JPWO2017145739A1 - 染色体数定量方法 - Google Patents
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Abstract
単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う工程を含む染色体数定量方法であって、マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含み、複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクルにおいてアニーリング時間が９０秒以上１５００秒未満であり、かつ、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用される複数のプライマーセットは、ローカルアラインメントスコアに基づく第１段階選抜工程と、グローバルアラインメントスコアに基づく第２段階選抜工程とを有するポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、染色体数定量方法。
Description
本発明は、染色体数定量方法に関する。
近年発達してきた次世代シーケンサ等により、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid；デオキシリボ核酸）塩基配列解析等の遺伝子解析が手軽に行えるようになった。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約があることから、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことが通常である。必要な特定の遺伝子領域のみを効率的かつ精度よく増幅する技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。
ところが、単一細胞のような少量ＤＮＡに対する直接的なＰＣＲは困難であるため、ＷＧＡ（Whole Genome Amplification；全ゲノム増幅）を用いてゲノム全領域を増幅後に、マルチプレックスＰＣＲおよび／またはハイブリダイゼーションによって関心領域をエンリッチメントしている。しかしながら、ＷＧＡは増幅バイアスが大きいため、染色体数定量を精度よく行うことが困難になってしまう。
特許文献１には、マルチプレックスＰＣＲで発生する非標的増幅産物の生成を軽減し、多数（千〜数万）の遺伝子を同時に増幅し、染色体定量などを行う方法が記載されている。より詳細には、プライマーを設計する際に、プライマー間の「アンデザイアラビリティスコア」が閾値未満となるように設計し、「アンデザイアラビリティスコア」はプライマーダイマー（プライマーの二量体）の形成の尤度が閾値以下となるように設計することが記載されている。しかしながら、「アンデザイアラビリティスコア」を具体的に計算する方法は記載されておらず、プライマーダイマーの生成を避けることはできていないと考えられる。
また、特許文献２には、複数の増幅部位（ターゲット）を効率よく増幅できるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマー設計方法が開示されている。
また、特許文献２には、複数の増幅部位（ターゲット）を効率よく増幅できるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマー設計方法が開示されている。
マルチプレックスＰＣＲ自体の感度を向上させ、少量ＤＮＡの増幅を精度よく行うためには、アニーリング時間を増大させ、プライマーを鋳型ＤＮＡに安定的にアニールさせることが考えられる。しかし、一般に、アニーリング時間の延長はミスプライミングによる、プライマーダイマーおよび非関心領域からの増幅産物等の非特異的増幅産物の増大の要因となる。そのため、一般的なマルチプレックスＰＣＲでは、アニーリング時間を長くしても、単一細胞または少数細胞などの少量ＤＮＡから染色体数を精度よく定量することができなかった。
本発明は、上記事情に鑑みて、単一細胞または少数細胞などの少量ＤＮＡから染色体数を精度よく定量することができる染色体数定量方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含むマルチプレックスＰＣＲを行う工程を含む染色体数定量方法であって、複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクルにおいてアニーリング時間が９０秒以上１５００秒未満であり、かつ、マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットの設計方法が、プライマーダイマー形成性の評価を、プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下で、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求め、求めたローカルアラインメントスコアに基づいて第１段階の選抜を行い、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求め、求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて第２段階の選抜を行い、第１段階および第２段階のいずれにおいても選抜されたプライマーを採用するプライマーセットの設計方法であると、単一細胞または少数細胞などの少量ＤＮＡから染色体数を精度よく定量することができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下に掲げる［１］〜［９］である。
［１］単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う工程を含む染色体数定量方法であって、
上記マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含み、
上記複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクルにおいてアニーリング時間が９０秒以上１５００秒未満であり、かつ、
上記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用される複数のプライマーセットは、
上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する標的ローカスを選択する、標的ローカス選択工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１段階選抜工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２段階選抜工程と、
上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第１段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、染色体数定量方法。
［２］上記アニーリング時間が９０秒以上１２００秒以下である、上記［１］に記載の染色体数定量方法。
［３］上記アニーリング時間が３００秒以上９００秒以下である、上記［１］または［２］に記載の染色体数定量方法。
［４］上記アニーリング時間が４５０秒以上９００秒以下である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［５］上記染色体が、１３番染色体、１８番染色体および２１番染色体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［６］上記複数のローカスのすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで、上記標的ローカス選択工程から上記プライマー採用工程までを繰り返す、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［７］上記標的ローカス選択工程において１または２以上のローカスを選択する、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［８］上記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットは、
上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第１の標的ローカスを選択する、第１の標的ローカス選択工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第１の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
上記第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
上記第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
上記第１の第１段階選抜工程および上記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
上記複数のローカスから、既に選択された標的ローカスとは異なる、上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第２の標的ローカスを選択する、第２の標的ローカス選択工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第２の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
上記第２のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
上記第２のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
上記第２の第１段階選抜工程および上記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第１段階選抜工程の両工程は、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記複数のローカスの数が３以上である場合は、上記第２の標的ローカス選択工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を、上記複数のローカスのすべてについてマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［９］上記鋳型はゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅による増幅産物ではない、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［１］単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う工程を含む染色体数定量方法であって、
上記マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含み、
上記複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクルにおいてアニーリング時間が９０秒以上１５００秒未満であり、かつ、
上記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用される複数のプライマーセットは、
上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する標的ローカスを選択する、標的ローカス選択工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１段階選抜工程と、
上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２段階選抜工程と、
上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第１段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、染色体数定量方法。
［２］上記アニーリング時間が９０秒以上１２００秒以下である、上記［１］に記載の染色体数定量方法。
［３］上記アニーリング時間が３００秒以上９００秒以下である、上記［１］または［２］に記載の染色体数定量方法。
［４］上記アニーリング時間が４５０秒以上９００秒以下である、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［５］上記染色体が、１３番染色体、１８番染色体および２１番染色体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［６］上記複数のローカスのすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで、上記標的ローカス選択工程から上記プライマー採用工程までを繰り返す、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［７］上記標的ローカス選択工程において１または２以上のローカスを選択する、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［８］上記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットは、
上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第１の標的ローカスを選択する、第１の標的ローカス選択工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第１の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
上記第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
上記第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
上記第１の第１段階選抜工程および上記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
上記複数のローカスから、既に選択された標的ローカスとは異なる、上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第２の標的ローカスを選択する、第２の標的ローカス選択工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第２の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
上記第２のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
上記第２のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
上記第２の第１段階選抜工程および上記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第１段階選抜工程の両工程は、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記複数のローカスの数が３以上である場合は、上記第２の標的ローカス選択工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を、上記複数のローカスのすべてについてマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
［９］上記鋳型はゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅による増幅産物ではない、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の染色体数定量方法。
本発明によれば、単一細胞または少数細胞などの少量ＤＮＡから、染色体数定量の対象である染色体数を精度よく定量することができる、染色体数定量方法を提供することができる。
また、本発明の染色体数定量方法によれば、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を介することが無いので、従来のＷＧＡを介することによるバイアスを排除することができる。
また、本発明の染色体数定量方法によれば、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を介することが無いので、従来のＷＧＡを介することによるバイアスを排除することができる。
以下では、本発明の染色体数定量方法について、詳細に説明する。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される範囲は、その範囲に「〜」の前後に記載された両端を含む範囲を意味する。
［マルチプレックスＰＣＲを行う工程］
マルチプレックスＰＣＲを行う工程は、単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、増幅しようとするローカスが存在する染色体上の複数のローカスを同時に増幅する工程である。
マルチプレックスＰＣＲを行う工程は、単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、増幅しようとするローカスが存在する染色体上の複数のローカスを同時に増幅する工程である。
〈単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ〉
単一細胞または少数細胞から抽出したゲノムＤＮＡについて、以下に説明する。
「単一の細胞」とは、１個の細胞をいい、「少数の細胞」とは、１０個未満の個数の細胞をいう。
ゲノムＤＮＡは、細胞から抽出したＤＮＡをいう。濃縮または希釈されていてもかまわないが、ゲノムＤＮＡを全ゲノム増幅によって増幅した全ゲノム増幅産物、およびゲノムＤＮＡの特定の領域を増幅した特定領域増幅産物は、ゲノムＤＮＡに含まない。
単一細胞または少数細胞から抽出したゲノムＤＮＡについて、以下に説明する。
「単一の細胞」とは、１個の細胞をいい、「少数の細胞」とは、１０個未満の個数の細胞をいう。
ゲノムＤＮＡは、細胞から抽出したＤＮＡをいう。濃縮または希釈されていてもかまわないが、ゲノムＤＮＡを全ゲノム増幅によって増幅した全ゲノム増幅産物、およびゲノムＤＮＡの特定の領域を増幅した特定領域増幅産物は、ゲノムＤＮＡに含まない。
《単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡ》
単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することにより調製することができる。
細胞の集団の中から単一の細胞を単離する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることもできるが、一例として、母体血試料から単一細胞を単離する方法について述べる。母体血試料以外の試料に対しても、後述する方法を適宜改変して使用することができる。
単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することにより調製することができる。
細胞の集団の中から単一の細胞を単離する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることもできるが、一例として、母体血試料から単一細胞を単離する方法について述べる。母体血試料以外の試料に対しても、後述する方法を適宜改変して使用することができる。
（母体血試料）
母体血試料は、母体（妊婦）から採取した血液試料であれば特に限定されないが、母体の末梢血が好ましい。母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球およびリンパ球等の白血球、ならびに核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球および胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。そのため、本発明では、妊娠後６週程度以降の妊婦の末梢血を検査することが好ましい。
母体血試料は、母体（妊婦）から採取した血液試料であれば特に限定されないが、母体の末梢血が好ましい。母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球およびリンパ球等の白血球、ならびに核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球および胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。そのため、本発明では、妊娠後６週程度以降の妊婦の末梢血を検査することが好ましい。
（胎児有核赤血球）
単一細胞は、胎児由来のものであれば特に限定されないが、胎児由来の有核赤血球が好ましい。胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中は、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個程度の割合で存在しているといわれており、妊婦の抹消血中の存在確率は非常に小さい。
単一細胞は、胎児由来のものであれば特に限定されないが、胎児由来の有核赤血球が好ましい。胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中は、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個程度の割合で存在しているといわれており、妊婦の抹消血中の存在確率は非常に小さい。
（胎児有核赤血球の濃縮）
単一細胞を単離する際の好ましい実施態様として、密度勾配遠心分離を用いて、胎児由来の有核赤血球を濃縮することが可能である。
単一細胞を単離する際の好ましい実施態様として、密度勾配遠心分離を用いて、胎児由来の有核赤血球を濃縮することが可能である。
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度である。一方、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度であり、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度であり、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度であり、好塩基球は１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、リンパ球は１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、単核球は１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
密度勾配遠心分離を用いて、胎児由来の有核赤血球を濃縮する場合、第一の媒体および第二の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、および／またはポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，シグマアルドリッチ社製）等の媒体を使用することができる。
パーコールおよび／またはヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度１．１３０ｇ／ｃｍ３（比重１．１３０）の製品が市販されており、希釈することによって、目的とする密度（比重）の媒体を調製することができる。また、ヒストパックは、密度１．０７７ｇ／ｃｍ３（比重１．０７７）の媒体および密度１．１１９ｇ／ｃｍ３（比重１．１１９）の媒体が市販されており、これらを混合することによって、目的とする密度（比重）の媒体を調製することができる。パーコールおよびヒストパックを使用することによって、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度である、胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。胎児由来の有核赤血球の中心密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この中心密度を挟む２つの異なる密度の媒体（第一の媒体および第二の媒体）を作成し、隣接して重層すると、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、第一の媒体の密度を１．０８０ｇ／ｍＬ以上、１．１００ｇ／ｍＬ以下に設定し、第二の媒体の密度を１．０６０ｇ／ｍＬ以上、１．０８０ｇ／ｍＬ以下に設定する。より好ましくは、第一の媒体の密度を１．０８０ｇ／ｍＬ以上、１．０９０ｇ／ｍＬ以下に設定し、第二の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上、１．０８０ｇ／ｍＬ以下に設定する。具体的な一実施態様としては、第一の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬに、および第二の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに、それぞれ設定して、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが好ましい。また、このように設定することによって、赤血球、好中球およびリンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第一の媒体および第二の媒体は、同じ種類の媒体であってよいし、異なる種類の媒体であってもよいが、好ましくは同じ種類の媒体である。
（有核赤血球候補の選別および単離）
単一細胞の単離方法の例としては、マイクロマニュピュレーターにより透明基板上から１個ずつ細胞を剥離して取得する方法、免疫染色およびＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）によるソーティングなどがある。
単一細胞の単離方法の例としては、マイクロマニュピュレーターにより透明基板上から１個ずつ細胞を剥離して取得する方法、免疫染色およびＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）によるソーティングなどがある。
以下では、マイクロマニュピュレーターにより透明基板上から単一細胞を剥離して取得する方法について詳細に説明する。
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板（血球細胞標本）を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板（血球細胞標本）を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
血球細胞標本から得られる血球細胞の形態情報に基づいて、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。好ましい実施態様としては、細胞の、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合いおよび／または核領域の面積等を利用して、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。特に、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合または核の円形度合いが条件を満足する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。
本発明では、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合「Ｎ／Ｃ」が下記式（１）を満足する細胞を選別することが好ましい。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ ・・・（１）
ただし、式（１）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ ・・・（１）
ただし、式（１）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
また、本発明では、核の長径の長さの平方に対する核領域の面積の割合「Ｎ／Ｌ２」が下記式（２）を満足する細胞を選別することが好ましい。
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５ ・・・（２）
ただし、式（２）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５ ・・・（２）
ただし、式（２）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補を選別するシステムは、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ、制御ＰＣ、およびディスプレイを装備している。光学搬送系は、対物レンズおよびＣＣＤカメラを備える。画像処理ＰＣは、データ解析およびデータ記憶を行う処理系を備える。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御および全体の処理を制御する制御系を備える。
人を含むすべての脊椎動物の血液中にある赤血球に存在する蛋白質がヘモグロビンである。有核赤血球は、血液中の有核細胞の１種である白血球とはヘモグロビンの有無が異なる。ヘモグロビンは、酸素と結合した場合、鮮明な赤色を呈する酸化ヘモグロビン、酸素と結合していない場合、暗赤色を呈する還元ヘモグロビンであり、動脈中および静脈中には、酸素結合量が異なるヘモグロビンが流れている。ヘモグロビンは、３８０ｎｍ〜６５０ｎｍに吸収を持つため、この波長領域の吸光度の違いに起因する少なくとも１つの単色光の情報でヘモグロビンを検出することが可能である。ヘモグロビンの存在を確認するには単色光を用いることが好ましく、ヘモグロビンの吸収が大きい４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長領域の単波長の光、または５２５ｎｍ〜５８０ｎｍの波長領域の単色光を選択することができる。これらの波長領域の吸収係数は、ヘモグロビンが存在することで高い値を示すため、白血球の細胞質の吸収係数との比は１以上となる。
実施態様として、円形に近い細胞核が存在する細胞で、しかもヘモグロビンを有する細胞を、有核赤血球の候補として識別することが可能である。さらに、胎児由来の有核赤血球および成人由来の有核赤血球は、胎児のヘモグロビンがヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）であり、成人のヘモグロビンがヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）であることから、異なる酸素結合能力により生じる分光特性の差異を利用して、胎児由来の有核赤血球を選別することが可能である。
細胞質の吸収係数を測定する場合には、顕微分光光度計を用いることができる。顕微分光光度計は、通常の分光光度計と同じ原理を、顕微鏡の光学系を利用する光度計であり、市販の装置を使用することが可能である。
細胞の形態情報および／または吸光度のみによっては、単離した有核赤血球が胎児由来であるか、または母体（妊婦）由来であるかの確定をすることができない場合がある。しかし、本発明においては、ＳＮＰおよび／またはＳＴＲ（Short Tandem Repeat：短鎖縦列反復配列）等による多型解析、ならびにＹ染色体の存在の確認など、ＤＮＡ解析によって、単離した有核赤血球の由来を判別することができる。
（ゲノムＤＮＡの抽出）
単一細胞からのゲノムＤＮＡ抽出は、従来公知の方法によって行うことができる。市販のＤＮＡ抽出キットを使用することが好ましい。単一細胞からのゲノムＤＮＡ抽出を行う際に使用することができる市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＷＧＡ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）などが挙げられる。市販のＤＮＡ抽出キットを使用する場合には、キット付属のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出を行えばよいが、プロトコールを適宜改変して用いてもよい。
単一細胞からのゲノムＤＮＡ抽出は、従来公知の方法によって行うことができる。市販のＤＮＡ抽出キットを使用することが好ましい。単一細胞からのゲノムＤＮＡ抽出を行う際に使用することができる市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＷＧＡ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）などが挙げられる。市販のＤＮＡ抽出キットを使用する場合には、キット付属のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出を行えばよいが、プロトコールを適宜改変して用いてもよい。
《少数細胞から抽出したゲノムＤＮＡ》
少数細胞から抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、細胞の集団の中から少数の細胞を分離し、分離した少数の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することによって、もしくは細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞を混合し、混合した少数の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することによって、もしくは細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを混合することによって、またはこれらのうち２つ以上の組合せによって、調製することができる。
少数細胞から抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、細胞の集団の中から少数の細胞を分離し、分離した少数の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することによって、もしくは細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞を混合し、混合した少数の細胞からゲノムＤＮＡを抽出することによって、もしくは細胞の集団の中から単一の細胞を単離し、単離した単一の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを混合することによって、またはこれらのうち２つ以上の組合せによって、調製することができる。
〈マルチプレックスＰＣＲ〉
マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマーセットを使用して、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するＰＣＲである。
マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマーセットを使用して、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するＰＣＲである。
《サーマルサイクル》
マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含む。所望により、さらに、初期熱変性および／または最終伸長などを含んでもよい。
マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含む。所望により、さらに、初期熱変性および／または最終伸長などを含んでもよい。
（熱変性）
熱変性の条件は、ゲノムＤＮＡの２本鎖を解離させて１本鎖にすることができる温度および時間であれば特に限定されない。
熱変性の好適な条件の例として、温度を９０℃〜９５℃、好ましくは９４±２℃に設定し、時間を１０秒〜６０秒、好ましくは３０秒±５秒に設定することが挙げられる。
熱変性の温度および時間は、鋳型のゲノムＤＮＡ量などに応じて、適宜変更してもよい。
熱変性の条件は、ゲノムＤＮＡの２本鎖を解離させて１本鎖にすることができる温度および時間であれば特に限定されない。
熱変性の好適な条件の例として、温度を９０℃〜９５℃、好ましくは９４±２℃に設定し、時間を１０秒〜６０秒、好ましくは３０秒±５秒に設定することが挙げられる。
熱変性の温度および時間は、鋳型のゲノムＤＮＡ量などに応じて、適宜変更してもよい。
（アニーリング）
アニーリングの条件は、解離して１本鎖となったゲノムＤＮＡにプライマーが結合することができる温度および時間であれば特に限定されない。
アニーリングの好適な条件の例として、温度を５０℃〜６５℃、好ましくは６０±２℃に設定し、時間を１０秒〜９０秒、好ましくは６０±１０秒に設定することが挙げられる。
ただし、複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクル、好ましくは全サイクルの約１／３、より好ましくは全サイクルの約１／２、さらに好ましくは全サイクルの約２／３、いっそう好ましくは全サイクルにおいて、アニーリング時間を９０秒以上１５００秒未満、好ましくは９０秒以上１２００秒以下、より好ましくは３００秒以上９００秒以下、さらに好ましくは４５０秒以上９００秒以下、とりわけ好ましくは約６００秒とする。なお、数値について「約」は、上下または前後、５％を含むものとする。
上記ただし書きによる制限を除いて、アニーリングの温度および時間は、プライマーのＧＣ含量（（全核酸塩基中のグアニン（Guanine，略号＝Ｇ）およびシトシン（Cytosine，略号＝Ｃ）、Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度である。Ｔｍはmelting temperatureに由来する。）、および配列の偏りなどに応じて、適宜変更してもよい。
アニーリングの条件は、解離して１本鎖となったゲノムＤＮＡにプライマーが結合することができる温度および時間であれば特に限定されない。
アニーリングの好適な条件の例として、温度を５０℃〜６５℃、好ましくは６０±２℃に設定し、時間を１０秒〜９０秒、好ましくは６０±１０秒に設定することが挙げられる。
ただし、複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクル、好ましくは全サイクルの約１／３、より好ましくは全サイクルの約１／２、さらに好ましくは全サイクルの約２／３、いっそう好ましくは全サイクルにおいて、アニーリング時間を９０秒以上１５００秒未満、好ましくは９０秒以上１２００秒以下、より好ましくは３００秒以上９００秒以下、さらに好ましくは４５０秒以上９００秒以下、とりわけ好ましくは約６００秒とする。なお、数値について「約」は、上下または前後、５％を含むものとする。
上記ただし書きによる制限を除いて、アニーリングの温度および時間は、プライマーのＧＣ含量（（全核酸塩基中のグアニン（Guanine，略号＝Ｇ）およびシトシン（Cytosine，略号＝Ｃ）、Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度である。Ｔｍはmelting temperatureに由来する。）、および配列の偏りなどに応じて、適宜変更してもよい。
（伸長）
伸長の条件は、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーの３’末端からのポリヌクレオチド鎖の伸長をすることができる温度および時間であれば特に限定されない。
伸長の好適な条件の例として、温度を７２±２℃に設定し、時間を１０秒〜６０秒、好ましくは３０±５秒に設定することが挙げられる。
伸長の温度および時間は、ＤＮＡポリメラーゼの種類、およびＰＣＲ増幅産物のサイズなどに応じて、適宜変更してもよい。
伸長の条件は、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーの３’末端からのポリヌクレオチド鎖の伸長をすることができる温度および時間であれば特に限定されない。
伸長の好適な条件の例として、温度を７２±２℃に設定し、時間を１０秒〜６０秒、好ましくは３０±５秒に設定することが挙げられる。
伸長の温度および時間は、ＤＮＡポリメラーゼの種類、およびＰＣＲ増幅産物のサイズなどに応じて、適宜変更してもよい。
（初期熱変性）
サーマルサイクルの最初のサイクルを開始する前に、初期熱変性を行ってもよい。
初期熱変性の条件は、熱変性の条件と同じ条件であってもよいし、異なる条件であってもよい。異なる条件とする場合、温度は熱変性と同じ温度に設定し、時間を熱変性よりも長い時間に設定することが好ましい。
初期熱変性を行うことによって、サーマルサイクルの１サイクル目においてゲノムＤＮＡの２本鎖の解離をより確実なものとすることができる。
サーマルサイクルの最初のサイクルを開始する前に、初期熱変性を行ってもよい。
初期熱変性の条件は、熱変性の条件と同じ条件であってもよいし、異なる条件であってもよい。異なる条件とする場合、温度は熱変性と同じ温度に設定し、時間を熱変性よりも長い時間に設定することが好ましい。
初期熱変性を行うことによって、サーマルサイクルの１サイクル目においてゲノムＤＮＡの２本鎖の解離をより確実なものとすることができる。
（最終伸長）
サーマルサイクルの最後のサイクルを終了した後に、最終伸長を行ってもよい。
最終伸長の条件は、伸長の条件と同じ条件であってもよいし、異なる条件であってもよい。異なる条件とする場合、温度は伸長と同じ温度に設定し、時間を伸長よりも長い時間に設定することが好ましい。
最終伸長を行うことによって、ポリヌクレオチド鎖の伸長をより確実なものとすることができる。
サーマルサイクルの最後のサイクルを終了した後に、最終伸長を行ってもよい。
最終伸長の条件は、伸長の条件と同じ条件であってもよいし、異なる条件であってもよい。異なる条件とする場合、温度は伸長と同じ温度に設定し、時間を伸長よりも長い時間に設定することが好ましい。
最終伸長を行うことによって、ポリヌクレオチド鎖の伸長をより確実なものとすることができる。
（サイクル数）
サイクル数は複数であれば特に限定されないが、好ましくは２０サイクル〜４０サイクル、より好ましくは３５±５サイクルである。
サイクル数は、マルチプレックスＰＣＲの鋳型となるゲノムＤＮＡの量、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットの数、および／またはマルチプレックスＰＣＲの反応溶液の量などに応じて、適宜変更してもよい。
ＰＣＲによる増幅産物は、理論的には１サイクルごとに２倍に増加するが、実際には、あるサイクルでプラトーに達してしまい、それ以上の増幅産物を望めないばかりか、非特異的増幅産物が増加する可能性もあり、一概にサイクル数を増加させることが望ましいとはいえない。
サイクル数は複数であれば特に限定されないが、好ましくは２０サイクル〜４０サイクル、より好ましくは３５±５サイクルである。
サイクル数は、マルチプレックスＰＣＲの鋳型となるゲノムＤＮＡの量、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットの数、および／またはマルチプレックスＰＣＲの反応溶液の量などに応じて、適宜変更してもよい。
ＰＣＲによる増幅産物は、理論的には１サイクルごとに２倍に増加するが、実際には、あるサイクルでプラトーに達してしまい、それ以上の増幅産物を望めないばかりか、非特異的増幅産物が増加する可能性もあり、一概にサイクル数を増加させることが望ましいとはいえない。
（プライマーセット）
マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットは、後述する「プライマーセットの設計方法」に従って設計したものを使用することができる。このプライマーセットはプライマーダイマーを形成しないように設計されているため、アニーリング時間を従来よりも長い時間に設定しても、非特異的増幅産物の増大を抑制することができ、マルチプレックスＰＣＲ自体の感度を向上させることができる。
プライマーセットの数は、増幅しようとするローカスの数に対応して設定される。同一のローカスを増幅するプライマーセットが２組以上あってもよいし、２つ以上のローカスを１組のプライマーセットで増幅してもよい。通常、ローカスとプライマーセットが１対１で対応することが好ましい。
マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットは、後述する「プライマーセットの設計方法」に従って設計したものを使用することができる。このプライマーセットはプライマーダイマーを形成しないように設計されているため、アニーリング時間を従来よりも長い時間に設定しても、非特異的増幅産物の増大を抑制することができ、マルチプレックスＰＣＲ自体の感度を向上させることができる。
プライマーセットの数は、増幅しようとするローカスの数に対応して設定される。同一のローカスを増幅するプライマーセットが２組以上あってもよいし、２つ以上のローカスを１組のプライマーセットで増幅してもよい。通常、ローカスとプライマーセットが１対１で対応することが好ましい。
《染色体上の複数のローカス》
（染色体）
染色体はヒトの１番染色体から２２番染色体までの常染色体、ならびにＸ染色体およびＹ染色体の性染色体からなる群から選択される１つ以上を含む。
染色体は、染色体数定量の対象である染色体を含めば特に限定されない。
染色体は、染色体数定量の対象である染色体の他に、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体などを含んでもよい。すなわち、マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとするローカスが存在する染色体であっても、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体などは、染色体数定量の対象である染色体から除外する。
染色体数定量の対象である染色体は、特に好ましくは、１３番染色体、１８番染色体および２１番染色体からなる群から選択される少なくとも１つを含む。これらの染色体は他の常染色体に比べてトリソミーまたはモノソミーを生じやすいからである。
染色体定量のための基準値を与える染色体としては、たとえば、トリソミーもしくはモノソミーを生じやすい染色体以外の常染色体、および／またはＸ染色体が挙げられる。なかでも、Ｘ染色体は男女の性別に依らず存在することから、好ましいものの一つである。
ローカスの有無にのみ興味がある染色体としては、たとえば、Ｙ染色体が挙げられる。Ｙ染色体の存在は男女の性別のうち男性を強く示唆するものだからである。胎児の染色体数を定量する場合には、母親（母体）由来の細胞と胎児由来の細胞とを判別するため、Ｙ染色体を含むことが好ましい。Ｙ染色体の存在は、細胞の母親（母体）由来の否定を示唆するからである。
（染色体）
染色体はヒトの１番染色体から２２番染色体までの常染色体、ならびにＸ染色体およびＹ染色体の性染色体からなる群から選択される１つ以上を含む。
染色体は、染色体数定量の対象である染色体を含めば特に限定されない。
染色体は、染色体数定量の対象である染色体の他に、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体などを含んでもよい。すなわち、マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとするローカスが存在する染色体であっても、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体などは、染色体数定量の対象である染色体から除外する。
染色体数定量の対象である染色体は、特に好ましくは、１３番染色体、１８番染色体および２１番染色体からなる群から選択される少なくとも１つを含む。これらの染色体は他の常染色体に比べてトリソミーまたはモノソミーを生じやすいからである。
染色体定量のための基準値を与える染色体としては、たとえば、トリソミーもしくはモノソミーを生じやすい染色体以外の常染色体、および／またはＸ染色体が挙げられる。なかでも、Ｘ染色体は男女の性別に依らず存在することから、好ましいものの一つである。
ローカスの有無にのみ興味がある染色体としては、たとえば、Ｙ染色体が挙げられる。Ｙ染色体の存在は男女の性別のうち男性を強く示唆するものだからである。胎児の染色体数を定量する場合には、母親（母体）由来の細胞と胎児由来の細胞とを判別するため、Ｙ染色体を含むことが好ましい。Ｙ染色体の存在は、細胞の母親（母体）由来の否定を示唆するからである。
（複数のローカス）
複数のローカスは、染色体上のローカスのうち、マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとするローカスである。
上述したとおり、染色体は染色体数定量の対象である染色体に加えて、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体なども含んでもよいことから、複数のローカスもまた、染色体数定量の対象である染色体上に存在するものに限定されず、染色体定量のための基準値を与える染色体上に存在するローカス、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体上に存在するローカスなどを含んでもよい。
複数のローカスは、染色体上のローカスのうち、マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとするローカスである。
上述したとおり、染色体は染色体数定量の対象である染色体に加えて、染色体定量のための基準値を与える染色体、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体なども含んでもよいことから、複数のローカスもまた、染色体数定量の対象である染色体上に存在するものに限定されず、染色体定量のための基準値を与える染色体上に存在するローカス、および／またはローカスの有無にのみ興味がある染色体上に存在するローカスなどを含んでもよい。
ローカスは、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在するものであってもよい。
遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームＲＮＡ（Ribonucleic acid：リボ核酸）遺伝子およびトランスファーＲＮＡ遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、５’−リーダー配列および３’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。
非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームＲＮＡ（Ribonucleic acid：リボ核酸）遺伝子およびトランスファーＲＮＡ遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、５’−リーダー配列および３’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。
非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
ローカスは、例えば、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）、ＳＮＶ（Single Nucleotide Variant：一塩基変異）、ＳＴＲＰ（Short Tandem Repeat Polymorphism：縦列型反復配列多型）、ミューテーション、ならびに挿入および／または欠失（インデル）などの座位であってもよい。
（ローカスの数）
また、ローカスの数は、染色体あたり、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは５０以上とする。ローカスの数が多いほど、染色体数定量の精度を向上することができる。
また、ローカスの数は、染色体あたり、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは５０以上とする。ローカスの数が多いほど、染色体数定量の精度を向上することができる。
［染色体数の定量工程］
本発明においては、染色体数の定量は、従来公知の方法によって行うことができるが、例えば、次世代シーケンサを用いて、後述する方法で行うことが好ましい。
本発明においては、染色体数の定量は、従来公知の方法によって行うことができるが、例えば、次世代シーケンサを用いて、後述する方法で行うことが好ましい。
次世代シークエンサーとしては、特に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスＰＣＲ増幅産物を次世代シークエンサー「ＭｉＳｅｑ」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスＰＣＲ増幅産物に６〜８塩基で構成されるサンプル識別配列（インデックス配列）ならびにＭｉＳｅｑフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのＰ５配列およびＰ７配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大９６種類のマルチプレックスＰＣＲ増幅産物を１回で測定することが可能である。
インデックス配列、Ｐ５配列およびＰ７配列をマルチプレックスＰＣＲ増幅産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはＰＣＲ法などを用いることが可能である。
ＭｉＳｅｑで得られたシーケンスデータを解析して染色体数を定量する方法としては、ＢＷＡ（Burrows-Wheeler Aligner；バーロウズ−ホィーラー・アライナー：Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、ｐ．1754-1760.；Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、ｐ．589-595）を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、ｐ．2078-2079；ＳＡＭは“Sequence Alignment/Map”に由来する。）、および／またはＢＥＤｔｏｏｌｓ（Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、ｐ．841-842）を用いることで染色体数の定量を実施することが好ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的ローカスをＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片に対して、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（カバレッジ、シーケンスデプスまたは配列リード数）をシークエンサーで求めることができる。
基準（参照）として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）と、母親由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、１：１．５（または２：３）となることが予想される。
本発明においては、あらかじめ、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母親由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠した場合の母親由来の増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来の増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定することもできる。この、あらかじめ決定したカットオフ値と、増幅産物の比を求めた結果とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである、と検査結果を解釈することも可能である。
［プライマーセットの設計方法］
本発明の特徴的な点の一つであるプライマーセットの設計方法について、以下に詳細に説明する。
本発明の特徴的な点の一つであるプライマーセットの設計方法について、以下に詳細に説明する。
本発明における、プライマーセットの設計方法の第１の態様は、以下の工程を備える。
（ａ）複数のローカスからマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する標的ローカスを選択する、標的ローカス選択工程；
（ｂ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、ローカルアラインメント工程；
（ｄ）上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１段階選抜工程；
（ｅ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、グローバルアラインメント工程；
（ｆ）上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２段階選抜工程；ならびに
（ｇ）上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
ただし、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
（ａ）複数のローカスからマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する標的ローカスを選択する、標的ローカス選択工程；
（ｂ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、ローカルアラインメント工程；
（ｄ）上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１段階選抜工程；
（ｅ）上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、グローバルアラインメント工程；
（ｆ）上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２段階選抜工程；ならびに
（ｇ）上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程。
ただし、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
本発明におけるプライマーセットの設計方法の第１の態様の各工程について詳細に説明する。
（ａ）標的ローカス選択工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）標的ローカス選択工程」として示す。
標的ローカス選択工程は、上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計するローカス（標的ローカス）を選択する工程である。
マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとする複数のローカスの数をＮ個（ただし、ＮはＮ≧２を満たす整数である。）として、選択しうる標的ローカスの数はｎ個（ｎは１≦ｎ≦Ｎを満たす整数である。）である。
２個以上のローカスを選択した場合は、それぞれのローカスについて、逐次プライマーセットを設計してもよいし、並行してプライマーセットを設計してもよいし、同時にプライマーセットを設計してもよい。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）標的ローカス選択工程」として示す。
標的ローカス選択工程は、上記複数のローカスから上記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計するローカス（標的ローカス）を選択する工程である。
マルチプレックスＰＣＲによって増幅しようとする複数のローカスの数をＮ個（ただし、ＮはＮ≧２を満たす整数である。）として、選択しうる標的ローカスの数はｎ個（ｎは１≦ｎ≦Ｎを満たす整数である。）である。
２個以上のローカスを選択した場合は、それぞれのローカスについて、逐次プライマーセットを設計してもよいし、並行してプライマーセットを設計してもよいし、同時にプライマーセットを設計してもよい。
（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する工程である。
なお、プライマー候補の塩基配列は、上記近傍領域の塩基配列に基づいて作成されるが、上記近傍領域の塩基配列に相補的でない部分を５’末端側に有していてもよい。このような、プライマーの５’末端側の相補的でない部分は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物に特定の塩基配列を付加するために用いられる場合がある。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する工程である。
なお、プライマー候補の塩基配列は、上記近傍領域の塩基配列に基づいて作成されるが、上記近傍領域の塩基配列に相補的でない部分を５’末端側に有していてもよい。このような、プライマーの５’末端側の相補的でない部分は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物に特定の塩基配列を付加するために用いられる場合がある。
標的ローカスの近傍領域は、染色体上の標的ローカスを含む領域のうち標的ローカスを除いた部分をいう。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの相補部分の長さ、プライマーの全長、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Guanine，略号＝Ｇ）およびシトシン（Cytosine，略号＝Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度である。Ｔｍはmelting temperatureに由来する。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
なお、プライマーの相補部分とは、アニーリングの際にプライマーが鋳型の一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズする部分をいう。プライマーの相補部分の塩基配列は標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて作成される。本発明において、プライマーは相補部分の５’末端に非相補部分が連結されていてもよい。非相補部分は、鋳型ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズすることを意図していない部分である。プライマーの非相補部分の塩基配列としては、マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物を鋳型としてＰＣＲ（セカンドＰＣＲ）を行い、シークエンス用の配列を増幅産物に付加するために用いられるテール配列などがある。
なお、プライマーの相補部分とは、アニーリングの際にプライマーが鋳型の一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズする部分をいう。プライマーの相補部分の塩基配列は標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて作成される。本発明において、プライマーは相補部分の５’末端に非相補部分が連結されていてもよい。非相補部分は、鋳型ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズすることを意図していない部分である。プライマーの非相補部分の塩基配列としては、マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物を鋳型としてＰＣＲ（セカンドＰＣＲ）を行い、シークエンス用の配列を増幅産物に付加するために用いられるテール配列などがある。
プライマーの相補部分の長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、より好ましくは１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、さらに好ましくは１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。プライマーの相補部分の長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
ＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
Ｔｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
Ｔｍ値は、ＯＬＩＧＯ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）、または、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
（特異性チェック工程）
所望により、特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性チェック工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する工程である。
特異性のチェックは、ゲノムＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、ゲノムＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
所望により、特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性チェック工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する工程である。
特異性のチェックは、ゲノムＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、ゲノムＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
相補塩基（マッチ）、非相補塩基（ミスマッチ）およびギャップ（挿入および／または欠失（インデル））のそれぞれに対して付与するスコア（本明細書において「スコアリング・システム」という場合がある。）、およびローカルアラインメントスコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基（マッチ）＝＋１、非相補塩基（ミスマッチ）＝−１、ギャップ（挿入および／または欠失（インデル））＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定することが考えられる。なお、ギャップに対するスコアをギャップペナルティという場合がある。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基（マッチ）＝＋１、非相補塩基（ミスマッチ）＝−１、ギャップ（挿入および／または欠失（インデル））＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定することが考えられる。なお、ギャップに対するスコアをギャップペナルティという場合がある。
プライマー候補の塩基配列がゲノムＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、標的ローカスを増幅できず、アーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
（ｃ）ローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
ローカルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
なお、後述する（ｅ）グローバルアラインメント工程および（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｆ）第２段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｄ）第１段階選抜工程を行ってもよい。
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
ローカルアラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコア（ローカルアラインメントスコア）が最大となるように行う。マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにマッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアラインメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
ローカルアラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコア（ローカルアラインメントスコア）が最大となるように行う。マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにマッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、マッチ、ミスマッチおよびギャップのそれぞれに与えるスコアは、表１に示すとおりとする。
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリクス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３のマトリクス内の太線部分参照）。
表４より、マッチ（＋１）×７、ミスマッチ（−１）×１２、およびギャップ（−３）×１であるから、このローカルラインメントについて、ローカルアラインメントスコアは「−８」である。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
（ｄ）第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）第１段階選抜工程」として示す。
第１段階選抜工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う工程である。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）第１段階選抜工程」として示す。
第１段階選抜工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う工程である。
ローカルアラインメントスコアの閾値（第１の閾値）を予め設定しておく。
ローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
ローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
ここで、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程に示した例において、第１の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「−８」であり、第１の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断することができる。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「−８」であり、第１の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断することができる。
なお、本工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
（ｅ）グローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
グローバルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
なお、上述した（ｃ）ローカルアラインメント工程および（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｄ）第１段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｆ）第２段階選抜工程を行ってもよい。
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
グローバルアラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコア（グローバルアラインメントスコア）が最大となるように行う。マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにマッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
グローバルアラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコア（グローバルアラインメントスコア）が最大となるように行う。マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにマッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれに与えるスコアを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。「３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列」に該当する。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、マッチ、ミスマッチおよびギャップのそれぞれに与えるスコアは、表１に示すとおりとする。
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行い、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る。
表６より、マッチ（＋１）×０、ミスマッチ（−１）×３、およびギャップ（−３）×０であるから、このグローバルアラインメントについて、グローバルアラインメントスコアは「−３」である。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
（ｆ）第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）第２段階選抜工程」として示す。
第２段階選抜工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う工程である。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）第２段階選抜工程」として示す。
第２段階選抜工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う工程である。
グローバルアラインメントスコアの閾値（第２の閾値）を予め設定しておく。
グローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
グローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアを第２の閾値未満とすることができる。
ここで、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程に示した例において、第２の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断することができる。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはプライマーダイマー形成性が低いと判断することができる。
なお、本工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
また、計算量を低減させるため、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆ）第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的ローカスの数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
これは、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアラインメントスコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアラインメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
（増幅配列長チェック工程）
所望により、幅配列長チェック工程を実施してもよい。
幅配列長チェック工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する工程である。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的ローカスを適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
所望により、幅配列長チェック工程を実施してもよい。
幅配列長チェック工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する工程である。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的ローカスを適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
（ｇ）プライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
図１のブロックダイアグラムに「（第ｎの）プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、上記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
既に記載したように、ローカルアラインメントスコアは「−８」であり、第１の閾値である「３」未満である。そして、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
本発明における、プライマーセットの設計方法の第２の態様は、以下の工程を備える。
（ａｎ）複数のローカスからマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第ｎの標的ローカスを選択する、第ｎの標的ローカス選択工程；
（ｂｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第ｎの標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎのローカルアラインメント工程；
（ｄｎ）上記第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第ｎ段階の選抜を行う、第ｎの第ｎ段階選抜工程；
（ｅｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎのグローバルアラインメント工程；
（ｆｎ）上記第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第ｎの第２段階選抜工程；ならびに
（ｇｎ）上記第ｎの第ｎ段階選抜工程および上記第ｎの第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎのプライマー採用工程。
（ａｎ）複数のローカスからマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第ｎの標的ローカスを選択する、第ｎの標的ローカス選択工程；
（ｂｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第ｎの標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎのローカルアラインメント工程；
（ｄｎ）上記第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第ｎ段階の選抜を行う、第ｎの第ｎ段階選抜工程；
（ｅｎ）上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎのグローバルアラインメント工程；
（ｆｎ）上記第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第ｎの第２段階選抜工程；ならびに
（ｇｎ）上記第ｎの第ｎ段階選抜工程および上記第ｎの第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎのプライマー採用工程。
ここで、ｎはｎ≧１を満たす整数であり、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
また、複数のローカスの数Ｎ（ＮはＮ≧２を満たす整数である。）がｎよりも大きい場合は、上記ｎをｎ＋１と置換して、複数のローカスのすべてについてプライマーセットが採用されるまで繰り返す。
ｎをｎ＋１と置換した場合の各工程を以下に示す。
ｎをｎ＋１と置換した場合の各工程を以下に示す。
（ａｎ＋１）複数のローカスから、既に選択された標的ローカスとは異なる、マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第ｎ＋１の標的ローカスを選択する、第ｎ＋１の標的ローカス選択工程；
（ｂｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第ｎ＋１の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて、少なくとも１つずつ作成する、第ｎ＋１のプライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎ＋１のローカルアラインメント工程；
（ｄｎ＋１）上記第ｎ＋１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第ｎ＋１の第１段階選抜工程；
（ｅｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程；
（ｆｎ＋１）上記第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第ｎ＋１段階の選抜を行う、第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程；
（ｇｎ＋１）上記第ｎ＋１の第１段階選抜工程および上記第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎ＋１のプライマー採用工程。
（ｂｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における上記第ｎ＋１の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて、少なくとも１つずつ作成する、第ｎ＋１のプライマー候補塩基配列作成工程；
（ｃｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎ＋１のローカルアラインメント工程；
（ｄｎ＋１）上記第ｎ＋１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第ｎ＋１の第１段階選抜工程；
（ｅｎ＋１）上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程；
（ｆｎ＋１）上記第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第ｎ＋１段階の選抜を行う、第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程；
（ｇｎ＋１）上記第ｎ＋１の第１段階選抜工程および上記第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎ＋１の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎ＋１のプライマー採用工程。
ここで、上記（ｃｎ＋１）第ｎ＋１のローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ＋１）第ｎ＋１の第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ＋１）第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ＋１）第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅｎ＋１）第ｎ＋１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ＋１）第ｎ＋１の第ｎ＋１段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
本発明におけるプライマーセットの設計方法の第２の態様の各工程について詳細に説明する。
（ａｎ）第ｎの標的ローカス選択工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの標的ローカス選択工程」として示す。
第ｎの標的ローカスを選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的ローカス選択工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、第ｎ−１の標的ローカス選択工程までに選択された標的ローカスとは異なるローカスを選択する。
なお、ｎ≧２である場合、第ｎの標的ローカスの選択は、第（ｎ−１）の標的ローカスの選択と同時に、またはその後に、することができる。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの標的ローカス選択工程」として示す。
第ｎの標的ローカスを選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的ローカス選択工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、第ｎ−１の標的ローカス選択工程までに選択された標的ローカスとは異なるローカスを選択する。
なお、ｎ≧２である場合、第ｎの標的ローカスの選択は、第（ｎ−１）の標的ローカスの選択と同時に、またはその後に、することができる。
（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
（特異性チェック工程）
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う。ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第１の標的ローカスから第（ｎ−１）の標的ローカスまでのそれぞれの標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である（以下同じ）。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う。ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第１の標的ローカスから第（ｎ−１）の標的ローカスまでのそれぞれの標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である（以下同じ）。
（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う。
（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合は、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う。
（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
ただし、ｎ≧２である場合、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う。
なお、本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様と同様に、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
また、計算量を低減させるため、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的ローカスの数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
（増幅配列長チェック工程）
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
（ｇｎ）第ｎのプライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー採用工程」として示す。
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー採用工程」として示す。
本発明のプライマーセットの設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［単一細胞の単離およびゲノムＤＮＡ抽出］
〈単一細胞の単離〉
（末梢血液試料取得）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid：エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
〈単一細胞の単離〉
（末梢血液試料取得）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid：エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
（有核赤血球の濃縮）
パーコール液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液および密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液２ｍＬを添加し、冷蔵庫で４℃に３０分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液２ｍＬを重層した。
その後、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。
遠沈管を取り出し、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）と密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板１を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板２を持ち、１端をスライドガラス基板１に３０°の角度で接触させ、スライドガラス基板２の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により２枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板２をスライドガラス基板１の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板１上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、１時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度３％としたギムザ染色液に１０分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
パーコール液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液および密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液２ｍＬを添加し、冷蔵庫で４℃に３０分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液２ｍＬを重層した。
その後、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。
遠沈管を取り出し、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）と密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板１を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板２を持ち、１端をスライドガラス基板１に３０°の角度で接触させ、スライドガラス基板２の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により２枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板２をスライドガラス基板１の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板１上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、１時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度３％としたギムザ染色液に１０分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
（細胞の形態情報による有核赤血球の識別）
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動ＸＹステージと、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、Ｚ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の２つの条件を満たす細胞を検出し、ＸＹ位置を記録した。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ ・・・（１）
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５ ・・・（２）
ここで、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式（１）および（２）を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動ＸＹステージと、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、Ｚ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の２つの条件を満たす細胞を検出し、ＸＹ位置を記録した。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ ・・・（１）
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５ ・・・（２）
ここで、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式（１）および（２）を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。
（胎児有核赤血球の選別）
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの１つの細胞に対して、４１５ｎｍ近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記（２）式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から３個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球３個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が１以上となる細胞を抽出した結果、明らかに１以上である細胞が８個検出された。
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの１つの細胞に対して、４１５ｎｍ近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記（２）式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から３個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球３個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が１以上となる細胞を抽出した結果、明らかに１以上である細胞が８個検出された。
（細胞の回収）
上述したとおり決定された８個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。
上述したとおり決定された８個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。
〈ゲノムＤＮＡ抽出〉
採取した単一細胞に対して、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて細胞溶解を行った。すなわち、キット付属の説明書「Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」および「Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」の記載に従って、各単一細胞を５μＬの Ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ に混合した後、４．８μＬの Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ および０．２μＬの Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ を混合して総液量を１０μＬとし、７５℃で１０分間インキュベートした後、さらに９５℃で４分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムＤＮＡを調製した。
採取した単一細胞に対して、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて細胞溶解を行った。すなわち、キット付属の説明書「Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」および「Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」の記載に従って、各単一細胞を５μＬの Ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ に混合した後、４．８μＬの Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ および０．２μＬの Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ を混合して総液量を１０μＬとし、７５℃で１０分間インキュベートした後、さらに９５℃で４分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムＤＮＡを調製した。
［プライマーセットの設計］
〈ローカスの選択〉
１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上のローカスからＰＣＲにより増幅するローカスを選択した。
選択したローカスを表８（１３番染色体、１８１箇所）、表９（１８番染色体、１７８箇所）、表１０（２１番染色体、１８８箇所）、表１１（Ｘ染色体、５１箇所）、および表１２（Ｙ染色体、４９箇所）に示す。
〈ローカスの選択〉
１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上のローカスからＰＣＲにより増幅するローカスを選択した。
選択したローカスを表８（１３番染色体、１８１箇所）、表９（１８番染色体、１７８箇所）、表１０（２１番染色体、１８８箇所）、表１１（Ｘ染色体、５１箇所）、および表１２（Ｙ染色体、４９箇所）に示す。
〈プライマーセットの作製〉
選択したローカスのそれぞれを含む標的ローカスをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを、上述した本発明のプライマーセットの設計方法に従って設計し、選抜し、採用した。
選択したローカスのそれぞれを含む標的ローカスをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットを、上述した本発明のプライマーセットの設計方法に従って設計し、選抜し、採用した。
１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上の各標的ローカスをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットとして採用したもののうち、それぞれ２０組について、プライマー名、塩基配列および配列番号を表１３〜表１７に示す。
プライマーセットを設計する際には、増幅産物のサイズを１４０ｂｐ〜１８０ｂｐ、Ｔｍ値を６０℃〜７０℃、およびプライマーの相補部分の長さを２０ｍｅｒに設定した。
なお、プライマーセットの選抜は、表１に示すスコアリング・システムによりスコアを計算し、ローカルアラインメントスコアおよびグローバルアラインメントスコアの閾値を、いずれも「＋３」として、選抜を行った。
プライマーセットを設計する際には、増幅産物のサイズを１４０ｂｐ〜１８０ｂｐ、Ｔｍ値を６０℃〜７０℃、およびプライマーの相補部分の長さを２０ｍｅｒに設定した。
なお、プライマーセットの選抜は、表１に示すスコアリング・システムによりスコアを計算し、ローカルアラインメントスコアおよびグローバルアラインメントスコアの閾値を、いずれも「＋３」として、選抜を行った。
また、配列番号１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２の塩基配列からなるプライマーの、本発明のプライマーセットの設計方法に従った、３’末端を含む条件の下に行ったローカルアラインメントおよびローカルアラインメントスコア、ならびにプライマーの３’末端３塩基に対するグローバルアラインメントおよびグローバルアラインメントスコアを図２に示す。
図２に示すとおり、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−８」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
図２に示すとおり、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−８」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
また、配列番号２１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２の塩基配列からなるプライマーの、本発明のプライマーセットの設計方法に従った、３’末端を含む条件の下に行ったローカルアラインメントおよびローカルアラインメントスコア、ならびにプライマーの３’末端３塩基に対するグローバルアラインメントおよびグローバルアラインメントスコアを図３に示す。
図３に示すとおり、配列番号２１の塩基配列と配列番号２２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−７」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
図３に示すとおり、配列番号２１の塩基配列と配列番号２２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−７」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
また、配列番号４１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４２の塩基配列からなるプライマーの、本発明のプライマーセットの設計方法に従った、３’末端を含む条件の下に行ったローカルアラインメントおよびローカルアラインメントスコア、ならびにプライマーの３’末端３塩基に対するグローバルアラインメントおよびグローバルアラインメントスコアを図４に示す。
図４に示すとおり、配列番号４１の塩基配列と配列番号４２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−３」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
図４に示すとおり、配列番号４１の塩基配列と配列番号４２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−３」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
また、配列番号６１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６２の塩基配列からなるプライマーの、本発明のプライマーセットの設計方法に従った、３’末端を含む条件の下に行ったローカルアラインメントおよびローカルアラインメントスコア、ならびにプライマーの３’末端３塩基に対するグローバルアラインメントおよびグローバルアラインメントスコアを図５に示す。
図５に示すとおり、配列番号６１の塩基配列と配列番号６２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−４」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
図５に示すとおり、配列番号６１の塩基配列と配列番号６２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−４」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
また、配列番号８１の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８２の塩基配列からなるプライマーの、本発明のプライマーセットの設計方法に従った、３’末端を含む条件の下に行ったローカルアラインメントおよびローカルアラインメントスコア、ならびにプライマーの３’末端３塩基に対するグローバルアラインメントおよびグローバルアラインメントスコアを図６に示す。
図６に示すとおり、配列番号８１の塩基配列と配列番号８２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−４」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
図６に示すとおり、配列番号８１の塩基配列と配列番号８２の塩基配列は、ローカルラインメントスコアが「−４」、グローバルアラインメントが「−３」であり、いずれも設定した閾値未満であった。
〈シングルプレックスＰＣＲによる増幅の確認〉
作製したプライマーセットが標的ローカスを増幅できることを確認するため、以下の手順によりシングルプレックスＰＣＲを行い、増幅の確認を行った。
多数の細胞（Ｙ染色体を持つ細胞を含む）から調製したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ） ２μＬ、プライマーミックス ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２（タカラバイオ社製） １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１（タカラバイオ社製） ０．１２５μＬ、および水 適量を混合して、最終液量 ２５μＬの反応溶液を調製した。
なお、上記プライマーミックスはプライマーセットの各プライマーを終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ６０秒を行った後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング６０℃ ９０秒、および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを３０サイクル繰り返して、シングルプレックスＰＣＲを行った。
シングルプレックスＰＣＲを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。
作製したプライマーセットが標的ローカスを増幅できることを確認するため、以下の手順によりシングルプレックスＰＣＲを行い、増幅の確認を行った。
多数の細胞（Ｙ染色体を持つ細胞を含む）から調製したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ） ２μＬ、プライマーミックス ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２（タカラバイオ社製） １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１（タカラバイオ社製） ０．１２５μＬ、および水 適量を混合して、最終液量 ２５μＬの反応溶液を調製した。
なお、上記プライマーミックスはプライマーセットの各プライマーを終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ６０秒を行った後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング６０℃ ９０秒、および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを３０サイクル繰り返して、シングルプレックスＰＣＲを行った。
シングルプレックスＰＣＲを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。
［実施例１］
〈アニーリング時間：９０秒〉
（マルチプレックスＰＣＲによる各標的ローカスの増幅）
抽出したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ） ２μＬ、プライマーミックス ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２（タカラバイオ社製） １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１（タカラバイオ社製） ０．１２５μＬ、および水 適量を混合して、最終液量 ２５μＬの反応溶液を調製した。
なお、上記プライマーミックスは、採用したすべてのプライマーセット（６４７セット）を各プライマーの終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ６０秒を行った後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング６０℃ ９０秒、および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを３５サイクル繰り返して、マルチプレックスＰＣＲを行った。
〈アニーリング時間：９０秒〉
（マルチプレックスＰＣＲによる各標的ローカスの増幅）
抽出したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ） ２μＬ、プライマーミックス ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２（タカラバイオ社製） １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１（タカラバイオ社製） ０．１２５μＬ、および水 適量を混合して、最終液量 ２５μＬの反応溶液を調製した。
なお、上記プライマーミックスは、採用したすべてのプライマーセット（６４７セット）を各プライマーの終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ６０秒を行った後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング６０℃ ９０秒、および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを３５サイクル繰り返して、マルチプレックスＰＣＲを行った。
〈ＤＮＡシーケンシング〉
（ＰＣＲ増幅産物の精製）
マルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ増幅産物を、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，キアゲン社製）を用いて精製した。また、ＰＣＲ増幅産物は、磁気ビーズ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ，ベックマンコールター社製）を用いて精製してもよい。
（ＰＣＲ増幅産物の精製）
マルチプレックスＰＣＲにより得られたＰＣＲ増幅産物を、スピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，キアゲン社製）を用いて精製した。また、ＰＣＲ増幅産物は、磁気ビーズ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ，ベックマンコールター社製）を用いて精製してもよい。
（インデックス配列およびフローセル結合用配列の付加）
次に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列およびフローセル結合用Ｐ５、Ｐ７配列をＰＣＲ増幅産物の両末端に付加した。プライマーとしては、表１８に示すＤ５０１−Ｆ（配列番号１０１）、Ｄ７０１−Ｒ（配列番号１０２）、Ｄ７０２−Ｒ（配列番号１０３）、Ｄ７０３−Ｒ（配列番号１０４）、Ｄ７０４−Ｒ（配列番号１０５）、Ｄ７０５−Ｒ（配列番号１０６）およびＤ７０６−Ｒ（配列番号１０７）を各１．２５μＭ、マルチプレックスＰＣＲによるＰＣＲ増幅産物、マルチプレックスＰＣＲミックス１、マルチプレックスＰＣＲミックス２および水と混合して反応溶液を調製した。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ３分の後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング５０℃ ６０秒および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを５サイクル、さらに、熱変性９４℃ ４５秒、アニーリング ５５℃ ６０秒および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを１１サイクル行った。なお、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
次に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列およびフローセル結合用Ｐ５、Ｐ７配列をＰＣＲ増幅産物の両末端に付加した。プライマーとしては、表１８に示すＤ５０１−Ｆ（配列番号１０１）、Ｄ７０１−Ｒ（配列番号１０２）、Ｄ７０２−Ｒ（配列番号１０３）、Ｄ７０３−Ｒ（配列番号１０４）、Ｄ７０４−Ｒ（配列番号１０５）、Ｄ７０５−Ｒ（配列番号１０６）およびＤ７０６−Ｒ（配列番号１０７）を各１．２５μＭ、マルチプレックスＰＣＲによるＰＣＲ増幅産物、マルチプレックスＰＣＲミックス１、マルチプレックスＰＣＲミックス２および水と混合して反応溶液を調製した。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃ ３分の後、熱変性９４℃ ３０秒、アニーリング５０℃ ６０秒および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを５サイクル、さらに、熱変性９４℃ ４５秒、アニーリング ５５℃ ６０秒および伸長反応７２℃ ３０秒のサーマルサイクルを１１サイクル行った。なお、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
マルチプレックスＰＣＲによるＰＣＲ増幅産物を、ＤＮＡ精製試薬キットＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマンコールター社製）を用いて精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて濃度を測定した。
より正確な増幅産物の定量として、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス社製）を用いて定量を行った。
より正確な増幅産物の定量として、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス社製）を用いて定量を行った。
（配列リード数（カバレッジ、シーケンスデプス）の測定）
マルチプレックスＰＣＲ増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の１３番番染色体、１８番染色体、および２１番染色体の標的ローカスごとのカバレッジ（シーケンスデプス）を、次世代シーケンサＭｉＳｅｑ（登録商標；イルミナ社製）を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。別途、母親由来と同定された有核細胞の２１番染色体の標的ローカスの増幅産物の量（配列リード数）を、ＭｉＳｅｑを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。
図７には、カバレッジ（シーケンスデプス）を横軸に、その割合を縦軸にとって作成したグラフ（ヒストグラム）を示す。なお、ヒストグラムの第１区間はカバレッジ＝０、第２区間はカバレッジ＝１、第３区間はカバレッジ＝２、第４区間はカバレッジ＝３〜４、第５区間はカバレッジ＝５〜８、第６区間はカバレッジ＝９〜１６、第７区間はカバレッジ＝１７〜３２、第８区間はカバレッジ＝３３〜６４、第９区間はカバレッジ＝６５〜１２８、第１０区間はカバレッジ＝１２９〜２５６、第１１区間はカバレッジ＝２５７〜１０２３、第１２区間はカバレッジ＝１０２５〜２０４８、第１３区間はカバレッジ＝２０４９〜４０９６、第１４区間はカバレッジ＝４０９７〜８１９２、第１５区間はカバレッジ＝８１９３〜１４３８４である。
マルチプレックスＰＣＲ増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の１３番番染色体、１８番染色体、および２１番染色体の標的ローカスごとのカバレッジ（シーケンスデプス）を、次世代シーケンサＭｉＳｅｑ（登録商標；イルミナ社製）を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。別途、母親由来と同定された有核細胞の２１番染色体の標的ローカスの増幅産物の量（配列リード数）を、ＭｉＳｅｑを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。
図７には、カバレッジ（シーケンスデプス）を横軸に、その割合を縦軸にとって作成したグラフ（ヒストグラム）を示す。なお、ヒストグラムの第１区間はカバレッジ＝０、第２区間はカバレッジ＝１、第３区間はカバレッジ＝２、第４区間はカバレッジ＝３〜４、第５区間はカバレッジ＝５〜８、第６区間はカバレッジ＝９〜１６、第７区間はカバレッジ＝１７〜３２、第８区間はカバレッジ＝３３〜６４、第９区間はカバレッジ＝６５〜１２８、第１０区間はカバレッジ＝１２９〜２５６、第１１区間はカバレッジ＝２５７〜１０２３、第１２区間はカバレッジ＝１０２５〜２０４８、第１３区間はカバレッジ＝２０４９〜４０９６、第１４区間はカバレッジ＝４０９７〜８１９２、第１５区間はカバレッジ＝８１９３〜１４３８４である。
［実施例２］
〈アニーリング時間：１８０秒〉
アニーリング時間を１８０秒に変更した点を除き、実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを実施し、次世代シーケンサ（ＭｉＳｅｑ，イルミナ社製）を用いてシーケンシングを行い、各標的ローカスのカバレッジ（リード・デプス）を計測し、カバレッジの範囲ごとにその割合を算出した。結果を図８のグラフ（ヒストグラム）に示す。
〈アニーリング時間：１８０秒〉
アニーリング時間を１８０秒に変更した点を除き、実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡを鋳型としてマルチプレックスＰＣＲを実施し、次世代シーケンサ（ＭｉＳｅｑ，イルミナ社製）を用いてシーケンシングを行い、各標的ローカスのカバレッジ（リード・デプス）を計測し、カバレッジの範囲ごとにその割合を算出した。結果を図８のグラフ（ヒストグラム）に示す。
［実施例３］
〈アニーリング時間：３００秒〉
アニーリング時間を３００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図９のグラフ（ヒストグラム）に示す。
〈アニーリング時間：３００秒〉
アニーリング時間を３００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図９のグラフ（ヒストグラム）に示す。
［実施例４］
〈アニーリング時間：６００秒〉
アニーリング時間を６００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１０のグラフ（ヒストグラム）に示す。
〈アニーリング時間：６００秒〉
アニーリング時間を６００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１０のグラフ（ヒストグラム）に示す。
［実施例５］
〈アニーリング時間：９００秒〉
アニーリング時間を９００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１１のグラフ（ヒストグラム）に示す。
〈アニーリング時間：９００秒〉
アニーリング時間を９００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１１のグラフ（ヒストグラム）に示す。
［実施例６］
〈アニーリング時間：１２００秒〉
アニーリング時間を９０秒から１２００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１２のグラフ（ヒストグラム）に示す。
〈アニーリング時間：１２００秒〉
アニーリング時間を９０秒から１２００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１２のグラフ（ヒストグラム）に示す。
［比較例１］
〈アニーリング時間：１５００秒〉
アニーリング時間を９０秒から１５００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１３のグラフ（ヒストグラム）に示す。
カバレッジ＝０（シーケンスリード＝０）が全体の５０％以上を占め、かつ、カバレッジ≦４に９５％以上が分布した。
アニーリング時間１５００秒では、染色体数を精度よく定量できるデータが得られないことがわかる。
〈アニーリング時間：１５００秒〉
アニーリング時間を９０秒から１５００秒に変更した点を除いて、実施例１と同様にした。結果を図１３のグラフ（ヒストグラム）に示す。
カバレッジ＝０（シーケンスリード＝０）が全体の５０％以上を占め、かつ、カバレッジ≦４に９５％以上が分布した。
アニーリング時間１５００秒では、染色体数を精度よく定量できるデータが得られないことがわかる。
［実施例１〜６および比較例１の対比］
図１４に、実施例１〜６および比較例１のカバレッジと割合をまとめた三次元円柱グラフを示す。横軸はカバレッジ（シーケンスデプス）を、縦軸は割合を、奥行きは実施例１〜６および比較例１を、それぞれ表す。
比較例１はアニーリング時間を１５００秒とした例である。図１３に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきは小さいが、低カバレッジに集中している。したがって、比較例１では、染色体数を精度よく定量することはできないと考えられる。
実施例１はアニーリング時間を９０秒とした例である。図７に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ：coefficient of variation）が小さく、カバレッジ（階級）＝４および８において割合が極大となっている。この結果から、実施例１では、染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例２はアニーリング時間を１８０秒とした例である。図８に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例１よりも小さく、カバレッジ（階級）＝６４において割合が最大となっている。この結果から、実施例２では、実施例１よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例３はアニーリング時間を３００秒とした例である。図９に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例２よりも小さく、カバレッジ（階級）＝２５６において割合が最大となっている。この結果から、実施例３では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例４はアニーリング時間を６００秒とした例である。図１０に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例３よりも小さく、カバレッジ（階級）＝１２８において割合が最大となっている。この結果から、実施例４では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例５はアニーリング時間を９００秒とした例である。図１１に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例４よりも小さく、カバレッジ（階級）＝６４において割合が最大となっている。この結果から、実施例５では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例６はアニーリング時間を１２００秒とした例である。図１２に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例３よりも小さく、カバレッジ（階級）＝８において割合が最大となっている。この結果から、実施例５では、実施例１よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
これらの結果を検討したところでは、アニーリング時間を、９０秒以上１５００秒未満、好ましくは９０秒以上１２００秒以下、より好ましくは３００秒以上９００秒以下、さらに好ましくは４５０秒以上９００秒以下に設定することにより、より精度よく、染色体数を定量することができると考えられる。アニーリング時間は９０秒以上１５００秒未満でとし、９０秒以上１２００秒以下が好ましく、３００秒以上９００秒以下がより好ましく、４５０秒以上９００秒以下がさらに好ましいと考えられる。
データが高カバレッジ側に集中し、ばらつきが少ないほど、より精度よく、染色体数を定量することができる。
図１４に、実施例１〜６および比較例１のカバレッジと割合をまとめた三次元円柱グラフを示す。横軸はカバレッジ（シーケンスデプス）を、縦軸は割合を、奥行きは実施例１〜６および比較例１を、それぞれ表す。
比較例１はアニーリング時間を１５００秒とした例である。図１３に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきは小さいが、低カバレッジに集中している。したがって、比較例１では、染色体数を精度よく定量することはできないと考えられる。
実施例１はアニーリング時間を９０秒とした例である。図７に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ：coefficient of variation）が小さく、カバレッジ（階級）＝４および８において割合が極大となっている。この結果から、実施例１では、染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例２はアニーリング時間を１８０秒とした例である。図８に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例１よりも小さく、カバレッジ（階級）＝６４において割合が最大となっている。この結果から、実施例２では、実施例１よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例３はアニーリング時間を３００秒とした例である。図９に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例２よりも小さく、カバレッジ（階級）＝２５６において割合が最大となっている。この結果から、実施例３では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例４はアニーリング時間を６００秒とした例である。図１０に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例３よりも小さく、カバレッジ（階級）＝１２８において割合が最大となっている。この結果から、実施例４では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例５はアニーリング時間を９００秒とした例である。図１１に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例４よりも小さく、カバレッジ（階級）＝６４において割合が最大となっている。この結果から、実施例５では、実施例２よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
実施例６はアニーリング時間を１２００秒とした例である。図１２に示すグラフ（ヒストグラム）を参照すると、カバレッジのばらつきを示す変動係数（ＣＶ）が実施例３よりも小さく、カバレッジ（階級）＝８において割合が最大となっている。この結果から、実施例５では、実施例１よりも染色体数を精度よく定量することができると考えられる。
これらの結果を検討したところでは、アニーリング時間を、９０秒以上１５００秒未満、好ましくは９０秒以上１２００秒以下、より好ましくは３００秒以上９００秒以下、さらに好ましくは４５０秒以上９００秒以下に設定することにより、より精度よく、染色体数を定量することができると考えられる。アニーリング時間は９０秒以上１５００秒未満でとし、９０秒以上１２００秒以下が好ましく、３００秒以上９００秒以下がより好ましく、４５０秒以上９００秒以下がさらに好ましいと考えられる。
データが高カバレッジ側に集中し、ばらつきが少ないほど、より精度よく、染色体数を定量することができる。
Claims (8)
- 単一または少数の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、染色体上の複数のローカスを同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う工程を含む染色体数定量方法であって、
前記マルチプレックスＰＣＲは、熱変性、アニーリングおよび伸長を含む複数のサーマルサイクルを含み、
前記複数のサーマルサイクルのうち少なくとも１サイクルにおいてアニーリング時間が９０秒以上１５００秒未満であり、かつ、
前記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用される複数のプライマーセットは、
前記複数のローカスから前記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する標的ローカスを選択する、標的ローカス選択工程と、
前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における前記標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、プライマー候補塩基配列作成工程と、
前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、ローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１段階選抜工程と、
前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、グローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２段階選抜工程と、
前記第１段階選抜工程および前記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列の塩基配列を、前記標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、プライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第１段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、染色体数定量方法。 - 前記アニーリング時間が９０秒以上１２００秒以下である、請求項１に記載の染色体数定量方法。
- 前記アニーリング時間が３００秒以上９００秒以下である、請求項１または２に記載の染色体数定量方法。
- 前記アニーリング時間が４５０秒以上９００秒以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の染色体数定量方法。
- 前記染色体が、１３番染色体、１８番染色体および２１番染色体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の染色体数定量方法。
- 前記複数のローカスのすべてに対してマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで、前記標的ローカス選択工程から前記プライマー採用工程までを繰り返す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の染色体数定量方法。
- 前記標的ローカス選択工程において１または２以上のローカスを選択する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の染色体数定量方法。
- 前記マルチプレックスＰＣＲにおいて使用するプライマーセットは、
前記複数のローカスから前記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第１の標的ローカスを選択する、第１の標的ローカス選択工程と、
前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における前記第１の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
前記第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
前記第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
前記第１の第１段階選抜工程および前記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
前記複数のローカスから、既に選択された標的ローカスとは異なる、前記マルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットを設計する第２の標的ローカスを選択する、第２の標的ローカス選択工程と、
前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、染色体上における前記第２の標的ローカスの近傍領域の塩基配列に基づいて、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのそれぞれについて、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
前記第２のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
前記第２のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
前記第２の第１段階選抜工程および前記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の標的ローカスを増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記第１のローカルアラインメント工程および前記第１の第１段階選抜工程の両工程は、前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第２のローカルアラインメント工程および前記第２の第１段階選抜工程の両工程は、前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記複数のローカスの数が３以上である場合は、前記第２の標的ローカス選択工程から前記第２のプライマー採用工程までの各工程を、前記複数のローカスのすべてについてマルチプレックスＰＣＲに供するプライマーセットが採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の染色体数定量方法。
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