JP6667915B2 - 胎児細胞由来の核酸の取得方法 - Google Patents
胎児細胞由来の核酸の取得方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6667915B2 JP6667915B2 JP2018558844A JP2018558844A JP6667915B2 JP 6667915 B2 JP6667915 B2 JP 6667915B2 JP 2018558844 A JP2018558844 A JP 2018558844A JP 2018558844 A JP2018558844 A JP 2018558844A JP 6667915 B2 JP6667915 B2 JP 6667915B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fraction
- blood cells
- cell
- cells
- nucleated red
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Description
a.母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Aを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識し、
b.標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Bを取得し、
c.前記画分B中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離するとともに、前記分離された血球の各々に対して、独立に染色体DNAの抽出処理を行うことで、一細胞レベルで区別可能な染色体DNAを各々含有する画分Cを取得し、
d.前記画分Cのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Cの群の中から、胎児由来の染色体DNAを含有する画分Dを選別する、
方法。
[P1]に記載の方法。
[P2]に記載の方法。
前記画分Cが無差別に取得されたものであることから、前記画分Dに含有される染色体DNAが有核赤血球に由来することは、前記d.において当該染色体DNAが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする、
[P3]に記載の方法。
前記画分Bを限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Eを取得するとともに、
前記画分Eのそれぞれに対して、前記染色体DNAの抽出処理を行うことで前記画分Cを取得する、
[P4]に記載の方法。
前記画分Fを撮像し、
前記画分Fに一細胞レベルで分離された血球の含まれることを、前記画分Fの像を用いて確認することで、前記画分Eとして前記画分Fが取得されたか否かを判定する、
[P5]に記載の方法。
[P3]〜[P6]のいずれかに記載の方法。
前記b.において、セルソーター内に前記画分Aを含む液体流を作り、
前記液体流中の前記標識された血球を標的として、前記液体流と交差する方向にパルス流を発生させ、前記標識された血球を前記パルス流に乗せることで、前記標識された血球を前記液体流から分離し、
前記分離した血球を、逐次的に収集することで前記画分Bを生成する、
[P3]〜[P7]のいずれかに記載の方法。
[P3]〜[P8]のいずれかに記載の方法。
前記b.において蛍光標識した前記画分A中の血球をセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Gを取得し、
前記画分G中の血球を平面チップ上に展開するとともに、前記平面チップ上から分取することで、有核赤血球の純度がさらに高められた前記画分Bを取得し、
前記c.において、前記画分B中の血球に対する一細胞レベルでの分離を無差別に行うとともに、前記染色体DNAの抽出処理を無差別に行うことで、前記画分Cを取得するところ、
前記画分Cが無差別に取得されたものであることから、前記画分Dに含有される染色体DNAが有核赤血球に由来することは、前記d.において当該染色体DNAが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする方法である、
[P3]に記載の方法。
[P3]〜[P10]のいずれかに記載の方法。
[P11]に記載の方法。
前記主流路には前記母体血試料が流れ、
前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Aが取得され、
前記除去流路の内接径が12〜19μmであり、
前記回収流路の内接径が20〜30μmである、
[P12]に記載の方法。
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
方法。
a.母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれか又は両方によって分画することで母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Aを、白血球及び細胞核に対して特異的に標識し、
b.標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで母体由来及び胎児由来の有核赤血球を含む画分Bを取得するところ、前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球を除外するとともに、細胞核に対して特異的な標識によりに標識された血球を回収するように選別を行い、
c.前記画分B中の血球のそれぞれを各血球が有核赤血球であるか否かを問わず一細胞レベルで分離するとともに、前記一細胞レベルで分離された血球のそれぞれに対して各血球が有核赤血球であるか否かを問わず核酸の抽出処理を行うことにより一細胞レベルで区別可能な核酸を各々含有する画分Cを取得し、
d.前記画分Cのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Cの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の核酸を含有する画分Dを選別する、
方法。
[R1]に記載の方法。
前記画分Aは前記母体血試料中の血球をその大きさによって分画することで母体血試料中から取得された画分であるとともに、母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれてなるものである、
[R1]又は[R2]に記載の方法。
前記血球分離チップは、主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路とを備えるマイクロ流路構造を有し、
前記主流路には前記母体血試料が流れ、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方から前記除去流路に向かって押し込み、
前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記主流路における前記除去流路の接続部の下流において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記画分Aが取得され、
前記除去流路の内接径が12〜19μmである、
[R3]に記載の方法。
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方からさらに前記回収流路に向かって押し込み、
前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Aが取得され、
前記回収流路の内接径が20〜30μmである、
[R4]に記載の方法。
[R1]〜[R5]のいずれかに記載の方法。
前記画分Fを撮像し、
前記画分Fに一細胞レベルで分離された血球の含まれることを、前記画分Fの像を用いて確認することで、前記画分Eとして前記画分Fが取得されたか否かを判定するところ、前記一細胞レベルで分離された血球が有核赤血球であるか否かは前記画分Fの像から判定しない、
[R6]に記載の方法。
前記流路を通じて各前記捕捉構造に前記画分Bに含まれる血球を分配することで血球を一細胞レベルで互いに分離するとともに、各前記捕捉構造に捕捉した後、捕捉した各細胞を溶解するとともに前記捕捉構造から前記反応構造に向かって溶解物を押し流すことで前記画分Cを前記反応構造内に取得する、
[R1]〜[R5]のいずれかに方法。
前記b.において、少なくとも細胞核に対して特異的に蛍光標識された前記画分A中の血球を蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
[R1]〜[R8]のいずれかに記載の方法。
前記d.において分子生物学的解析を行うために、前記染色体DNAに対して全ゲノム又はゲノム中の一部領域の増幅を行い、
前記胎児由来の核酸として増幅産物であるDNAを含有する前記画分Dを選別する、
[R1]〜[R9]のいずれかに記載の方法。
前記RNAはmRNA及びノンコーディングRNAのいずれか又は両方であり、
前記d.において分子生物学的解析を行うために、前記RNAに対して逆転写を行い、
前記胎児由来の核酸として逆転写産物であるcDNAを含有する前記画分Dを選別する、
[R1]〜[R9]のいずれかに記載の方法。
前記画分Wの群の中から、前記画分Dに紐付けられた画分Zを一細胞レベルで区別可能な胎児由来の染色体DNAを含有する画分として得る、
[R11]に記載の方法。
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法。
a.母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Aを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識するところ、少なくとも核酸に対する標識を蛍光標識によって行い、
b.標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Bを取得するところ、少なくとも核酸に対して特異的に蛍光標識された前記画分A中の血球を蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別し、
c.前記画分B中の血球を一細胞レベルでそれぞれ無差別に分離するとともに、前記分離された血球の各々に対して、無差別かつ独立に染色体DNAの抽出処理を行うことで、一細胞レベルで区別可能な染色体DNAを各々含有する画分Cを取得し、
d.前記画分Cのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Cの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の染色体DNAを含有する画分Dを選別する、
方法であって、
前記画分Cが無差別に取得されたものであることから、前記画分Dに含有される染色体DNAが一細胞レベルで分離された有核赤血球に由来することは、前記d.において当該染色体DNAが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とし、
前記画分Aは、母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれかによって分画することで取得されたものであり、
前記c.において、前記画分Bを限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Eを取得するとともに、前記画分Eのそれぞれに対して、前記染色体DNAの抽出処理を行うことで前記画分Cを取得し、
前記画分Bには母体由来及び胎児由来の有核赤血球が含まれている、
方法。
前記b.において標識した前記画分A中の血球をセルソーティングによって選別することで、前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球が除外された前記画分Bを取得する、
[R14]に記載の方法。
前記b.において、前記蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングの前若しくは後に、赤血球に対して特異的に磁気標識された前記画分A中の血球を磁気標識による細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
又は
前記a.において、赤血球に対する標識を蛍光標識によって行い、
前記b.において、核酸及び赤血球に対して特異的に蛍光標識された前記画分A中の血球を前記蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
[R14]又は[R15]に記載の方法。
レーン1:ヒト男性の標準DNA、200コピー。
レーン2:ヒト女性の標準DNA、200コピー。
レーン3:ヒト男性の標準DNA、0コピー。
レーン4:ヒト男性の標準DNA、1コピー。
レーン5:ヒト男性の標準DNA、4コピー。
レーン6:ヒト男性の標準DNA、8コピー。
レーン7:ヒト男性の標準DNA、16コピー。
レーン8:ヒト男性の標準DNA、64コピー。
レーン9:ヒト男性の標準DNA、100コピー。
レーン10:試料1
レーン1:蒸留水。
レーン2:ヒト男性の標準DNA、20ng。
レーン3:ヒト女性の標準DNA、20ng。
レーン4:MALBAC法による増幅産物1、450ng。
レーン5:MALBAC法による増幅産物2、610ng。
レーン6:MALBAC法による増幅産物3、700ng。
pos:市販の男性由来ヒトゲノムDNA(ポジティブコントロール)
Marker:DNAラダー
レーン1−16:MALBAC法による増幅産物
40 細胞核
41 有核赤血球
42 無核赤血球
43 白血球
44 容器
45a−f
46 遠心管
47 主流路
48a−c 血球
49 副流路
50 血球分離チップ
51 入口
52 主流路
53 副流路
54a−d 出口
55 出口
56a−d 流路
57 シリンジ
58 シリンジ
59a−d 分岐流路
61 平面チップ
62 血球
74 装置
75 流路
76 捕捉構造
77 反応構造
78 細胞
B 画分
C1−8 画分
C11−18 画分
D 画分
E1−8 画分
F1−3 画分
Fr1−5 画分
FT フロースルー
G 画分
M 染色体
P 染色体
S21−26 ステップ
S28−30 ステップ
S32−33 ステップ
S35−37 ステップ
S65−66 ステップ
S68−70 ステップ
S72 ステップ
Claims (16)
- 胎児由来の核酸を取得するための方法であって、
a.母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれか又は両方によって分画することで母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Aについて、含まれる白血球及び細胞核のそれぞれに対して特異的に標識し、
b.標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで母体由来及び胎児由来の有核赤血球を含む画分Bを取得するところ、前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球を除外するとともに、細胞核に対して特異的な標識により標識された血球を回収するように選別を行い、
c.前記画分B中の血球のそれぞれを各血球が有核赤血球であるか否かを問わず一細胞レベルで分離するとともに、前記一細胞レベルで分離された血球のそれぞれに対して各血球が有核赤血球であるか否かを問わず核酸の抽出処理を行うことにより一細胞レベルで区別可能な核酸を各々含有する画分Cを取得し、
d.前記画分Cのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Cの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の核酸を含有する画分Dを選別する、
方法。 - 前記c.において、血球が有核赤血球に由来するか否かを問わない方法で前記画分Cが取得されたことから、前記画分Dに含有される核酸が一細胞レベルで分離された有核赤血球に由来することは、前記d.において当該核酸が胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする、
請求項1に記載の方法。 - 前記母体血試料は、母体血それ自体、又は母体血に比べて全血球数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未濃縮試料であり、
前記画分Aは前記母体血試料中の血球をその大きさによって分画することで母体血試料中から取得された画分であるとともに、母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれてなるものである、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記母体血試料を血球分離チップで処理することで前記母体血試料中の血球をその大きさによって分画し、
前記血球分離チップは、主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路とを備えるマイクロ流路構造を有し、
前記主流路には前記母体血試料が流れ、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方から前記除去流路に向かって押し込み、
前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記主流路における前記除去流路の接続部の下流において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記画分Aが取得され、
前記除去流路の内接径が12〜19μmである、
請求項3に記載の方法。 - 前記血球分離チップは、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路をさらに備え、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方からさらに前記回収流路に向かって押し込み、
前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Aが取得され、
前記回収流路の内接径が20〜30μmである、
請求項4に記載の方法。 - 前記c.において、前記画分Bを限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Eを取得するとともに、前記画分Eのそれぞれに対して、前記核酸の抽出処理を行うことで前記画分Cを取得する、
請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 前記セルソーティングでは、血球を含有する微量の流体が連続的に分取され、
前記流体を再び一つの容器に収集してまとめることはせず、細胞を含む液滴の吐出装置により、血球ごとに流体を別個の容器に分注することで前記画分Eを得る、
請求項6に記載の方法。 - 前記画分Bから有核赤血球であるか否かを問わず血球を分取することで画分Fを取得し、
前記画分Fを撮像し、
前記画分Fに一細胞レベルで分離された血球の含まれることを、前記画分Fの像を用いて確認することで、前記画分Eとして前記画分Fが取得されたか否かを判定するところ、前記一細胞レベルで分離された血球が有核赤血球であるか否かは前記画分Fの像から判定しない、
請求項6に記載の方法。 - 前記c.において、流路、前記流路に沿って連続的に配置されるとともに前記流路に接続する複数の捕捉構造及び各前記捕捉構造に付随した反応構造を備える流体デバイスを用いて前記画分Cを取得するところ、
前記流路を通じて各前記捕捉構造に前記画分Bに含まれる血球を分配することで血球を一細胞レベルで互いに分離するとともに、各前記捕捉構造に捕捉した後、捕捉した各細胞を溶解するとともに前記捕捉構造から前記反応構造に向かって溶解物を押し流すことで前記画分Cを前記反応構造内に取得する、
請求項1〜5のいずれかに方法。 - 前記a.において、少なくとも細胞核に対する標識を核酸に対する蛍光標識によって行い、
前記b.において、少なくとも細胞核に対して特異的に蛍光標識された前記画分A中の血球を蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - 前記a.において、母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画して得られた画分に対して、さらに免疫除去法により白血球を除去することで、前記画分Aを取得し、これを標識する、
請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記c.において前記画分Cに含有される前記核酸は染色体DNAであり、
前記d.において分子生物学的解析を行うために、前記染色体DNAに対して全ゲノム又はゲノム中の一部領域の増幅を行い、
前記胎児由来の核酸として増幅産物であるDNAを含有する前記画分Dを選別する、
請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記c.において前記画分Cに含有される前記核酸はRNAであり、
前記RNAはmRNA及びノンコーディングRNAのいずれか又は両方であり、
前記d.において分子生物学的解析を行うために、前記RNAに対して逆転写を行い、
前記胎児由来の核酸として逆転写産物であるcDNAを含有する前記画分Dを選別する、
請求項1〜11のいずれかに記載の方法。 - 請求項1〜13のいずれかに記載の方法により得た前記画分D中の前記核酸の配列をマイクロアレイ解析又は配列決定法により解析し、
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法。 - さらに前記c.において前記RNAの抽出と同時に、各血球に対して染色体DNAの抽出を行うことで各画分Cに紐付けられた画分Wを取得し、
前記画分Wの群の中から、前記画分Dに紐付けられた画分Zを一細胞レベルで区別可能な胎児由来の染色体DNAを含有する画分として得る、
請求項13に記載の方法。 - 請求項15に記載の方法により得た前記画分Z中の前記核酸の配列をマイクロアレイ解析又は配列決定法により解析し、
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016253589A JP6234542B1 (ja) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | 胎児細胞由来染色体dnaの取得方法 |
PCT/JP2017/037706 WO2018123220A1 (ja) | 2016-12-27 | 2017-10-18 | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020025062A Division JP2020103299A (ja) | 2020-02-18 | 2020-02-18 | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018123220A1 JPWO2018123220A1 (ja) | 2019-11-07 |
JP6667915B2 true JP6667915B2 (ja) | 2020-03-18 |
Family
ID=60417541
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016253589A Active JP6234542B1 (ja) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | 胎児細胞由来染色体dnaの取得方法 |
JP2018558844A Active JP6667915B2 (ja) | 2016-12-27 | 2017-10-18 | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016253589A Active JP6234542B1 (ja) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | 胎児細胞由来染色体dnaの取得方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11365404B2 (ja) |
EP (1) | EP3564389A4 (ja) |
JP (2) | JP6234542B1 (ja) |
KR (1) | KR102225123B1 (ja) |
CN (1) | CN110114474A (ja) |
CA (1) | CA3047709C (ja) |
TW (1) | TW201831877A (ja) |
WO (1) | WO2018123220A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019078277A1 (ja) * | 2017-10-19 | 2019-04-25 | 株式会社 TL Genomics | 細胞分級用チップ |
WO2020045434A1 (ja) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 京セラ株式会社 | 粒子分離デバイスおよび粒子分離装置 |
US20210382035A1 (en) | 2018-10-25 | 2021-12-09 | Tl Genomics Inc. | Pretreatment of blood for classifying blood cells using microchannel |
WO2020203510A1 (ja) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 株式会社 TL Genomics | 微細回路とシリンジとの組み合わせに対する駆動装置 |
EP4050093A4 (en) | 2019-10-23 | 2024-02-14 | Tl Genomics Inc | DEVICE FOR BLOOD |
JP2020103299A (ja) * | 2020-02-18 | 2020-07-09 | 株式会社 TL Genomics | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 |
WO2021200749A1 (ja) * | 2020-04-01 | 2021-10-07 | 株式会社 TL Genomics | 細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法 |
JP7440905B2 (ja) | 2020-08-25 | 2024-02-29 | 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ | 粒子の純化方法、単一粒子分注方法、及び細胞クラスター解析方法、並びそれに用いる装置 |
WO2022067174A1 (en) * | 2020-09-28 | 2022-03-31 | Georgia Tech Research Corporation | Microfluidic devices for particle capture and methods thereof |
CA3206327A1 (en) | 2020-12-25 | 2022-06-30 | Tl Genomics Inc. | Method for detecting copy number of specific nucleic acid per single cell |
CN112914930B (zh) * | 2021-01-28 | 2021-10-22 | 董艳双 | 一种产科临床用出血测量装置 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5311356B2 (ja) | 1973-06-30 | 1978-04-20 | ||
JPS5266793A (en) | 1975-11-26 | 1977-06-02 | Masaichi Shimada | Width adjust apparatus for apparatus of take up mortion of fabric |
JPS5341813A (en) | 1976-09-29 | 1978-04-15 | Agency Of Ind Science & Technol | Transporting system for slurry |
JPS5857537B2 (ja) | 1980-01-08 | 1983-12-20 | ウエスト・ポイント−ペツペレル・インコ−ポレ−テツド | 移動可能な織布への液体化学薬品の付加装置 |
DE4222573C1 (ja) | 1992-05-16 | 1993-08-12 | Dorothee Dr. 4400 Muenster De Ahlert | |
IL110364A0 (en) * | 1993-07-19 | 1994-10-21 | Aprogenex Inc | Enriching and identifying fetal nucleated erythrocytes in maternal blood for in situ hybridization |
US5731156A (en) | 1996-10-21 | 1998-03-24 | Applied Imaging, Inc. | Use of anti-embryonic hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
US5962234A (en) | 1997-10-20 | 1999-10-05 | Applied Imaging Corporation | Use of anti-embryonic epsilon hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
CA2462914A1 (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples |
AU2003229397B2 (en) | 2002-05-31 | 2009-04-23 | Genetic Technologies Limited | Maternal antibodies as fetal cell markers to identify and enrich fetal cells from maternal blood |
EP1732951B1 (en) | 2004-03-31 | 2009-12-02 | Adnagen AG | Monoclonal antibodies with specificity for fetal erythroid cells |
US20060223178A1 (en) | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Tom Barber | Devices and methods for magnetic enrichment of cells and other particles |
JP2009511001A (ja) | 2005-09-15 | 2009-03-19 | アルテミス ヘルス,インク. | 細胞及びその他の粒子を磁気濃縮するためのデバイス並びに方法 |
JP2007175684A (ja) | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Minoru Seki | 微粒子の濃縮・分級のための流路構造および方法 |
ITTO20070307A1 (it) | 2007-05-04 | 2008-11-05 | Silicon Biosystems Spa | Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva |
JP5308834B2 (ja) | 2009-01-13 | 2013-10-09 | 古河電気工業株式会社 | 微粒子分別装置及び微粒子分別方法 |
JP5311356B2 (ja) * | 2009-09-04 | 2013-10-09 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 有核赤血球濃縮回収用チップ及び有核赤血球濃縮回収方法 |
CN102782503B (zh) | 2010-02-09 | 2014-11-05 | 小滴喷射有限公司 | 包含颗粒体的液状体的喷射装置 |
JP5265815B2 (ja) | 2010-08-20 | 2013-08-14 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 血球の密度変化を利用した密度勾配遠心による有核赤血球の回収法 |
EP2652155B1 (en) | 2010-12-16 | 2016-11-16 | Gigagen, Inc. | Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells |
US9074204B2 (en) | 2011-05-20 | 2015-07-07 | Fluidigm Corporation | Nucleic acid encoding reactions |
US20140141997A1 (en) * | 2011-06-30 | 2014-05-22 | National University Of Singapore | Foetal nucleated red blood cell detection |
JP5857537B2 (ja) | 2011-08-30 | 2016-02-10 | 日本精工株式会社 | エアスピンドル |
US20130302884A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-11-14 | Fluidigm Corporation | Methods, systems and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics |
WO2015175562A1 (en) * | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Kellbenx Incorporated | Preparation of fetal nucleated red blood cells (nrbcs) for diagnostic testing |
JP2016067268A (ja) | 2014-09-29 | 2016-05-09 | 富士フイルム株式会社 | 胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法 |
CN111500534B (zh) * | 2016-07-11 | 2022-11-29 | 山东亚大药业有限公司 | 分离纯化胎儿有核红细胞的试剂盒 |
-
2016
- 2016-12-27 JP JP2016253589A patent/JP6234542B1/ja active Active
-
2017
- 2017-10-18 EP EP17887449.1A patent/EP3564389A4/en active Pending
- 2017-10-18 KR KR1020197022034A patent/KR102225123B1/ko active IP Right Grant
- 2017-10-18 WO PCT/JP2017/037706 patent/WO2018123220A1/ja unknown
- 2017-10-18 CN CN201780080826.5A patent/CN110114474A/zh active Pending
- 2017-10-18 US US16/473,046 patent/US11365404B2/en active Active
- 2017-10-18 CA CA3047709A patent/CA3047709C/en active Active
- 2017-10-18 JP JP2018558844A patent/JP6667915B2/ja active Active
- 2017-12-27 TW TW106146016A patent/TW201831877A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6234542B1 (ja) | 2017-11-22 |
KR102225123B1 (ko) | 2021-03-08 |
WO2018123220A1 (ja) | 2018-07-05 |
US20200087654A1 (en) | 2020-03-19 |
CN110114474A (zh) | 2019-08-09 |
KR20190097263A (ko) | 2019-08-20 |
EP3564389A4 (en) | 2020-11-25 |
JP2018102242A (ja) | 2018-07-05 |
CA3047709A1 (en) | 2018-07-05 |
US11365404B2 (en) | 2022-06-21 |
JPWO2018123220A1 (ja) | 2019-11-07 |
TW201831877A (zh) | 2018-09-01 |
EP3564389A1 (en) | 2019-11-06 |
CA3047709C (en) | 2022-10-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6667915B2 (ja) | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 | |
KR102313468B1 (ko) | 세포 분류용 칩 | |
JP5642537B2 (ja) | 非侵襲的出生前診断の方法並びに装置 | |
US9334477B2 (en) | Method for collecting nucleated red blood cells via density-gradient centrifugation utilizing changes in blood cell density | |
US20080113358A1 (en) | Selection of cells using biomarkers | |
US20100112586A1 (en) | Diagnosis of fetal abnormalities by comparative genomic hybridization analysis | |
US20130345084A1 (en) | Methods and devices for obtaining and analyzing cells | |
US20090181421A1 (en) | Diagnosis of fetal abnormalities using nucleated red blood cells | |
JP2022536121A (ja) | Facsを用いた胎児細胞の単離 | |
JP2018102289A (ja) | 胎児細胞由来染色体dnaの取得方法 | |
JP2020103299A (ja) | 胎児細胞由来の核酸の取得方法 | |
WO2023104773A1 (en) | Isolation and diagnostics of fetal cells | |
Abdullah et al. | Isolation of Nucleated Red Blood Cell from Peripheral Blood of β-Thalassemia Major Patients using CD71 Magnetic Beads and Future Application |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190514 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190514 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20190514 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190606 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20191004 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191023 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191211 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200121 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200218 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6667915 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |