WO2021200749A1 - 細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法 - Google Patents

細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法 Download PDF

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WO2021200749A1
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chromosome
droplets
probes
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洋昭 山中
知大 久保
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株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the number of copies of a chromosome or a portion thereof of a cell, particularly a fetal cell.
  • the present invention particularly relates to humans.
  • Patent Document 1 discloses a method for simultaneously amplifying a plurality of target nucleic acid regions with one reaction volume (paragraph [0003]).
  • Test primers are used to simultaneously amplify at least 1,000 different target loci in a sample containing maternal and fetal DNA from the pregnant mother of the fetal to determine the presence or absence of fetal chromosomal abnormalities.
  • the source of the genetic material used in determining the fetal genetic status may be fetal cells, such as fetal nucleated red blood cells, isolated from maternal blood (paragraph [0350]).
  • Fetal cells flowing in the blood of pregnant women are useful in prenatal diagnosis in the following points. Examination of free fetal DNA fragments present in the blood of pregnant women does not reflect abnormalities in the number and morphology of the fetal chromosomes. Therefore, it is not suitable for detecting these chromosomal abnormalities. In contrast, genomic DNA obtained from fetal cells flowing in the blood of pregnant women accurately reflects these chromosomal abnormalities. Therefore, single-cell analysis of fetal cells contributes to the accurate detection of chromosomal abnormalities.
  • fetal cells are obtained from the amniotic membrane. Testing using fetal cells is suitable for definitive diagnosis. However, invasive tests are not suitable for preliminary tests because they are disadvantageous due to puncture of the uterus and amniotic membrane. On the other hand, tests performed on fetal cells flowing in the blood of pregnant women are non-invasive to the uterus and amniotic membrane, and such disadvantages can be avoided. Therefore, it is also suitable for preliminary inspection.
  • Patent Document 2 discloses a method for obtaining genomic DNA of fetal cells flowing in the blood of a pregnant woman at the single cell level. In this way, when trying to obtain the genomic DNA of a fetal cell at the single cell level, only a very limited number of copies, for example, the genomic DNA of only a few fetal cells can be obtained. This is because the amount of fetal cells contained in the blood of a pregnant woman that can be collected is very small. Chromosomal abnormalities with at least one abnormality in the number of chromosomes and morphology of chromosomes are difficult to detect in such a very limited number of copies of genomic DNA.
  • whole genome amplification is one solution.
  • the amplification factor may differ between the easily amplified part and the hardly amplified part on the chromosome. Or allergic dropouts may occur.
  • the amplification product of such whole genome amplification does not easily reflect the number of copies of each chromosome or part of each chromosome before amplification. Therefore, the data obtained from the amplification products may show false positives or false negatives of chromosomal abnormalities.
  • An object of the present invention is to more accurately detect the aneuploidy of a chromosome or a part thereof from genomic DNA having an extremely limited number of copies of fetal cells and other trace cells obtained at the single cell level. And.
  • Genomic DNA isolated from fetal cells obtained from the blood of a pregnant woman and separated from the pregnant women cells obtained from the blood is subjected to digital PCR without whole-genome amplification.
  • Fragmented genomic DNA is marginally diluted and introduced into each droplet of digital PCR.
  • the droplet is A probe that hybridizes to a chromosome or a part thereof that is a target for detecting a chromosomal abnormality, hereinafter referred to as a target region, and hereinafter referred to as a target probe.
  • the target probe and the reference probe fluoresce in different colors.
  • the target probe is composed of a group of a plurality of types of probes that hybridize with each other at a plurality of locations on the target region and emit fluorescence of the same color to each other.
  • the reference probe is composed of a group of a plurality of types of probes that are hybrid-formed at a plurality of locations on the reference region and emit fluorescence of the same color to each other.
  • the fluorescing droplets of the target probe and the fluorescing droplets of the reference probe are counted, respectively.
  • the target probe fluoresces in a different color for each target region and
  • the group of reference probes is a common reference for each of the groups of target probes.
  • [4] The plurality of types of the target regions are located on a plurality of types of chromosomes selected from chromosomes 13, 18 and 21. The method according to [3].
  • the plurality of probes emitting fluorescence of the same color as each other are distributed on a plurality of types of chromosomes or on one type of chromosome.
  • the number of hybrid forming sites of the target probe is 3 to 30 per the target region.
  • the number of hybrid forming sites of the reference probe is 3 to 30 per the reference region.
  • the droplets are liquids separated from each other by water droplets in oil or microwells.
  • a probe that fluoresces in a color different from that of the target probe and the reference probe is further added to the droplet.
  • the fetal cells used in one run of digital PCR are a plurality of cells obtained from the same pregnant woman.
  • the method according to [2]. [10] By counting the fluorescing droplets of the target probe and the fluorescing droplets of the reference probe by the method described in [2], a set of the number of these droplets or these Generates electronic data containing the ratio of the number of droplets, The electronic data is provided as electronic data for diagnosing a fetal chromosomal abnormality, or a chromosomal abnormality in a fetal cell is detected based on the electronic data. Method.
  • the chromosomal abnormality is any of autosomal trisomy, autosomal partial monosomy, X monosomy and other sex chromosomal abnormalities, chromosomal microdeletion and total chromosomal polyploids.
  • Fragmented genomic DNA was introduced into each droplet of digital PCR by limiting dilution.
  • the droplet contains a chromosome or a portion thereof that is a target for detecting a chromosomal abnormality, a probe that hybridizes with a target region, and a target probe.
  • the target probe is composed of a group of a plurality of types of probes that hybridize with each other at a plurality of locations per the target region of one type and emit fluorescence of the same color to each other.
  • Count the fluorescing droplets of the target probe and Electronic data containing the number of these droplets and further including the number of fetal cells subjected to digital PCR as a reference was generated.
  • the electronic data is provided as electronic data for diagnosing a fetal chromosomal abnormality, or a chromosomal abnormality in a fetal cell is detected based on the electronic data.
  • a step of obtaining the fetal cells from the blood of a pregnant woman and further isolating the genomic DNA from the fetal cells is further provided, and in such steps, The fetal cells concentrated from the blood were obtained in a mixed state with pregnant women's cells. After each cell in the mixed state is made into one cell, genomic DNA and RNA are isolated from these cells at the same time, and the genomic DNA and RNA are linked to each other as information. By molecular biologically analyzing each of the RNAs, the genomic DNA derived from the fetal cell is identified from any of the associated genomic DNAs. The method according to [1]. [14] A method for detecting the number of copies of a cell chromosome or a portion thereof.
  • Genomic DNA isolated from cells is subjected to digital PCR without whole-genome amplification.
  • digital PCR the fragmented genomic DNA is marginally diluted and introduced into each droplet of digital PCR.
  • the droplet contains a chromosome or a portion thereof that is a target for detecting a chromosomal abnormality, a probe that hybridizes with a target region, and a target probe.
  • the target probe is composed of a group of a plurality of types of probes that hybridize with each other at a plurality of locations on the target region and emit fluorescence of the same color to each other. Counting the fluorescing droplets of the target probe, Method.
  • the droplet further contains a portion on the genome that does not overlap with the target region, a probe that hybridizes with the reference region, and a reference probe.
  • the reference probe is composed of a group of a plurality of types of probes that are hybrid-formed at a plurality of locations on the reference region and emit fluorescence of the same color to each other.
  • the target probe and the reference probe fluoresce in different colors.
  • the fluorescing droplets of the reference probe are counted separately from the fluorescing droplets of the target probe.
  • the present invention is useful for more accurately detecting the aneuploidy of the chromosome or part of a cell from a very limited number of copies of genomic DNA of fetal cells and other trace cells obtained at the single cell level. ..
  • Figure 1 shows the flow of digital PCR performed to detect the aneuploidy of the chromosome or part of the fetal cell.
  • the template for digital PCR is genomic DNA obtained from fetal cells Cf flowing in the blood 19 of a pregnant woman.
  • genomic Gf the genomic DNA of Cf of a fetal cell.
  • fetal cells Cf are obtained from the blood 19 of a pregnant woman.
  • the fetal cell Cf is separated from the pregnant woman cell Cm obtained from the blood 19.
  • Fetal cells Cf are obtained at the single cell level.
  • the fetal cell Cf is a fetal nucleated red blood cell (NRBC).
  • the "foetation” is a group of cells in the womb of a human or animal, and may grow into one individual by undergoing a developmental process in the womb as it is.
  • a foetation refers to one after the onset of placental formation.
  • the foetation includes the placenta and other attachments thereof.
  • the "fetal cell” refers to a cell isolated from the fetal, particularly including one that circulates in the blood of a pregnant woman.
  • the genome Gf is isolated from the cell nucleus of the fetal cell Cf.
  • genomic DNAs of two or more fetal cells obtained from the same pregnant woman are mixed and subjected to one run of digital PCR.
  • the digital PCR run is performed by a dedicated digital PCR device.
  • the number of fetal cells subjected to one run of digital PCR is 2-10.
  • the number of fetal cells subjected to one run of digital PCR is any of 3,4,5,6,7,8 and 9.
  • Fetal cells may be divided into two or more groups and each may be run for digital PCR.
  • the genome Gf may be obtained by applying the method shown in Patent Document 2.
  • isolating the genome Gf from the fetal cells Cf pregnant women's cells Cm and fetal cells Cf are obtained from blood 19 in a mixed state.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • single-cell dispenser single-cell dispenser
  • limiting dilution are used to single-cell the mixed cells. Identification of pregnant women's cells Cm and fetal cells Cf is not performed prior to monocellularization.
  • the number of fetal cells is extremely small compared to the number of cells or blood cells in the blood of a pregnant woman. It is preferable to appropriately select various concentration means to sufficiently concentrate the fetal cells before performing single cell formation.
  • concentration means include density gradient centrifugal fractionation, hydraulic classification, selective enrichment by binding of cell surface molecules to carriers and FACS.
  • Hydraulic classification includes classification by Dean style. Selective enrichment by binding of cell surface molecules to carriers includes selective enrichment by antibody-antigen reaction and selective enrichment by binding of lectins to cell surface sugar chains. Selective enrichment by antibody-antigen reaction includes column enrichment, MACS (magnetic activated cell sorting), NanoVelcro Chip TM enrichment and PicoBioChip TM enrichment. FACS (fluorescence-activated cell sorting) includes those that remove leukocytes and anucleated erythrocytes. FACS includes those using a fluorescent intercalator for DNA and those using a fluorescent antibody.
  • the number of cells to be monocellular can be reduced by concentrating fetal cells Cf.
  • concentration of fetal cells Cf and single cell formation of pregnant women's cells Cm and fetal cells Cf are performed at the same time.
  • Genomic DNA is isolated from the single-celled pregnant woman cells Cm and fetal cells Cf in FIG. 1. Further RNA is isolated at the same time. However, RNA is separated from genomic DNA. In one aspect, RNA is at least one of mRNA and non-coding RNA. Each genomic DNA and each RNA are linked to each other as information by reference numbers and the like.
  • RNA of fetal cell Cf is referred to as transcript Tf.
  • transcript Tf the genomic DNA of the pregnant woman cell Cm
  • genomic Gm the genomic Gm.
  • transcript Tm RNA of pregnant woman cell Cm.
  • transcripts Tm and transcripts Tf are analyzed molecularly and biologically, respectively.
  • the transcript that is, RNA
  • the transcript is derived from the fetal cell Cf or the pregnant woman cell Cm.
  • any of these genomic DNAs is the genomic Gf derived from the fetal cell Cf based on the association with RNA.
  • FIG. 1 it is specified based on the data obtained by molecular biological analysis whether it is derived from fetal cell Cf or pregnant woman cell Cm.
  • discrimination is performed based on the presence or absence of a transcript derived from the gene sequence derived from the father. Discrimination is based on transcripts that are high or low expression specific to the foetation in other embodiments.
  • the above method is effective because it is generally difficult to distinguish between fetal cells Cf and pregnant women cells Cm based on their appearance and molecules on their surface. Genome Gm isolated from pregnant women's cells Cm is not used as essential in the following steps.
  • a chromosome or a part thereof that is a target for detecting a chromosomal abnormality may be referred to as a target region.
  • the chromosome may be particularly referred to as a target chromosome.
  • the fragment 22 is then obtained from the genome Gf.
  • fragmentation is performed by restriction enzyme cleavage.
  • Fragment 22 is critically diluted and introduced into each droplet containing droplets 23a-23d.
  • Droplets are tiny reaction systems for performing PCR.
  • the droplets 23a-23d are water droplets in oil.
  • the droplets 23a-23d are liquids separated from each other by microwells.
  • fragment 22 is subjected to digital PCR as a template without amplifying the entire genome.
  • the fragment 22 is used as it is as a template for the droplets 23a to 23d of digital PCR.
  • FIG. 2 shows the principle of increasing droplet fluorescence in digital PCR. Shown in this figure is a probe method, also called the 5'-nuclease method.
  • the probe 25 includes a fluorescent substance 26a on the 5'side, a quencher 26b on the 3'side, and an oligonucleotide 26c complementary to the template DNA.
  • the probe 25 hybridizes to a specific sequence of template DNA.
  • the probe 25 may be a dd-probe. “Dd” stands for Double-Dye Probe.
  • fluorescent substance is FAM, fluorescein amidite.
  • quenchers are ZEN TM and IBFQ, Iowa black fluorescein quencher.
  • An example of another probe is a double quencher probe with any of these quenchers.
  • An example of a double quencher probe is the 5'FAM / ZEN / 3'IBFQ probe.
  • the forward primer 27a binds to the 3'side of the template DNA to which the probe 25 is bound.
  • DNA extends from the forward primer 27a.
  • the 5'-> 3'exonuclease activity of DNA polymerase degrades probes hybridized with the template.
  • the fluorescent substance 26a is released from the probe 25. Therefore, the suppression of the fluorescent substance 26a by the quencher 26b is released.
  • the fluorescent substance 26a fluoresces.
  • the reverse primer 27b binds to the 3'side of the complementary strand. DNA extends from the reverse primer 27b.
  • the fluorescent substance 26a released from the quencher 26b increases. Therefore, the fluorescence of the droplets increases.
  • the aneuploidy of the fetal cell chromosome or part thereof is detected as a chromosomal abnormality.
  • the aneuploidy of a part of the chromosome is an abnormality of the morphology of the chromosome.
  • chromosomal morphological abnormalities are at least one of deletions, inversions, translocations and duplications. Deletions include microdeletion.
  • the chromosomal abnormality is any of autosomal trisomy, autosomal partial monosomy, sex chromosome aberration, and total chromosomal polyploid.
  • the autosomal trisomy is one of trisomy 21 (Down's syndrome), trisomy 18 (Edwards syndrome) and trisomy 13 (Patau syndrome).
  • Symptoms derived from autosomal partial monosomy in one aspect are 5p deletion syndrome, 4p deletion syndrome, 1p36 deletion syndrome, 22q11.2 deletion syndrome, Sotos syndrome and Smith Maginnis syndrome.
  • the symptom resulting from abnormal chromosomal morphology is Emanuel syndrome.
  • the sex chromosome abnormality is either an excess of the X chromosome, an excess of the Y chromosome, or an X chromosome monosomy.
  • the symptom resulting from an abnormality in a sex chromosome is either Klinefelter's syndrome or Turner's syndrome.
  • the whole chromosome polyploid is triploid or tetraploid.
  • FIG. 3 shows an example of placement of a probe on the chromosome for detection of autosomal trisomy on chromosome 21.
  • the probe 29a and the probe 29b are of the same quality as the probe 25 shown in FIG.
  • the probe 29a and probe 29b detect trisomy on chromosome 21 (Chr21).
  • Chromosome 21 (Chr21) is an example of a target region and an example of a target chromosome.
  • the probe 29a which corresponds to the reference probe in FIG. 3, hybridizes specifically with the reference chromosome.
  • the chromosome containing the target region is chromosome 21 (Chr21).
  • the reference chromosome refers to other chromosomes. Including these reference chromosomes or parts thereof, this may be referred to as a reference region.
  • chromosome 1 Chr1
  • a reference chromosome a chromosome that is likely to be lethal before reaching the fetal period when diversification of the chromosome occurs is selected.
  • the reference probe not only serves as a reference for ploidy, but also functions as a so-called internal standard.
  • the signal of the reference probe may be further evaluated when it is not possible to evaluate whether or not the digital PCR reaction was successful based on the signal presented by the target probe alone.
  • the probe 29b which corresponds to the target probe, specifically hybridizes to chromosome 21 (Chr21).
  • chromosome 21 One type of probe specific for one location on each chromosome of chromosome 1 (Chr1) and chromosome 21 (Chr21) is used.
  • probes specific for a plurality of locations on each chromosome may be used.
  • Each probe is combined with a set of primers specific for each location. In the following description, the description that there are also a plurality of primer sets is omitted.
  • FIG. 3 there are a total of two sites to which the probe binds on two chromosomes 1 (Chr1) per cell, that is, per cell nucleus.
  • chromosome 21 (Chr21) disomy there are a total of two sites on which the probes on the two chromosomes 21 (Chr21) bind.
  • trisomy 21 (Chr21) there are a total of 3 sites to which the probe binds on the three chromosomes 21 (Chr21).
  • the droplets 23a, 23c and other droplets are fluorescing.
  • Droplet 23a fluoresces from the reference probe on chromosome 1 (Chr1).
  • Droplet 23c fluoresces from the target probe on chromosome 21 (Chr21).
  • the target probe and the reference probe fluoresce in different colors.
  • the droplets 23b and 23d do not fluoresce from the probe.
  • FIG. 4 which droplet emits fluorescence from which chromosomal site is determined when the genomic DNA fragment is randomly distributed to each droplet.
  • This figure is schematic and does not accurately represent the degree of density of fluorescent droplets.
  • the ratio of the number of droplets that responded to chromosome 1 (Chr1) to the number of droplets that responded to chromosome 21 (Chr21) is 1: 1. Alternatively, it is 2: 2.
  • the ratio of the number of droplets that responded to chromosome 21 (Chr21) to the number of droplets that responded to chromosome 1 (Chr1) is 1: 1.5, or It is 2: 3.
  • chromosomal aneuploidy is reflected in the ratio of the number of fluorescent droplets.
  • FIG. 5 is a graph showing the result of counting the number of fluorescent droplets. However, the numerical values represented by the graph are virtual. The fluorescing droplets of the target probe and the fluorescing droplets of the reference probe are counted respectively. The graph shows the ratio of the number of droplets. The experimenter estimates from the number of fluorescent droplets whether a single cell sample is chromosome 21 (Chr21) disomy or chromosome 21 (Chr21) trisomy.
  • FIG. 6 shows an example of the arrangement of probes on the chromosome. Unlike the example shown in FIG. 3, a plurality of types of probes are used per target chromosome. The trisomy of chromosome 21 (Chr21) is detected in each probe of the probe group 30a and the probe group 30b. These probes are of the same quality as the probe 25 shown in FIG.
  • Each probe of the probe group 30a which corresponds to the reference probe in FIG. 6, is specific to a chromosome other than chromosome 21 (Chr21), that is, a reference chromosome.
  • chromosome 1 Chr1
  • Chr1 chromosome 1
  • Chr1 Multiple probes specific to each of multiple locations on chromosome 1 (Chr1) are used.
  • Each probe in the probe group 30a fluoresces in the same color as each other.
  • Each probe of the probe group 30b which corresponds to the target probe in FIG. 6, is specific to chromosome 21 (Chr21), that is, the target chromosome. Multiple probes specific to each of multiple locations on chromosome 21 (Chr21) are used. Each probe in the probe group 30b fluoresces in the same color as each other.
  • the number of hybrid forming sites of the probe group 30a is 2 or more and less than 1,000 per reference chromosome, here chromosome 1 (Chr1).
  • the hybrid formation sites are 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, per reference region. It is one of 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50 and 100 pieces. In the figure, there are 10 on chromosome 1 (Chr1).
  • the number of hybrid forming sites of the probe group 30b is 2 or more and less than 1,000 per target chromosome, here, chromosome 21 (Chr21).
  • the hybrid formation sites are 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 per target region. It is one of 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50 and 100 pieces. In the figure, there are 10 on chromosome 21 (Chr21).
  • the number of hybrid forming points of the probe group 30a and the number of hybrid forming parts of the probe group 30b are the same. In other embodiments, the number of hybrid forming sites in the probe group 30a is greater or less than the number of hybrid forming sites in the probe group 30b.
  • FIG. 6 there are a total of 20 sites to which probes bind on two chromosomes 1 (Chr1) per cell, that is, per cell nucleus.
  • the chromosome 21 (Chr21) disomy there are a total of 20 sites to which the probes on the two chromosomes 21 (Chr21) bind.
  • trisomy 21 (Chr21) there are a total of 30 sites to which the probes on the three chromosomes 21 (Chr21) bind.
  • a third probe different from the target probe and the reference probe is further added to the droplet.
  • the third probe is also a probe that binds to a chromosome other than the target chromosome and the reference chromosome.
  • the third probe fluoresces in a different color than both the target probe and the reference probe.
  • the third probe binds to the sex chromosome. Such a third probe can be used for gender determination.
  • the droplets 33a, 33c, 33d and other droplets are fluorescing.
  • Droplets 33a and 33d fluoresce from the reference probe on chromosome 1 (Chr1).
  • Droplet 33c fluoresces from the target probe on chromosome 21 (Chr21).
  • the target probe and the reference probe fluoresce in different colors.
  • the droplet 33b does not fluoresce from the probe.
  • FIG. 7 which droplet emits fluorescence derived from which chromosomal site is determined when the genomic DNA fragment is randomly distributed to each droplet, which is the same as the example described above.
  • This figure is schematic and does not accurately represent the degree of density of fluorescent droplets.
  • the ratio of the number of droplets that responded to chromosome 1 (Chr1) to the number of droplets that responded to chromosome 21 (Chr21) was 1: 1 (2 :). 2).
  • the ratio of the number of droplets that responded to chromosome 21 (Chr21) to the number of droplets that responded to chromosome 1 (Chr1) was 1: 1.5 (2: 3). ).
  • the number of reference probe-positive droplets and target probe-positive droplets has increased.
  • the number of locations to which probes are assigned differs depending on the type of chromosome, standardize the number of droplets based on the number of locations to be assigned, and then detect chromosomal aneuploidy. The same is true for other embodiments.
  • FIG. 8 shows a layout of the probe 31c, which is a reference probe of another aspect. Select multiple types of chromosomes as reference regions.
  • reference probes are distributed to each of chromosome 1, chromosome 2, and chromosome 3.
  • the reference region straddles chromosomes 1 to 3.
  • the probe group 30a which is a reference probe
  • the probe group 30b which is a target probe
  • the probe group 30b which is a target probe
  • the probe group 30d which is a reference probe
  • the probe group 30e which is a target probe
  • each of these probe groups consists of four probes.
  • the target probe is specific to the "part on the chromosome” that is the target for detecting chromosomal abnormalities.
  • the probe group 30e is specific to the region where deletion of chromosome 5 is likely to occur. 5p deletion syndrome is known as a symptom of such chromosomal deletion.
  • Such a "chromosomal portion" is an aspect of the target region according to the present embodiment.
  • the reference probe is on the chromosome containing the target region and is specific to the “part other than the target region”.
  • the probe group 30d is specific for a region other than the region on chromosome 5 where deletion of chromosome 5 is likely to occur.
  • Such a "part other than the target region” is one aspect of the reference region according to the present embodiment.
  • the reference region is a portion that does not overlap the target region on the genome.
  • the number of events in digital PCR that is, the number of drops that generate fluorescence, is 2: 1 between the probe group 30d and the probe group 30e.
  • such probe groups 30d and probe groups 30e are used for the detection of other partial monosomy, translocations and microdeletion.
  • FIG. 10 further shows the arrangement of the probe when setting the second and third target regions.
  • all chromosomes 13, 18 and 21 are trisomy. This figure was created only for the purpose of understanding the technical significance, and does not explain whether such chromosomal abnormalities are detected in the medical sense.
  • a plurality of types of target probes are added to each droplet.
  • the probe group 30b, the probe group 30f, and the probe group 30g are used.
  • a probe group 30a is further used as a reference probe (group).
  • the probe group 30f consists of a plurality of types of probes specific to chromosome 13.
  • the probe group 30 g consists of a plurality of types of probes specific to chromosome 18.
  • one reference probe (group) is a common reference for each of the target probes.
  • the probe group 30a serves as a common reference for the probe group 30b, the probe group 30f, and the probe group 30g.
  • the probe group 30b, the probe group 30f and the probe group 30g fluoresce in different colors for each target region, that is, for each target chromosome.
  • the probe group 30a is assigned the first fluorescence
  • the probe group 30e is assigned the second fluorescence
  • the probe group 30b is assigned the third fluorescence
  • the probe group 30g is assigned the fourth fluorescence.
  • the target chromosomes referred to here are chromosomes 13, 18 and 21.
  • the target chromosome shown in FIG. 10 is an example. In other embodiments, any two of chromosomes 13, 18 and 21 may be selected. At this time, any two of the probe group 30b, the probe group 30f, and the probe group 30g are selected and subjected to digital PCR. In another embodiment, other target chromosomes or target regions are added in addition to or in place of the above three target chromosomes.
  • One aspect of this embodiment is a method of providing electronic data including a number for identifying at least one of the number of chromosomes and the morphology of a fetal cell.
  • Genomic DNA is subjected to digital PCR according to the method described above.
  • the digital PCR device counts the fluorescing droplets of the target probe and the fluorescing droplets of the reference probe, respectively.
  • the computer produces electronic data containing the number of each droplet.
  • the number of fluorescing droplets of the reference probe may be replaced by the number of cells subjected to digital PCR.
  • the computer may generate electronic data that includes the number of droplets of the target probe and further includes the number of fetal cells subjected to digital PCR as a reference.
  • the number of cells subjected to digital PCR may be input to the computer by the experimenter.
  • electronic data is provided as electronic data for diagnosing fetal chromosomal abnormalities.
  • Electronic data may be stored by a predetermined server and provided to other terminals via a network.
  • a doctor, other specialist, or a computer detects chromosomal abnormalities in fetal cells based on electronic data.
  • Information on the detected chromosomal abnormality of the fetal cell may be stored by a predetermined server and provided to other terminals via a network.
  • a doctor or other specialist diagnoses the presence or absence of a fetal chromosomal abnormality in the pregnant woman based on the information of the fetal cell chromosomal abnormality.
  • digital PCR is performed by fluorescence by the probe method.
  • Digital PCR may be performed using fluorescence by the intercalator method.
  • a chromosomal abnormality of fetal cells flowing in the blood of a pregnant woman was detected.
  • chromosomal abnormalities of cells isolated from in vitro fertilized embryos may be detected by digital PCR according to the above embodiment in order to obtain data necessary for preimplantation genetic diagnosis.
  • chromosomal abnormalities of fetal cells floating in amniotic fluid may be detected by digital PCR according to the above embodiment.
  • FIG. 11 shows the counting result when digital PCR is performed using a single probe.
  • Each item on the horizontal axis represents the mass of the template genomic DNA. The test was performed three times independently for each template amount.
  • the template is genomic DNA isolated from the human cultured cell K562 cell line, which has been confirmed to have no chromosomal aneuploidy.
  • the vertical axis represents the ratio of the measured value to the predicted value of the number of droplets that emit a positive signal.
  • the predicted value represents the number of droplets converted from the mass of genomic DNA.
  • the predicted value is the number of droplets predicted when the probe is amplified without leaking in all templates and produces droplets that emit a positive signal.
  • the number of copies of the template was calculated from the mass of the genomic DNA, assuming that each cell had 6.7 pg of genomic DNA and 2n of chromosomes. The same applies hereinafter.
  • the probe is manufactured by Integrated DNA Technologies (IDT) and is specific to chromosome 21.
  • the probe quencher is a double quencher consisting of ZEN and IBFQ.
  • the fluorescent dye of the probe is either FAM or HEX for each probe.
  • Digital PCR was performed as follows.
  • a reaction solution is prepared by mixing 2xPCR Supermix, a mixed solution of primers and probes, a DNA sample as a template, and water. Dispense this into all eight sample wells of the DG8 cartridge for droplet formation (Bio-Rad). At the same time, inject Droplet Generator oil into all the oil wells of the DG8 cartridge. Close the cartridge by setting the cartridge in the cartridge holder. After hooking the gasket attached to the cartridge to the cartridge, insert the cartridge into the QX200 (trademark) Droplet Generator (Bio-Rad) to create a droplet. Dispense the created droplet into a 96-Well plate. Place the foil heat seal for ddPCR on the plate.
  • the ratio of the measured value and the predicted value of the number of droplets did not vary greatly.
  • the amount of template DNA was 200 pg or less, the variation in the ratio between the measured value and the predicted value of the number of droplets increased as the amount of template DNA decreased.
  • FIG. 12 shows the counting results when digital PCR was performed using a single probe or three types of probes and a 200 pg template. The test was performed four times independently for each probe type.
  • the template is purified human genomic DNA. Genomic DNA was obtained from the market.
  • the vertical axis represents the ratio of the measured value and the predicted value of the number of droplets as in FIG. By mixing multiple probes into the droplets, the variability in the ratio of the measured and predicted values of the number of droplets was reduced compared to when measured with a single probe.
  • the template amount is 200 pg in FIG. 13 and 150 pg in FIG. It is understood that the genomic DNA 150 pg of cells with diploid autosomal chromosomes contains 44 to 46 genomic copies. The test was performed twice independently for each type of template and probe.
  • the “Disomy” template is purified genomic DNA.
  • the template for "Trisomy” is genomic DNA isolated from cultured human cells Detroit 532. Detroit 532 is a fibroblast derived from Down's syndrome patients.
  • the vertical axis represents the ratio of the measured value and the predicted value of the number of droplets as in FIG.
  • the vertical axis represents the measured value of the number of droplet signals.
  • FIG. 15 shows a modified example of FIG.
  • the probe group 30a which corresponds to the reference probe in the figure, hybridizes specifically with the reference chromosome.
  • the target chromosomes (Target 1 and Target 2) are chromosome 13 (Chr13) and chromosome 18 (Chr18).
  • a reference chromosome a chromosome that may not be lethal before the fetal period is selected if the chromosome is diversified.
  • the reference chromosome is chromosome 21 (Chr21). Chromosome 21 contains the area responsible for Down's syndrome.
  • a probe group 30b is assigned as a reference probe.
  • Chromosome 13 contains the area responsible for Patau's syndrome.
  • Chromosome 18 contains the area responsible for Edwards syndrome.
  • the chromosome selected as the reference chromosome does not have to be selected from among the chromosomes that are likely to have positive ploidy. That is, in one embodiment, the determination is made including the possibility that the reference chromosome also has aneuploidy.
  • FIG. 16 shows a virtual aggregation result.
  • the fluorescent droplets of each probe group shown in FIG. 15 are counted. Convert the number of droplets in each area to the number of copies (%).
  • the number of copies of chromosome 21 (Chr21) is 100%.
  • the position on the vertical axis of the diamond indicates the number of copies.
  • the number of copies of each target chromosome is determined to be less than the number of copies of chromosome 21 (Chr21), which is the reference chromosome. This determination is made by applying the lower limit (Floor) statistically obtained in advance to the number of copies (%).
  • the boxplot shown by the broken line is an example of the statistical results of the case where chromosome 21 is triploid.
  • chromosome 21 When the number of copies of chromosome 21 (Chr21) is 100%, the lower limit (Floor) is located between -33% and -0%. At this time, it is determined that chromosome 13 (Chr13) and chromosome 18 (Chr18) are haploid and chromosome 21 (Chr21) is triploid.
  • FIG. 17 shows a virtual aggregation result different from that of FIG. It is determined that the number of copies of chromosome 18 (Chr18) is larger than the number of copies of chromosome 21 (Chr21), which is the reference chromosome. This determination is made by applying a pre-statistically determined upper limit (Ceiling) to the number of copies (%).
  • the boxplot shown by the broken line is an example of the statistical results of the case where chromosome 18 is triploid.
  • the number of copies of chromosome 13 (Chr18) is determined to be equivalent to the number of copies of chromosome 21 (Chr21), which is the reference chromosome.
  • chromosome 21 When the number of copies of chromosome 21 (Chr21) is 100%, the upper limit (Ceiling) is located between + 0% and + 50%. At this time, it is determined that chromosome 13 (Chr13) and chromosome 21 (Chr21) are haploid and chromosome 18 (Chr18) is triploid.
  • FIG. 18 shows an embodiment in which the number of templates is increased by single-stranded genome fragments.
  • a fragment 22 of the genome is obtained as shown in FIG.
  • double the number of single-stranded fragments 37 is obtained. See Non-Patent Document 1.
  • the modification is carried out by heating.
  • the single-stranded fragment 37 is critically diluted and introduced into each droplet containing droplets 38a-38d.
  • the single-stranded fragment 37 is subjected to digital PCR as a template without amplifying the entire genome. From the above, even when the number of double-stranded genome fragments is small, a large number of droplets to which the probe reacts can be obtained.

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Abstract

細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する。細胞から単離したゲノムDNAを全ゲノム増幅することなくデジタルPCRに供する。デジタルPCRにおいて、断片化したゲノムDNAを限界希釈してデジタルPCRの各ドロップレットに導入する。ドロップレットは、染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ（３０ｂ）、以下標的プローブという、を含有する。標的プローブは、標的領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなる。標的プローブの蛍光を発するドロップレットを計数する。

Description

細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法
　本発明は細胞、特に胎児細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法に関する。本発明は特にヒトに関する。
　特許文献１は複数の目的の核酸領域を１反応体積で同時に増幅する方法を開示している（段落[0003]）。胎児染色体異常の存在の有無を判定するための胎児の妊娠中の母親由来の母系DNAおよび胎児DNAを含む試料中の少なくとも1,000個の異なる標的遺伝子座を同時に増幅するために試験プライマーが使用される（段落[0012]）。胎児の遺伝子の状態を決定することにおいて使用する遺伝物質の供給源は、母系の血液から単離された胎児有核赤血球などの胎児の細胞であってもよい（段落[0350]）。
　妊婦の血液中を流れる胎児細胞は出生前診断において以下の点で有用である。妊婦の血液中に存在する胎児の遊離DNA断片による検査は、胎児の染色体の数及び染色体の形態の異常を反映していない。したがってこれらの染色体異常を発見するのに適していない。これに対して妊婦の血液中を流れる胎児細胞から得たゲノムDNAはこれらの染色体異常を正確に反映している。したがって胎児細胞の一細胞解析は染色体異常を正確に検出するのに資する。
　また羊水検査や絨毛検査といった侵襲的検査では胎児細胞を羊膜内から取得する。胎児細胞を用いた検査は確定診断に向いている。しかしながら侵襲的検査では子宮及び羊膜への穿刺による不利益を伴うため予備的検査には向いていない。これに対して妊婦の血液中を流れる胎児細胞で行う検査は子宮及び羊膜に対して非侵襲的であり、係る不利益を回避できる。このため予備的検査にも向いている。
特表２０１５－５２６０７３号公報 国際公開第２０１８／１２３２２０号
Mariana Fitarelli-Kiehl, Fangyan Yu, Ravina Ashtaputre, Ka Wai Leong, Ioannis Ladas, Julianna Supplee, Cloud Paweletz, Devarati Mitra, Jonathan D Schoenfeld, Sareh Parangi, G Mike Makrigiorgos, "Denaturation-Enhanced Droplet Digital PCR for Liquid Biopsies", Clinical Chemistry, Volume 64, Issue 12, December 2018, Pages 1762-1771, [retrieved on 2021-03-10]. Retrieved from <https://doi.org/10.1373/clinchem.2018.293845>
　特許文献２は妊婦の血液中を流れる胎児細胞のゲノムDNAを一細胞レベルで取得する方法を開示している。このように一細胞レベルで胎児細胞のゲノムDNA取得しようとすると極めて限られたコピー数、例えば、ほんの数個の胎児細胞分のゲノムDNAしか取得できない。これは採血可能な量の妊婦の血液中に含まれる胎児細胞がごく微量だからである。染色体の数及び染色体の形態の少なくともいずれかの異常を伴う染色体異常を、このように極めて限られたコピー数のゲノムDNAから発見するのは難しい。
　ここで全ゲノム増幅は一つの解決策となる。しかしながら、染色体上の増幅しやすい部分としにくい部分との間で増幅率が異なる可能性がある。あるいはアレルドロップアウトの起きる可能性がある。このような全ゲノム増幅の増幅産物は、増幅前の各染色体あるいは各染色体の部分のコピー数を反映しにくい。したがって増幅産物から得たデータは染色体異常の偽陽性や偽陰性を示す可能性がある。
　本発明は、一細胞レベルで取得した胎児細胞及びその他の微量細胞の極めて限られたコピー数のゲノムDNAから、その細胞の染色体又はその部分の異数性を、より正確に検出することを課題とする。
［１］　胎児細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法であって、
　妊婦の血液中から取得された胎児細胞であって、前記血液中から取得される妊婦細胞とは分離されたものから単離したゲノムDNAを全ゲノム増幅することなくデジタルPCRに供する、
　方法。
［２］　断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈することでデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
　前記ドロップレットは、
　染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、と、
　ゲノム上の前記標的領域とは重ならない部分、以下リファレンス領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下リファレンスプローブという、と、
　を含有し、
　前記標的プローブと、前記リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光し、
　前記標的プローブは、前記標的領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
　前記リファレンスプローブは、前記リファレンス領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、前記リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数する、
　［１］に記載の方法。
［３］　複数種類の前記標的領域ごとに、前記標的プローブの群を複数種類、各ドロップレットに添加し、
　前記標的プローブは前記標的領域ごとに異なる色で蛍光し、
　前記リファレンスプローブの群は、前記標的プローブの群のそれぞれにとって共通のリファレンスである、
　［２］に記載の方法。
［４］　前記複数種類の前記標的領域は１３番染色体、１８番染色体及び２１番染色体から選ばれる複数種類の染色体上にある、
　［３］に記載の方法。
［５］　前記複数種類のリファレンスプローブからなる群において、前記互いに同一の色の蛍光を発する複数のプローブは、複数種類の染色体上に分配されている又は一種類の染色体上に分配されている、
　［２］に記載の方法。
［６］　標的プローブのハイブリッド形成個所は前記標的領域あたり３～３０個であり、
　リファレンスプローブのハイブリッド形成個所は前記リファレンス領域あたり３～３０個である、
　［２］に記載の方法。
［７］　前記ドロップレットは油中水滴又はマイクロウェルで互いに分割された液体である、
　［２］に記載の方法。
［８］　前記標的プローブとも、前記リファレンスプローブとも異なる色で蛍光するプローブをさらにドロップレットに添加する、
　［２］に記載の方法。
［９］　デジタルPCRの１ランに供される胎児細胞は同一の妊婦より取得された複数の細胞である、
　［２］に記載の方法。
［１０］　［２］に記載の方法により、標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数することで、これらのドロップレットの数の組、又はこれらのドロップレットの数の比を含んだ電子データを生成し、
　前記電子データを胎児の染色体異常を診断するための電子データとして提供する、又は前記電子データに基づき胎児細胞の染色体異常を検出する、
　方法。
［１１］　前記染色体異常は、常染色体トリソミー、常染色体部分モノソミー、Xモノソミー及びその他の性染色体異常、染色体微小欠失及び全染色体多倍体のいずれかである、
　［１０］に記載の方法。
［１２］　断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈することでデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
　前記ドロップレットは、染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、を含有し、
　前記標的プローブは、一種類の前記標的領域あたり複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
　標的プローブの蛍光を発するドロップレットを計数し、
　これらのドロップレットの数を含み、デジタルPCRに供された胎児細胞の個数をリファレンスとしてさらに含んだ電子データを生成し、
　前記電子データを胎児の染色体異常を診断するための電子データとして提供する、又は前記電子データに基づき胎児細胞の染色体異常を検出する、
　［１］に記載の方法。
［１３］　妊婦の血液中から前記胎児細胞を取得し、さらに前記ゲノムDNAを前記胎児細胞から単離する工程をさらに備え、かかる工程の中で、
　前記血液より濃縮した前記胎児細胞を、妊婦細胞との混合状態で取得し、
　混合状態の細胞をそれぞれ一細胞化した上でこれらの細胞からそれぞれゲノムDNAとRNAとを同時に単離して、ゲノムDNAとRNAとを情報として互いに紐づけし、
　前記RNAをそれぞれ分子生物学的に解析することで、前記紐づけされたゲノムDNAのいずれかより、前記胎児細胞に由来するゲノムDNAを特定する、
　［１］に記載の方法。
［１４］　細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法であって、
　細胞から単離したゲノムDNAを全ゲノム増幅することなくデジタルPCRに供し、
　デジタルPCRにおいて、断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈してデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
　前記ドロップレットは、染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、を含有し、
　前記標的プローブは、前記標的領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットを計数する、
　方法。
［１５］　前記ドロップレットは、ゲノム上の前記標的領域とは重ならない部分、以下リファレンス領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下リファレンスプローブという、をさらに含有し、
　前記リファレンスプローブは、前記リファレンス領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
　前記標的プローブと、前記リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光し、
　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットとは別個に、前記リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットを計数する、
　方法。
［１６］　前記細胞は着床前の体外受精胚の細胞である、
　［１４］に記載の方法。
［１７］　前記細胞は羊水中に浮遊する胎児細胞である、
　［１４］に記載の方法。
　本発明は、一細胞レベルで取得した胎児細胞及びその他の微量細胞の極めて限られたコピー数のゲノムDNAから、その細胞の染色体又はその部分の異数性を、より正確に検出するのに役立つ。
デジタルPCRの流れ図。 ドロップレットの蛍光の原理図。 染色体上のプローブの配置図。 ドロップレットの蛍光の模式図。 蛍光ドロップレットの計数結果のグラフ。 染色体上のプローブの配置図。 ドロップレットの蛍光の模式図。 染色体上のプローブの配置図。 染色体上のプローブの配置図。 染色体上のプローブの配置図。 蛍光ドロップレットの計数結果のグラフ。 蛍光ドロップレットの計数結果のグラフ。 蛍光ドロップレットの計数結果のグラフ。 蛍光ドロップレットの計数結果のグラフ。 染色体上のプローブの配置図。 蛍光ドロップレット数の集計結果のグラフ。 蛍光ドロップレット数の集計結果のグラフ。 ドロップレットへのゲノム断片の分配の流れ図。
＜胎児細胞のゲノムDNAの取得＞
　図１は胎児細胞の染色体又はその部分の異数性を検出するために行うデジタルPCRの流れである。デジタルPCRのテンプレートは妊婦の血液１９中を流れる胎児細胞Ｃｆから取得したゲノムDNAである。以下、胎児細胞のＣｆのゲノムDNAをゲノムＧｆという。まず妊婦の血液１９から胎児細胞Ｃｆを取得する。胎児細胞Ｃｆは血液１９中から取得された妊婦細胞Ｃｍとは分離されたものである。胎児細胞Ｃｆは一細胞レベルで取得したものである。一態様において胎児細胞Ｃｆは胎児の有核赤血球（NRBC）である。なお一態様において「胎児」は、人又は動物の胎内にある細胞群であって、そのまま胎内において発生の過程を経ることにより一の個体に成長する可能性のあるものである。一態様において胎児は胎盤の形成の開始以後のものをいう。一態様において胎児は、胎盤その他のその附属物を含む。一態様において「胎児細胞」は胎児から分離した細胞をいい、特に妊婦血中を循環するものを含む。
　図１において胎児細胞Ｃｆの細胞核よりゲノムＧｆを単離する。一態様において同一の妊婦より取得された２個以上の胎児細胞のゲノムDNAを混合してデジタルPCRの１ランに供する。一態様においてデジタルPCRのランは専用のデジタルPCR装置が実行する。一態様においてデジタルPCRの１ランに供される胎児細胞の数は２～１０個である。一態様においてデジタルPCRの１ランに供される胎児細胞の数は３，４，５，６，７，８及び９個のいずれかである。胎児細胞を２つ以上の群に分けて、それぞれでデジタルPCRのランを行ってもよい。
　図１に示す一態様において特許文献２に示す方法を応用してゲノムＧｆを取得してもよい。ゲノムＧｆを胎児細胞Ｃｆから単離するにあたり、血液１９より妊婦細胞Ｃｍと胎児細胞Ｃｆとを混合状態で取得する。例えばFACS（fluorescence-activated cell sorting）のシングルセルソーティング、シングルセルディスペンサー及び限界希釈といった手段を用いて、混合状態の細胞を一細胞化する。妊婦細胞Ｃｍと胎児細胞Ｃｆの同定は一細胞化の前に行わない。
　一般に妊婦の血液中の細胞の数又は血球の数に比べて胎児細胞の数は極めて小さい。一細胞化を行う前に各種の濃縮手段を適切に選択して胎児細胞を十分に濃縮しておくことが好ましい。一態様においてこのような濃縮手段は密度勾配遠心分画、水力学的分級、細胞表面分子と担体との結合による選択的濃縮及びFACSを含む。
　水力学的分級はDean流による分級を含む。細胞表面分子と担体との結合による選択的濃縮は、抗体抗原反応による選択的濃縮、及びレクチンと細胞表面の糖鎖との結合による選択的濃縮を含む。抗体抗原反応による選択的濃縮はカラム濃縮、MACS（magnetic activated cell sorting）、NanoVelcro Chip（商標）による濃縮及びPicoBioChip（商標）による濃縮を含む。FACS（fluorescence-activated cell sorting）は白血球や無核赤血球を除去するものを含む。FACSはDNAに対する蛍光インターカレーターを用いるもの及び蛍光抗体を用いるものを含む。
　図１において胎児細胞Ｃｆの濃縮により一細胞化すべき細胞の数を減らすことができる。一態様においてシングルセルソーティングでは胎児細胞Ｃｆの濃縮と、妊婦細胞Ｃｍ及び胎児細胞Ｃｆの一細胞化とを同時に行う。
　図１において一細胞化された妊婦細胞Ｃｍと胎児細胞ＣｆとからゲノムDNAを単離する。さらにRNAを同時に単離する。ただしRNAはゲノムDNAからは分離する。一態様においてRNAはmRNA及びノンコーディングRNAの少なくともいずれかである。各ゲノムDNAと各RNAとは参照番号などにより、情報として互いに紐づけされている。以下、胎児細胞ＣｆのRNAを転写産物Ｔｆという。以下、妊婦細胞ＣｍのゲノムDNAをゲノムＧｍという。以下、妊婦細胞ＣｍのRNAを転写産物Ｔｍという。
　図１において、これらの転写産物Ｔｍや転写産物Ｔｆをそれぞれ分子生物学的に解析する。解析の結果として当該転写産物すなわちRNAが、胎児細胞Ｃｆと妊婦細胞Ｃｍとのいずれに由来するのかが事後的に判明する。そして、これらのゲノムDNAのいずれかが胎児細胞Ｃｆに由来するゲノムＧｆであることを、RNAとの紐づけに基づき事後的に特定する。
　図１において、胎児細胞Ｃｆと妊婦細胞Ｃｍとのいずれに由来するのかを分子生物学的に解析して得られたデータに基づき特定する。一態様において父由来の遺伝子配列に由来する転写産物の有無に基づいて判別する。他の態様において胎児特有に高発現する又は低発現となる転写産物に基づいて判別する。胎児細胞Ｃｆと妊婦細胞Ｃｍとをそれらの外観や、それらの表面の分子に基づき区別することは一般に難しいので上記方法は有効である。妊婦細胞Ｃｍから単離したゲノムＧｍは以下の工程では必須のものとして用いない。
＜デジタルPCR＞
　上記の工程によって得られる胎児細胞のゲノムDNAのコピー数は極めて限られている。したがってデジタルPCRによるコピー数の定量によって胎児細胞の染色体又はその部分の異数性を検出することが好ましい。染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分を標的領域という場合がある。また標的領域が染色体全体にわたっている場合、当該染色体のことを特に標的染色体という場合がある。
　図１において次にゲノムＧｆよりその断片２２を得る。一態様において断片化は制限酵素切断によって行う。断片２２を限界希釈してドロップレット２３ａ～２３ｄを含む各ドロップレットに導入する。ドロップレットはPCRを行うための微小な反応系である。一態様においてドロップレット２３ａ～２３ｄは油中水滴である。他の一態様においてドロップレット２３ａ～２３ｄはマイクロウェルで互いに分割された液体である。
　図１において断片２２を全ゲノム増幅することなく鋳型としてデジタルPCRに供する。一態様において断片２２をそのままデジタルPCRのドロップレット２３ａ～２３ｄの鋳型として供する。
　図２はデジタルPCRにおけるドロップレットの蛍光増大の原理を示す。本図に示すのは5’-ヌクレアーゼ法とも呼ばれるプローブ法である。プローブ２５は5‘側の蛍光物質２６ａ、3’側のクエンチャー２６ｂ及び鋳型DNAに対して相補的なオリゴヌクレオチド２６ｃを備える。プローブ２５は鋳型DNAの特定配列に対してハイブリッド形成する。プローブ２５はdd-プローブでもよい。“dd”とはDouble-Dye Probe(ダブルダイプローブ)を表す。
　蛍光物質の一例はFAM，fluorescein amiditeである。クエンチャーの例はZEN（商標）及びIBFQ，Iowa black fluorescein quencherである。他のプローブの例はこれらのクエンチャーをいずれも有するダブルクエンチャープローブである。ダブルクエンチャープローブの一例は5'FAM/ZEN/3'IBFQプローブである。
　図２においてフォワードプライマー２７ａが、プローブ２５の結合した鋳型DNAの3’側に結合する。フォワードプライマー２７ａからDNAが伸長する。DNAポリメラーゼの有する5’-> 3′エキソヌクレアーゼ活性が、鋳型とハイブリッド形成したプローブを分解する。蛍光物質２６ａがプローブ２５から遊離する。このためクエンチャー２６ｂによる蛍光物質２６ａの抑制が解除される。蛍光物質２６ａは蛍光を発する。
　図２においてリバースプライマー２７ｂが相補鎖の3’側に結合する。リバースプライマー２７ｂからDNAが伸長する。PCRによってDNAが増幅するとクエンチャー２６ｂから解放された蛍光物質２６ａが増大する。したがってドロップレットの蛍光は増大する。
＜染色体異常＞
　一態様において、胎児細胞の染色体又はその部分の異数性は染色体異常として検出されるものである。一態様において染色体の部分の異数性は染色体の形態の異常である。一態様において染色体の形態の異常は欠失、逆位、転座及び重複の少なくともいずれかである。欠失は微小欠失を含む。一態様において染色体異常は常染色体トリソミー、常染色体部分モノソミー、性染色体異常、全染色体多倍体のいずれかである。
　一態様において常染色体トリソミーは21トリソミー（ダウン症候群）、18トリソミー（エドワーズ症候群）及び13トリソミー(パトー症候群)のいずれかである。一態様において常染色体部分モノソミーに由来する症候は、5p欠失症候群、4p欠失症候群、1p36欠失症候群、22q11.2欠失症候群、ソトス症候群及びスミス・マギニス症候群である。
　一態様において染色体の形態の異常に由来する症候はエマヌエル症候群である。
　一態様において性染色体異常はＸ染色体の過剰、Ｙ染色体の過剰、及びＸ染色体モノソミーのいずれかである。一態様において性染色体異常の異常に由来する症候はクラインフェルター症候群及びターナー症候群のいずれかである。
　一態様において全染色体多倍体は3倍体又は4倍体である。
＜プローブの配置＞
　図３は２１番染色体の常染色体トリソミーの検出のための、染色体上のプローブの配置例を示す。プローブ２９ａ及びプローブ２９ｂは図２に示したプローブ２５と同質のものである。プローブ２９ａ及びプローブ２９ｂで２１番染色体（Chr21）のトリソミーを検出する。２１番染色体（Chr21）は標的領域の一例であり、また標的染色体の一例である。
　図３においてリファレンスプローブにあたるプローブ２９ａはリファレンス染色体に特異的にハイブリッド形成する。図において標的領域を含む染色体は２１番染色体（Chr21）である。リファレンス染色体はそれ以外の染色体を指す。これらリファレンス染色体又はその部分を含めて、これをリファレンス領域という場合がある。本図ではリファレンス染色体として１番染色体（Chr1）を選択している。一態様においてリファレンス染色体として、当該染色体の異数化が起きると胎児期に至る前に致死となる可能性が高い染色体を選択する。リファレンスプローブは倍数性の基準になるだけでなく、いわゆる内部標準として機能する。標的プローブの呈するシグナルだけでは、デジタルPCR反応が正常に行われたかどうか評価できない場合にリファレンスプローブのシグナルをさらに評価してもよい。
　図３では、標的プローブにあたるプローブ２９ｂは２１番染色体（Chr21）に特異的にハイブリッド形成する。１番染色体（Chr1）と２１番染色体（Chr21）の各染色体上の１か所に対して特異的なプローブを１種類用いる。後に述べる通り、各染色体上の複数の個所に対して特異的なプローブをそれぞれ用いてもよい。各プローブにはそれぞれの個所に特異的なプライマーの組が組み合わされる。以下の説明では、プライマーの組もまた複数あることについての記述は省略する。
　図３において一細胞当たり、すなわち細胞核一つあたり２本の１番染色体（Chr1）上のプローブの結合する部位は合計で２個ある。また２１番染色体（Chr21）ダイソミーの場合、２本の２１番染色体（Chr21）上のプローブの結合する部位は合計で２個ある。また２１番染色体（Chr21）トリソミーの場合、３本の２１番染色体（Chr21）上のプローブの結合する部位は合計で３個ある。
　図４ではドロップレット２３ａ、２３ｃ及びその他のドロップレットが蛍光を発している。ドロップレット２３ａは１番染色体（Chr1）のリファレンスプローブに由来する蛍光を発している。ドロップレット２３ｃは２１番染色体（Chr21）の標的プローブに由来する蛍光を発している。標的プローブと、リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光する。ドロップレット２３ｂ及び２３ｄはプローブに由来する蛍光を発していない。
　図４において、どのドロップレットが、どの染色体部位に由来する蛍光を発するかはゲノムDNA断片が各ドロップレットにランダムに分配された時に決定される。本図は模式的なものであり、蛍光を発するドロップレットの密集の程度を正確に表しているわけではない。
　図４の上段の２１番染色体（Chr21）ダイソミーでは、１番染色体（Chr1）に反応したドロップレットとの２１番染色体（Chr21）に反応したドロップレットの数との比が１：１である、あるいは２：２である。下段の２１番染色体（Chr21）トリソミーでは、２１番染色体（Chr21）に反応したドロップレットの数と１番染色体（Chr1）に反応したドロップレットの数の比が１：１．５である、あるいは２：３である。このようにデジタルPCRでは染色体異数性が蛍光を発するドロップレットの個数の比に反映される。
　図５は蛍光を発するドロップレットの個数を計数した結果を表すグラフである。ただしグラフの表す数値は仮想的なものである。標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数する。グラフはドロップレットの数の比を表している。実験者は一細胞のサンプルが２１番染色体（Chr21）ダイソミーであるか、２１番染色体（Chr21）トリソミーであるかを、蛍光するドロップレットの数から推定する。
＜各領域中のハイブリッド形成個所の複数化＞
　図６は染色体上のプローブの配置例を示す。図３に示す例とは異なり標的となる染色体あたり複数種類のプローブを用いる。プローブ群３０ａ及びプローブ群３０ｂの各プローブで２１番染色体（Chr21）のトリソミーを検出する。これらのプローブは図２に示したプローブ２５と同質のものである。
　図６においてリファレンスプローブにあたるプローブ群３０ａの各プローブは、２１番染色体（Chr21）以外の染色体すなわちリファレンス染色体に特異的である。本図ではリファレンス染色体として１番染色体（Chr1）を選ぶ。１番染色体（Chr1）の複数個所に対してそれぞれ特異的なプローブを複数用いる。プローブ群３０ａの各プローブは互いに同一の色の蛍光を発する。
　図６において標的プローブにあたるプローブ群３０ｂの各プローブは２１番染色体（Chr21）、すなわち標的染色体に特異的である。２１番染色体（Chr21）の複数個所に対してそれぞれ特異的なプローブを複数用いる。プローブ群３０ｂの各プローブは互いに同一の色の蛍光を発する。
　図６に示す一態様においてプローブ群３０ａのハイブリッド形成個所はリファレンス染色体、ここでは１番染色体（Chr1）あたり２個以上１，０００個未満である。一態様においてハイブリッド形成個所はリファレンス領域あたり３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，５０及び１００個のいずれかである。図中では１番染色体（Chr1）に１０個存在する。
　図６に示す一態様においてプローブ群３０ｂのハイブリッド形成個所は標的染色体、ここでは２１番染色体（Chr21）あたり２個以上１，０００個未満である。一態様においてハイブリッド形成個所は標的領域あたり３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，５０及び１００個のいずれかである。図中では２１番染色体（Chr21）に１０個存在する。
　図６に示す一態様においてプローブ群３０ａのハイブリッド形成個所とプローブ群３０ｂのハイブリッド形成個所とは互いに同数である。他の態様においてプローブ群３０ａのハイブリッド形成個所はプローブ群３０ｂのハイブリッド形成個所よりも多い又は少ない。
　図６において一細胞当たり、すなわち細胞核一つあたり２本の１番染色体（Chr1）上のプローブの結合する部位は合計で２０個ある。また２１番染色体（Chr21）ダイソミーの場合、２本の２１番染色体（Chr21）上のプローブの結合する部位は合計で２０個ある。また２１番染色体（Chr21）トリソミーの場合、３本の２１番染色体（Chr21）上のプローブの結合する部位は合計で３０個ある。
　図６に示す一態様において標的プローブとも、リファレンスプローブとも異なる第三のプローブをさらにドロップレットに添加する。一態様において第三のプローブは標的染色体とリファレンス染色体以外の他の染色体に結合するプローブでもある。第三のプローブは標的プローブとも、リファレンスプローブとも異なる色で蛍光する。一態様において第三のプローブは性染色体に結合する。係る第三のプローブは性別判定に用いることができる。
　図７ではドロップレット３３ａ、３３ｃ、３３ｄ及びその他のドロップレットが蛍光を発している。ドロップレット３３ａ及び３３ｄは１番染色体（Chr1）のリファレンスプローブに由来する蛍光を発している。ドロップレット３３ｃは２１番染色体（Chr21）の標的プローブに由来する蛍光を発している。標的プローブと、リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光する。ドロップレット３３ｂはプローブに由来する蛍光を発していない。
　図７において、どのドロップレットが、どの染色体部位に由来する蛍光を発するかはゲノムDNA断片が各ドロップレットにランダムに分配された時に決定される点は先に説明した例と変わらない。本図は模式的なものであり、蛍光を発するドロップレットの密集の程度を正確に表しているわけではない。
　図７の上段の２１番染色体（Chr21）ダイソミーでは、１番染色体（Chr1）に反応したドロップレットとの２１番染色体（Chr21）に反応したドロップレットの数との比が１：１（２：２）である。下段の２１番染色体（Chr21）トリソミーでは、２１番染色体（Chr21）に反応したドロップレットの数と１番染色体（Chr1）に反応したドロップレットの数の比が１：１．５（２：３）である。図４と比較してリファレンスプローブ陽性のドロップレットも標的プローブ陽性のドロップレットもその数が増えている。
　このように染色体異数性が蛍光を発するドロップレットの個数の比に反映される点は先に説明した例と変わらない。ただしドロップレットの個数が増えた分、偽陽性や偽陰性のドロップレットによってその比に誤差を生じる可能性は低減される。染色体当たりのプローブの種類、すなわちプローブの結合箇所を増やすことは染色体異数性をより正確に検出するのに適する。
　染色体の種類ごとにプローブを割り当てる個所の数が異なる場合は、割り当てる個所の個数でドロップレットの個数を標準化してから、染色体異数性を検出する。他の実施形態において同様である。
＜染色体をまたいだリファレンス領域＞
　上記実施形態ではリファレンス領域にリファレンスプローブを複数用いる場合、リファレンス領域を標的染色体以外のいずれかの一種類の染色体とした。図８は他の態様のリファレンスプローブであるプローブ３１ｃの配置図を表す。リファレンス領域として複数種類の染色体を選ぶ。図中では１番染色体、２番染色体及び３番染色体のそれぞれにリファレンスプローブを分配している。リファレンス領域は１番から３番の染色体をまたいでいる。
＜同一染色体の中での標的領域とリファレンス領域の共存＞
　図６においては、リファレンスプローブであるプローブ群３０ａと標的プローブであるプローブ群３０ｂとを相異なる染色体に特異的なものとした。図９に示す他の態様においてリファレンスプローブであるプローブ群３０ｄと標的プローブであるプローブ群３０ｅとは同一の染色体に対して特異的であり、同一の５番染色体（Chr5）中に共存する。図中でこれらのプローブ群はそれぞれ４個のプローブからなる。
　図９に示す態様において標的プローブは染色体異常の検出の標的となる「染色体上の部分」に特異的である。図中においてプローブ群３０ｅは５番染色体の欠失の起こりやすい領域に特異的である。このような染色体の欠失の症候として5p欠失症候群が知られる。このような「染色体上の部分」は本実施形態に係る標的領域の一態様である。
　図９において、リファレンスプローブは標的領域を含む染色体上であって「標的領域以外の部分」に特異的である。図中においてプローブ群３０ｄは５番染色体上の５番染色体の欠失の起こりやすい領域以外の領域に対して特異的である。このような「標的領域以外の部分」は本実施形態に係るリファレンス領域の一態様である。一態様においてリファレンス領域は、ゲノム上の標的領域とは重ならない部分である。
　図９に示す染色体異常において、デジタルPCRにおけるイベント数、いわゆる蛍光を生じるドロップ数はプローブ群３０ｄとプローブ群３０ｅとの間で２：１になる。他の態様において、このようなプローブ群３０ｄとプローブ群３０ｅとをその他の部分モノソミーや転座や微小欠失の検出に対して用いる。
＜複数の標的領域に対して共通して用いるリファレンス領域＞
　図１０はさらに第２，第３の標的領域を設定する場合のプローブの配置を示す。本図では例示として１３番、１８番及び２１番染色体の全てがトリソミーである。本図はあくまで技術的意義を理解するために作成されたものであり、このような染色体異常が医学的な意味で発見されるかどうかを説明するものではない。標的領域の種類は複数でもよく、これらの標的領域同士をプローブの蛍光で区別してもよい。
　図１０に示す態様では、標的プローブ（群）を複数種類、各ドロップレットに添加する。本図ではプローブ群３０ｂ、プローブ群３０ｆ及びプローブ群３０ｇを用いる。リファレンスプローブ（群）としてさらにプローブ群３０ａを用いる。プローブ群３０ｆは１３番染色体に特異的な複数種類のプローブからなる。プローブ群３０ｇは１８番染色体に特異的な複数種類プローブからなる。
　図１０に示す態様では、一つのリファレンスプローブ（群）が、標的プローブのそれぞれにとって共通のリファレンスである。本図ではプローブ群３０ａがプローブ群３０ｂ、プローブ群３０ｆ及びプローブ群３０ｇにとって共通のリファレンスとなる。プローブ群３０ｂ、プローブ群３０ｆ及びプローブ群３０ｇは標的領域ごとに、すなわち標的染色体ごとに異なる色で蛍光する。例えばプローブ群３０ａに第１の蛍光を割り当て、プローブ群３０ｅに第２の蛍光を割り当て、プローブ群３０ｂに第３の蛍光を割り当て、プローブ群３０ｇに第４の蛍光を割り当てる。なお、ここでいう標的染色体は１３番、１８番及び２１番染色体である。染色体ごとに異なる蛍光を呈する標的プローブ（群）を用いることで、複数の染色体における染色体異常を一回の検査で同時に検出する。
　図１０に示す標的染色体は例示である。他の態様において１３番、１８番及び２１番染色体のいずれか２つを選んでもよい。この時、プローブ群３０ｂ、プローブ群３０ｆ及びプローブ群３０ｇのいずれか２つを選んでデジタルPCRに供する。他の態様において、上記３つの標的染色体に加えて、又は上記３つの標的染色体に代えて、他の標的染色体や標的領域を追加する。
＜電子データの生成と提供＞
　本実施形態の一態様は、胎児細胞の染色体の数及び染色体の形態の少なくともいずれかを特定するための数を含む電子データを提供する方法である。上述の方法にしたがいゲノムDNAをデジタルPCRに供する。デジタルPCR装置は標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数する。コンピューターはそれぞれのドロップレットの数を含んだ電子データを生成する。
　他の態様においてリファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットの数はデジタルPCRに供した細胞の数に置き換えてもよい。コンピューターは標的プローブのドロップレットの数を含み、デジタルPCRに供された胎児細胞の個数をリファレンスとしてさらに含んだ電子データを生成してもよい。デジタルPCRに供した細胞の数は実験者がコンピューターに入力してもよい。
　一態様において電子データを胎児の染色体異常を診断するための電子データとして提供する。電子データは所定のサーバが記憶しネットワークを通じて他の端末に提供してもよい。一態様において医師や、その他の専門家や、コンピューターが、電子データに基づき胎児細胞の染色体異常を検出する。検出した胎児細胞の染色体異常の情報を所定のサーバが記憶しネットワークを通じて他の端末に提供してもよい。一態様において医師やその他の専門家は、胎児細胞の染色体異常の情報をもとに、当該妊婦に係る胎児の染色体の異常の有無を診断する。
＜実施形態の変形例＞
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば、上記実施形態ではデジタルPCRをプローブ法による蛍光で実施する。デジタルPCRをインターカレーター法による蛍光を用いて実施してもよい。
　上記実施形態では、妊婦の血液中を流れる胎児細胞の染色体異常を検出した。他の態様において、着床前診断に必要なデータの取得のために、体外受精胚から単離した細胞の染色体異常を上記実施形態に係るデジタルPCRで検出してもよい。また羊水検査による診断に必要なデータの取得のために、羊水中に浮遊する胎児細胞の染色体異常を上記実施形態に係るデジタルPCRで検出してもよい。
　図１１は単一のプローブを用いてデジタルPCRを行った時の計数結果を表す。横軸の各項目はそれぞれテンプレートのゲノムDNAの質量を表す。試験はテンプレート量ごとに独立して３回行った。テンプレートは染色体異数性の無いことが確認されている、ヒト培養細胞K562細胞株から単離したゲノムDNAである。縦軸はポジティブなシグナルを発するドロップレットの数の実測値と予測値の比を表す。予測値はゲノムDNAの質量から換算したドロップレットの数を表す。
　図１１において予測値は、プローブがすべてのテンプレートにて漏らさず増幅しポジティブなシグナルを発するドロップレットを生じた場合に予測されるドロップレット数である。テンプレートのコピー数は細胞１個あたり６．７ｐｇのゲノムDNAと２ｎの染色体とを有しているものとして、ゲノムDNAの質量より換算した。以下同様である。
　プローブは、Integrated DNA Technologies （IDT）社製で、21番染色体に特異的である。プローブのクエンチャーは、ZEN及びIBFQからなるダブルクエンチャーである。プローブの蛍光色素は、プローブごとにFAM及びHEXのいずれかである。
　デジタルPCRは以下の通り行った。2xPCR Supermixと、プライマー及びプローブの混合液と、テンプレートとなるDNA試料と、水とを混合して反応液を調製する。これをドロップレット形成用のDG8カートリッジ（Bio-Rad社）の8つのサンプルウェルすべてに分注する。同時にDG8カートリッジのオイルウェルのすべてにDroplet Generator オイルを注入する。カートリッジをカートリッジホルダーにセットすることでカートリッジを閉じる。カートリッジに付属のガスケットをカートリッジに引っ掛けた上で、カートリッジをQX200（商標） Droplet Generator（Bio-Rad社）の中に入れて、ドロップレットを作成する。作成したドロップレットは96Wellプレートに分注する。プレート上にddPCR用ホイルヒートシールを乗せる。PX1 PCR Plate Sealer（Bio-Rad社）でプレートとシールとを圧着することでプレートに封をする。増幅はサーマルサイクラーC1000Touch（Bio-Rad社）を用いて行う。PCRサイクル条件は2xPCR Supermix添付の標準プロトコルに従う。液滴の蛍光はQX200 Droplet Readerで読み取る。読み取ったシグナルを元にQuantaSoft（商標）のソフトウェアで一次データを得る。一次データをMicrosoft社のエクセルで分析する。
　テンプレートDNA量が５００ｐｇ以上では、ドロップレットの数の実測値と予測値の比に大きなばらつきが生じなかった。テンプレートDNA量が２００ｐｇ以下では、テンプレートDNA量が減少するに従いドロップレットの数の実測値と予測値の比のばらつきが増大した。
　図１２は単一のプローブ又は３種類のプローブと200pgのテンプレートを用いてデジタルPCRを行った時の計数結果を表す。試験はプローブの種類の数ごとに独立して４回行った。テンプレートは精製したヒトのゲノムDNAである。ゲノムDNAは市場より入手した。縦軸は図１１と同様にドロップレットの数の実測値と予測値の比を表す。複数のプローブをドロップレット中に混合することで、単一のプローブで測定した時よりも、ドロップレットの数の実測値と予測値の比のばらつきが減少した。
　図１３及び図１４は単一のプローブ又は３種類のプローブを用いて、Disomy及びTrisomyのテンプレートにてデジタルPCRを行った時の計数結果を表す。テンプレート量は図１３において200pgであり、図１４において150pgである。なお常染色体がいずれも2倍体の細胞のゲノムDNA150pgには44～46個のゲノムコピーが含まれていると解される。試験はテンプレート及びプローブの種類の数ごとに独立して２回行った。“Disomy”のテンプレートは精製したゲノムDNAである。“Trisomy”のテンプレートはヒト培養細胞Detroit532から単離したゲノムDNAである。Detroit532はダウン症患者由来の線維芽細胞である。
　図１３において縦軸は図１１と同様にドロップレットの数の実測値と予測値の比を表す。複数のプローブをドロップレット中に混合することで、単一のプローブで測定した時よりも、ドロップレットの数の実測値と予測値の比のばらつきが減少した。
　図１４において縦軸はドロップレットのシグナル数の実測値を表す。単一のプローブの使用では、テンプレートのコピー数の比（Disomy/Trisomy）は2/3にならなかった。しかしながら、複数のプローブの同時使用では、テンプレートのコピー数の比（Disomy/Trisomy）が2/3であった。この試験結果は、極微量のゲノムDNAからでも、複数のプローブの同時使用により、染色体の異数性を検出できることを示す。
　さらに考察すると、150pgのゲノムDNAをWhole genome amplificationの増幅対象とした場合、反応がAllele drop outの影響を受ける。Allele drop outが発生するのはゲノムのコピー数が少ないからである。したがってWhole genome amplificationで増幅したゲノムDNAを用いて染色体の異数性を測定した時の結果はAllele drop outによって変動する。これに対して、Whole genome amplificationをせずにデジタルPCRを用いてコピー数を絶対的に定量することでAllele drop outの影響を避けられる。
＜変形例：リファレンス染色体における異数性検出＞
　図１５は図１０の変形例を示す。図においてリファレンスプローブにあたるプローブ群３０ａはリファレンス染色体に特異的にハイブリッド形成する。図において標的染色体（Target 1及びTarget 2）は１３番染色体（Chr13）及び１８番染色体（Chr18）である。一態様においてリファレンス染色体として、当該染色体の異数化が起きると胎児期に至る前に致死とならない可能性のある染色体を選択する。図においてリファレンス染色体は２１番染色体（Chr21）である。２１番染色体はダウン症候群の責任領域を含む。リファレンスプローブとしてプローブ群３０ｂを割り当てる。１３番染色体はパトー症候群の責任領域を含む。１８番染色体はエドワーズ症候群の責任領域を含む。
　図１５に示す通り、リファレンス染色体として選ばれる染色体は、正倍数性を有する可能性が高い染色体に限定された中から選択されなくともよい。すなわち一態様においてリファレンス染色体においても異数性を有する可能性を含めた判定を行う。
　図１６は仮想的な集計結果を示す。図１５に示す各プローブ群の蛍光を発するドロップレットをそれぞれ計数する。各領域のドロップレット数をコピー数（％）に変換する。２１番染色体（Chr21）のコピー数を100%とする。ひし形の縦軸上の位置がコピー数を示す。各標的染色体のコピー数はリファレンス染色体である２１番染色体（Chr21）のコピー数よりも少ないと判定される。この判定は予め統計的に求めた下限（Floor）をコピー数（％）に適用することで行う。破線で表した箱ひげ図は２１番染色体が三倍性である症例の統計結果の例示である。２１番染色体（Chr21）のコピー数を100%とした時、下限（Floor）は-33%から-0%の間に位置する。この時、１３番染色体（Chr13）及び１８番染色体（Chr18）が正倍数性で、２１番染色体（Chr21）が三倍性であると判定する。
　図１７は図１６とは異なる仮想的な集計結果を示す。１８番染色体（Chr18）のコピー数はリファレンス染色体である２１番染色体（Chr21）のコピー数よりも多いと判定される。この判定は予め統計的に求めた上限（Ceiling）をコピー数（％）に適用することで行う。破線で表した箱ひげ図は１８番染色体が三倍性である症例の統計結果の例示である。１３番染色体（Chr18）のコピー数はリファレンス染色体である２１番染色体（Chr21）のコピー数と同等と判定される。２１番染色体（Chr21）のコピー数を100%とした時、上限（Ceiling）は+0%から+50%の間に位置する。この時、１３番染色体（Chr13）及び２１番染色体（Chr21）が正倍数性で、１８番染色体（Chr18）が三倍性であると判定する。
　なおドロップレット数から分かるコピー数（％）と予め統計的に求めた下限（Floor）及び上限（Ceiling）のみからは、リファレンス染色体及び標的染色体のいずれが正倍数性であるかが分からない。したがっていずれか一方が一倍性で、他方が正倍数性すなわち二倍性である可能性が残される。一の胚に由来する相異なる種類の染色体において、同時に２種類以上の染色体に異数性変異の生じることは極めて可能性が低い。なぜならそのような変異を有する胚が出生前診断を受ける胎児にまで成長することは極めて稀だからである。したがって染色体異数性の判断における考慮の優先順位を下げてよい。あるいはそのような可能性を棄却してもよい。
＜変形例：ゲノム断片の一本鎖化＞
　図１８はゲノム断片を一本鎖化することで、鋳型を増やす態様を表す。図１に示すように次にゲノムの断片２２を得る。図１８に示すように断片２２を変性することで、その倍の数の一本鎖断片３７を得る。非特許文献１参照。一態様において変性は加熱で行う。一本鎖断片３７を限界希釈してドロップレット３８ａ～３８ｄを含む各ドロップレットに導入する。一本鎖断片３７を全ゲノム増幅することなく鋳型としてデジタルPCRに供する。上記により、二本鎖のゲノム断片数が少ない場合でも、プローブが反応するドロップレットを数多く得られる。
　この出願は、2020年4月1日に出願された日本出願特願2020-065483を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１９　血液、　２２　断片、　２３ａ－ｄ　ドロップレット、　２５　プローブ、　２６ａ　蛍光物質、　２６ｂ　クエンチャー、　２６ｃ　オリゴヌクレオチド、　２７ａ　フォワードプライマー、　２７ｂ　リバースプライマー、　２９ａ－ｆ　プローブ、　３０ａ－ｇ　プローブ群、　３３ａ－ｄ　ドロップレット、　Ｃｆ　胎児細胞、　Ｃｍ　妊婦細胞、　Ｇｆ　ゲノム、　Ｇｍ　ゲノム、　Ｔｆ　転写産物、　Ｔｍ　転写産物

Claims (17)

  1. 　胎児細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法であって、
    　妊婦の血液中から取得された胎児細胞であって、前記血液中から取得される妊婦細胞とは分離されたものから単離したゲノムDNAを全ゲノム増幅することなくデジタルPCRに供する、
    　方法。
  2. 　断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈することでデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
    　前記ドロップレットは、
    　染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、と、
    　ゲノム上の前記標的領域とは重ならない部分、以下リファレンス領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下リファレンスプローブという、と、
    　を含有し、
    　前記標的プローブと、前記リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光し、
    　前記標的プローブは、前記標的領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
    　前記リファレンスプローブは、前記リファレンス領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
    　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、前記リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数する、
    　請求項１に記載の方法。
  3. 　複数種類の前記標的領域ごとに、前記標的プローブの群を複数種類、各ドロップレットに添加し、
    　前記標的プローブは前記標的領域ごとに異なる色で蛍光し、
    　前記リファレンスプローブの群は、前記標的プローブの群のそれぞれにとって共通のリファレンスである、
    　請求項２に記載の方法。
  4. 　前記複数種類の前記標的領域は１３番染色体、１８番染色体及び２１番染色体から選ばれる複数種類の染色体上にある、
    　請求項３に記載の方法。
  5. 　前記複数種類のリファレンスプローブからなる群において、前記互いに同一の色の蛍光を発する複数のプローブは、複数種類の染色体上に分配されている又は一種類の染色体上に分配されている、
    　請求項２に記載の方法。
  6. 　標的プローブのハイブリッド形成個所は前記標的領域あたり３～３０個であり、
    　リファレンスプローブのハイブリッド形成個所は前記リファレンス領域あたり３～３０個である、
    　請求項２に記載の方法。
  7. 　前記ドロップレットは油中水滴又はマイクロウェルで互いに分割された液体である、
    　請求項２に記載の方法。
  8. 　前記標的プローブとも、前記リファレンスプローブとも異なる色で蛍光するプローブをさらにドロップレットに添加する、
    　請求項２に記載の方法。
  9. 　デジタルPCRの１ランに供される胎児細胞は同一の妊婦より取得された複数の細胞である、
    　請求項２に記載の方法。
  10. 　請求項２に記載の方法により、標的プローブの蛍光を発するドロップレットと、リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットとをそれぞれ計数することで、これらのドロップレットの数の組、又はこれらのドロップレットの数の比を含んだ電子データを生成し、
    　前記電子データを胎児の染色体異常を診断するための電子データとして提供する、又は前記電子データに基づき胎児細胞の染色体異常を検出する、ここで前記染色体異常は、前記標的領域及び前記リファレンス領域のいずれかに生じるものである、
    　方法。
  11. 　前記染色体異常は、常染色体トリソミー、常染色体部分モノソミー、Xモノソミー及びその他の性染色体異常、染色体微小欠失及び全染色体多倍体のいずれかである、
    　請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記断片化した前記ゲノムDNAを熱変性により一本鎖化してから限界希釈する、
    　請求項２に記載の方法。
  13. 　断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈することでデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
    　前記ドロップレットは、染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、を含有し、
    　前記標的プローブは、一種類の前記標的領域あたり複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
    　標的プローブの蛍光を発するドロップレットを計数し、
    　これらのドロップレットの数を含み、デジタルPCRに供された胎児細胞の個数をリファレンスとしてさらに含んだ電子データを生成し、
    　前記電子データを胎児の染色体異常を診断するための電子データとして提供する、又は前記電子データに基づき胎児細胞の染色体異常を検出する、
    　請求項１に記載の方法。
  14. 　細胞の染色体又はその部分のコピー数を検出する方法であって、
    　細胞から単離したゲノムDNAを全ゲノム増幅することなくデジタルPCRに供し、
    　デジタルPCRにおいて、断片化した前記ゲノムDNAを限界希釈してデジタルPCRの各ドロップレットに導入し、
    　前記ドロップレットは、染色体異常の検出の標的となる染色体又はその部分、以下標的領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下標的プローブという、を含有し、
    　前記標的プローブは、前記標的領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
    　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットを計数する、
    　方法。
  15. 　前記ドロップレットは、ゲノム上の前記標的領域とは重ならない部分、以下リファレンス領域という、に対してハイブリッド形成するプローブ、以下リファレンスプローブという、をさらに含有し、
    　前記リファレンスプローブは、前記リファレンス領域上の複数個所にそれぞれハイブリッド形成するとともに互いに同一の色の蛍光を発する複数種類のプローブの群からなり、
    　前記標的プローブと、前記リファレンスプローブとは互いに異なる色で蛍光し、
    　前記標的プローブの蛍光を発するドロップレットとは別個に、前記リファレンスプローブの蛍光を発するドロップレットを計数する、
    　請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記細胞は着床前の体外受精胚の細胞である、
    　請求項１４に記載の方法。
  17. 　前記細胞は羊水中に浮遊する胎児細胞である、
    　請求項１４に記載の方法。
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