CN111321108A - 一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法。所述方法为将含有细胞的样本铺在装有完全培养基的培养皿中，在完全培养基中添加无外泌体血清和青霉素和链霉素，培养后收集细胞上清；膜过滤器预处理后离心取上清，用等体积的PEG6000混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；透析；离心，不连续的碘克沙醇梯度处理；再离心，从梯度顶部收集等体积的12个组分；然后对碘克沙醇梯度6‑9组分的外泌体进行低温高速离心取沉淀即为纯化后的外泌体。采用本发明的方法得到的外泌体纯度高且耗时较短。
Description
技术领域
本发明涉及生物质纯化领域，尤其涉及一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小囊泡。它广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。作为人体内的一类重要囊泡，外泌体自2013年起逐步成为科研热点。
当前有多种纯化提取外泌体的方法,最经典的外泌体分离方法是超速离心法，超速离心法是通过外泌体与其他生物组分密度的微小差异进行分离，该方法分离得到的外泌体纯度较高，但是耗时较长且回收率不稳定，得率较低，重复离心可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低质量。还有常用的密度梯度离心法，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/mL的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。此外还有PEG试剂盒、免疫提取等方法，这些外泌体分离方法各有优缺点，尚无统一、高效的分离纯化方法，严重影响提取效率及后期分析结果的一致性。
因此，急需开发一种简单快速高纯度的外泌体分离方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、高纯度的外泌体分离方法。
为实现上述目的，本发明提供一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于,包含如下步骤：
S1、用膜过滤器预处理细胞上清或含有外泌体的液体样本，第一次离心取上清；增加转速第二次离心取上清；
优选的，用0.22μm膜过滤器预处理细胞上清，2000×g，离心10min,取上清；10000×g离心30min,取上清；
S2、用等体积的PEG6000与上清混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；
优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，2-6℃孵育1-3h，然后3000×g离心8-12min,去上清，沉淀重悬于PBS中；
更优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，4℃孵育2h，然后3000×g离心10min,去上清，沉淀重悬于1mL PBS中；
S3、将上述重悬液加到透析袋中透析；透析后的样本高速低温离心；
优选的，将上述重悬液加到10KD的透析袋中，透析1h；透析后的样本在100000×g条件下，4℃离心17min；
S4、透析后所得使用不连续的碘克沙醇梯度进行处理；
优选的，透析后所得添加40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL 20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度；
S5、低温高速离心，从梯度顶部收集等体积的12个组分；然后对碘克沙醇梯度6-9组分的外泌体进行低温高速离心取沉淀即为纯化后的外泌体；
优选的，在100000×g条件下，4℃离心2h，从梯度顶部收集等体积的12个组分；用100000×g超速离心法在4℃下对碘克沙醇梯度6-9组分的外泌体进行2h；所述碘克沙醇梯度6-9组分为采用PBS进行稀释，稀释体积比例为1:10。
进一步，还包括S6步骤，将所得纯化后的外泌体重新悬浮在PBS中进行后续分析。
进一步，所述S1步骤中的细胞上清的收集方式为，将含有细胞的样本铺在装有完全培养基的培养皿中，在完全培养基中添加无外泌体血清和青霉素和链霉素，待细胞密度达到80％-90％收集细胞上清。
进一步，所述S2步骤中，所述无外泌体血清的添加量为完全培养基体积的10％；所述青霉素和链霉素的添加量为完全培养基体积的1％。青霉素的终浓度为100u/mL，链霉素的终浓度为100ug/mL.
进一步，所述含有外泌体的液体样本为血浆、脑脊液、尿液、乳液、淋巴液或唾液。
本发明提供的一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法，通过碘克沙醇作为介质进行梯度离心，得到的外泌体纯度高且耗时较短。
本发明的方法使用范围广，既适用于细胞上清，又适用于含有外泌体的液体样本，比如血浆、脑脊液、尿液、乳液、淋巴液或唾液。
附图说明
图1是不同处理方法的结果比较图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
S1、用0.22μm膜过滤器(美国Millipore公司)预处理5mL人的血浆，2000g，离心10min,取上清；10000g离心30min,取上清；
S2、用等体积的8％的PEG6000与上清混合，在4℃孵育2h，然后3000g离心10min,去上清，沉淀重悬与1mL PBS中。
S3、外泌体悬液加到10KD的透析袋中，透析1h；透析后的样本在100000×g条件下，4℃离心17min。
S4、透析后的样本使用不连续的碘克沙醇(美国Thermo)梯度进行处理。通过添加1.2mL40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL 20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度。
S5、在100000×g条件下，4℃离心2h，从梯度顶部收集等体积(400μL)的12个组分。用100000×g超速离心法在4℃下对碘克沙醇梯度6-9组分(1:10在PBS中稀释)的外泌体进行2h。
S6、将外泌体重新悬浮在100μL的PBS中进行，取10μL外泌体悬液用透射电子显微镜放大150000倍进行观察，得到图1和表1。其中：
PEG6000表示只采用了PEG6000单独沉淀外泌体，没有其他处理；即采用了S1-S2，但是重悬的体积为100μLPBS,直接进入S6步骤后的结果；
普通超离表示只采用了普通超速离心处理外泌体，没有其他处理；即采用了S1,S5步骤中的在100000×g条件下，4℃离心2h，直接进入S6步骤后的结果；
碘克沙醇密度梯度离心表示只采用了碘克沙醇密度梯度离心处理外泌体，没有其他处理；即采用了S1，S4步骤中只进行通过添加1.2mL 40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度，S5-S6步骤后的结果；
PEG6000+普通超离表示采用了PEG6000沉淀和普通超速离心共同处理外泌体；即采用了S1-S3，S5步骤中的在100000×g条件下，4℃离心2h，直接进入S6步骤后的结果；
PEG6000+透析+碘克沙醇密度梯度表示采用了PEG6000沉淀，透析和碘克沙醇密度梯度离心共同处理外泌体。即采用了S1-S6步骤后的结果。
表1采用不同处理的实验结果表(单位：h)
从图1可以看出：PEG6000单独沉淀外泌体时有很多PEG颗粒随外泌体一起沉淀，导致外泌体不纯；普通超离的效果要比PEG6000好很多，但是也有杂质影响，且费时长；单独使用碘克沙醇密度梯度离心纯度可以，但是耗时长达16.67h；PEG6000联合普通超速离心，减少超离的时间，但是没有办法除去PEG颗粒；PEG6000结合透析及联合碘克沙醇密度梯度离心，减少密度梯度离心的时间，得到的外泌体纯度高而且耗时短。
此实施例中的细胞上清可以替换成脑脊液、尿液、乳液、淋巴液或唾液，具有同样的效果。
实施例2：
S0、将人的非小细胞肺癌细胞A549铺在15cm的培养皿中，在30mL完全培养基中添加10％的无外泌体血清和1％青霉素/链霉素，培养48h。
S1、用0.22μm膜过滤器(美国Millipore公司)预处理30mL细胞上清，2000g，离心10min,取上清；10000g离心30min,取上清；
S2、用等体积的8％的PEG6000与上清混合，在4℃孵育2h，然后3000g离心10min,去上清，沉淀重悬与1mL PBS中。
S3、外泌体悬液加到10KD的透析袋中，透析1h；透析后的样本在100000×g条件下，4℃离心17min。
S4、透析后的样本使用不连续的碘克沙醇(美国Thermo)梯度进行处理。通过添加1.2mL40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL 20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度。
S5、在100000×g条件下，4℃离心2h，从梯度顶部收集等体积(400μL)的12个组分。用100000×g超速离心法在4℃下对碘克沙醇梯度6-9组分(1:10在PBS中稀释)的外泌体进行2h。
S6、将外泌体重新悬浮在100μL的PBS中进行，取10μL外泌体悬液用透射电子显微镜放大150000倍进行观察，发现得到的外泌体纯度高而且耗时短。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于,包含如下步骤：
S1、用膜过滤器预处理细胞上清或含有外泌体的液体样本，第一次离心取上清；增加转速第二次离心取上清；
优选的，用0.22μm膜过滤器预处理细胞上清，2000×g，离心10min,取上清；10000×g离心30min,取上清；
S2、用等体积的PEG6000与上清混合，低温孵育，然后离心,去上清，沉淀重悬PBS中；
优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，2-6℃孵育1-3h，然后3000×g离心8-12min,去上清，沉淀重悬于PBS中；
更优选的，用等体积的8％的PEG6000与上清混合，4℃孵育2h，然后3000×g离心10min,去上清，沉淀重悬于1mL PBS中；
S3、将上述重悬液加到透析袋中透析；透析后的样本高速低温离心；
优选的，将上述重悬液加到10KD的透析袋中，透析1h；透析后的样本在100000×g条件下，4℃离心17min；
S4、透析后所得使用不连续的碘克沙醇梯度进行处理；
优选的，透析后所得添加40％碘克沙醇溶液，然后仔细分层1.2mL 20％、10％和5％碘克沙醇溶液，形成梯度；
S5、低温高速离心，从梯度顶部收集等体积的12个组分；然后对碘克沙醇梯度6-9组分的外泌体进行低温高速离心取沉淀即为纯化后的外泌体；
优选的，在100000×g条件下，4℃离心2h，从梯度顶部收集等体积的12个组分；用100000×g超速离心法在4℃下对碘克沙醇梯度6-9组分的外泌体进行2h；所述碘克沙醇梯度6-9组分为采用PBS进行稀释，稀释体积比例为1:10。
2.如权利要求1所述高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于，还包括S6步骤，将所得纯化后的外泌体重新悬浮在PBS中进行后续分析。
3.如权利要求1所述高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于，所述S1步骤中的细胞上清的收集方式为，将含有细胞的样本铺在装有完全培养基的培养皿中，在完全培养基中添加无外泌体血清和青霉素和链霉素，待细胞密度达到80％-90％收集细胞上清。
4.如权利要求1或2所述高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述无外泌体血清的添加量为完全培养基体积的10％；所述青霉素和链霉素的添加量为完全培养基体积的1％。
5.如权利要求1所述高纯度外泌体密度梯度离心的方法，其特征在于，所述含有外泌体的液体样本为血浆、脑脊液、尿液、乳液、淋巴液或唾液。
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