TW201831877A - 源自胎兒細胞的核酸的取得方法 - Google Patents

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Abstract

本發明中，a.針對自母體血試樣中取得且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮之組分(A)進行標記。b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的組分A中之血球，藉此取得有核紅血球之純度經提高之組分(B)。將組分(B)中之血球以單一細胞水準分別分離，並且對分離之血球各自獨立地進行核酸之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之核酸之組分(C)。d.對組分(C)各自進行分子生物學分析，藉此自組分(C)之群組中揀選含有源自胎兒的核酸之組分(D)。

Description

源自胎兒細胞的核酸的取得方法
本發明係關於一種自母體血試樣中取得源自胎兒細胞的染色體DNA(Deoxyribonucleic acid；去氧核糖核酸)之方法。
為了進行非侵入性產前遺傳檢查(Noninvasive prenatal genetic testing；NIPT)，正不斷開發以較高之純度採集源自胎兒細胞的染色體DNA之方法。為了採集源自胎兒細胞的染色體DNA，正嘗試將母體血中之源自胎兒的有核紅血球(nucleated red blood cells；NRBC)濃縮的方法。
專利文獻1至專利文獻3及專利文獻12揭示有將母體血試樣中之有核紅血球濃縮的方法。專利文獻1至專利文獻3及專利文獻12中使用密度梯度離心分離法。專利文獻2中進一步使用微流路晶片。專利文獻3使用磁場。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利第5265815號公報。
專利文獻2：日本專利第5311356號公報。
專利文獻3：日本專利特開2009-511001號公報。
專利文獻4：日本專利特開2016-067268號公報。
專利文獻5：日本專利第4091123號公報。
專利文獻6：日本專利特表第2007-530629號公報。
專利文獻7：日本專利第5857537號公報。
專利文獻8：日本專利第5308834號公報。
專利文獻9：日本專利特表2015-515263號公報。
專利文獻10：日本專利第5642537號公報。
專利文獻11：日本專利特開2007-175684號公報。
專利文獻12：日本專利特表平06-509178號公報。
專利文獻13：日本專利特開2015-158489號公報。
[非專利文獻]
非專利文獻1：上出泰山、梅原永能、佐合治彥著，「面向自母體血中有效率地回收胎兒有核紅血球之新嘗試」，成醫會，慈惠醫科大學雜誌(Tokyo Jikeikai Medical Journal)，2015年，130：11-7。
非專利文獻2：「Cold Spring Harb Perspect Med(冷泉港實驗室醫學展望)」2013；3：a011643。
非專利文獻3：Macaulay I.C.、Haerty W.、Kumar P.、 Li Y.I.及Hu T.X.等人，「(2015)G&T-seq：parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes(單細胞基因組與轉錄組平行測序)」，Nat Methods(自然方法)，12：519-522。
如專利文獻3之段落0164所示，於利用FACS(Fluorescence activated Cell Sorting；螢光流式細胞分選法)分析母體血試樣之情形時，CD71(TFRC，Transferrin receptor protein 1；轉鐵蛋白受體蛋白1)及CD235a(GPA，Glycophorin A；血型糖蛋白A)陽性之有核細胞亦即有核紅血球僅佔源自母體血的單核細胞之0.15%以下。母體血中之有核細胞主要係由源自母體的白血球所佔據。
於藉由上述各濃縮方法所得之有核紅血球之組分中，亦有源自母體的白血球仍佔支配地位之情形。因此，亦存在由該組分所得之源自胎兒細胞的染色體DNA中混入有源自母體的白血球之DNA的可能性。另外，母體血中亦含有源自母體的有核紅血球。因此，以較高之純度獲得源自胎兒細胞的染色體DNA仍較為困難。
專利文獻4中示出了於載玻片上進行血球之形態觀察並將有核紅血球候選之細胞單離的方法(段落0069至段落0070)。該方法中，將利用密度梯度離心分離法進行了濃縮之有核紅血球塗佈於載玻片上後，對血球進行梅-吉染色(May-Giemsa stain)(段落0066至段落0068)。進而，藉由分子生物學分析而確認經單離之有核紅血球候選之血球是否源自胎兒(段落0079)。
本發明提供一種自母體血試樣中取得源自胎兒細胞的染色體DNA之方法。本發明之目的在於提供一種可取得染色體DNA之方法，上述染色體DNA係源自以單一細胞水準經單離之源自胎兒的有核紅血球。
[P1]一種源自胎兒細胞的染色體DNA的取得方法，係用於取得源自胎兒細胞的染色體DNA；a.針對自母體血試樣中取得且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮之組分A，對紅血球及核酸進行特異性標記；b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得有核紅血球之純度經提高之組分B；c.將前述組分B中之血球以單一細胞水準分別分離，並且對前述經分離之血球各自獨立地進行染色體DNA之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之染色體DNA之組分C；d.對 前述組分C分別進行分子生物學分析，藉此自前述組分C之群組中揀選含有源自胎兒的染色體DNA之組分D。
[P2]如[P1]所記載之方法，其中前述組分A係自母體血試樣中之血球中去掉至少一部分無核紅血球而成。
[P3]如[P2]所記載之方法，其中前述組分A係藉由將母體血試樣中之血球至少利用該血球之密度及大小之任一者進行分組而取得。
[P4]如[P3]所記載之方法，其中於前述c.中，與前述組分B中之各血球是否具備有核紅血球之特徵無關，無差別地進行對前述組分B中之血球的單一細胞水準之分離，並且無差別地進行前述染色體DNA之提取處理，藉此取得前述組分C；此時由於前述組分C係無差別地取得，故而前述組分D中所含有之染色體DNA係源自有核紅血球這一情況，係根據於前述d.中鑑定該染色體DNA係源自胎兒而事後推定。
[P5]如[P4]所記載之方法，其中於前述c.中，利用極限稀釋法對前述組分B進行分組，藉此取得分別含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E；對前述組分E各自進行前述染色體DNA之提取處理，藉此取得前述組分C。
[P6]如[P5]所記載之方法，其中自前述組分B中無差別地分取組分F；對前述組分F進行攝影；使用前述組分F之像確認前述組分F中含有以單一細胞水準經分離之血球，藉此判定是否取得了前述組分F作為前述組分E。
[P7]如[P3]至[P6]中任一項所記載之方法，其中於未對前述組分A中之血球進行組織學交聯固定之情況下進行前述標記及前述細胞分選。
[P8]如[P3]至[P7]中任一項所記載之方法，其中於前述a.中藉由螢光標記進行前述標記；於前述b.中，於細胞分選儀內製作含有前述組分A之液體流；將前述液體流中之前述經標記的血球作為標靶，於與前述液體流交叉之方向上產生脈衝流，使前述經標記的血球承載於前述脈衝流，藉此將前述經標記的血球自前述液體流中分離；依次收集前述經分離之血球，藉此生成前述組分B。
[P9]如[P3]至[P8]中任一項所記載之方法，其中於前述a.中，前述組分A係藉由以下方式獲得之組分：自至少將母體血試樣中之血球利用密度或大小進行分組而獲得之組分中，進而藉由免疫去除法去除白血球。
[P10]如[P3]所記載之方法，其中於前述a.中藉由螢光標記進行前述標記；於前述b.中藉由細胞分選而揀選經螢 光標記的前述組分A中之血球，藉此取得有核紅血球之純度經提高之組分G；將前述組分G中之血球於平面晶片上展開，並且自前述平面晶片上分取，藉此取得有核紅血球之純度經進一步提高之前述組分B；於前述c.中，無差別地進行對前述組分B中之血球的單一細胞水準之分離，並且無差別地進行前述染色體DNA之提取處理，藉此取得前述組分C；此時由於前述組分C係無差別地取得，故而前述組分D中所含有之染色體DNA係源自有核紅血球這一情況，係根據於前述d.中鑑定該染色體DNA係源自胎兒而事後推定。
[P11]如[P3]至[P10]中任一項所記載之方法，係包括：將前述母體血試樣利用血球之密度或大小進行分組，藉此取得前述組分A。
[P12]如[P11]所記載之方法，其中利用血球分離晶片對前述母體血試樣進行處理，藉此將前述母體血試樣利用血球之大小進行分組。
[P13]如[P12]所記載之方法，其中前述血球分離晶片具備主流路、連接於前述主流路之去除流路、及較前述去除流路更靠下游且連接於前述主流路之回收流路；於前述主流路中流動前述母體血試樣；於前述去除流路中自前述母體而試樣中去除無核紅血球，並且於前述回收流路中自 前述母體血試樣中回收有核紅血球，藉此自前述回收流路中取得前述組分A；前述去除流路之內接徑為12μm至19μm；前述回收流路之內接徑為20μm至30μm。
[P14]一種供診斷的資料的取得方法，係利用微陣列或序列測定法對藉由如[P1]至[P13]中任一項所記載之方法獲得的前述組分D中之染色體DNA進行分析；根據前述分析之結果取得供非侵入性產前遺傳檢查中之診斷的資料。
[R1]一種源自胎兒的核酸的取得方法，係用於取得源自胎兒的核酸；a.針對組分A對白血球及細胞核進行特異性標記，上述組分A係藉由將母體血試樣中之血球利用該血球之密度及大小之任一者或兩者進行分組而自母體血試樣中取得，且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮；b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球之組分B，此時以將藉由特異性標記對前述白血球進行了標記的血球除外，並且將藉由特異性標記對細胞核進行了標記的血球回收之方式進行揀選；c.對於前述組分B中之各個血球，無論各血球是否為有核紅血球均以單一細胞水準進行分離，並且對於前述以單一細胞水準經分離之各個血球，無論各血球是否為有核紅血球均進行核酸之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之核酸之組 分C；d.對前述組分C各自進行分子生物學分析，藉此自前述組分C之群組中揀選組分D，該組分D含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的核酸。
[R2]如[R1]所記載之方法，其中於前述c.中，利用無論血球是否係源自有核紅血球之方法取得了前述組分C，故而前述組分D中所含有之核酸係源自以單一細胞水準經分離之有核紅血球這一情況，係根據於前述d.中鑑定該核酸係源自胎兒而事後推定。
[R3]如[R1]或[R2]所記載之方法，其中前述母體血試樣為母體血本身、或與母體血相比以總血球數為基準而有核紅血球未經濃縮的未濃縮試樣；前述組分A係藉由將前述母體血試樣中之血球利用該血球之大小進行分組而自母體血試樣中取得，並且係自母體血試樣中之血球中去掉至少一部分無核紅血球而成。
[R4]如[R3]所記載之方法，其中藉由利用血球分離晶片對前述母體血試樣進行處理而將前述母體血試樣中之血球利用該血球之大小進行分組；前述血球分離晶片具有微流路結構，該微流路結構具備主流路、連接於前述主流路之側部的副流路、及於前述副流路之下游連接於前述主流路中之與前述副流路為相反側之側部的去除流路；於前述主流路中流動前述母體血試樣；自副流路中流出之液體 將於前述主流路中流動之血球從前述主流路之側部向前述去除流路推入；於前述去除流路中自前述母體血試樣中去除無核紅血球，並且於前述主流路中之前述去除流路之連接部之下游自前述母體血試樣中回收有核紅血球，藉此取得前述組分A；前述去除流路之內接徑為12μm至19μm。
[R5]如[R4]所記載之方法，其中前述血球分離晶片進而具備回收流路，該回收流路係於前述去除流路之下游連接於前述主流路中之與前述副流路為相反側之側部；自副流路中流出之液體將於前述主流路中流動之血球從前述主流路之側部進一步向前述回收流路推入；於前述回收流路中自前述母體血試樣中回收有核紅血球，藉此自前述回收流路中取得前述組分A；前述回收流路之內接徑為20μm至30μm。
[R6]如[R1]至[R5]中任一項所記載之方法，其中於前述c.中，利用極限稀釋法對前述組分B進行分組，藉此取得含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E，並且對前述組分E各自進行前述核酸之提取處理，藉此取得前述組分C。
[R7]如[R6]所記載之方法，其中自前述組分B中無論是否為有核紅血球均分取血球，藉此取得組分F；對前述 組分F進行攝影；使用前述組分F之像確認前述組分F中含有以單一細胞水準經分離之血球，藉此判定是否取得了前述組分F作為前述組分E，此時不根據前述組分F之像判定前述以單一細胞水準經分離之血球是否為有核紅血球。
[R8]如[R1]至[R5]中任一項所記載之方法，其中於前述c.中使用流體設備取得前述組分C，上述流體設備具備流路、沿著前述流路連續地配置且連接於前述流路之多個捕捉結構、及隨附於各前述捕捉結構之反應結構；此時通過前述流路將前述組分B所含之血球分配至各前述捕捉結構中，藉此將血球以單一細胞水準相互分離，並且於捕捉至各前述捕捉結構中後，將捕捉之各細胞溶解並且推動溶解物從前述捕捉結構流向前述反應結構，藉此於前述反應結構內取得前述組分C。
[R9]如[R1]至[R8]中任一項所記載之方法，其中於前述a.中，至少藉由對核酸之螢光標記進行對細胞核之標記；於前述b.中，至少藉由基於螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對細胞核進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球。
[R10]如[R1]至[R9]中任一項所記載之方法，其中於前述c.中，前述組分C所含有之前述核酸為染色體DNA； 為了於前述d.中進行分子生物學分析，對前述染色體DNA進行全基因組或基因組中之一部分區域之擴增；揀選含有為擴增產物之DNA作為前述源自胎兒的核酸之前述組分D。
[R11]如[R1]至[R9]中任一項所記載之方法，其中於前述c.中，前述組分C中所含有之前述核酸為RNA(Ribonucleic acid；核糖核酸)；前述RNA為mRNA(信使核糖核酸)及非編碼RNA之任一者或兩者；為了於前述d.中進行分子生物學分析，對前述RNA進行反轉錄；揀選含有為反轉錄產物之cDNA(complementary DNA；互補去氧核糖核酸)作為前述源自胎兒的核酸之前述組分D。
[R12]如[R11]所記載之方法，其中進而於前述c.中於前述RNA之提取之同時，對各血球進行染色體DNA之提取，藉此取得與各組分C匹配之組分W；自前述組分W之群組中獲得與前述組分D匹配之組分Z作為含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的染色體DNA之組分。
[R13]一種供診斷的資料的取得方法，係利用微陣列分析或序列測定法對藉由[R1]至[R12]中任一項所記載之方法獲得的前述組分D中之前述核酸之序列進行分析；根據前述分析之結果取得供非侵入性產前遺傳檢查中之診斷的資料。
[R14]一種源自胎兒細胞的染色體DNA的取得方法，係用於取得源自胎兒細胞的染色體DNA；a.針對自母體血試樣中取得且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮之組分A，對紅血球及核酸進行特異性標記，此時至少藉由螢光標記進行對核酸之標記；b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得有核紅血球之純度經提高之組分B，此時至少藉由基於螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對核酸進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球；c.將前述組分B中之血球以單一細胞水準分別無差別地分離，並且對前述經分離之血球各自無差別且獨立地進行染色體DNA之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之染色體DNA之組分C；d.對前述組分C各自進行分子生物學分析，藉此自前述組分C之群組中揀選組分D，該組分D含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的染色體DNA；且前述方法由於前述組分C係無差別地取得，故而前述組分D中所含有之染色體DNA係源自以單一細胞水準經分離之有核紅血球這一情況，係根據於前述d.中鑑定該染色體DNA係源自胎兒而事後推定；前述組分A係藉由將母體血試樣中之血球利用該血球之密度及大小之任一者進行分組而取得；於前述c.中，利用極限稀釋法對前述組分B進行分組，藉此取得分別含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E，並且對前述組分E各自進行前述染色體DNA 之提取處理，藉此取得前述組分C；前述組分B中含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球。
[R15]如[R14]所記載之方法，其中於前述a.中針對前述組分A追加地對白血球進行特異性標記；於前述b.中藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得將藉由特異性標記對前述白血球進行了標記的血球除外之前述組分B。
[R16]如[R14]或[R15]所記載之方法，其中於前述a.中藉由磁性標記進行對紅血球之標記；於前述b.中，於基於前述螢光標示式細胞分取法的細胞分選之前或之後，藉由基於利用磁性標記之細胞分取法的細胞分選而揀選對紅血球進行了特異性磁性標記的前述組分A中之血球；或者，於前述a.中藉由螢光標記進行對紅血球之標記；於前述b.中，藉由基於前述螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對核酸及紅血球進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球。
本發明之方法於染色體DNA之提取處理之後，得知所採集的染色體DNA係源自以單一細胞水準經單離之源自胎兒的有核紅血球。藉此，本發明中可取得染色體DNA，該染色體DNA係源自以單一細胞水準經單離之源 自胎兒的有核紅血球。
39‧‧‧顆粒
40‧‧‧細胞核
41‧‧‧有核紅血球
42‧‧‧無核紅血球
43‧‧‧白血球
44‧‧‧容器
45a、45b、45c、45d、45e、45f‧‧‧層
46‧‧‧離心管
47‧‧‧主流路
48a、48b、48c、62‧‧‧血球
49‧‧‧副流路
50‧‧‧血球分離晶片
51‧‧‧入口
52‧‧‧主流路
53‧‧‧副流路
54a、54b、54c、54d、55‧‧‧出口
56a、56b、56c、56d、75‧‧‧流路
57、58‧‧‧針筒
59a、59b、59c、59d‧‧‧分支流路
61‧‧‧平面晶片
74‧‧‧裝置
76‧‧‧捕捉結構
77‧‧‧反應結構
78‧‧‧細胞
Ar1、Ar2‧‧‧集團
B、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、D、E、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、F1、F2、F3、Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、G、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、Z‧‧‧組分
FT‧‧‧順流
M、P‧‧‧染色體
S21、S22、S23、S24、S25、S26、S28、S29、S30、S32、S33、S35、S36、S37、S65、S66、S68、S69、S70、S72‧‧‧程序
圖1為取得染色體DNA之流程圖。
圖2為單一細胞水準之分離與DNA提取之概念圖。
圖3為極限稀釋之一方式之概念圖。
圖4為進行單一細胞水準之分離的裝置之示意圖。
圖5為挑選組分D之流程圖。
圖6為表示診斷用資料之取得的流程圖。
圖7為平面晶片上之利用螢光的分取之示意圖。
圖8為取得組分A之流程圖。
圖9為密度梯度積層離心之結果之示意圖。
圖10為細胞分選儀之示意圖。
圖11表示Hoechst33342之螢光強度分佈。
圖12表示母體血中之免疫標記之螢光強度分佈。
圖13表示一般血中之免疫標記之螢光強度分佈。
圖14表示擴增之SRY基因序列之DNA之電泳像。
圖15為血球分離晶片之平面圖。
圖16為血球分離晶片之示意圖。
圖17為血球之染色像。
圖18為擴增之SRY基因序列之DNA之電泳像。
圖19為單一細胞水準之分離與RNA提取之概念圖。
圖20為挑選組分D之流程圖。
圖21為染色體DNA及RNA之同時提取之概念圖。
圖22為擴增之DNA之電泳像。
<<第一實施形態>>
以下所示之<<第一實施形態>>及其實施例1及實施例2中，藉由圖1所示之步驟取得來源於源自胎兒的有核紅血球的染色體DNA。首先，對作為起始材料之母體血試樣進行說明。
[採血]
本實施形態中，起始材料為人類孕婦之母體血試樣。孕婦較佳為月經後胎齡為10週至33週。月經後胎齡係將末次月經首日作為第一天，以足天數或足週數表示。月經後胎齡也能以將受精後胎齡加上2週之形式算出。
母體血試樣可為母體血本身。母體血試樣亦可為對母體血進行某些化學處理或物理處理，藉此賦予適於保存或此後之處理之效率化般的變化之母體血。該處理中例如包含細胞凋亡抑制劑等保存劑之添加、溫度之調整、用於防止血球沈澱之試劑之添加、以及利用氣墊保護血球免受振盪之物理損傷的處理，但不限定於該等。
本實施形態中，所謂母體血係指自孕婦採集之血液。母體血可藉由通常之醫學方法自孕婦採集。亦可對所採集之母體血立即進行有核紅血球之濃縮。另外，亦可自進行採血之場所將母體血輸送至進行濃縮處理之場所後，進行有核紅血球之濃縮。亦可對母體血進行所需之保存處理。
[有核紅血球1
本實施形態中，取得目標為源自胎兒的有核紅血球之染色體DNA。以下對源自胎兒的有核紅血球進行說明。
本實施形態中，所謂血球係指血液細胞。血液含有血球及血漿。某種說法中，可謂人類血球中紅血球佔大部分，白血球或血小板佔其餘部分。母體血含有源自胎兒的有核紅血球。
本實施形態中，有核紅血球為正紅芽球，較佳為喪失了細胞分裂能力之正紅芽球。紅血球係藉由造血幹細胞分化並且成熟而產生。於分化及成熟之過程中，自造血幹細胞開始依序出現髓系前驅細胞、紅系/巨核系前驅細胞、早期紅系前驅細胞(BFU-E)、晚期紅系前驅細胞(CFU-E)、原正紅芽球、嗜鹼性正紅芽球、多色性正紅芽球、正色性正紅芽球、網狀紅血球及紅血球。
正紅芽球中包含原正紅芽球、嗜鹼性正紅芽球、多色性正紅芽球及正色性正紅芽球。正色性正紅芽球分化成網狀紅血球之過程中自血球中失去核。正色性正紅芽球通常喪失細胞分裂能力。
有核紅血球通常處於骨髄中。然而如先前技術中所述，血液中可見極微量之有核紅血球。另外，母體血中可見極微量之源自母體及源自胎兒的有核紅血球。母體血中，源自胎兒的有核紅血球之個數通常少於源自母體的有核紅血球之個數。
[a.對組分A之標記]
<a-1.利用濃縮的組分A之取得>
於步驟a.中，針對有核紅血球經濃縮之組分A，對紅血球及核酸進行特異性標記。此處，組分A係藉由將母體血試樣中之血球至少利用該血球之密度及大小之任一者進行分組而取得。組分A亦可藉由將母體血試樣中之血球利用血球之密度及大小兩者進行分組而取得。以下，分「a-1.利用濃縮的組分A之取得」及「a-2.組分A之螢光標記」進行說明。
圖1所示之程序S21中，自母體血試樣中取得以總血球為基準、較佳為以總紅血球為基準而有核紅血球經濃縮之組分A。本實施形態中所謂有核紅血球經濃縮，係指組分中之有核紅血球於總血球中所佔之比例提高。較佳為指有核紅血球於紅血球中所佔之比例提高。
組分A之取得係藉由將母體血試樣中之血球利用密度或大小進行分組而進行。血球之利用密度之分組例如可藉由上述密度梯度離心分離法進行。血球之利用大小之分組例如可藉由上述微流路晶片般之血球分離晶片進行。藉由該分組而獲得自母體血試樣中之血球中去掉至少一部分無核紅血球而成之組分。
另外，血球之利用大小之分組例如亦可藉由應用迪恩渦流(Dean flow)或迪恩力(Dean force)之方法進行。該方法亦可使用由microfluidic chipshop GmbH所提供之螺旋分選儀(spiral sorter)進行。
於圖1所示之程序S21中，亦可進而藉由免疫去除法對將母體血試樣中之血球利用密度或大小分組所得之組分去除白血球。藉此取得有核紅血球經進一步濃縮之組分A。
圖1所示之程序S21亦可藉由組入至以下將述之程序S22至程序26中而以一系列步驟之形式於一個實驗室中進行。另外，亦可利用臨床設施從由該臨床設施採集的母體血中取得組分A之後，將組分A輸送至中央實驗室。中央實驗室中亦可不進行程序S21而僅進行程序S22至程序26。
<a-2.組分A之標記>
於圖1所示之程序S22中，針對組分A對紅血球及核酸進行特異性標記。標記(label或labeling)可為磁性標記亦可為螢光標記，較佳為螢光標記。標記可為直接標記亦可為間接標記。間接標記可利用標籤與二次抗體，亦可利用生物素-抗生物素蛋白結合。
對紅血球之特異性標記亦可為對紅血球表面之特異性標記。對紅血球之特異性標記亦可為免疫標記。免疫標記亦可為利用抗體之標記。免疫標記之標靶抗原亦可為糖鏈抗原。標記亦可利用對CD71及CD235a(GPA，Glycophorin A)般之紅血球特異性抗原的抗體。
對紅血球之特異性免疫標記亦可為對未成熟紅血球之特異性標記。亦可為將血紅素之胚ε-球蛋白鏈般的未成 熟紅血球特徵性肽鏈作為標靶抗原的免疫標記。該免疫標記用之抗體係記載於專利文獻5中。
藉由對核酸之特異性標記而將有核紅血球所具有之核特異性地標記。對核酸之特異性標記亦可為染料標記。所標記的核酸較佳為DNA。染料亦可為螢光染料。核亦可藉由螢光染料進行螢光標記。螢光染料亦可為Hoechst33342。
另外，亦可使用與存在於胎兒有核紅血球上之表面抗原反應，但與孕婦之紅血球細胞上之表面抗原不反應的抗體。抗體亦可為單株抗體。例如亦可為專利文獻6中記載之抗體、4B9。該抗體亦可與上述對紅血球之特異性免疫標記或對核酸之特異性標記一併使用。藉由使用該抗體，即便不依據對核酸之特異性標記亦可對有核紅血球進行特異性標記。
於圖1所示之程序S22中，對紅血球之特異性標記與對核酸之特異性標記亦可同時進行。另外，亦可先進行任一標記。另外，亦可先進行任一標記，並亦先進行程序S23中之分取。然後，進行隨後進行之標記及分取。
再者，亦可於進行上述任一標記或所有標記之前，對組分A中之血球進行組織學交聯固定。另外，亦可於該 狀態下進行後述利用細胞分選的分組。藉由將血球交聯固定，可預防血球彼此凝聚。因此，能以良好之精度進行利用細胞分選的分取。亦可於後述d.中之分子生物學分析之前將提取之DNA脫交聯。
亦可於未對組分A中之血球進行組織學交聯固定之狀態下，進行後述般之分組、亦即利用細胞分選的分組。藉此，可使後述d.中之分子生物學分析中的交聯固定之影響最小化。
例如，亦可不進行血球之交聯固定而同時進行對核酸之特異性標記與對紅血球之特異性免疫標記。亦可進而於進行該等標記之後將血球交聯固定。亦可進而對經交聯固定之血球進行白血球特異性免疫標記。
[b.利用細胞分選的組分B之取得]
<b-1.成為基礎之細胞分選>
於程序S23中，藉由細胞分選而揀選經標記的組分A中之血球，藉此取得組分B。於細胞分選中，例如使用為了揀選細胞而利用之裝置(細胞分選儀)。若標記為螢光標記，則利用細胞分選的揀選之方法亦可為螢光標示式細胞分取法(FACS)。利用細胞分選的揀選之方法亦可為利用 磁性標記之細胞分取法。本實施形態中，細胞分選之原理及細胞分選儀之機型並無特別限定。細胞分選較佳為利用流動式細胞測量術(flow cytometry)進行。
於一態樣中，FACS係藉由對細胞分析儀添加分取裝置而成者、作為一例係細胞分選儀而進行。於一態樣中，細胞分選儀係使細胞承載於連續流動之流體，並且利用對細胞照射激、發光所得的細胞之螢光而鑑定各細胞之特徵。該鑑定亦為細胞分析儀之功能。根據藉由鑑定所得之資訊，細胞分選儀進而將細胞製成封閉於液滴中之狀態，並且收集含有特定之細胞的液滴，藉此分取特定之細胞。
於一態樣中，細胞分選儀使細胞承載於連續流動之流體，並且利用對細胞照射激發光所得的細胞之螢光而鑑定各細胞之特徵。根據藉由鑑定所得之資訊，細胞分選儀於使細胞繼續承載於連續流動之流體的狀態下分取含有特定之細胞的組分。
作為此種不使用液滴之細胞分選儀，已知後述圖10及專利文獻7所記載般之將脈衝流用於分取之細胞分選儀。另外，已知專利文獻8所記載般之將流體之溶膠-凝膠轉換用於分取之細胞分選儀。
此種不使用液滴之細胞分選儀可保持使細胞承載於流體之狀態而將細胞導入分取容器內，因此不易損傷細胞。另外，在將細胞導入容器中之前的步驟中，將流體封閉於流路晶片內，藉此容易防止由流體之飛沫所致的裝置或環境之污染。
於圖1所示之程序S23中，較佳為以取得藉由特異性標記對紅血球進行了標記的血球之方式揀選血球。由於有核紅血球為紅血球，故而可藉由對紅血球之特異性標記將有核紅血球與以白血球為代表之其他血球區分。
於圖1所示之程序S23中，較佳為以取得藉由特異性標記對有核血球進行了標記的血球之方式揀選血球。由於有核紅血球具有核，故而可藉由對核酸之特異性標記將有核紅血球與以無核紅血球為代表之其他血球區分。
於圖1所示之程序S23中，藉由將該等標記組合而取得有核紅血球之純度經提高之組分B。所取得之組分B中含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球。利用對紅血球之特異性標記的分取、與利用對核酸之特異性標記的分取亦可同時進行。另外，亦可先進行任一者。例如亦可藉由對紅血球之特異性磁性標記進行揀選之後，藉由對核酸之特異性螢光標記進行揀選，藉此取得組分B。
於圖1所示之程序S22中，亦可追加地針對組分A對白血球進行特異性標記。白血球特異性標記亦可為免疫標記。該標記亦可為對CD45般之白血球特異性抗原的標記。抗原亦可為糖鏈抗原。於程序S23中，較佳為以將藉由特異性標記對白血球進行了標記的血球除外之方式揀選血球。
<b-2.追加之細胞分選>
於在圖1所示之程序S21中對組分A中之血球進行了螢光標記之情形時，較佳為使用FACS作為細胞分選。另外，螢光標記於利用細胞分選之處理後亦殘存，故而亦可有效地利用該螢光標記。
例如亦可對藉由細胞分選所得之第一次組分進一步追加利用螢光而分取細胞。例如亦可對所得之第一次組分進一步重複進行利用細胞分選之揀選，取得第二次以後之組分。藉此亦可最終獲得上述組分B。
[c.血球之分離與DNA提取]
於步驟c.中，將組分B中之血球以單一細胞水準分別分離。另外，對經分離之血球各自獨立地進行染色體DNA之提取處理。藉此，取得分別含有能以單一細胞水 準區分之染色體DNA的組分C。本實施形態中，染色體DNA係指基因組DNA。
以下，分「c-1.單一細胞水準之血球分離」及「c-2.利用DNA提取的組分C之取得」進行說明。
<c-1.單一細胞水準之血球分離>
於圖1所示之程序S24中，將組分B中之血球以單一細胞水準分別分離。另外，將組分B中之血球以單一細胞水準相互分離。本實施形態中將血球以單一細胞水準分離中，包括將血球依單一細胞逐個分離。亦即包括獲得單細胞。
對組分B中之血球的單一細胞水準之分離較佳為與組分B中之各血球是否具備有核紅血球之特徵無關而無差別地進行。亦即，較佳為無論各血球是否為有核紅血球均將血球分離。無差別之術語中不包括將以下情況除外之含意：於直至取得組分B為止之過程中，根據血球之密度及大小以及標記將有核紅血球濃縮。
進行上述濃縮及細胞分取之結果為，於圖2所示之組分B中，相對較充裕地含有具有細胞核40之有核紅血球41。有時於組分B中亦含有其他血球。其他血球中例如 包括無核紅血球42、或具有細胞核40之白血球43。所謂無差別地分離，係指將該等細胞全部以單一細胞水準分離。
為了將圖2所示之組分B中之血球以單一細胞水準分別分離，較佳為將該等分別分配至各個容器44中。可藉由該分配將組分B進一步分組。分組較佳為藉由極限稀釋法(limited dilution)進行。藉由利用極限稀釋法進行分組，可取得分別含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E。極限稀釋法亦可藉由以下方式進行：以可形成多於血球數之組分之方式設定分取體積後，自經充分懸濁之組分B中分取。
描畫合計8個與圖2所示之容器44同等之容器。容器44之個數可根據組分B中之血球之個數或欲獲得之組分C之個數而適當選擇。容器例如可為8連管，另外亦可為96孔、384孔及其他孔數之任一孔板。圖2中描畫有組分E1、組分E2及組分E4至組分E8作為組分E。極限稀釋法中，亦可產生如組分E3般不含血球之組分。
對圖2所示之容器44之血球分配較佳為如上述般無差別地進行。亦即，絲毫不排除以下情況：於分配有核紅血球41時將無核紅血球42或白血球43亦以單一細胞水準分配。
於本實施形態中，例如並不依據專利文獻4所記載般的根據細胞之形態資訊識別胎兒有核紅血球候選細胞。另外，並不進行依據此種候選細胞之識別將候選細胞單離成單一細胞單位。本實施形態之單一細胞水準之分離中，較佳為不進行伴隨此種有核紅血球之鑑定的單離操作。於較佳態樣中，於本實施形態之方法中，於步驟c-1.中利用分離成單一細胞水準之步驟對藉由細胞分選所得之組分進行處理之前，不包括用以進一步根據血球之形態資訊自組分中分取血球之步驟。
於本實施形態中，較佳為將單一細胞水準之分離優先而使用有限之處理時間。於較佳態樣中，於本實施形態之方法中不包括以下步驟：將組分於上述平面晶片上展開，並且藉由螢光鑑定有核紅血球。於較佳態樣中，於本實施形態之方法中，於步驟c-1.中利用分離成單一細胞水準之步驟對藉由細胞分選所得之組分進行處理之前，不包括用以進一步自組分B中分取血球之步驟。
上述內容並非將以下情況除外：觀察組分A或組分B之一部分或全部，確認該組分A或組分B之一部分或全部中包含有核紅血球。例如亦可對組分之一部分進行顯微鏡觀察，根據形態資訊或基於螢光之資訊或基於其他特徵 之資訊確認有核紅血球之存在，藉此進行各步驟之品質管理。
圖3表示極限稀釋之一方式。於該方式中，自組分B中無差別地分取組分F。亦即，無論各血球是否為有核紅血球均分取組分F。圖中描畫有組分F1至組分F3作為該組分F。對該等組分F1至組分F3進行攝影。組分F1中包含以單一細胞水準經分離之血球。組分F2中包含二細胞之血球。組分F3中不含血球。使用組分F1至組分F3之像確認該等情況。藉此取得組分F1作為組分E。另外，亦可藉由圖像分析而判定是否取得了組分E。亦可使組分F2回到組分B中。
於圖3所示之極限稀釋之方式中，可於分注各組分時利用相機等判別是否實際上分注了單細胞。藉由該方式，可更可靠地以單一細胞水準分離血球。另外，可避免生成不含血球之組分。為了實現此種極限稀釋之方式，亦可使用由On-chip Biotechnologies提供之單一細胞分注器On-chiP SPiS。
另外，圖1所示之程序S24亦可藉由以下方式進行：將組分B之血球分散於載玻片或晶片上之後，將該等依單一細胞逐個無差別地單離。亦即，無論各血球是否為有核紅血球均進行單離。另外，亦可一邊於程序S23中進行 細胞分選，一邊一併進行程序S24。亦即，雖然於細胞分選中連續地分取含有血球之微量流體，但亦可不將該等流體再次收集匯總於一個容器中，而是對每個血球分別將流體分注至各個容器中。
<c-2.利用DNA提取的組分C之取得>
於圖1及圖2所示之程序S25中，進而對經分離之血球各自獨立地進行染色體DNA之提取處理，藉此取得組分C。藉由經過程序S24及程序S25，組分C變得分別含有能以單一細胞水準區分之染色體DNA。於本實施形態中，於含有能將提取染色體DNA前之血球以單一細胞水準區分的染色體DNA之組分中，包含具有自單一細胞之血球中提取的染色體DNA之組分。
如圖2所示，較佳為對分取至各容器44中的含有血球之組分E1至組分E8無差別地進行染色體DNA之提取處理。提取處理係與組分B中之各血球是否具備有核紅血球之特徵無關而無差別地進行。另外，提取處理係與各組分E中之血球是否具備有核紅血球之特徵無關而無差別地進行。亦即，無論各血球是否為有核紅血球，均進行提取處理。無差別之術語不包括將以下情況除外之含意：於直至取得組分B為止之過程中，根據血球之密度及大小以及標記將有核紅血球濃縮。
提取處理之結果為，獲得組分C1、組分C2及組分C4至組分C8作為組分C。亦即，絲毫不排除以下情況：自有核紅血球41中提取染色體DNA時，自無核紅血球42或白血球43中亦提取染色體DNA。另外，亦可存在組分C3般對不含血球之組分進行染色體DNA提取之化學處理所得的組分。
DNA提取處理係以單一細胞水準各自獨立地進行。因此，例如組分C4或組分C7中含有源自有核紅血球41的染色體DNA。另外，組分C4或組分C7中未混合有其他細胞之染色體DNA。組分C4或組分C7中，含有與自如上述般預先單離之有核紅血球所得的染色體DNA同等純度之染色體DNA。再者，此處所提及之純度係著眼於有無混入源自母體的白血球之染色體DNA。
如圖2所示，染色體DNA之提取係對各血球無差別地進行。亦即，無論各血球是否為有核紅血球均進行提取處理。因此，源自無核紅血球42的組分C1、組分C5及組分C8中不含染色體DNA。源自白血球43的組分C2及組分C6中含有白血球之染色體DNA。組分E3中原本不存在血球，故而組分C3中不含染色體DNA。
本實施形態之方法容許該等般之低效率作業。藉由如此般無差別地進行細胞之分離及DNA提取，即便不依存伴隨有核紅血球之鑑定的單離操作亦可取得有核紅血球之染色體DNA。因此，作為一系列步驟整體而實現效率化。
本實施形態之步驟c.中注意以下三點。作為第一點，容許以下情況：對於本實施形態之方法之實施者而言，於步驟c.中尚不明確圖2所示之8個組分C中於組分C4或組分C7中含有源自有核紅血球的染色體DNA之事實本身。這一情況之原因在於：於本實施形態之方法中，無須根據形態資訊單離有核紅血球。進而原因在於：組分C係如上述般無差別地取得。
作為第二點，圖2所示之哪個組分C中取得了源自有核紅血球的染色體DNA係藉由在後述d.中進行分子生物學分析而事後推定。通常混入至母體血中之胎兒細胞為胎兒之有核紅血球，因此藉由判明染色體DNA係源自胎兒而推定上述內容。
作為第三點，容許以下情況：對於本實施形態之方法之實施者而言，於步驟c.中尚不明確圖2所示之組分C4或組分C7所含的染色體DNA係源自母親之有核紅血球，還是源自胎兒之有核紅血球。這一情況之原因在於： 於前一步驟中，無須使用區分母親之有核紅血球與胎兒之有核紅血球的手段。染色體DNA係源自胎兒這一情況係藉由在後述d.中進行分子生物學分析而事後判明。
例如亦可使用圖4所示之裝置74代替圖2所示之容器44，裝置74具有流路75、捕捉結構76及反應結構77。沿著流路75連續地配置有多個捕捉結構76。各捕捉結構76上隨附有反應結構77。
於圖4所示之裝置74中，藉由將細胞78分配至各捕捉結構76中，而將細胞78以單一細胞水準相互分離。然而，捕捉結構76中捕捉之含有細胞78之組分並未被分取至特定之容器中。於捕捉結構76中捕捉所有或所需個數之細胞78後，將捕捉之細胞78溶解，並推動溶解物流向反應結構77，藉此對細胞進行處理。於反應結構77內，亦可進行染色體DNA之提取及以下將述之全基因組擴增之反應作為細胞之處理。
亦可使用專利文獻9所揭示之微流體設備(micro-fluidic device)作為圖4所示之裝置74。另外，亦可使用由Fluidigm公司提供之C1 Single-Cell Auto Prep Array IFC作為微流體設備。
[d.自組分C之群組中的組分D之挑選]
<d-1.利用DNA分析的組分D之挑選>
於圖1及圖2所示之程序S26中，對組分C各自進行分子生物學分析。藉此自組分C之群組中揀選含有源自胎兒的染色體DNA之組分D。如圖2所示，組分D除了含有源自母親的染色體M之DNA之複本以外，還含有源自父親的染色體P之DNA之複本。於胎兒為男性之情形時Y染色體與X染色體成對，但不成為同源染色體。
圖5中示出圖1及圖2所示之程序S26之較佳例。於圖5所示之程序S28中，對組分C之染色體DNA進行全基因組擴增。作為全基因組擴增之方法，可使用MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles；多重退火環狀循環擴增技術)所代表之PCR(Polymerase Chain Reaction；聚合酶鏈式反應)法、MDA(Multiple strand Displacement Amplification；多重置換擴增)及DOP-POP-PCR(Degenerate Oligonucleotide-primed PCR；簡並寡聚核苷酸引子PCR)。其中，就遍及全基因組區域而擴增之偏倚小之方面而言，較佳為MALBAC。
藉由全基因組擴增，組分C中充裕地含有染色體DNA之複本。以下，除了特別提及之情形以外，將染色體DNA之複本亦稱為染色體DNA。
於圖5所示之程序S29中，進行分子生物學分析。藉此區分各組分C之染色體DNA係源自母體還是源自胎兒。關於該區分，可留意以下方面。
於本實施形態中，將源自母體的染色體與源自母親的染色體相區分。源自母體的染色體係淨源自母體的體細胞。源自母體的一對染色體中，一對中的任一染色體均源自母體。
於本實施形態中，所謂源自母親的染色體係指源自母親之生殖細胞的染色體。只要未特別提及，則源自母親的染色體係指源自胎兒的染色體。該染色體與源自父親的染色體形成同源染色體(homologous chromosome)。
於母體與母親一致之情形時，源自母親的染色體之DNA序列與源自母體的染色體之DNA序列係共同。再者，即便胎兒並非源自母體之卵子而是源自來源於其他女性的卵子，亦可應用本實施形態之方法。
作為圖5所示之程序S29中之分子生物學分析，較佳為STR(Short Tandem Repeat；短串聯重複序列)分析。於STR分析中，可區分源自父親的序列與源自母親的序列。源自胎兒的DNA中包含並非源自母親的STR。因此，可不依賴於胎兒之性別而鑑定染色體DNA係源自胎兒。
於得知胎兒為男性之情形時，亦可進行基於Y染色體特異性序列之分析。源自男性胎兒的DNA中包含並非源自母親的Y染色體。因此，可鑑定染色體DNA係源自胎兒。
於圖5所示之程序S30中，根據上述分子生物學分析結果確認哪個組分C係源自胎兒。藉此可自組分C中挑選組分D。
於圖5所示之程序S30中，無須完全確認組分D係源自有核紅血球。於程序S30中已失去血球之形態資訊。由於程序S23中已提高了有核紅血球之純度，故而推定組分D機率性地源自有核紅血球。
藉由圖1至圖5所示之一系列步驟可取得含有染色體DNA之組分D，上述染色體DNA係源自以單一細胞水準經單離之源自胎兒的有核紅血球。為了將該染色體DNA供於產前診斷，進行圖6所示之處理。
再者，通常產前檢查或產前診斷之術語中有時亦包含未確定檢查。另外，藉由本實施形態所得之染色體DNA有時用於確診。這一情況之原因在於：本實施形態中所得之檢查用之資料係僅由胎兒細胞中之染色體DNA獲得。
於僅使用源自胎兒的染色體DNA所得之資料中，由源自母體細胞的染色體DNA混入至DNA試樣中所致的對資料之影響極小或不存在。再者，所謂此處提及之混入之有無並非指遺傳之原理，亦即非指胎兒之同源染色體之一半源自母親且另一半源自父親。
可認為與利用例如血漿中所含之DNA斷片的先前型NIPT相比，本實施形態之方法更適於確診。這一情況之原因在於：先前型NIPT所用之DNA試樣係將源自母體細胞的染色體DNA與源自胎兒細胞的染色體DNA混合。
本實施形態中所得的上述染色體DNA及資料有時被供於NIPD(non-invasive prenatal diagnosis；非侵入性產前診斷)。將本實施形態中之染色體DNA或資料用於未確定檢查還是用於確診可由醫師判斷。是否將依據藉由本實施形態所得之染色體DNA及資料的診斷視為確診之妥當性係依據醫學判斷，不影響本發明之技術本質。
於DNA分析時，必修預先將用於固定染色體DNA之交聯解除。亦即，預先將染色體DNA脫交聯。藉此可有效率地推進DNA分析。另外，亦可藉由不進行交聯而防止脫交聯反應中DNA損傷。
[e.供診斷的資料之取得]
<e-1.以染色體DNA為樣本之供診斷的資料之取得>
於圖6中示出用以供診斷的資料之取得方法。於程序S32中，對上述組分D之染色體DNA之序列資訊之一部分或全部進行分析。分析可利用序列確定而進行。序列測定可對基因組之一部分或全部進行。序列確定可為桑格測序(Sanger's Sequencing)亦可為NGS(new generation sequencing；次世代測序)。
NGS可為由Roche公司提供般之焦磷酸測序(Pyrosequencing)、由Illumina公司提供般之利用合成之測序、以及由Thermo Fisher SCENTIFIC公司提供般之利用連接(ligation)之測序、及離子半導體測序之任一種。
於圖6所示之程序S32中，序列資訊之分析亦可利用微陣列進行。微陣列亦可為SNP(Single Nucleotide Polymorphism；單核苷酸多態性)微陣列。本實施形態之 方法中，遍及源自胎兒的染色體DNA之全長而無偏倚地獲得複本數。因此，適於提供MPS法(massively parallel sequencing；大規模平行測序)之情況下困難的可靠性高之SNP微陣列資料。另外，微陣列亦可為CGH(Comparative Genomic Hybridisation；比較基因組雜交)陣列。
於圖6所示之程序S33中，根據序列資訊之分析結果生成適於由醫師進行診斷之資料。該資料中亦可含有分析之原始資料之一部分或全部。另外，亦可基於適當之手續而製作適於醫學統計分析之資料。
[變形例]
再者，本發明不限於上述實施形態，可於不偏離主旨之範圍內適當變更。上述實施形態係以人類為對象之方法。本實施形態之方法亦可應用於人類以外之哺乳類。
<溶血法>
上述實施形態中，為了自母體血試樣中之血球中去掉至少一部分無核紅血球，利用血球之密度或大小。亦可藉由將母體血試樣中之血球選擇性地溶血而將無核紅血球選擇性地去除。藉此，將經溶血之無核紅血球自組分中之總血球之範圍內除外，因此可取得有核紅血球經濃縮之組 分A。溶血例如可藉由以下方式進行：藉由氯化銨溶血劑對分散有血球之分散介質之滲透壓進行調整。
<利用平面晶片之分取>
圖7為平面晶片上之利用螢光的分取之示意圖。如上所述，於圖1所示之程序S23中藉由細胞分選而取得組分B。此處，亦可追加利用平面晶片之分取法作為輔助利用細胞分選的分取之其他分組法。
首先，如上述般藉由細胞分選而揀選經螢光標記的組分A中之血球，藉此首先取得有核紅血球之純度經提高之組分G。然後，如圖7所示般將組分G中之血球於平面晶片61上展開。進而，自平面晶片61上分取發出對紅血球及核酸之特異性標記之訊號的血球62。藉此，取得相較於組分G而有核紅血球之純度經進一步提高之組分B。
作為利用該平面晶片的使用螢光之分取機構，亦可使用由Silicon Biosystems公司提供之DEPArray(專利文獻10)、或由Rarecyte公司提供之CyteFinder及CytePicker。
如上所述，本實施形態之方法並不依存於藉由利用平面晶片之分取手段嚴格判定是否為有核紅血球。再者，有 時可藉由使用該等裝置而以一體的步驟之形式實施組分B之取得與組分C之取得。
[實施例1]
<採血>
於圖8中示出圖1所示之程序S21之實施例。於程序S35中進行母體血之採血。本實施例中，於適當之手續下接受母體血及一般血之提供。母體血係作為試驗研究用而由妊娠33週之孕婦提供。胎兒性別為男性。本實施例中所用之一般血係作為試驗研究用而由並非孕婦之人提供。母體血及一般血之採集係於醫療機構中進行。將該等血液於適當之管理下輸送至發明者等人之研究室。
必要之母體血之量可考慮如下。可認為10ml之母體血中含有約3×1010個血球。另外，可認為相同體積之母體血中含有約36個至2168個有核紅血球(非專利文獻1)。
鑒於上述有核紅血球之比例，成為起始材料之母體血之量亦可為0.01ml至100ml。母體血之量亦可為0.01ml、0.02ml、0.03ml、0.04ml、0.05ml、0.06ml、0.07ml、0.08ml、0.09ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、 8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml。本實施例中使用20ml母體血作為起始材料。
利用全自動細胞計數器TC20(BIORAD)進行測定，結果每10ml母體血含有3.16×1010個血球。以PBS(Phosphate buffered saline；磷酸鹽緩衝鹽水)將母體血稀釋至2倍。
隨後之利用密度梯度離心法之濃縮處理係於採血後經過較佳為48小時、36小時、更佳為24小時、進而佳為3小時、尤佳為2小時以內進行。採血後至處理開始之時間越短，越可提高利用密度梯度離心法之濃縮之效率。本實施例中採血後2小時開始處理。另外，藉由添加細胞凋亡抑制劑等保存劑，可抑制濃縮效率隨時間經過而降低。
<有核紅血球之濃縮>
經過圖8所示之程序S36及程序S37，利用二階段之密度梯度離心法將母體血中之有核紅血球濃縮。此處所謂濃縮，係指將有核紅血球以外之血球去除。濃縮中自母體血中去除之血球較佳為無核紅血球。進而佳為於濃縮中自母體血中亦去除血小板。
藉由經過圖8所示之程序S36及程序S37之濃縮而獲得組分A。濃縮後，組分A中之有核紅血球相對於總血球之比例大於母體血試樣中之有核紅血球相對於總血球之比例。
於圖8所示之程序S36中，藉由密度梯度積層離心將母體血分組。密度梯度積層離心係密度梯度離心之一種。於本實施例中使用細胞分離液(Percoll)及鹽水製作密度1.085g/ml及1.075g/ml之等滲液。於離心管中將該等依序積層後，進而層疊10ml母體血。將該離心管於20℃以1750G離心30分鐘。
圖9中示出密度梯度積層離心之結果之示意圖。於離心管46中自上而下依序形成有層45a至層45f。層45a中血漿經濃縮。層45b中白血球43經濃縮。可認為層45a及層45b之密度小於1：075g/ml。層45c為密度1.075g/ml之等滲液之層。
圖9所示之層45d中有核紅血球41經濃縮。可認為層45d之密度大於1.075g/ml小於1.085g/ml。藉由分取層45d並清洗血球而獲得包含有核紅血球之組分。將該組分作為試樣1。使用全自動細胞計數器TC20測定試樣1中之血球數。血球數為約9.95×106個。
圖9所示之層45e為密度1.085g/ml之等滲液之層。層45f中無核紅血球42經濃縮。可認為層45f之密度大於1.085g/ml。
於圖8所示之程序S37中，亦可藉由高滲離心將程序S36中所得之組分進行分組(專利文獻1)。高滲離心為密度梯度離心之一種。繼而使用試樣1之一半量作為組分A，進行以下之螢光標記之程序。
<螢光標記>
於圖1所示之程序S22中對組分A進行螢光標記。經螢光標記之血球較佳為成為與包含未經螢光標記之血球的其他血球相互分離之狀態。本實施例中關於螢光標記之條件，例如可如以下般進行螢光標記。
首先，利用Hoechst33342(Sigma-Aldrich製造)、抗CD45-PE標記抗體(Miltenyi-Biotec製造，殖株名：5B1)及抗CD235a-FITC標記抗體(Miltenyi-Biotec製造，殖株名：REA175)將組分A之血球同時染色。染色時不進行血球之交聯固定。染色係於4℃進行10分鐘。染色後，將血球之懸濁液於4℃以300G之條件離心10分鐘，藉此回收經標記的血球。
再者，螢光標記之條件亦可如以下般變更。例如，首先亦可利用Hoechst33342將組分A之血球染色。然後，亦可利用抗CD45-PE標記抗體及抗CD235a-FITC標記抗體對血球進行免疫染色。亦可一邊將血球及抗體顛倒混和，一邊於室溫進行抗體抗原反應。然後，亦可於血球之懸濁液中添加磷酸緩衝鹽水。藉此可降低所添加之螢光抗體之濃度。然後，亦可將血球之懸濁液於25℃以300G離心3分鐘而回收血球。
抗體之濃度亦可設為上述抗體之隨附文件中記載的標準使用濃度之約1/100至1/10。藉此，可實現細胞分選處理中之訊號/雜訊比之改善。本實施例中，於稀釋抗體時，將抗CD45-PE標記抗體與緩衝液之間的體積比(稀釋率)設為1：10。另外，將抗CD235a-FITC標記抗體與緩衝液之間的體積比(稀釋率)設為1：1099。
於圖1所示之程序S23中，藉由細胞分選將組分A進一步分組。使用圖10之示意圖所示之細胞分選儀作為細胞分選儀。該細胞分選儀係對血球進行螢光檢測。
首先，於圖10所示之主流路47內製作包含經螢光標記的組分A之恆常液體流。對液體流中之血球48a投射激發光，藉由螢光而檢測標記訊號之有無。副流路49與 主流路47交叉。血球48a流向主流路47與副流路49之交叉點。
圖10所示之血球48b係被檢測出訊號之血球。該血球於主流路47內流動而來進入交叉點。副流路49中可於與液體流交叉之方向上產生脈衝流。根據上述訊號，以血球48b作為標靶而產生脈衝流。
藉由使圖10所示之血球48b承載於副流路49之脈衝流，而將血球48b自主流路47之液體流中分離。將經分離之血球48b依次收集。藉此生成由經收集之48b所構成之組分B。
於圖10中，對無訊號或訊號弱之血球48c不賦予脈衝流。血球48c保持承載於液體流之狀態而於主流路47內流走。
關於該細胞分選儀，已於專利文獻7中詳細進行了說明。另外，本實施例中使用由On-chip Biotechnologies所提供之細胞分選儀(細胞分選儀之型號：On-chip-Sort MS6)。本實施例中，用以進行細胞揀選之細胞分選儀之動作條件如下。
<利用細胞分選的分析>
圖11表示Hoechst33342之螢光強度分佈。縱軸表示血球之出現頻率。橫軸表示Hoechst之螢光訊號之強度。表現出兩個峰值。出現頻率於強度40至50之間成為最小。於該範圍內設定邊界值，將強度大於該邊界值之血球推定為有核血球。另外，將強度小於該邊界值之血球推定為無核血球。
圖12表示母體血中之免疫標記之螢光強度分佈。圖13表示一般血中之免疫標記之螢光強度分佈。縱軸表示與抗CD235a抗體結合之FITC(fluorescein isothiocyanate；螢光異硫氰酸鹽)之發光訊號之強度。橫軸表示與抗CD45抗體結合之PE(phycoerythrin；藻紅素)之發光訊號之強度。
圖12及圖13中之Ar1表示強烈表現出CD235a-FITC之訊號的基團。Ar2表示經CD45標記之白血球之基團。
藉由將母體血之結果與一般血之結果比較得知，與一般血相比，母體血中屬於Ar1之血球之個數較多。
於圖12中，將Ar1中FITC之發光訊號之強度大於1×103者作為有核紅血球之候選。這一情況之原因在於：於預備實驗中，背景雜訊、亦即白血球之FITC之發光訊 號強度為1×103以下。基於上述條件研究，藉由細胞分選而取得包含有核紅血球之候選之組分B。
<分子生物學分析>
對組分B整體使用Nucleospin Tissue XS進行DNA提取。亦可進行單一細胞水準之分離後進行DNA提取。另外，亦可對從以單一細胞水準經分離之細胞中獲得之DNA進行全基因組擴增。全基因組擴增例如可使用由Yikon Genomics公司提供之MALBAC而進行。
本實施例中，將藉由DNA提取所得之DNA作為模板進行PCR反應。PCR反應中使用Ex-Taq聚合物酶(Ex-Taq polymerase)。圖14表示分子生物學分析之結果。圖14所示之電泳像中泳道1至泳道11表示針對SRY(Sex-determining region of Y-chromosome；Y染色體性別決定區)基因序列的由PCR所得之270bp長之擴增產物。模板如下。
於泳道1之左側中示出200bp之DNA梯狀條帶。
泳道1：人類男性之標準DNA，200複本。
泳道2：人類女性之標準DNA，200複本。
泳道3：人類男性之標準DNA，0複本。
泳道4：人類男性之標準DNA，1複本。
泳道5：人類男性之標準DNA，4複本。
泳道6：人類男性之標準DNA，8複本。
泳道7：人類男性之標準DNA，16複本。
泳道8：人類男性之標準DNA，64複本。
泳道9：人類男性之標準DNA，100複本。
泳道10：試樣1
由圖14所示之電泳像得知，試樣1中含有具有4複本至16複本之SRY基因序列的DNA。因此得知試樣1中含有源自胎兒的染色體DNA。
[實施例2]
本實施例中利用自妊娠33週之孕婦採集的血液。胎兒性別為男性。
<利用血球分離晶片的母體血之濃縮>
於實施例2中使用0.3ml母體血，藉由血球分離晶片進行母體血之濃縮步驟。作為血球分離晶片，例如可使用專利文獻11中記載者。血球分離晶片係以細胞之大小為基準將母體試樣中之血球分組。
圖15中作為血球分離晶片之一例，示出血球分離晶片50之平面圖。血球分離晶片50具有入口51、主流路52、副流路53以及出口54a至出口54d及出口55。主流路52自入口51朝向出口55依序具有流路56a至流路56d。流路56a至流路56d係自入口51至出口55連成一條。
圖15所示之入口51與裝入有母體血之針筒57連接。自針筒57以預定之流量將母體血送至入口51。母體血經由入口51進入流路56a。於濃縮開始時，母體血係於採血後經過2小時至3小時。
母體血較佳為預先稀釋。稀釋率可設為2倍至500倍。本實施例中將稀釋率設為50倍。稀釋係利用磷酸緩衝生理鹽水進行。可將母體血稀釋液之每單位時間之流量設為1μl/min至1000μl/min。本實施例中設為25μl/min。利用血球分離晶片的分組係進行10小時。一次分組例如可處理15ml之母體血稀釋液。
圖15所示之血球分離晶片50具有副流路53。副流路53與針筒58連接。於針筒58中裝入有PBS。藉由對針筒58內施加壓力，PBS經過副流路53而流入流路56b。
圖15所示之分支流路59a至分支流路59d均為自主流路52分支之流路。於流路56c中，自上游側開始依序以分支流路59a、分支流路59b、分支流路59c及分支流路59d之順序自主流路52分支。
圖15所示之分支流路59a至分支流路59d均具有多個自主流路52分支之細流路。各細流路係自主流路52之上游朝向下游排列。分支流路59a至分支流路59d分別到達出口54a至出口54d。分支流路59a至分支流路59d中之各細流路分別於出口54a至出口54d近前合流。流路56d到達出口55。
圖16中示意性地示出利用血球分離晶片50的血球之分類過程。如圖15所示，分支流路59a至分支流路59d分別具有多個細流路。圖16中為了簡化說明，於各分支流路59a至59d中分別示出各一條細流路。
母體血自圖16所示之主流路52之上游流動而來。母體血大量含有血球。血球到達流路56b。另一方面，於副流路53中流動而來之PBS將於主流路52中流動之血球從主流路52之側部推擠。於流路56b至流路56c中，將血球推至分支流路59a至分支流路59d側。
於圖16所示之流路56a中，於主流路52中之與副流路53對向之側配置有分支流路59a至分支流路59d。分支流路59a至分支流路59d各自所具有之細流路之內接徑依該等細流路之排列順序而變大。此處，內接徑為細流路之正交截面中之內接圓之直徑。本實施例中，分支流路59a至分支流路59d之細流路之內接徑分別為8μm、12μm、15μm及25μm。於本實施例中，細流路之截面為四邊形。細流路之截面亦可為其他多邊形亦可為圓。
圖15及圖16所示之血球分離晶片50中設有4個分支流路。分支流路之個數只要為2個以上則並無特別限定。例如亦可將分支流路設為至少2個。該2個分支流路中，上游之細流路之內接徑可為12μm至19μm。上游之細流路之內接徑亦可為13μm、14μm、15μm、16μm、17μm及18μm之任一個。本實施例之分支流路59c適用該內接徑。分支流路59c可謂無核紅血球之去除流路。
另外，下游之細流路之內接徑可為20μm至30μm。下游之細流路之內接徑可為21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm及29μm之任一個。本實施例之分支流路59d適用該內接徑。分支流路59d可謂有核紅血球之回收流路。
被副流路53推擠之血球流入圖16所示之分支流路59a至分支流路59d中。流入各分支流路中之血球之徑略小於該分支流路之細流路之內接徑。圖中示出顆粒39作為略小於分支流路59a之細流路之內接徑的血球。顆粒39到達出口54a。圖中示出無核紅血球42作為略小於分支流路59b、分支流路59c之細流路之內接徑的血球。無核紅血球42到達出口54b、出口54c。
可認為有核紅血球之直徑之大小為11μm至13μm。圖中示出有核紅血球41作為略小於分支流路59d之細流路之內接徑的血球。進而示出白血球43。有核紅血球41及白血球43到達出口54d。
未被取入圖16所示之分支流路59a至分支流路59d中的血球以FT(Flow Through；順流)之形式與血漿一起通過流路56d，並且到達圖15所示之出口55。例如凝聚之血球等包含在順流中。於出口54a至出口54d及出口55分別設有接受流體之貯液器。
於連接於圖16所示之出口54a至出口54d的各貯液器中分別分取組分Fr1至組分Fr4。順流係作為組分Fr5而被分取至連接於圖15所示之出口55的貯液器中。藉由以上操作，血球分離晶片50可利用大小將血球分組。另外，血球分離晶片作為篩而發揮功能，因此組分Fr1至組 分Fr4中不含大小超過各細流路徑之粒子。因此，可防止凝聚之血球混入Fr4中。
與利用密度之方法相比，利用血球大小之濃縮方法具有優點。一個優點為以下方面：採血後之經過時間對血球密度之影響大，但對血球大小之影響小。這表示即便採血場所距對血球進行分組處理之場所遠，亦容易實施本實施例之方法。另一優點為以下方面：例如上述血球分離晶片之操作般，利用大小之分組可利用容易之操作來進行。
<實際之分組>
將利用上述血球分離晶片對15ml母體血稀釋液進行分組所得之結果示於表1中。該母體血中含有300μl之母體血全血。可認為母體血全血中含有1.43×109個血球。使用全自動細胞計數器TC20進行測定。通過分支流路1及分支流路2以及順流3的組分之血球數如表1所示。
表1所示之組分Fr4中之血球為3.29×107個。若亦考慮密度梯度積層離心之結果，則理解該組分中含有相當於有核紅血球及白血球之血球。使用組分Fr4作為上述組分A，進行利用細胞分選的分析。
實施例1之密度梯度離心法中，必須採集離心管中浮游之組分。相對於此，使用血球分離晶片之本實施例中，血球分離晶片自身可分取組分A。因此，可簡便地進行用以獲得組分A之濃縮操作。
<利用細胞分選的組分B之分取>
組分B之分取係與實施例1同樣地進行。首先，利用Hoechst33342及PE修飾抗CD45抗體將組分A染色。染色係於不對細胞進行包含交聯固定之固定處理的情況下進行。然後利用FITC修飾抗CD235a抗體進行染色。抗體之濃度係與實施例1同樣地最適化。
利用On-Chip公司之細胞分選儀對組分Fr4之3.29×107個血球進行揀選。揀選對Hoechst33342及CD235a呈陽性且對CD45呈陰性之血球。CD45陰性之選 擇亦可於使用CD45抗體微球之親和純化中藉由免疫學去除而進行。藉由以上操作而獲得含有661個血球之組分B。
<單一細胞水準之分離>
於圖17中示出如上述般經染色之血球。如圖所示，凝聚之產生得到抑制。因此表示能將血球以單一細胞水準相互分離。本實施例中，可認為凝聚得到抑制之原因在於已使染色之抗體濃度最適化。
<染色體DNA之提取>
將上述組分B分成各自含有約200個血球之3個組分。期待該等組分中含有1個至2個源自胎兒的有核紅血球。
對各組分進行染色體DNA之提取。利用MALBAC法對染色體DNA進行全基因組擴增。藉此可將源自胎兒的Y染色體擴增，於後續步驟中容易地檢測SRY基因。將經擴增之染色體DNA作為模板，SRY基因序列特異性地進行PCR擴增。將SRY基因之PCR產物之電泳像示於圖18中。模板如下。
於泳道1之左側示出200bp之DNA梯狀條帶。
泳道1：蒸餾水。
泳道2：人類男性之標準DNA，20ng。
泳道3：人類女性之標準DNA，20ng。
泳道4：由MALBAC法所得之擴增產物1,450ng。
泳道5：由MALBAC法所得之擴增產物2,610ng。
泳道6：由MALBAC法所得之擴增產物3,700ng。
於以泳道4之擴增產物1作為模板之PCR中，可見SRY之條帶(band)。於以其他擴增產物作為模板之PCR中，未見SRY之條帶。由以上內容得知，藉由將組分B進行分組，可分為含有源自胎兒的血球之組分與不含源自胎兒的血球之組分。另外啟示，藉由以單一細胞水準進行極限稀釋，可鑑定經分離成單一細胞水準的血球中之SRY基因之有無。
根據上述新穎見解可認為：本領域技術人員可容易地理解，能取得能以單一細胞水準進行區分且源自胎兒的染色體DNA。亦即，本實施例中獲得各自含有200個血球之3個組分，相對於此，其他方法中藉由極限稀釋法，若將組分B分成600個以上之組分則可將血球以單一細胞水準分離。此種分組亦可無差別地進行，另外亦可一邊確認所得之小組分中各含有1個細胞一邊進行分組。另外，亦可對該等以單一細胞水準含有血球之小組分進行預定之DNA提取處理及擴增處理。
單細胞之染色體DNA中通常僅存在自雙親之配子所得的各單複本(single copy)之基因或對偶基因(allele)。然而，以MALBAC法為代表之全基因組擴增法可將單一細胞之染色體DNA作為模板，將該等單複本之DNA序列擴增。經擴增之DNA可較佳地用於產前檢查或產前診斷所需要之分子生物學資料之取得。
[參考例：拾取法]
專利文獻4揭示了所謂拾取法。拾取法中，於載玻片上觀察經梅-吉染色之細胞，並根據形態單離有核紅血球。該方法中，以單一細胞水準單離有核紅血球。故而可獲得不含白血球之組分。因此，由該組分所得之源自胎兒細胞的染色體DNA係純度極高。此處所提及之純度係著眼於有無混入源自母體的細胞之染色體DNA。
然而，專利文獻4中揭示：藉由形態觀察而被識別為最像有核紅血球之細胞、亦即自第一位開始按序排列之5個細胞均非源自胎兒的有核紅血球(段落0078)。專利文獻4中，不得不對隨後按序排列之5個細胞進行分子生物學分析，自該5個細胞中獲得1個源自胎兒的細胞(段落0079)。
於進行產前診斷之情形時，受檢對象之母體血試樣當然僅能以有限之量採血。另外於產科醫學上已明確，可進行產前診斷之期間僅係依作為受檢對象之各孕婦之有限期間。另一方面，血液中之源自胎兒的有核紅血球之個數極少。因此，期望可在有限期間內檢查試樣總量之方法。換言之，以如下情況為前提之方法並不理想：於判明源自胎兒的細胞之取得失敗後，再次重複步驟。
依存於形態觀察之方法於可確切地採集有核紅血球之方面可靠性高。另一方面，作為可靠性之代價，關於在一定時間內找出源自胎兒的有核紅血球之合理期待受損。
另外，母體血中亦含有源自母體的有核紅血球，故難以藉由形態觀察而揀選源自胎兒的有核紅血球。依存於形態資訊之源自胎兒的有核紅血球候選之揀選必須藉由分子生物學分析來證實。
另外，發明者於本發明之研究過程中發現：於拾取法中，需要操作者十分熟練地將所識別之有核紅血球自標本將細胞移至容器中。另外，另一方面發明者發現：於如上述實施形態及實施例般充分進行了濃縮之狀況下，即便係無差別的單一細胞水準之分子生物學分析，亦可找出來源於源自胎兒的有核紅血球之染色體DNA。
根據以上內容，上述實施形態及實施例中並不優先將有核紅血球單離。取而代之，將最終採集能以單一細胞水準區分之源自胎兒的染色體DNA優先。為了達成該優先目標，得知更有效率的是無差別地藉由極限稀釋法等進行分組之後，無差別地進行分子生物學分析。
於實行無差別之分子生物學分析時，必須準備有核紅血球以較供依存於形態資訊之方法的組分高之水準經濃縮的組分。換言之，必須自組分中充分去除其他血球。這一情況之原因在於：若未自組分中充分去除其他血球，則需進行分子生物學處理之血球數變得龐大，變得不適於單一細胞水準之分子生物學分析。因此，藉由將利用密度或大小之濃縮與利用細胞分選的濃縮組合而實現高水準之有核紅血球之濃縮。
<<第二實施形態>>
以下所示之第二實施形態及其實施例中亦與<<第一實施形態>>同樣地取得染色體DNA，該染色體DNA是來源於以單一細胞水準經單離之源自胎兒的有核紅血球。以下以與<<第一實施形態>>之不同點為中心進行說明。關於以下之記載中省略且第二實施形態所必需之技術設想，如<<第一實施形態>>中所記載。
[採血及有核紅血球]
關於採血之詳情及作為標靶之有核紅血球，如<<第一實施形態>>所記載。
[a.對組分A之標記]
<a-1.利用濃縮的組分A之取得>
利用濃縮的組分A之取得係如<<第一實施形態>>所記載般進行。
<a-2.組分A之標記>
於圖1所示之程序S22中，針對組分A對白血球及細胞核進行特異性標記。標記(label或labeling)可為磁性標記亦可為螢光標記，較佳為螢光標記。標記可為直接標記亦可為間接標記。間接標記可利用標籤與二次抗體，亦可利用生物素-抗生物素蛋白結合。
對白血球之特異性標記亦可為對白血球表面之特異性標記。對白血球之特異性標記亦可為免疫標記。免疫標記亦可為利用抗體之標記。免疫標記之標靶抗原亦可為糖 鏈抗原。標記亦可利用對CD45般之白血球特異性抗原的抗體。
亦可藉由對核酸之特異性標記而將有核紅血球所具有之細胞核進行特異性標記。對核酸之特異性標記亦可為染料標記。所標記的核酸較佳為DNA。染料亦可為螢光染料。核亦可藉由螢光染料進行螢光標記。螢光染料亦可為Hoechst33342。對細胞核之特異性標記亦可為免疫標記。
於圖1所示之程序S22中，對白血球之特異性標記與對細胞核之特異性標記亦可同時進行。另外，亦可先進行任一個標記。另外，亦可先進行任一標記，並亦先進行程序S23中之分取。然後，亦可進行隨後進行之標記及分取。
再者，亦可於進行上述任一標記或所有標記之前，對組分A中之血球進行組織學交聯固定。另外，亦可於該狀態下進行後述利用細胞分選的分組。藉由將血球交聯固定，可防止血球彼此凝聚。因此能以良好之精度進行利用細胞分選的分取。亦可於後述d.中之分子生物學分析之前將提取之DNA脫交聯。
亦可於未對組分A中之血球進行組織學交聯固定之狀態下進行後述般之分組、亦即利用細胞分選的分組。藉 此，可使後述d.中之分子生物學分析中之交聯固定之影響最小化。
例如亦可不進行血球之交聯固定而同時進行對細胞核之特異性標記與白血球特異性免疫標記。亦可進而於進行該等標記之後將血球交聯固定。亦可進而對經交聯固定之血球進行紅血球特異性免疫標記。
[b.利用細胞分選的組分B之取得]
<b-1.成為基礎之細胞分選>
於程序S23中，藉由細胞分選而揀選經標記的組分A中之血球，藉此取得組分B。細胞分選之原理及細胞分選儀之機型如<<第一實施形態>>所記載。
於圖1所示之程序S23中，較佳為以將藉由特異性標記對白血球進行了標記的血球除外之方式揀選血球。由於有核紅血球為紅血球，故而可藉由對白血球之特異性標記將有核紅血球與白血球區分。
於圖1所示之程序S23中，較佳為以取得藉由特異性標記對有核血球進行了標記的血球之方式揀選血球。由於 有核紅血球具有細胞核，故而可藉由對細胞核之特異性標記將有核紅血球與無核紅血球區分。
於圖1所示之程序S23中，藉由將該等標記組合而取得有核紅血球之純度經提高之組分B。所取得之組分B中含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球。利用對白血球之特異性標記的白血球之排除、與利用對細胞核之特異性標記的有核血球之回收亦可同時進行。另外，亦可先進行任一者。例如亦可藉由對白血球之特異性磁性標記進行白血球之排除後，藉由對細胞核之特異性螢光標記進行揀選，藉此取得組分B。
於圖1所示之程序S22中，亦可追加地針對組分A對紅血球進行特異性標記。紅血球特異性標記亦可為免疫標記。該標記亦可為對CD71及CD235a般之紅血球特異性抗原之標記。抗原亦可為糖鏈抗原。於程序S23中，較佳為以將藉由特異性標記對紅血球進行了標記的血球回收之方式揀選血球。
<b-2.追加之細胞分選>
亦可進行追加之細胞分選。該追加之細胞分選之方法亦可依照<<第一實施形態>>之記載。
[c.血球之分離與核酸提取]
於步驟c.中將組分B中之血球以單一細胞水準分別分離。另外，對經分離之血球各自獨立地進行核酸之提取處理。藉此而取得分別含有能以單一細胞水準區分之核酸的組分C。核酸可為DNA，亦可為RNA(Ribonucleic Acid；核糖核酸)。另外，亦可除了取得DNA之組分以外，自取得了DNA之組分的單細胞中進一步提取RNA之組分。DNA亦可為染色體DNA。於本實施形態中，染色體DNA係指基因組DNA。RNA亦可為mRNA，亦可為非編碼RNA。mRNA或非編碼RNA可為全長，亦可為部分序列。
「c-1.單一細胞水準之血球分離」係如<<第一實施形態>>所記載般進行。單一細胞水準之血球分離較佳為使用極限稀釋法。作為極限稀釋之一方式，亦可藉由含有粒狀體之液滴之噴出裝置進行單一細胞水準之血球分離。
作為利用噴出裝置之極限稀釋之一例，有利用專利文獻13所記載之噴出裝置的方法。該噴出裝置中藉由壓電元件般之致動器向成為靶之容器噴出液滴，該液滴具有以含有1個血球之方式設定之體積。此處，自多個容器中依各血球分別選擇1個容器後向各容器噴出液滴，藉此將血球以單一細胞水準分離。
單一細胞水準之血球分離後，取得組分C。於欲自胎兒細胞取得之核酸為染色體DNA之情形時，「c-2.利用DNA提取的組分C之取得」係如<<第一實施形態>>所記載般進行。於欲自胎兒細胞取得之核酸中進而含有RNA之情形時，「c-3.利用RNA提取的組分C之取得」係如以下般進行。如上文所述，亦可對血球同時進行RNA之提取與染色體DNA之提取。
<c-3.利用RNA提取的組分C之取得>
於圖19中示意性地示出單一細胞水準之分離與RNA提取。於進行圖1所示之程序S2後，不實施程序S25，而如圖19所示般提取RNA。於程序S65中，進而對經分離之血球各自獨立地進行RNA之提取處理，藉此取得組分C。藉由經過程序S24及程序S65，組分C變得分別含有能以單一細胞水準區分之RNA。於本實施形態中，於含有能將提取RNA前之血球以單一細胞水準區分的RNA之組分中，包含具有從單一細胞之血球中提取的RNA之組分。
如圖2所示，較佳為對分取至各容器44中之含有血球之組分E1至組分8無差別地進行RNA之提取處理。提取處理係與組分B中之各血球是否具備有核紅血球之 特徵無關而無差別地進行。另外，提取處理係與各組分E中之血球是否具備有核紅血球之特徵無關而無差別地進行。亦即無論各血球是否為有核紅血球均進行提取處理。無差別之術語中不包括將以下情況除外之含意：於直至取得組分B為止之過程中，根據血球之密度及大小以及標記將有核紅血球濃縮。
提取處理之結果為，獲得組分C11、組分C12及組分C14至組分C18作為組分C。亦即，絲毫不排除以下情況：於自有核紅血球41中提取RNA時，自無核紅血球42或白血球43中亦提取RNA。另外，亦可存在組分C13般對不含血球之組分進行RNA提取之化學處理所得的組分。
RNA提取處理係以單一細胞水準分別獨立地進行。因此，例如組分C14或組分C17中含有源自有核紅血球41的RNA。另外，組分C14或組分C17中並未混合有其他細胞之RNA。組分C14或組分C17中，含有與自如上述般預先單離之有核紅血球中獲得的RNA同等純度之RNA。再者，此處所提及之純度係著眼於有無混入源自母體的白血球或紅血球之RNA。
如圖19所示，RNA之提取係對各血球無差別地進行。亦即無論各血球是否為有核紅血球均進行提取處理。因此，源自無核紅血球42的組分C11、組分C15及組分 C18中含有無核紅血球之RNA。源自白血球43的組分C12及組分C16中含有白血球之RNA。組分E3中原本不存在血球，故而組分C13中不含RNA。
本實施形態之方法容許該等般之低效率作業。藉由如此般無差別地進行細胞之分離及RNA提取，即便不依存於伴隨有核紅血球之鑑定的單離操作亦可取得有核紅血球之RNA。因此，作為一系列步驟之整體而實現效率化。
於本實施形態之步驟c.中注意以下三點。作為第一點，容許以下情況：對於本實施形態之方法之實施者而言，於步驟c.中尚不明確圖2所示之8個組分C中於組分C14或組分C17中含有源自有核紅血球的RNA之事實本身。這一情況之原因在於：本實施形態之方法中，無須根據形態資訊單離有核紅血球。進而原因在於：組分C係如上述般無差別地取得。
作為第二點，圖2中所示之哪個組分C中取得了源自有核紅血球的RNA係藉由在後述d.中進行分子生物學分析而事後推定。通常混入母體血中之胎兒細胞為胎兒之有核紅血球，因此藉由判明RNA係源自胎兒而推定上述內容。
作為第三點，容許以下情況：對於本實施形態之方法之實施者而言，於步驟c.中尚不明確圖2所示之組分C14或組分C17所含的RNA係源自母親的有核紅血球，還是源自胎兒的有核紅血球。這一情況之原因在於：於前一步驟中，無須使用區分母親之有核紅血球與胎兒之有核紅血球的手段。RNA係源自胎兒這一情況係藉由在後述d.中進行分子生物學分析而事後判明。
例如亦可使用圖4所示之裝置74代替圖2所示之容器44。裝置74具有流路75、捕捉結構76及反應結構77。沿著流路75而連續地配置有多個捕捉結構76。各捕捉結構76上隨附有反應結構77。
於圖4所示之裝置74中，藉由將細胞78分配至各捕捉結構76中而將細胞78以單一細胞水準相互分離。然而，捕捉結構76中捕捉之包含細胞78之組分並未被分取至特定之容器中。將所有或所需個數之細胞78捕捉至捕捉結構76中後，將所捕捉之細胞78溶解，並推動溶解物流向反應結構77，藉此對細胞進行處理。於反應結構77內，亦可進行RNA之提取及以下將述的cDNA擴增之反應作為細胞之處理。
亦可使用專利文獻9所揭示之微流體設備作為圖4所示之裝置74。另外，亦可使用由Fluidigm公司提供之C1 Single-Cell Auto Prep Array IFC作為微流體設備。
如後述<d-3.關於染色體DNA及RNA之同時提取與分析的補充>所述，亦可於提取RNA之同時進行染色體DNA之提取。
[d.利用對核酸之分析的組分D之挑選]
於自胎兒細胞中取得之核酸為染色體DNA之情形時，「d-1.利用DNA分析的組分D之挑選」係如<<第一實施形態>>所記載般進行。例如亦可如圖5之程序S28所示般對組分C之染色體DNA進行全基因組擴增。亦可進行基因組中之一部分區域之擴增而代替進行全基因組提取。然後如<<第一實施形態>>所記載般，於程序S29中進行分子生物學分析，並且於程序S30中進行組分D之挑選。
於自胎兒細胞中取得之核酸為RNA之情形時，「d-2.利用RNA分析的組分D之挑選」係如以下般進行。
<d-2.利用RNA分析的組分D之挑選>
於圖19所示之程序S66中，對組分C分別進行分子生物學分析。藉此自組分C之群組中揀選組分D，該組分D含有源自胎兒的RNA或來源於源自胎兒的RNA之cDNA。
於圖20中示出圖19所示之程序S66之較佳例。於圖20所示之程序S68中，以組分C之RNA作為模板進行反轉錄。藉由反轉錄而於組分C中充裕地含有具有與RNA互補之序列的cDNA。以下，將反轉錄後變得含有cDNA之組分亦稱為組分C。亦可於反轉錄後將組分C中之RNA分解。
於圖5所示之程序S29中進行分子生物學分析。藉此區分各組分C所含有之RNA係源自母體還是源自胎兒。於該區分時可留意以下方面。
本實施形態中，將源自母體的RNA與從源自母親的基因組轉錄之RNA相區分。源自母體的RNA係淨源自母體的體細胞。
本實施形態中，所謂從源自母親的基因組轉錄之RNA係指源自胎兒從母親繼承之染色體的轉錄產物。只要未特別提及，則從源自母親的基因組轉錄的RNA係指 源自胎兒的RNA。該RNA亦可與源自胎兒從父親繼承之染色體的RNA處於混合狀態。
於母體與母親一致之情形時，從源自母親的基因組轉錄之RNA之序列與源自母體的RNA之序列係共同。再者，即便胎兒並非源自母體之卵子而是源自來源於其他女性的卵子，亦可應用本實施形態之方法。
作為圖20所示之程序S69中之分子生物學分析，較佳為基於與β-球蛋白基因關聯之胚ε-球蛋白基因(非專利文獻2)的方法。胚ε-球蛋白基因係胎兒特異性地表達，故而可根據ε-球蛋白基因之轉錄產物之表達量將胎兒細胞與母體細胞(白血球、其他有核血球)相區分。
於得知胎兒為男性之情形時，亦可進行基於Y染色體特異性序列之分析。源自男性胎兒的RNA具有源自Y染色體的序列作為並非源自母親之基因組的序列。因此，可鑑定RNA係源自胎兒。
於圖20所示之程序S70中，根據上述分子生物學分析結果確認哪個組分C係源自胎兒。藉此可自組分C中挑選組分D。再者，因進行反轉錄而組分C變得含有cDNA。所得之組分D中含有cDNA。
於圖20所示之程序S70中，無須完全確認組分D係源自有核紅血球。於程序S70中已失去血球之形態資訊。由於程序S23中已提高了有核紅血球之純度，故而機率性地推定獲得了源自有核紅血球的組分D。
藉由圖1、圖19及圖20所示之一系列步驟可取得含有cDNA之組分D，上述cDNA係將源自以單一細胞水準經單離之源自胎兒的有核紅血球的RNA作為模板而合成。
於反轉錄時，必須將b.中用於固定的交聯預先解除。亦即，預先將RNA脫交聯。藉此可有效率地推進反轉錄及DNA分析。另外，亦可藉由不進行交聯而防止於脫交聯反應中RNA損傷。
<d-3.關於染色體DNA及RNA之同時提取與分析的補充>
於圖21中示出染色體DNA及RNA之同時提取。較佳為對血球進行程序S65所示之RNA之提取與程序S25所示之染色體DNA之提取，藉此同時取得組分W。於該情形時，進行程序S66所示之利用RNA分析的組分D之挑選代替利用染色體DNA分析的組分D之挑選。藉此， 即便不進行染色體DNA分析亦可取得源自以單一細胞水準經分離之胎兒細胞的染色體DNA。
根據圖21所示之RNA之組分D之挑選結果，如程序S72所示，自相當於組分W之群組的組分W1至組分W8中挑選組分W4作為組分Z。組分W4係與組分C14同樣地源自組分E4。因此根據組分D之挑選結果已判明組分W4係源自胎兒細胞。於實際作業中，各組分W1至W8與各組分C11至C18必須分別預先匹配。匹配較佳為利用識別符相關聯。可藉由RNA分析進行組分D之揀選後，自組分Z中之染色體DNA取得後述供診斷之資料。
與由單細胞所得之染色體DNA之複本數相比，期待RNA之複本數更多。與利用染色體DNA的胎兒細胞之指定相比，利用RNA的胎兒細胞之指定係效率更良好。
作為適於如此般同時提取RNA與DNA並且進行序列分析的方法，可列舉非專利文獻3所記載之G&T-seq(Genome and transcriptome sequencing；基因組與轉錄組測序)法。於G&T-seq法中，自單細胞中提取染色體DNA與全長mRNA。該方法中首先將單離之單細胞溶解。然後對溶解物使用經生物素化之寡聚dT捕捉引子，藉此捕捉RNA。進而使用經抗生蛋白鏈菌素被覆之磁性微球自溶解物中分離DNA。捕捉之RNA係使用 Smart-Seq2法擴增。另一方面，DNA之擴增中使用MDA法。
於包含G&T-seq法並同時取得RNA及染色體DNA之方法中，染色體DNA及RNA係互相收容於不同之容器中。必須於該等容器上預先標注將染色體DNA與RNA相關聯之上述識別符。
另外，藉由按照圖21所示之方法選出多個RNA之組分D，可收集與RNA之組分D相同數量的多個染色體DNA之組分Z。進而將組分Z相互混合。藉此能以整體(bulk)狀態而非單一細胞水準進行染色體DNA之擴增。換言之，可於成為模板之染色體DNA之複本數大於1的狀態下開始DNA擴增。經擴增之染色體DNA可如上述實施形態中所述般進行分析。儘管可如此般整體分析，但源自母體的DNA混入之虞亦極小。這一情況之原因在於：已由單一細胞水準之精度指定組分Z係源自胎兒細胞。未必一定要將多個組分Z相互混合後進行染色體DNA之擴增。亦可由1個組分Z進行染色體DNA之擴增。
[e.供診斷的資料之取得]
於組分D含有染色體DNA之情形時，「e-1.基於染色體DNA之供診斷的資料之取得」係如<<第一實施形態 >>所記載般進行。亦可由含有染色體DNA之組分Z同樣地取得資料。
於組分D含有RNA之情形時，該RNA試樣可用於包括產前遺傳學檢查的對胎兒之診斷方法之研究。
[變形例]
變形例可如<<第一實施形態>>所記載般進行。
[實施例3]
於實施例3中，與上述實施例同樣地取得之核酸係設為染色體DNA。另外，於細胞分選中不進行利用紅血球特異性標記之揀選。於以下之步驟中只要未特別提及，則與實施例2同樣地進行。
利用自妊娠24週之孕婦採集的血液。胎兒性別為男性。與實施例1及實施例2同樣地，實驗操作係由女性實驗者進行。這一情況係為了防止男性實驗者所擁有之SRY基因序列之污染。
<利用血球分離晶片的母體血之濃縮>
於本實施例中使用約8ml母體血。將血液稀釋至5倍。藉由與實施例2中記載之血球分離晶片(微流路結構)具有同等功能的由微流路結構所構成之晶片進行該濃縮步驟。
與實施例2中所用的晶片中之微流路結構不同，實施例3中所用的晶片之微流路結構中僅存在與Fr3(流路徑15μm)、Fr4(流路徑25μm)及Fr5(FT，順流)對應之流路。因此，將包含無核紅血球的相對較小之血球回收至Fr3中。藉由如此般利用Fr3將無核紅血球去除而獲得有核紅血球經濃縮之組分A。
晶片中之微流路結構中處理容量有限度，因此將試樣分割成多份後分別利用各個微流路結構進行處理。針對處理後之試樣中殘留有可認為是由無核紅血球所致的紅色的批次，進而再一次實施利用血球分離晶片之處理。藉由第一次處理而未殘留紅色的批次係總計獲得了6.8×106個血球(本實施例中稱為組分A1)。實施了2次處理的批次係總計獲得了2.74×106個血球(本實施例中稱為組分A2)。使用組分A1之一部分及組分A2全部進行細胞分選。
<利用細胞分選的組分B之分取>
含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球的組分B之分取係如下般進行。以hoechst33342及抗CD45抗體對組分A進行染色。以對hoechst33342呈陽性且對CD45(白血球)呈陰性之方式揀選血球。對組分A1中之血球重複進行細胞分選，藉此進行2次細胞分選。對組分A2中之血球進行1次細胞分選。獲得總計含有300個血球之組分B。
<單一細胞水準之分離與染色體DNA之提取>
如以下般，自組分B獲得16個組分C。首先，基於組分B以期待值0.5個/孔將血球分注至PCR管(孔)內。本實施例中1次分注體積為0.7μm。分注係使用連續自動分注機(Eppendorf公司製造之自動吸管(auto-pipette))進行。對各孔之血球部分進行染色體DNA之提取，藉此獲得組分C。
對組分C中之染色體DNA藉由MALBAC法進行全基因組擴增。將經擴增之染色體DNA作為模板，SRY基因序列特異性地進行PCR擴增。另外，對GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因序列亦特異性地進行PCR擴增。GAPDH基因係存在於常染色體上，故母體細胞之染色體DNA亦成為GAPDH之模板。將PCR產物之電泳像示於圖22中。模板及記號(Marker)如下。
neg：市售之源自女性的人類基因組DNA(陰性對照)。
pos：市售之源自男性的人類基因組DNA(陽性對照)。
Marker：DNA梯狀條帶。
泳道1至泳道16：由MALBAC法所得之擴增產物。
如圖22所示，泳道1至泳道7、泳道10至泳道12、泳道15及泳道16中可見GAPDH之擴增。泳動像顯示於該等組分C中分配有源自有核血球的染色體DNA。以總泳道數16為基準之成功率為75%。泳道9及泳道13中可見遷移率與其他泳道之條帶不同之條帶。可認為該等條帶係源自由MALBAC法所得之擴增產物，但具有何種序列不明。
如圖22所示，泳道3、泳道6、泳道11及泳道16中可見SRY之擴增。這一情況表示於該等組分C中分配有源自胎兒血球的染色體DNA。因此得知可挑選泳道3、泳道6及泳道11所表示之組分C作為組分D。由上述內容表示，藉由本實施例之方法能取得能以單一細胞水準區分且源自胎兒的染色體DNA。
<關於直至取得組分B為止的步驟中之濃縮效率>
對組分B中之血球的單一細胞水準之利用極限稀釋法的分離係與組分B中之各血球是否具備有核紅血球之特徵無關而無差別地進行。亦即，無論各血球是否為有核紅血球均將血球分離。因此可認為上述各泳道所顯示之結果反映組分B中之各血球之構成比例。
自相當於各16泳道的16個組分C中獲得了4個組分D。因此於一個觀點中，推定組分B中相對於總血球數每100而獲得25個胎兒有核紅血球。
自相當於具有GAPDH擴增之各12泳道的11個組分C中獲得了4個組分D。因此於一個觀點中，推定組分B中相對於總血球數每100而獲得33個胎兒有核紅血球。
根據以上內容推定組分B中胎兒有核紅血球相對於總血球之比例係最小25%以上、最大33%之高水準。可認為本實施例中之濃縮效率高於其他方法中之濃縮效率。
另外，於上述實施例所示之直至取得組分B為止的步驟中，進行利用血球分離晶片的無核紅血球之去除與利用細胞分選的白血球之去除。該等步驟中之胎兒細胞之濃縮效率高。本發明之一態樣係源自胎兒的紅血球之濃縮方法，該方法具有使用血球分離晶片之直至取得組分B為止的步驟。該方法係適於有效率地取得組分D的濃縮方 法，上述組分D含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的核酸。
本申請案主張以2016年12月27日提出申請之日本專利申請案特願2016-253589為基礎之優先權，將該申請案揭示之所有內容併入至本文中。

Claims (16)

  1. 一種源自胎兒的核酸的取得方法，係用於取得源自胎兒的核酸；a.針對組分A對白血球及細胞核進行特異性標記，上述組分A係將母體血試樣中之血球利用前述血球之密度及大小之任一者或兩者進行分組而自母體血試樣中取得，且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮；b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球之組分B，此時以將藉由特異性標記對前述白血球進行了標記的血球除外，並且將藉由特異性標記對細胞核進行了標記的血球回收之方式進行揀選；c.針對前述組分B中之各個血球，無論各血球是否為有核紅血球均以單一細胞水準進行分離，並且針對前述以單一細胞水準經分離之各個血球，無論各血球是否為有核紅血球均進行核酸之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之核酸之組分C；d.對前述組分C各自進行分子生物學分析，藉此自前述組分C之群組中揀選含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的核酸之組分D。
  2. 如請求項1所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中由於前述c.中利用無論血球是否係源自有核紅血球的方法取得了前述組分C，故而前述組分D中所含 有之核酸係源自以單一細胞水準經分離之有核紅血球這一情況，係根據在前述d.中鑑定前述核酸係源自胎兒而事後推定。
  3. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中前述母體血試樣為母體血本身、或與母體血相比以總血球數為基準而有核紅血球未經濃縮的未濃縮試樣；前述組分A係藉由將前述母體血試樣中之血球利用前述血球之大小進行分組而自母體血試樣中取得之組分，並且係自母體血試樣中之血球中去掉至少一部分無核紅血球而成。
  4. 如請求項3所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中藉由利用血球分離晶片對前述母體血試樣進行處理而將前述母體血試樣中之血球利用前述血球之大小進行分組；前述血球分離晶片具有微流路結構，前述微流路結構具備主流路、連接於前述主流路之側部的副流路、及於前述副流路之下游連接於前述主流路中之與前述副流路為相反側之側部的去除流路；於前述主流路中流動前述母體血試樣；自副流路中流出之液體將於前述主流路中流動之血球從前述主流路之側部向前述去除流路推入；於前述去除流路中自前述母體血試樣中去除無核紅血球，並且於前述主流路中之前述去除流路之連 接部之下游自前述母體血試樣中回收有核紅血球，藉此取得前述組分A；前述去除流路之內接徑為12μm至19μm。
  5. 如請求項4所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中前述血球分離晶片進而具備回收流路，前述回收流路係於前述去除流路之下游連接於前述主流路中之與前述副流路為相反側之側部；自副流路中流出之液體將於前述主流路中流動之血球從前述主流路之側部進一步向前述回收流路推入；於前述回收流路中自前述母體血試樣中回收有核紅血球，藉此自前述回收流路中取得前述組分A；前述回收流路之內接徑為20μm至30μm。
  6. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中於前述c.中，利用極限稀釋法對前述組分B進行分組，藉此取得分別含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E，並且對前述組分E各自進行前述核酸之提取處理，藉此取得前述組分C。
  7. 如請求項6所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中自前述組分B中無論是否為有核紅血球均分取血球，藉此取得組分F；對前述組分F進行攝影；使用前述組分F之像確認前述組分F中含有以單一細胞水準經分離之血球，藉此判定是否取得了前 述組分F作為前述組分E，此時不根據前述組分F之像判定前述以單一細胞水準經分離之血球是否為有核紅血球。
  8. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中於前述c.中使用流體設備取得前述組分C，上述流體設備具備流路、沿著前述流路連續地配置並且連接於前述流路之多個捕捉結構、及隨附於各前述捕捉結構之反應結構；此時通過前述流路將前述組分B所含之血球分配至各前述捕捉結構中，藉此將血球以單一細胞水準相互分離，並且於捕捉至各前述捕捉結構中後，將捕捉之各細胞溶解並且推動溶解物從前述捕捉結構流向前述反應結構，藉此於前述反應結構內取得前述組分C。
  9. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中於前述a.中至少藉由對核酸之螢光標記進行對細胞核之標記；於前述b.中，至少藉由基於螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對細胞核進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球。
  10. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中於前述c.中，前述組分C所含有之前述核酸為染色體去氧核糖核酸； 為了於前述d.中進行分子生物學分析，對前述染色體去氧核糖核酸進行全基因組或基因組中之一部分區域之擴增；揀選含有為擴增產物之去氧核糖核酸作為前述源自胎兒的核酸之前述組分D。
  11. 如請求項1或2所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中於前述c.中，前述組分C所含有之前述核酸為核糖核酸；前述核糖核酸為信使核糖核酸及非編碼核糖核酸之任一者或兩者；為了於前述d.中進行分子生物學分析，對前述核糖核酸進行反轉錄；揀選含有為反轉錄產物之互補去氧核糖核酸作為前述源自胎兒的核酸之前述組分D。
  12. 如請求項11所記載之源自胎兒的核酸的取得方法，其中進而於前述c.中於前述核糖核酸之提取之同時，對各血球進行染色體去氧核糖核酸之提取，藉此取得與各組分C匹配之組分W；自前述組分W之群組中獲得與前述組分D匹配之組分Z作為含有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的染色體去氧核糖核酸之組分。
  13. 一種供診斷的資料的取得方法，係： 利用微陣列分析或序列測定法對藉由如請求項1至12中任一項所記載之方法獲得的前述組分D中之前述核酸之序列進行分析；根據前述分析之結果取得供非侵入性產前遺傳檢查中之診斷的資料。
  14. 一種源自胎兒細胞的染色體去氧核糖核酸的取得方法，係用於取得源自胎兒細胞的染色體去氧核糖核酸；a.針對自母體血試樣中取得且以總血球為基準而有核紅血球經濃縮之組分A，對紅血球及核酸進行特異性標記，此時至少藉由螢光標記進行對核酸之標記；b.至少藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得有核紅血球之純度經提高之組分B，此時至少藉由基於螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對核酸進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球；c.將前述組分B中之血球以單一細胞水準分別無差別地分離，並且對前述經分離之血球各自無差別且獨立地進行染色體去氧核糖核酸之提取處理，藉此取得分別含有能以單一細胞水準區分之染色體去氧核糖核酸之組分C；d.對前述組分C各自進行分子生物學分析，藉此自前述組分C之群組中揀選組分D，前述組分D含 有能以單一細胞水準區分之源自胎兒的染色體去氧核糖核酸；由於前述組分C係無差別地取得，故而前述組分D中所含有之染色體去氧核糖核酸係源自以單一細胞水準經分離之有核紅血球這一情況，係根據於前述d.中鑑定前述染色體去氧核糖核酸係源自胎兒而事後推定；前述組分A係藉由將母體血試樣中之血球利用前述血球之密度及大小之任一者進行分組而取得；於前述c.中，利用極限稀釋法對前述組分B進行分組，藉此取得分別含有以單一細胞水準經分離之血球之組分E，並且對前述組分E各自進行前述染色體去氧核糖核酸之提取處理，藉此取得前述組分C；前述組分B中含有源自母體及源自胎兒的有核紅血球。
  15. 如請求項14所記載之源自胎兒細胞的染色體去氧核糖核酸的取得方法，其中於前述a.中針對前述組分A追加地對白血球進行特異性標記；於前述b.中藉由細胞分選而揀選經標記的前述組分A中之血球，藉此取得將藉由特異性標記對前述白血球進行了標記的血球除外之前述組分B。
  16. 如請求項14或15所記載之源自胎兒細胞的染色體去氧核糖核酸的取得方法，其中於前述a.中藉由磁性標記進行對紅血球之標記； 於前述b.中，於基於前述螢光標示式細胞分取法的細胞分選之前或之後，藉由基於利用磁性標記之細胞分取法的細胞分選而揀選對紅血球進行了特異性磁性標記的前述組分A中之血球；或者，於前述a.中藉由螢光標記進行對紅血球之標記；於前述b.中，藉由基於前述螢光標示式細胞分取法的細胞分選而揀選對核酸及紅血球進行了特異性螢光標記的前述組分A中之血球。
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