CN114317400A - 外泌体分离纯化检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种外泌体分离纯化检测方法，包括以下步骤：S1：上清液的提取：收集含有外泌体的待提取液的上清液；S2：二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级切向流超滤装置，将超滤后的液体回收得到渗透液；之后将继续所述渗透液通过所述第二级切向流超滤装置中，回收过滤液得到富集液；S3外泌体粒径、浓度检测：将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果以及S4：冻干，本发明还提供了外泌体分离纯化检测装置，本发明能够制备获得纯度较高的外泌体产品，具有较高的商业化与推广价值。

Description

外泌体分离纯化检测方法及装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种外泌体分离纯化检测方法及装置。

背景技术

外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，广泛存在于细胞培养上清液、血液、唾液、尿液、精液、羊水以及其它生物体液中。外泌体来源于多种细胞，例如B细胞，T细胞，树突状细胞、红细胞和肿瘤细胞均可释放外泌体。外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，可以调控细胞代谢、细胞凋亡以及免疫调节等作用，可作为医疗美容、再生医学、疾病诊断等行业，被誉为细胞治疗的下一个前沿领域。因为外泌体在各个领域具有巨大应用价值，研发出能够稳定、成熟的外泌体检测设备和方法是将外泌体运用在生物医药研发以及生产上的前提。目前，外泌体的检测方法主要有流式细胞术、蛋白免疫印迹、动态光散射、酶联免疫吸附试验等。

超速离心一直被视为分离提取外泌体的金标准。该方法根据沉降系数、大小和形状多次差速离心来进行分离得到外泌体。先收集间充质干细胞(MSC)培养基上清液，先在4℃条件下，300g-500g离心10分钟，得到上清液1和沉淀1，这一步骤是为了去除活细胞；接下来对上清液1在4℃条件下2000g离心10～20分钟，去除死细胞，得到上清液2和沉淀2；对上清液2进行离心，离心条件为4℃，10,000g，20～30分钟，得到上清液3和沉淀3，这一步是为了去除细胞碎片；接下来对上清液3进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70～120分钟，得到上清液4和沉淀4，这一步是为了去除囊泡结构；之后对上清液4进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70～120分钟，得到上清液5和沉淀5，沉淀5即为外泌体。接下来使用PBS重悬外泌体，即可得到外泌体悬液。该项技术耗时大约5～6个小时。

然而，超速离心法处理样本量较小，得到的外泌体纯度也不高，并且可能对外泌体造成一定的损伤，步骤繁琐，费时费力，对操作人员依赖性强也不适用于工业化的大规模生产。此外，外泌体的主要挑战之一是消除纳米级的污染物，包括干扰外泌体标志物解析的游离核酸和脂蛋白。超速离心是目前分离外泌体的主要技术，但是它也比较难以符合当前临床和科学研究的标准，主要是由于该方法得到的外泌体纯度不足，产量较低，完整性欠佳且分离纯化操作耗时长。

流式细胞术是在细胞水平上对单个细胞或者外泌体等其他粒子进行快速的多个参数的定量分析。流式细胞术可以快速的分析上万个生物粒子，具有精度高、速度快、准确性好等优点。外泌体按照差速离心法提取出来之后，接下来进行一抗和二抗孵育，加入anti-CD63抗体，混匀，进行一抗孵育25～35min；一抗孵育后加入荧光二抗，混匀，室温避光孵育25～35min；上机检测一般推荐使用美国Beckman Coulter公司的CytoFLEX S型号流式细胞仪。接着进行参数设施，所述参数设置的步骤具体包括：1)建立FSC/VSSC散点图，圈定500nm以下的微颗粒分布区域，设定门；2)建立CD63参数散点图，设定门；然后按正常程序打开流式细胞仪，建立FSC/VSSC散点图，使用美国Beckman Coulter公司的Megamix-Plus FSCbeads，分别用100nm、200nm、300nm和500nm的微球，调整gain值，圈定500nm以下的微颗粒分布区域，设定门，同时以PBS溶液为阴参，去除PBS溶液中本身颗粒的干扰；同样的电压条件下，样本检测管分布于门内的包含囊泡微颗粒；建立CD63参数散点图，设定门，门内CD63阳性的囊泡微颗粒，即为外泌体；上机检测的上机速度设定为中速，使上机样品的机器读取速度为4000-8000个/秒；最后利用流式细胞仪分析软件CytExpert对数据进行分析，得到外泌体的定量检测结果。整个实验完成耗时大约4～5个小时。

流式细胞术虽然方便快捷，可以保留外泌体的生物结构和形态，但是样品固定和脱水会影响尺寸和形态，且为非定量的方法。而且需要在提取外泌体之后，分别孵育一抗和荧光二抗之后才能上机检测，步骤比较繁琐。此外，流式细胞术定量的是荧光二抗的信号，不是直接定量的外泌体本身。此外，外泌体的其他信息，比如说粒径、颗粒浓度等信息也无从得知，有限的参数信息将进一步限制外泌体在大规模生产制备纯化上的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是供一种外泌体纯化检测方法，以解决目前市面上常规外泌体纯化检测方法中纯化及检测过程繁琐、历时较长、成本高的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种外泌体分离纯化检测方法，包括以下步骤：

S1：上清液的提取：收集含有外泌体的待提取液的上清液；

S2：二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级切向流超滤装置，将超滤后的液体回收得到渗透液；之后将继续所述渗透液通过所述第二级切向流超滤装置中，回收过滤液得到富集液；

S3外泌体粒径、浓度检测：将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果；

S4：冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。

作为优选的方案，所述步骤S2中，所述第一级切向流超滤装置的过滤膜孔径为大于等于0.18μm；所述步骤S3中，所述第二级切向流超滤装置的过滤膜孔径为小于等于0.03μm。并且第二级切向流超滤系统在第一级切向流超滤系统的下游。外泌体能够穿过第一级切向流超滤系统的超滤膜，外泌体不能够穿过第二级切向流超滤系统的超滤膜。

作为优选的方案，所述步骤S5的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。作为优选的方案，所述步骤S4中，所述富集液与磷酸盐缓冲溶液的体积配比为6：4。

作为优选的方案，所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞上清液、血液、尿液、唾液中的一种或多种。

作为优选的方案，所述步骤S4中，还包括对富集液中外泌体的浓度以及粒径范围进行监测的步骤：检测外泌体浓度范围大于等于10⁹个/ml，粒径范围为30nm-150nm，若外泌体的浓度以及粒径范围处于上述范围中，则进入步骤S4；若外泌体的浓度以及粒径范围不处于上述任一范围中，则重返步骤S2进行二次切向超滤处理。

本发明通过设计的二次两级切向流超滤方法提高外泌体浓度并且降低其它杂质的浓度，且进一步地通过富集液与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，控制外泌体溶液的浓度以及外泌体的粒径，对纯度进行把控，最终制备获得的产品纯度高，且方法简单。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供一种外泌体纯化检测设备，以解决目前市面上常见外泌体纯化检测设备生产效率低，操作复杂的问题。

本发明采用的技术方案如下：一种外泌体纯化检测设备，包括通过管路连通的切向流超滤系统、纳米颗粒示踪分析系统以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤系统包括相连通的第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置，所述第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤装置的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径；所述第二级切向流超滤装置与所述纳米颗粒示踪分析系统的进口相连接。

作为优选的方案，所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口、第一级出口，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口、第二级出口，且所述第一级出口与所述第二级进口相连通。

9.根据权利要求8所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述纳米颗粒示踪分析系统还与所述第一级进口相连通。

10.根据权利要求7所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述纳米颗粒示踪分析系统还与一冻干冷藏系统相连接。

11.根据权利要求10所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置、冷冻干燥机、低温仓储空间，且所述机械驱动装置用于将冷冻干燥机冷冻后的产品移动至低温仓储空间

本设备通过改进切向流超滤法为二次两级切向超滤系统，能够自动制备分离纯化细胞培养基上清液，能够全程实现自动化，减少人工操作时长以及降低常规分离提纯外泌体过程中的损伤和污染，然后使用纳米颗粒追踪分析技术自动分析收集到的浓缩液的浓度，并且大大节省外泌体的分离纯化制备时间。

附图说明

图1为本发明中外泌体纯化一体化设备的结构示意图；

图2为本发明的工作原理示意图；

图3为本发明的工作过程图。

附图标记说明：

1、切向流超滤系统；11、第一级切向流超滤装置；111、第一级进口；112、第一级出口；12、第二级切向流超滤装置；121、第二级进口；122、第二级出口；2、纳米颗粒示踪分析系统；3、冷冻干燥机；4、机械驱动装置；5、低温仓储空间。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

实施例1：

S1：收集含有外泌体的细胞培养基的上清液；

S2二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于于所述外泌体直径，将其截留，回收过滤液得到富集液；

所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.18μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.03μm；

S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到10⁹个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行再次的二次切向过滤处理；

S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例2：

S1：收集含有外泌体的细胞培养基的上清液；

S2二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体直径，将其截留，回收过滤液得到富集液；

所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.19μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.02μm；

S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到10⁹个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行再次的二次切向过滤处理；

S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例3

S1：收集含有外泌体的细胞培养基的上清液；

S2二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体直径，将其截留，回收过滤液得到富集液；

所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.20μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.01μm；

S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到10⁹个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行再次的二次切向过滤处理；

S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏系统由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警系统。

实施例4：

本实施例提供了外泌体纯化一体化设备，具体包括通过管路依次相连通的切向流超滤系统1、纳米颗粒示踪分析系统2以及用于驱动的蠕动泵；所述蠕动泵用于驱动设备内部液体的流动；通过加入含有外泌体的待提取液至设备中，待提取液依次流经切向流超滤系统1、纳米颗粒示踪分析系统2完成外泌体的纯化；

所述切向流超滤系统1包括相连通的第一级切向流超滤装置11与第二级切向流超滤装置12，所述第一级切向流超滤装置11上设置有第一级进口111、第一级出口112，所述第二级切向流超滤装置12上设置有第二级进口121、第二级出口122，且所述第一级出口112与所述第二级进口121相连通，使得通入的待提取液先进入至第一级切向流超滤装置11进行超滤，之后流入到第二级切向流超滤装置12中进行再次地超滤；

所述第一级切向流超滤装置11与第二级切向流超滤装置12内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤系统1超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤系统1超滤膜的孔径；且第二级切向流超滤系统1超滤膜的孔径小于通入的待提取液中外泌体的直径；

所述第二级切向流超滤装置12与所述纳米颗粒示踪分析系统2相连接；

所述第二级切向流超滤装置12还与一冻干冷藏系统相连接，所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置4、冷冻干燥机3、低温仓储空间5，且所述机械驱动装置4用于将冷冻干燥机3冷冻后的产品移动至低温仓储空间5。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：上清液的提取：收集含有外泌体的待提取液的上清液；

S2：二次切向超滤：将S1收集的上清液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级切向流超滤装置，将超滤后的液体回收得到渗透液；之后将继续所述渗透液通过第二级切向流超滤装置中，回收过滤液得到富集液；

S3外泌体粒径、浓度检测：将步骤S2得到的富集液与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果；

S4：冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。

2.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述第一级切向流超滤装置的过滤膜孔径为大于等于0.18μm；所述步骤S3中，所述第二级切向流超滤装置的过滤膜孔径为小于等于0.03μm。

3.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：所述步骤S5的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。

4.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：所述步骤S4中，所述富集液与磷酸盐缓冲溶液的体积配比为6：4。

5.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞上清液、血液、尿液、唾液、羊水、尿液、精液中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化检测方法，其特征在于：所述步骤S4中，还包括对富集液中外泌体的浓度以及粒径范围进行监测的步骤：检测外泌体浓度范围大于等于10⁹个/ml，粒径范围为30nm-150nm，若外泌体的浓度以及粒径范围处于上述范围中，则进入步骤S4；若外泌体的浓度以及粒径范围不处于上述任一范围中，则重返步骤S2进行二次切向超滤处理。

7.一种外泌体分离纯化检测装置，其特征在于：包括通过管路连通的切向流超滤系统(1)、纳米颗粒示踪分析系统(2)以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤系统(1)包括相连通的第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)，所述第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤装置(11)的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置(12)的超滤膜孔径；所述第二级切向流超滤装置(12)与所述纳米颗粒示踪分析系统(2)的进口相连接。

8.根据权利要求7所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口(111)、第一级出口(112)，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口(121)、第二级出口(122)，且所述第一级出口(112)与所述第二级进口(121)相连通。

9.根据权利要求8所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述纳米颗粒示踪分析系统(2)还与所述第一级进口(111)相连通。

10.根据权利要求7所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述纳米颗粒示踪分析系统(2)还与一冻干冷藏系统相连接。

11.根据权利要求10所述的一种外泌体纯化一体化装置，其特征在于：所述冻干冷藏系统包括机械驱动装置(4)、冷冻干燥机(3)、低温仓储空间(5)，且所述机械驱动装置(4)用于将冷冻干燥机(3)冷冻后的产品移动至低温仓储空间(5)。

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