CN115029306A - 一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体；具体包括以下步骤：选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质构建三维培养体系；向所述三维培养体系中接种鹿茸干细胞进行培养；通过超速离心法从步骤S2中培养的鹿茸干细胞中分离出外泌体；本发明中的所述鹿茸干细胞可长时间粘附在所述中空纤维的外侧，通过所述营养物质进行培养，使得鹿茸干细胞释放的外泌体可以被持续浓缩富集，保证大规模实验对外泌体的需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的直径为30-150 nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。近期研究发现，干细胞来源的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生方面存在良好的临床应用前景。在多种疾病/损伤模型中，间充质干细胞源性外泌体干预后已被证明可恢复组织功能，在体外试验中也有类似效果，主要由细胞外囊泡miRNAs介导，胞外囊泡具有脂质双层结构，容易穿透细胞膜，不易引起免疫反应，并且可防止内部RNA和蛋白质降解。因为外泌体不含DNA成分，避免不同个体间遗传信息传递带来的风险，与细胞治疗相比，间充质干细胞源性外泌体的非细胞疗法更安全、易操作，有巨大的潜力。
目前许多用于收集细胞外泌体的方法是基于从经典的二维细胞培养方法获得的培养基中分离而来，经过多轮离心或过滤，然后进行超速离心或密度梯度离心，这些方法需要大规模培养细胞获得的大体积的细胞培养液，而且间充质干细胞的扩增能力有限，外泌体的低产量阻碍了间充质干细胞用于外泌体研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，使得鹿茸干细胞可以长时间粘附在所述三维培养体系中，使得鹿茸干细胞释放的外泌体被持续的浓缩富集，保证了大规模实验需要。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体。
进一步的，一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；
S2、接种鹿茸干细胞
向所述三维培养体系中接种鹿茸干细胞进行培养；
S3、分离外泌体
通过超速离心法从步骤S2中培养的鹿茸干细胞中分离出外泌体。
进一步的，步骤S1中所述中空纤维的壁面厚度为1mm。
进一步的，步骤S2中所述鹿茸干细胞的培养条件为36℃、5%CO2。
进一步的，将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液。
进一步的，将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，低温保存。
进一步的，步骤S2中所述鹿茸干细胞为原代鹿茸干细胞在传代培养基上培养至3-5代的鹿茸干细胞。
进一步的，所述原代鹿茸干细胞采集于生长期30-50天的鹿茸。
本发明的有益效果是：
（1）、本发明中的所述鹿茸干细胞可长时间粘附在所述中空纤维的外侧，通过所述营养物质进行培养，使得鹿茸干细胞释放的外泌体可以被持续浓缩富集，保证了大规模实验对外泌体的需要。
（2）、本发明中所述鹿茸干细胞采集于生长期30-50天的鹿茸，容易获取增殖速度较快的鹿茸干细胞，便于提高外泌体的制备效率。
（3）、本发明通过高速离心法分离外泌体，使得制备的外泌体结构完整，杂质较少，粒径分布具有代表性，仅有单一主峰。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体；具体包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；所述中空纤维的壁面厚度为1mm；
S2、接种鹿茸干细胞
选取生长期30天鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割为0.6mm3碎块，取3g所述碎块，洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀A，向所述沉淀A中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，加入10ml DMEM原代培养液进行洗涤，其后在1200r/min下离心4min，收集沉淀B；将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于36℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，得到鹿茸干细胞，向所述三维培养体系中接种所述鹿茸干细胞在36℃、5% CO2下进行培养；所述鹿茸干细胞的接种量为1500个鹿茸干细胞每平方厘米；将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液；
S3、分离外泌体
将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
实施例2
一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体；具体包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；所述中空纤维的壁面厚度为1mm；
S2、接种鹿茸干细胞
选取生长期40天鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割为0.8mm3碎块，取3g所述碎块，洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀A，向所述沉淀A中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，加入10ml DMEM原代培养液进行洗涤，其后在1200r/min下离心4min，收集沉淀B；将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于36℃、5％CO2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，得到鹿茸干细胞，向所述三维培养体系中接种所述鹿茸干细胞在36℃、5% CO2下进行培养；所述鹿茸干细胞的接种量为1400个鹿茸干细胞每平方厘米；将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液；
S3、分离外泌体
将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
实施例3
一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体；具体包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；所述中空纤维的壁面厚度为1mm；
S2、接种鹿茸干细胞
选取生长期50天鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割为0.6mm3碎块，取3g所述碎块，洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀A，向所述沉淀A中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，加入10ml DMEM原代培养液进行洗涤，其后在1200r/min下离心4min，收集沉淀B；将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于36℃、5％CO2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，得到鹿茸干细胞，向所述三维培养体系中接种所述鹿茸干细胞在36℃、5% CO2下进行培养；所述鹿茸干细胞的接种量为1600个鹿茸干细胞每平方厘米；将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液；
S3、分离外泌体
将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
对比例1
一种制备鹿茸干细胞外泌体的方法，具体包括以下步骤：
S1、接种鹿茸干细胞
选取生长期30-50天鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割为0.6mm3碎块，取3g所述碎块，洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀A，向所述沉淀A中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，加入10ml DMEM原代培养液进行洗涤，其后在1200r/min下离心4min，收集沉淀B；将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于36℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2-4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，得到鹿茸干细胞，向平板培养基中接种所述鹿茸干细胞在36℃、5% CO2下进行培养；所述鹿茸干细胞的接种量为1500个鹿茸干细胞每平方厘米；将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液；
S2、分离外泌体
将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜（0.22μm）过滤后，得到外泌体进行低温保存。
对比例2
一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体；具体包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；所述中空纤维的壁面厚度为1mm；
S2、接种鹿茸干细胞
选取生长期60天鹿茸的间充质组织，洗去血污，将其切割为0.7mm3碎块，取3g所述碎块，洗涤干净后置于离心管中，在1200r/min离心4min，收集沉淀A，向所述沉淀A中加入30ml消化液，在40℃下振荡消化，在所述碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，并在1200r/min下离心4min，加入10ml DMEM原代培养液进行洗涤，其后在1200r/min下离心4min，收集沉淀B；将所述沉淀B均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于36℃、5％CO2的细胞培养箱中培养4h，其后正置培养瓶继续静置培养，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化，冻存，获得原代鹿茸干细胞；原代鹿茸干细胞在传代培养基上进行传代培养，传至3-5代，得到鹿茸干细胞，向所述三维培养体系中接种所述鹿茸干细胞在36℃、5% CO2下进行培养；所述鹿茸干细胞的接种量为1500个鹿茸干细胞每平方厘米；将所述鹿茸干细胞培养至90%汇合时，收集上清液；
S3、分离外泌体
将所述上清液置于离心管中，经无菌滤膜（0.22 μm）过滤后，在滤液中加入等体积的XBP 试剂，混匀后静置1 h，将上述样品加入到spin 柱内，经600r/min 离心1 min 后弃去滤液，将spin 柱放回同一离心管中，加入10 mL 缓冲液XWP 并6000r/min 离心4 min；离心后将spin 柱转移至新的收集管中，并在spin 柱中加入1 mL XE，孵育1 min 后，经6000r/min 离心4 min，收集洗脱滤液，于-80 ℃保存备用。
【注】所述营养液为语纯生物-MSCM-sf间充质干细胞专用培养基。
检测实施例1-实施例3以及对比例1-2培养的外泌体，检测结果显示，实施例1-3制备的外泌体量大，能满足大规模实验的需求，且结构完整，杂质较少，粒径分布具有代表性，仅有单一主峰；对比例1制备的外泌体相对于实施例1-实施例3，获得外泌体量大大降低，不能满足大规模实验的需求；对比例2制备的外泌体相对于实施例1-实施例3，获得外泌体量降低，同时结构完整度低于实施例，杂质较多，粒径分布不均。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：利用中空纤维构建三维培养体系，并向所述三维培养体系中灌注营养物质培养鹿茸干细胞，通过培养的所述鹿茸干细胞制备外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建三维培养体系
选取具有分子量截留作用的中空纤维，将多个所述中空纤维锚定在封闭系统中，向所述中空纤维之间的间隙内灌注营养物质；
S2、接种鹿茸干细胞
向所述三维培养体系中接种鹿茸干细胞进行培养；
S3、分离外泌体
通过超速离心法从步骤S2中培养的鹿茸干细胞中分离出外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：步骤S1中所述中空纤维的壁面厚度为1mm。
4.根据权利要求2所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：步骤S2中所述鹿茸干细胞的培养条件为36℃、5%CO2。
5.根据权利要求4所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：将所述鹿茸干细胞培养至93%汇合时，收集上清液。
6.根据权利要求5所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：将所述上清液置于离心管中，在4℃下，经过300r/min离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、2000r/min下离心15min；取上清液置于新的离心管中，在4℃、20000r/min下离心30min；取上清液置于新的超速离心管中，在4℃、100000r/min下离心2h；收集沉淀，经过无菌PBS重悬，在经过无菌滤膜过滤后，低温保存。
7.根据权利要求2所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：步骤S2中所述鹿茸干细胞为原代鹿茸干细胞在传代培养基上培养至3-5代的鹿茸干细胞。
8.根据权利要求7所述的一种应用三维培养体系高效制备鹿茸干细胞外泌体的方法，其特征在于：所述原代鹿茸干细胞采集与生长期30-50天的鹿茸。
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- 2022-06-21 CN CN202210704958.3A patent/CN115029306A/zh active Pending
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