离后的样本流出第五分离单元。
图2中，各分离单元的上层夹具和下层夹具采用聚烯烃类或聚酰胺类材料制成，优选地由聚乙烯或有机玻璃制成。各多孔滤膜的过滤孔径小于其所分离的组分的大小，从而使得要分离的组分被留在滤膜上以及滤膜与上层夹具之间，而水分及其他直径小于过滤孔径的组分通过滤膜，从而由设置在下层夹具中的出液口流出。第一多孔滤膜用于过滤杂质，其孔径为50μm；由于循环肿瘤细胞的直径为20μm左右，且其变形性相对白细胞较差，因此第二多孔滤膜用于分离循环肿瘤细胞，其孔径为8μm；由于白细胞直径在10μm左右，红细胞直径为5μm左右，因此第三多孔滤膜用于分离血细胞，其孔径为3μm；第四多孔滤膜用于过滤较大的细胞外囊泡，其孔径为200nm；外泌体直径为40-100nm之间，因此第五多孔滤膜用于分离外泌体，其孔径为30nm。
在本实施方式的装置中，各分离单元为具有一定厚度的圆饼状，各多孔滤膜的轴心位于同一条直线上，同时与外部封装的分离腔室的轴心在同一条直线上。该装置的过滤原理如图3所示：全血样本经适当稀释后，从第一分离单元的上层夹具的进液口流入，经过第一多孔滤膜的作用，去除杂质；除杂后的血液样本进入第二分离单元，经第二分离单元作用后，血液中少量的循环肿瘤细胞被捕获在第二多孔滤膜上，其余血液样本即进入第三分离单元中；在第三多孔滤膜的作用下，血样中的血细胞，包括红细胞和白细胞被捕获在第三多孔滤膜上，去除血细胞的血液样本随即流入第四分离单元中，样本中较大的细胞外囊泡被第四多孔滤膜滤除，而剩余样本中仅包含有外泌体和蛋白、DNA、RNA样本；这些样本再在第五多孔滤膜的作用下，外泌体被捕获，剩余血清通过设置在第五分离单元的下层夹具中的出液口流出，进而从分离腔室的出口流出，最后被放置在出口的离心管收集。
血液样本分离后，可将五个分离单元从注射器外壳中推出，分别把五个多孔滤膜拿出即可分别对其捕获的组分进行分析，收集原理如图4所示：从相反方向冲洗，即可得到收集在该多孔滤膜上的细胞及外泌体，细胞可在培养皿中继续培养，细胞和外泌体也可提取RNA组分做qPCR等进行基因组分析，细胞及外泌体可直接在滤膜上做免疫荧光染色进行蛋白表达分析，或固定在扫描电镜下进行形貌观察。出口收集的血清可进行蛋白组学和基因组学检测，研究癌症患者血清中癌症相关蛋白和基因的表达情况。
另外，血液样本还可提前进行红细胞破碎去除红细胞，这样可改善过滤过程中可能出现的多孔滤膜的堵塞情况，且被捕获在第三多孔滤膜中的白细胞亦可进行白细胞蛋白和基因组分析。
上述较佳实施方式说明本发明的分离和富集体液成分的装置，可同时分离血液中的多种组分，如癌症患者血液中的循环肿瘤细胞、血细胞、外泌体、血清，并且分离后的每种组分可以单独拿出进行细胞免疫学和基因组学分析，多功能分离集成于一体，可实现大量血液样本的快速分离。本发明的装置具有集成度高、通量高、易操作等优势，为各类体外体液样本的快速分离提供一种便捷有效的新途径。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种分离和富集体液成分的装置，其特征在于，包括分离腔室、集成于所述分离腔室内的多个分离单元、连接在第一分离单元入口处的进样器和连接于所述分离腔室出口处的收样器；
其中，每一个所述分离单元包括上层夹具、下层夹具和位于上层夹具与下层夹具之间的多孔滤膜，所述上层夹具中设置有进液口，所述下层夹具中设置有出液口，所述多孔滤膜的孔径直径小于所分离的组分的直径。
2.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述体液成分包括循环肿瘤细胞和外泌体。
3.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述分离单元整体呈圆饼状，横截面为圆形。
4.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述多孔滤膜的材料为聚乙烯或氧化铝材料。
5.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述多孔滤膜的孔径为20nm～50μm。
6.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述分离单元的数量为5。
7.根据权利要求6所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述多孔滤膜的孔径自上而下依次为50μm、8μm、3μm、200nm、30nm。
8.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，每一个所述分离单元的下层夹具上设置有通孔作为出液口。
9.根据权利要求8所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，每一个所述分离单元的下层夹具上设置有数十个通孔作为出液口，所述通孔的直径为500μm～1mm。
10.根据权利要求1所述的分离和富集体液成分的装置，其特征在于，所述多个分离单元被固定在所述分离腔室中，所述多孔滤膜的中心轴在同一条直线上，并与所述分离腔室的中心轴在同一条直线上。
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