CN115109741A - 一种脂质筏的快速分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脂质筏的快速分离方法，利用碘克沙醇对动物组织匀浆裂解后的上清液进行密度梯度离心，鉴定，获得。本发明建立一种免于洗涤剂处理且能获得不同动物不同组织内脂质筏的快速分离方法，路线不仅离心时间短、效率高、前处理过程简单，且适用于不同动物组织内脂质筏的快速分离，填补了脂质筏快速分离技术的空白。
Description
技术领域
本发明涉及一种从动物组织中快速分离脂质筏的方法。
背景技术
脂质筏是通过多种脂质-蛋白及脂质-脂质互作形成的一种富含胆固醇、鞘磷脂、多种信号蛋白的微域，分布于细胞膜上，其特点表现为分子尺寸小(10-200nm)、高度动态、异质有序。脂质筏结构上分布着大量有关细胞生长、增殖、分化、凋亡相关的受体信号蛋白，并且这些信号蛋白的活性严重依赖于脂质筏的结构，因此脂质筏也被视作细胞内外信号传递的功能平台。
常规提取脂质筏是基于膜脂质和蛋白质在洗涤剂内不同的溶解性，将洗涤剂抵抗性的膜定义为脂质筏，洗涤剂溶解性的膜定义为非脂质筏。但是这种技术有着许多缺陷：
1)洗涤剂抵抗膜中蛋白的组成强烈依赖于所选择洗涤剂的种类；
2)温度或洗涤剂浓度的细微变化会产生不同的结果并显着改变膜蛋白的组成，造成了不同研究之间矛盾性的结果；
3)该技术路线的离心时间长达16～24h，而且产生的脂质筏部分也容易受到其他膜组分的污染。
发明内容
基于此，有必要提供一种脂质筏的快速分离方法，无需采用洗涤剂处理组织，仅利用碘克沙醇进行更快速的密度梯度分离，且膜蛋白不易受到污染。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供不同浓度梯度碘克沙醇在从动物组织中分离脂质筏中的应用。所述动物组织选自心脏、肝脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、附睾脂肪中的一种或多种。
本发明还提供一种脂质筏的快速分离方法，包括如下步骤：获取动物组织匀浆，裂解后离心，取上清液，转入新的离心管中；向含所述上清液的离心管中加入60±5％碘克沙醇溶液，混匀得高密度底层；再加入35±3％碘克沙醇溶液形成中密度层，再加入5±1％碘克沙醇溶液形成低密度层，转移至超速离心机内进行密度梯度超速离心，转速不低于53000rpm，离心2～3h，从上到下分级收集在中密度层和低密度层的界面处形成的明亮条带层，鉴定，即得。
在其中一些实施例中，上清液、高密度底层中60％碘克沙醇溶液、中密度层35％碘克沙醇溶液与低密度层5％碘克沙醇溶液的体积比为(0.4～0.6)：2：0.75：0.75。
在其中一些实施例中，所述鉴定的方法为：每个分级收集的样品体积为0.4～0.6mL，采用BCA法测定每个级份的总蛋白含量，跑胶，转膜，封闭，孵育一抗脂质筏标志物Flotillin和二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG，显影。
在其中一些实施例中，所述跑胶采用10％分离胶和5％浓缩胶。
在其中一些实施例中，所述转膜采用聚偏二氟乙烯膜。
在其中一些实施例中，所述动物组织选自心脏、肝脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、附睾脂肪中的一种。所述动物可以为小鼠或者大鼠等。
在其中一些实施例中，裂解后离心转速为1000×g，4℃条件离心10min。
在其中一些实施例中，所述获取动物组织匀浆的方法为：取出组织，清除血污，每100mg组织加入0.5mLpH为7.8的Tris-HCL缓冲液，并加入2颗3mm钢珠，用高速低温组织研磨仪在60Hz、-20℃条件下研磨30s，暂停15s，重复研磨多次，获得均一的组织匀浆。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明建立一种免于洗涤剂快速分离组织内脂质筏的方法，首次实现利用碘克沙醇进行更快速的密度梯度分离脂质筏，分离时间由传统方法的16-24h缩短到2-3h。本发明获得的脂质筏富集在中低密度碘克沙醇层的界面附近，克服了传统方法分离的脂质筏易受到其他组分污染的难题。本发明可以更高效率地分离出不同动物不同组织内的脂质筏，适用范围广。
附图说明
图1为本发明脂质筏的分离方法的工艺流程示意图。
图2为本发明对小鼠心脏、肝脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、附睾脂肪中分离得到的脂质筏及其鉴定图；其中胶图中的1至8分别对应分级收集的8份条带层。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
如图1所示，本发明提供一种从动物组织中快速分离脂质筏的方法，包括如下步骤：
S1，获取动物组织匀浆：将组织取出，清除血污，称重100mg组织于1.5mL离心管内，加入0.5mL试剂A(20mM Tris-HCL,250mM Sucrose,6mM EDTA,1mM CaCl2，pH＝7.8)，并加入2颗3mm钢珠，用高速低温组织研磨仪(KZ-Ⅲ-FP,武汉塞维尔生物科技有限公司)在60Hz、-20℃研磨30s，暂停15s，重复研磨3次，得呈均一的混合液。
S2，将动物组织匀浆置于冰上裂解30min，期间每隔5min上下颠倒摇匀，确保组织完全裂解。裂解后离心：1000×g,4℃条件下离心10min，取上清液0.4-0.6mL，转入新的离心管中。
S3，密度梯度超速离心：
向含上清液的离心管中加入2mL60％碘克沙醇溶液(Sigma,D1556-250ML)，混匀，转入4mL超净离心管(Beckman,344062)内，得高密度底层；再加入0.75mL35％碘克沙醇介质溶液形成中密度层，再加入0.75mL5％碘克沙醇介质溶液形成低密度层，转移至超速离心机内进行密度梯度超速离心，转速为53000rpm，离心2.5h，从上到下分级收集8份，每份0.5mL,其中在中密度层和低密度层的界面处形成的明亮条带即为目标脂质筏。
S4，鉴定：
分级完成后采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp,BL521A)测定每个级份样品的总蛋白含量，然后制备10％分离胶和5％浓缩胶，每孔上样10μg蛋白进行电泳，待蓝色的溴甲酚蓝指示剂跑到底部时进行转膜，采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Bio-rad)，转膜完成后进行封闭、孵育一抗脂质筏标志物Flotillin(ABClonal,A6220)、二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG(ABClonal,AS014)，进行显影。
本发明实质建立一种免于洗涤剂处理、利用不同含量的碘克沙醇密度梯度快速分离获得组织内脂质筏的方法，该技术路线不仅离心时间短、效率高、前处理过程简单，且适用于小鼠或者大鼠等不同动物不同组织内脂质筏的快速分离，填补了脂质筏快速分离技术的空白。
下面进行举例说明：
实施例1
本实施例对小鼠颈椎脱臼处死后进行解剖，将心脏取出，清除血污，称重100mg心脏于1.5mL离心管内，加入0.5mL试剂A(20mM Tris-HCL,250mM Sucrose,6mM EDTA,1mMCaCl2，pH＝7.8),并加入2颗3mm钢珠，用高速低温组织研磨仪(KZ-Ⅲ-FP,武汉塞维尔生物科技有限公司)在60Hz、-20℃研磨温度下运行30s，暂停15s，共计研磨3次，研磨完成后即可看到心脏呈均一的混合液。将匀浆之后的心脏组织匀浆取出，置于冰上裂解30min,期间每隔5min上下颠倒摇匀，确保心脏被完全裂解。将裂解后的心脏裂解液在1000×g、4℃条件下离心10min，取上清液置于于另一新离心管内待用，沉淀被丢弃。
在含心脏裂解上清液的离心管中添加2mL60％碘克沙醇介质溶液(Sigma,D1556-250ML)并混匀，然后将混合物置于4mL超净离心管内(Beckman,344062)，然后依次加入0.75mL35％级份的碘克沙醇溶液和5％级份的碘克沙醇溶液，将超净离心管放置于适配器内并悬挂在SW60Ti转子上，用Avanti JXN-26(Beckman)超速离心机在53000rpm、4℃下超离2.5h。超离完成后，在35％和5％界面附近可见一条均一、明亮的条带，即为目标脂质筏，从上向下用移液器收集8个级份，每个级份样品0.5mL。
分级完成后，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp,BL521A)测定每个级份样品的总蛋白含量，然后制备10％分离胶、5％浓缩胶，每孔上样10μg蛋白进行电泳，待蓝色的溴甲酚蓝指示剂跑到底部时进行转膜，采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Bio-rad)，转膜完成后进行封闭，孵育一抗脂质筏标志物Flotillin(ABClonal,A6220)和二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG(ABClonal,AS014)，进行显影，结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2样品为从心脏中提取分离的脂质筏。
实施例2
本实施例的方法步骤与实施例1相同，区别仅在于：解剖取出的组织为肝脏，显影结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2和3的样品为从肝脏中提取分离的脂质筏。
实施例3
本实施例的方法步骤与实施例1相同，区别仅在于：解剖取出的组织为肺脏，显影结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2和3的样品为从肺脏中提取分离的脂质筏。
实施例4
本实施例的方法步骤与实施例1相同，区别仅在于：解剖取出的组织为肾脏，显影结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2和3的样品为从肾脏中提取分离的脂质筏。
实施例5
本实施例的方法步骤与实施例1相同，区别仅在于：解剖取出的组织为棕色脂肪，需要同时清除血污和毛发，显影结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2和3的样品为从棕色脂肪中提取分离的脂质筏。
实施例6
本实施例的方法步骤与实施例1相同，区别仅在于：解剖取出的组织为附睾脂肪，需要同时清除血污和毛发，显影结果如图2所示。
由图2可以看出，判定级份2的样品为从附睾脂肪中提取分离的脂质筏。
另外，值得说明的是，本申请探索阶段还分别向裂解上清液中直接添加60％碘克沙醇溶液或者45％碘克沙醇溶液进行离心分离脂质筏，结果发现离心后均未见明亮的脂质筏条带层。
本发明通过向裂解上清液中依次加入不同浓度含量的碘克沙醇密度梯度进行离心处理时，则能将脂质筏富集在中低密度层附近，具有对脂质筏的分离有时间短、效率高等优点。
此外，本发明不仅适用于小鼠中不同组织内脂质筏的快速分离，还适用于大鼠等动物不同组织内脂质筏的快速分离，适用范围广。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.碘克沙醇在从动物组织中分离脂质筏中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物组织选自心脏、肝脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、附睾脂肪中的一种或多种。
3.一种脂质筏的快速分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取动物组织匀浆，裂解后离心，取上清液，转入新的离心管中；
向含所述上清液的离心管中加入60±5％碘克沙醇溶液，混匀得高密度底层；再加入35±3％碘克沙醇溶液形成中密度层，再加入5±1％碘克沙醇溶液形成低密度层，转移至超速离心机内进行密度梯度超速离心，转速不低于53000rpm，离心2～3h，从上到下分级收集在中密度层和低密度层的界面处形成的条带层，鉴定，即得。
4.根据权利要求3所述的脂质筏的快速分离方法，其特征在于，上清液、高密度底层中60±5％碘克沙醇溶液、中密度层35±3％碘克沙醇溶液与低密度层5±1％碘克沙醇溶液的体积比为(0.4～0.6)：2：0.75：0.75。
5.根据权利要求3所述的脂质筏的快速分离方法，其特征在于，所述获取动物组织匀浆的方法为：取出组织，清除血污，每100mg组织加入0.5mL pH值7.8的Tris-HCL缓冲液，并加入3mm钢珠，用高速低温组织研磨仪在60Hz、-20℃条件下研磨30s，暂停15s，重复研磨多次，获得均一的组织匀浆。
6.根据权利要求3至5任一项所述的脂质筏的快速分离方法，其特征在于，所述动物组织选自心脏、肝脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、附睾脂肪中的一种或多种。
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