JP2022536121A - Ｆａｃｓを用いた胎児細胞の単離 - Google Patents

Abstract

本発明は、妊婦に由来する血液試料などの試料から胎児細胞を単離するための自動化された方法に関する。単離された胎児細胞は、胎児ＤＮＡにおける遺伝的異常を特定するために用いることができる。【選択図】なし

Description

本発明は、妊婦に由来する血液試料などの試料から胎児細胞を単離するための自動化された方法に関する。単離された胎児細胞は、胎児ＤＮＡにおける遺伝的異常を特定するために用いることができる。

妊娠中に、胎盤の胎児細胞が母体血液循環に侵入することがある。これらの胎児細胞のほとんどは、胎盤に由来する栄養膜細胞、血管内栄養膜細胞または絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）である。母体循環に侵入するこれらの胎児細胞は、内皮および上皮の両方の特徴を示す。それにより上皮性栄養膜細胞が特性を変化させ母体循環に侵入する過程を、上皮間葉転換（ＥＭＴ）とよぶ。

ＥＭＴは、それにより上皮細胞が次第にその上皮的特性を失い間葉類似の表現型を獲得する過程である。ＥＭＴは、胚上皮細胞の移動および一過性脱分化が例えば神経管の形成に必要とされる、初期胚発生において説明されている。

中胚葉マーカー（すなわち内皮マーカー）を正の選択マーカーとして用いることによって、母体血液試料にごく少数含まれる胎児細胞は、いくらかの母体細胞と共に濃縮される。、胎児細胞の陽性識別をその後、濃縮された細胞を上皮マーカーに接触させること（それによりＥＭＴ現象を利用する）により行う。血液試料に存在するいずれの正常母体細胞も、上皮マーカーを発現していない。

図２Ａに示すような先行技術の方法では、母体血液試料を処理し、その後濃縮して大部分の母体細胞を除去する。次に、細胞を、蛍光標識した母性マーカーおよび胎児性マーカーで染色し、スライド上で走査する。後者の過程は、母体血液試料中のごく低い胎児細胞の存在率を考慮して、冗漫で時間がかかる。

一局面において、本発明は、妊婦の生物学的試料から胎児細胞を単離する方法に関し、方法は：
（ａ）上記の妊婦由来の生物学的試料を提供する工程であって、生物学的試料が、細胞画分を含む、工程；
（ｂ）上記の細胞画分に含まれる細胞を、少なくとも１個の胎児細胞上皮マーカーおよび／または内皮マーカーに対する１種類以上の蛍光標識物質と接触させる工程；
（ｃ）細胞に結合した１種類以上の蛍光標識物質の検出に基づき蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、上記の細胞を選別する工程；
および
（ｄ）個々の選別細胞に胎児由来識別子を割り振る工程を含む、選別細胞中の胎児細胞を識別する工程、
を含む。

発明者らは、ＦＡＣＳを用いて単一細胞選別し、かつ次に蛍光標識された１種類以上の抗体の複数のパラメーター（散乱およびシグナルなど）に関するＦＡＣＳの結果を簡易に解析することにより胎児性である確率の高い細胞を識別することが可能であるという、意外な観察結果を得た。ＦＡＣＳの結果は、数値スコアであってもバイナリーであってもよい識別子と組み合わせることができる。本発明の方法を用いて、発明者らは、選別細胞中の胎児細胞を識別できる可能性の非常に高い方法を開発した。

従来技術の方法より有利な点が、図１に示され、主たる利点は、過程を完全自動化し得ること、および胎児細胞である可能性が高いと同定された細胞を単離する必要がないことである。

識別された細胞は、遺伝子解析により胎児細胞であると確認でき、かつ細胞の遺伝的異常を特定するために更に利用できる。

さらなる一局面において、本発明は、胎児における遺伝的異常を決定する方法に関し、方法は：
（ａ）本発明の方法によって単離される１個以上の胎児細胞を取得する工程；
および
（ｂ）胎児細胞のゲノム中の遺伝的異常に関連する１種類以上の遺伝マーカーを検出する工程、
を含む。

胎児細胞の濃縮および単離にＦＡＣＳを用いることの論拠。Ａ）＝この工程後の胎児細胞へのアクセスは時間と労力がかかりり、処理効率を低下させる。Ｂ）＝この工程後の胎児細胞へのアクセスはより速く、母体細胞の混入リスクは低い。しかし、未だヒトの介入が必要である。Ｃ）＝胎児細胞を物理的に取り出さない。９６穴プレート当たり１細胞で、その後に単一細胞解析を行う。 ＦＡＣＳを用いない胎児細胞濃縮（Ａ）およびＦＡＣＳを用いる胎児細胞濃縮（Ｂ）。Ａ．１およびＢ．１＝サンプリング、Ａ．２およびＢ．２＝血液処理、Ａ．３およびＢ．３＝選択、濃縮および染色、Ａ４．およびＢ．５＝走査、および胎児細胞の「取り出し」ならびにＢ．４＝ＦＡＣＳ。 ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｘ軸）（ＣＫ抗体）およびＰＥ（Ｙ軸）（ＣＤ１４＋ＣＤ４５）に関するＦＡＣＳプロットにおけるゲート１のＸおよびＹ座標。５つの座標のうち、対角線を結ぶ２つは固定されておらず、ｘ軸およびｙ軸において一定範囲を有する。 ＦＡＣＳを用いる単一細胞選別およびＳＴＲ分析を用いるそれらの解析。Ａ）＝サンプリング、Ｂ）＝血液処理、Ｃ＝選択、濃縮および染色、Ｄ）＝ＦＡＣＳ、ならびにＥ）＝ＡＢＩ３５００（ＳＴＲ分析） ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｘ軸）（ＣＫ抗体）およびＰＥ（Ｙ軸）（ＣＤ１４＋ＣＤ４５）に関するＦＡＣＳプロットにおけるゲートＧ７のＸおよびＹ座標。ゲートＧ７を用いて、個々のチューブに個別に単一細胞を選別した。 単一選別細胞に関するＳＴＲ分析の編集データ。図中の割合（％）は、各試料からの個々の割合（％）の平均である。Ａ）＝母体細胞、Ｂ）＝胎児細胞、Ｃ）＝胎児細胞＋母体細胞、Ｄ）＝無細胞、およびＥ）＝他の混入 胎児細胞の濃縮、識別、およびＦＡＣＳを用いた細胞の単一選別後の分析の完全実施のワークフロー。Ａ）＝サンプリング、Ｂ）＝血液処理、Ｃ＝選択、濃縮および染色、Ｄ）＝ＦＡＣＳ、Ｅ）＝全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、Ｆ）＝ＡＢＩ３５００（ＳＴＲ分析）、ならびにＧ）＝アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション。 ゲーティング方略。Ａ）全イベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびＳＳＣ－Ａ（Ｙ軸）。高ＳＳＣ値のイベント（デブリ（細胞片））を除外した。Ｂ）低ＳＳＣイベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびヘキスト（Ｙ軸）。残りの細胞を次に、ヘキスト^＋細胞についてゲートした。Ｃ）ヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。ヘキスト^＋画分から、ＣＫ^＋ＣＤ４５^－ＣＤ１４^－細胞を、単一細胞選別した。 第１選別のゲーティング方略。Ａ）全イベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびＳＳＣ－Ａ（Ｙ軸）。高ＳＳＣ値のイベント（デブリ）を除外した。Ｂ）低ＳＳＣイベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびヘキスト（Ｙ軸）。残りの細胞を次に、ヘキスト^＋細胞についてゲートした。Ｃ）ヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。ヘキスト^＋画分から、ＣＫ^{中程度～高}ＣＤ４５^－ＣＤ１４^－細胞を、濃縮工程としてバルク選別した。 第２選別のゲーティング方略。Ａ）全イベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびＳＳＣ－Ａ（Ｙ軸）。高ＳＳＣ値のイベント（デブリ）を除外した。Ｂ）低ＳＳＣイベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびヘキスト（Ｙ軸）。残りの細胞を次に、ヘキスト^＋細胞についてゲートした。Ｃ）ヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。ヘキスト^＋画分から、ＣＫ^高ＣＤ４５^－ＣＤ１４^－細胞を、単一細胞選別した。 試料３０９１－Ｂに関する第１選別のゲーティング方略。Ａ）全イベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびＳＳＣ－Ａ（Ｙ軸）。高ＳＳＣ値のイベント（デブリ）を除外した。Ｂ）低ＳＳＣイベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびヘキスト（Ｙ軸）。残りの細胞を次に、ヘキスト^＋細胞についてゲートした。Ｃ）ヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。濃縮工程として、ヘキスト^＋画分から、ＣＤ１４１＋ＣＤ１０５^{中程度～高}ＣＤ４５^－ＣＤ１４^－細胞を、バルク選別した。 試料３０９１－Ｂに関する第２選別のゲーティング方略。Ａ）全イベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびＳＳＣ－Ａ（Ｙ軸）。高ＳＳＣ値のイベント（デブリ）を除外した。Ｂ）低ＳＳＣイベント、ＦＳＣ－Ａ（Ｘ軸）およびヘキスト（Ｙ軸）。残りの細胞を次に、ヘキスト^＋細胞についてゲートした。Ｃ）ヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。ヘキスト^＋画分から、ＣＤ１４１＋ＣＤ１０５^高ＣＤ４５^－ＣＤ１４^－細胞を、単一細胞選別した。 第２選別のゲーティング方略。Ａ）低ＳＳＣイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。試料ＡＡＬ３０２－Ｂに関する第２の選別。ヘキスト、ＣＤ４５およびＣＤ１４を添加しなかった。Ｂ）低ＳＳＣおよびヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。試料ＡＡＬ３０２－Ａに関する第２選別。ヘキストを添加したが、ＣＤ４５およびＣＤ１４は添加しなかった。 第２選別のゲーティング方略。Ａ）低ＳＳＣおよびヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。試料ＫＯ３８１に関する第２選別；ここでＣＤ４５は非添加。Ｂ）低ＳＳＣおよびヘキストイベント、ＡＦ４８８（Ｘ軸）およびＡＦ５５５（Ｙ軸）。試料ＫＯ３８０に関する第２選別；ここでＣＤ１４は添加しなかった。

母体血液試料からの胎児細胞単離に関する課題を、図１に示す。通常、３０ｍＬの血液試料は、赤血球溶血後におおよそ１５０ｍｉｏ（１５０ｘ１０^６）細胞を含む。これらを、本明細書中に記載の濃縮法を用いて、胎児細胞について濃縮できる。これは、おおよそ２５０，０００細胞を含む試料をもたらす。これらの中にはごく少数の胎児細胞しか存在しないので、胎児細胞の用手スクリーニングまたはスライド上での細胞の選定は、多大な時間と労力を必要とする方法である。

そのような方法の一例を、図２Ａのフロー図に示す；血液試料を取得し、試料を処理し濃縮する。残りの細胞をスライド上にスポットし、用手法および半自動的方法の組み合わせを用いて顕微鏡で走査し選定する。

本明細書中の実施例の一つは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を利用して、胎児細胞についてこの集団をさらに濃縮して、個々に検査する細胞の数を数千個の細胞にさらに減らせることを、示している。この方法のフロー図を、図２Ｂに示す。

発明者らは、濃縮した母体血液試料から胎児細胞を単一選別できるという意外な発見をした。したがって発明はまた、出生前診断の方法に関し、方法は：
（１）細胞画分を含む、胎児を身ごもっている女性由来の血液試料を提供する工程；
（２）試料を胎児細胞に関して濃縮する工程；
（３）試料を：
（ｉ）核に対する蛍光標識物質；
（ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質；
および
（ｉｉｉ）胎児細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
の群のそれぞれから選択される少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程；
（４）濃縮試料から蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で少なくとも１個の胎児細胞を単一細胞選別する工程であって、
（ｉ）胎児細胞マーカーに対する蛍光標識物質の正の選択；
（ｉｉ）核に対する蛍光標識物質の正の選択；
および
（ｉｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質の負の選択、
に基づく、工程；
（５）選別細胞中の少なくとも１個の胎児栄養膜細胞を識別する工程であって、胎児栄養膜細胞から遺伝子型を取得することにより胎児起源識別子を個別に選別された細胞に割り振る工程を含む、工程、
および
（６）胎児の表現型を診断する工程、
を含む。

ＭＡＣＳを用いた濃縮の目的は、ＦＡＣＳ機に供する細胞の数を減らすことである（濃縮がおおよそ１５０ｍｉｏ個からおおよそ２５０．０００個へと細胞数を少させることを示す図１を参照のこと）。ＭＡＣＳ濃縮の実施は、非濃縮試料からの胎児細胞の識別が可能であることを実証する実施例に示されるように、不要である。これは単に、ＦＡＣＳ機におけるイベント数をかなり増やす。より具体的には、実施例３は、ＦＡＣＳを用いて胎児細胞に関し試料を濃縮できることを示している。

磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）は、それらの表面抗原（ＣＤ分子）に応じて様々な細胞集団を分離する方法である。

他の実施態様において、ＭＡＣＳは、例えば上皮マーカーに対するマイクロビーズ（サイトケラチンマイクロビーズなど）を用いてなど、細胞内標的に対し用いられる。

Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳシステムは、超常磁性ナノ粒子およびカラムを利用する。超常磁性ナノ粒子は、１００ｎｍのオーダーのものである。それらは、カラム内部でそれらを捕捉するために、標的細胞をタグ付けするために用いられる。カラムを永久磁石間に設置し、これにより磁性粒子細胞複合体がそこを通過するときに標識細胞が捕捉され得る。カラムは、鋼綿から成り、これは、磁場勾配を、カラムが永久磁石間に設置されたときに分離効率を最大化するように増加させる。

磁気活性化細胞選別は、しばしばマイクロビーズと組み合わせて一般に利用される方法であり、マイクロビーズは、特定の細胞を標的化するために利用できる、抗体にコンジュゲートされた磁気ナノ粒子である。磁気活性化細胞選別を利用して、所望の細胞について細胞集団を濃縮できる。磁性ナノ粒子は、標識物質に直接コンジュゲートされてよい。磁性ナノ粒子はまた、標識物質を結合できる他の物質にコンジュゲートされてもよい（２次標識）。

ＭＡＣＳを濃縮工程として選択した場合、この工程に先だって、細胞画分に含まれる細胞を、胎児細胞マーカーに対する少なくとも１種類の磁気標識で標識した物質と接触させる工程を実施することが好ましい。

本開示の一実施態様において、試料を、１種類以上の内皮マーカーに特異的な標識物質で標識された細胞を選択することによって、胎児細胞に関して濃縮する。内皮マーカーの例は、本明細書中の下でさらに記載される。

本開示の一実施態様において、試料を、１種類以上の上皮マーカーに特異的な標識物質で標識された細胞を選択することによって、胎児細胞に関して濃縮する。上皮マーカーの例には、本明細書中の下でさらに記載される。

上皮マーカーが、試料中の胎児細胞の濃縮のために、用いられてよい。濃縮は、固体表面への抗体固定化を利用して行われてよい。

細胞選別は、特異的物理特性の存在または非存在に基づき細胞集団を精製するために用いられる方法である。選別能を有するフローサイトメーターでは、機器は、細胞のサイズ、形態、および蛋白質発現を含むパラメーターを用いて細胞を検出し、次に液滴技術により細胞を選別し、次の実験用途のために細胞のサブセットを回収する。

フローサイトメトリーの細胞ソーターは、フローサイトメトリー分析装置とは異なり収集システムを有する。収集工程は、試料が、フローセルを通過するシース液の液流中に注入されレーザーが照射されると始まる。液流が次に、振動ノズルを通過して細胞を運ぶ。液流中の撹乱は、理想的には１個の細胞を含む液滴へとそれを分離する。帯電リングが、ちょうど液流が砕けて液滴になる位置に設置される。電荷が、蛍光強度が測定される直前に置かれるリングにかけられ、反対電荷が、液流から砕ける液滴上で捕捉される。帯電した液滴はその後、静電偏向システムを通って落下し、システムは、それらの電荷に基づいて液滴を容器に選り分ける。いくつかのシステムでは、電荷が液流に直接適用され、離脱する液滴は、液流と同じ符号の電荷を保持する。液流は次いで、液滴が離脱した後に中性に戻る。

滅菌条件下で収集されるならば、選別細胞を、さらに培養、操作、および試験できる。

そのようなＦＡＣＳでの選別は、単一細胞選別およびバルク選別のいずれであってもよく、廃棄され所定の閾値を示さない細胞は…

ゲートを設定してＦＡＣＳ機がどのように細胞を選別するのかを規定する。設定に合致する細胞は、選別され、ゲート設定外の細胞は、後の試験のために選別されるかあるいは廃棄される。ユーザーがどのようにＦＡＣＳ機を設定したかに応じて、選別は、バルク選別または単一細胞選別のいずれかであってよい。バルク選別は、所定のゲート設定内の細胞が同じチューブ中に収集されるようにする。単一細胞選別は、所定の設定内の細胞が収集チューブに個々に選別されるようにする。単一細胞選別は多くの場合、実施例５に例示するように、バルク選別よりも多くの時間を要する。ＦＡＣＳ機は数千細胞／秒で選別できるので、異なる設定は、実験に応じてかなり異なる。単一細胞コンパートメントへの選別では、９６穴プレートなどの、低い出力を必要とする。対照的に、バルク選別を用いる場合には、チューブ当たり数千個の細胞を選別できる。

本発明の一実施態様において、試料を濃縮するためにバルク選別を用いる。別の一実施態様において、細胞を単一細胞選別する（例えば単一細胞コンパートメントへの選別など）ために単一細胞選別を用いる。

実験のゲーティング方略に依存して、まずバルク選別を用い次に単一選別することにより、試料に添加するのに必要とされる物質の量ならびに実験時間を削減できる。そのようなパラメーターは好適には、前方散乱、側方散乱、およびフローサイトメーター内のレーザーにより励起された蛍光色素分子から放射される蛍光などの定量化を含む。

前方散乱は、物体が引き起こしかつ細胞のサイズと通常相関する、光路方向における乱れであると理解される。

側方散乱は、光路方向から反射されかつ光路方向の粒状体の量に通常相関する、光であると理解される。

放射蛍光は、レーザーなどの光源が試料上に存在する蛍光色素分子を励起し所定のレーザーおよび蛍光色素分子に適合する当業者に公知のフィルターを通過する際に、定量される。特定の励起波長および蛍光波長を有する蛍光色素分子について、当業者であれば好適な波長、ならびに好適な励起および吸収フィルターを有する光源を選択できる。

パラメーターがフローサイトメーターにより測定されると、細胞が、選別され得る。好適にはこれは、独立したコンパートメントに各細胞を選別することによって実施される。選別された細胞は好ましくは、少なくとも１種類の上皮マーカーおよび／または内皮マーカーを発現するが、血球に特異的な少なくとも１種類の細胞マーカーを発現しない細胞である。選別のために細胞を選択する方法の例は、特定ゲートが選別のために選択される実施例に記載されている。ゲートは、選別細胞数を比較的少数に保ちながら胎児細胞の選別可能性を最大化するように選択される。残りの（非選別の）細胞は、廃棄され、その理由は、それらが胎児細胞を含むと予想されないからである。

好ましい別の一実施態様において、ＦＡＣＳを濃縮に用い、ここで好ましくは選別細胞を、濃縮試料をＦＡＣＳで単一細胞選別する前に、単一のチューブに収集する。

一つの実施態様において、試料を、上皮マーカーのシグナルに基づいてＦＡＣＳで濃縮する。

別の一実施態様において、試料を、内皮マーカーのシグナルに基づいてＦＡＣＳで濃縮する。

したがって、濃縮工程としてＦＡＣＳを選択した場合、この工程に先だって細胞画分に含まれる細胞を、胎児細胞マーカーに対する少なくとも１種類の蛍光標識された物質に接触させる工程を実施することが好ましい。

濃縮工程に続いて、ＦＡＣＳによる単一細胞選別を実施する。好ましい一実施態様において、少なくとも１種類の上皮マーカーについて陽性であり、かつ少なくとも１種類の血球マーカーについて陰性または低値である細胞を、単一細胞コンパートメントに選別する。これを、図８のＣ）に例示する。

好ましい別の一実施態様において、細胞胎児マーカー、核マーカーに関する正のシグナルおよび母性マーカーに関する負のシグナルに基づいて、細胞を単一細胞コンパートメントに選別する。これを、図８のＢ）およびＣ）に例示する。

好ましい一実施態様において、試料を、濃縮および単一細胞選別に対する同じゲーティング方略を用いることにより、選別する。

別の一実施態様において、試料を、濃縮および単一細胞選別に対する同じゲーティング方略を用いることにより、濃縮および単一細胞選別とは異なるゲートサイズで、選別する。

本明細書中に開示の単離法は好ましくは、蛍光標識物質を用いて、胎児細胞および母体細胞を選択的に標識する。一つの実施態様では、方法は、母体細胞から胎児細胞を識別するために内皮マーカー、上皮マーカーおよび血球マーカーを用いることに依存し、デブリ（細胞片）から細胞を識別するためにさらに核染色を用いてもよい。

他の実施態様において、標識物質は、本発明において用いる方法で（ＭＡＣＳなど）固定化され得るものなどの、磁気標識物質である。

胎児マーカーは、１種類以上のサイトケラチン（ＣＫ）などの、１種類以上の上皮マーカーであってよい。サイトケラチン類は、上皮組織の細胞内細胞骨格に見出されるケラチン蛋白質である。サイトケラチン類は、４０～６８キロダルトンでサイズが異なる。それらは、中間フィラメントの重要な構成要素であり、細胞が機械的ストレスに抵抗するのを助ける。上皮細胞内でのこれらのサイトケラチン類の発現は、特定器官または組織にかなり特異的である。サイトケラチン類は、ヒト・サイトケラチン１（ＣＫ１）、ヒト・サイトケラチン２（ＣＫ２）、ヒト・サイトケラチン３（ＣＫ３）、ヒト・サイトケラチン４（ＣＫ４）、ヒト・サイトケラチン５（ＣＫ５）、ヒト・サイトケラチン６（ＣＫ６）、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン９（ＣＫ９）、ヒト・サイトケラチン１０（ＣＫ１０）、ヒト・サイトケラチン１３（ＣＫ１３）、ヒト・サイトケラチン１４（ＣＫ１４）、ヒト・サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、ヒト・サイトケラチン１６（ＣＫ１６）、ヒト・サイトケラチン１７（ＣＫ１７）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）から成る群から選択される。

好ましい実施態様において、サイトケラチンは、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９またはそれらの組み合わせである。

一つの実施態様において、上皮マーカーに対する標識物質は、汎ＣＫ標識物質である。汎ＣＫ標識物質は、１度に複数のサイトケラチン類を標的とする標識物質である。一つの実施態様において、汎ＣＫ標識物質は、５８、５６、５２、６０、５１、４８および６８キロダルトンの分子量を有するサイトケラチン類を標的とする。

好ましい実施態様において、標識物質は、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９を標的とする物質の組み合わせ、ならびに汎ＣＫ標識物質である。

異なるサイトケラチンマーカー間で区別する必要はないので、好適には異なるサイトケラチン類を標的とする蛍光標識物質は、同じ蛍光色素分子を有してよい。

内皮マーカーは、上記のような濃縮に利用できるが、蛍光標識に用いられてもよく、検出された蛍光が、識別子の算出に利用されてよい。

さらなるパラメーターは、蛍光標識された１種類以上の内皮マーカーの蛍光であってよい。内皮マーカーは、内皮細胞中／上で特異的に発現されるマーカーである。上記の内皮マーカーは好ましくは、他の細胞種の細胞中あるいは細胞上で特に発現されない。

好ましい一実施態様において、内皮マーカー由来の蛍光を、胎児細胞の単一細胞選別に用いる。

そのような内皮マーカーは、Ｔｈｙ－１（ＣＤ９０）、トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）、ヒト・エンドグリン（ＣＤ１０５）、ヒト・ビメンチン（Ｖｉｍ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１；Ｆｌｔ－１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）、血管内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦＲ－３）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、内皮蛋白質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ１４６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ５、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ３およびＣＤ５９から成る群から選択できる。

好ましい実施態様において、内皮マーカーは、ＣＤ１０５および／またはＣＤ１４１である。

好ましい別の一実施態様において、内皮マーカーは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１４１である。

内皮マーカーに対する蛍光標識物質は、当業者に公知の方法で、共有結合的に複合体化される。好ましい実施態様では、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８を用いる。好ましい別の一実施態様では、ＦＩＴＣを用いる。

一つの実施態様において、母体血球特異的マーカーを用いる。好適な母体細胞マーカーは、胎児細胞で発現されないマーカーであろう。好ましいマーカーは、白血球マーカーである。

好ましい実施態様において、母性マーカーは、ＣＤ１４および／またはＣＤ４５などの、血球マーカーである。

好ましい別の一実施態様において、血球マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、およびＣＤ１９に対するマーカーの組み合わせである。

本発明の特徴は、蛍光標識物質を用いた細胞の特異標識である。これらの物質は、特定種類の細胞に特異的に結合できる（例えば、細胞表面または内部のマーカーへの結合による）いかなる種類の分子であってもよい。

好ましい蛍光標識物質は、抗体である。

標識物質は、本発明により、抗体であってよく、当該技術分野において公知の任意の好適な抗体など（他の免疫学的に活性な抗体断片または一本鎖抗体を含む）であってよい。抗体分子は一般的に、Ｙ字型の分子であり、その基本単位は、ジスルフィド結合による共有結合で互いに連結された２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖の４つのポリペプチドから成る。これらの鎖のそれぞれは、異なるドメインに折りたたまれる。重鎖および軽鎖両方のＣ末端領域は、配列において保存されており、定常領域とよばれ、Ｃドメインとしても知られる。Ｎ末端領域（Ｖドメインとしても知られる）は、配列において可変であり、抗体の特異性を担う。抗体は、主にＶドメイン中の短い６つの相補性決定領域により抗原を特異的に認識しそれに結合する。

標識物質は、単一の部分（例えば、ポリペプチドまたは蛋白質）であってよく、あるいは２つ以上の部分（例えば、一対の一本鎖抗体ドメインなどの一対のポリペプチド）であってもよい。抗体の作成法は、当業者には公知であり、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を作成するための免疫付与方略による、あるいは代替的結合メンバーを作成するインビトロ法による。ポリクローナル抗体は、ヒツジ、ヤギ、ウサギまたはラットポリクローナル抗体などであってよい。

さらに、高親和性結合できる任意の好適な分子を用いることができ、そのような分子としては、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、特に、ファージディスプレイ（下記を参照のこと）によって取得され得るＦａｂおよびｓｃＦｖ抗体、あるいは単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）またはキメラ抗体などの抗体断片が挙げられる。標識物質は、天然蛋白質またはポリペプチドに由来してよく；デノボ設計されてよく、あるいはライブラリーから選択されてもよい。例えば、標識物質は、抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、リポカリン、一本鎖ＭＨＣ分子、アンチカリン（登録商標）（Ｐｉｅｒｉｓ）、アフィボディ（登録商標）、ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）またはトリネクチン（登録商標）（Ｐｈｙｌｏｓ）に由来してよい。このように、各種の結合メンバーを作成する方法は、当該技術分野において公知である。

本発明の一実施態様において、標識物質は、抗体断片であり、好ましくは抗原結合断片または可変領域である。本発明の有用な抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片とよばれる、２つの同一な抗原結合断片を生成し、それぞれが単一抗原結合部位、および容易に結晶化し得るその能力のためそのようによばれる、残りの「Ｆｃ」断片を有する。ペプシン処理は、抗原を架橋できる２つの抗原結合断片を有する１つのＦ（ａｂ’）_２断片、および残り別の断片（ｐＦｃ’とよばれる）を生成する。

追加の断片としては、抗体断片から形成される二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、および多重特異性抗体が挙げられる。

好ましい一実施態様において、本発明は、天然蛋白質またはポリペプチドに由来する標識物質に関し、蛋白質またはポリペプチドは、例えばデノボ設計されてよく、あるいはライブラリーから選択されてもよい。標識物質は、単一の部分（例えば、ポリペプチドまたは蛋白質）であってよく、あるいはそれは、２つ以上の部分（例えば、一対のポリペプチド）を含んでよい。標識物質は、例えば、しかし排他独占的に、リポカリン、一本鎖ＭＨＣ分子、アンチカリン（登録商標）（Ｐｉｅｒｉｓ）、アフィボディ（登録商標）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、またはトリネクチン（登録商標）（Ｐｈｙｌｏｓ）、ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）であってよい。標識物質は、当該技術分野で周知の組換え法によって選択または設計されてよい。

本発明の別の一実施態様において、標識物質は、アフィボディ（当該技術分野で公知の任意の好適なアフィボディなど）、特に本明細書中に定義されるような抗体（アフィボディまたはアフィボディの免疫学的断片など）である。アフィボディは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのコンビナトリアル変異により構築されたアフィボディ・ライブラリーからインビトロで選択される。プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌由来の表面蛋白質である。その結合ドメインは、５８残基から成り、そのうち１３残基が、アフィボディ（登録商標）ライブラリーを作成するために無作為化される。したがって、アフィボディのサイズは、抗体よりもかなり小さい（ｗｗｗ．ａｆｆｉｂｏｄｙ．ｃｏｍ）。

最後に、標識物質は、蛍光色素分子に直接または間接的に連結された受容体リガンドであってよい。

したがって、本発明の目的は、ハイブリダイゼーション技術に基づく、母体生物学的試料中の胎児細胞の選択的標識を提供することである。あるいは、胎児細胞により選択的に発現されるｍＲＮＡを認識するプローブを用いてもよい。

胎児細胞特異的ＲＮＡ、一般的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列を、胎児細胞マーカーとして用いることができる。そのようなｍＲＮＡの存在は、胎児蛋白質の遺伝子が転写され発現されることを示している。胎児細胞および母体細胞を含む試料中の胎児細胞を標識するために用いるプローブとしては、特異的蛋白質をコードするＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、核酸分子が挙げられる。胎児細胞は、他の細胞種には存在しない、異なるｍＲＮＡまたはＲＮＡ種を含む。これらのＲＮＡの検出は、胎児起源の細胞の標識に役立ち得る。

同様に、母体細胞を、母体細胞のｍＲＮＡに特異的なプローブを用いて標識してよい。

本発明においては、プローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の検出のための、当該技術分野において公知のいかなる種類のプローブであってよい。当業者に公知の従来プローブとしては、市販の合成機を用いてデオキシヌクレオチドのヌクレオチドからそれぞれ合成されるＲＮＡおよびＤＮＡプローブが挙げられる。プローブは、天然ヌクレオチド塩基または天然ヌクレオチド塩基の既知の類似体から成ってよい。プローブは１つ以上のヌクレオチド類似体（ワトソン・クリック塩基対を形成できるペプチド核酸およびその他の合成分子を含む）を含むオリゴマーであってよいことが、さらに考慮される。

染色体ＤＮＡの検出には、蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）がしばしば用いられる。

一つの実施態様において、標識物質（抗体など）または合成プローブを、それに蛍光色素分子を共有結合させることにより、直接標識する。別の一実施態様において、標識物質（抗体など）または合成プローブを、それに蛍光色素分子が共有結合させた第２の物質により、間接的に標識する。細胞中の標的へのこのようなプローブまたは標識物質の結合は、明るい蛍光として顕微鏡下で観察でき、あるいはＦＡＣＳにより検出できる。

標識法の組み合わせを用いることによって、胎児細胞由来のシグナルを増強でき、それにより識別を容易にできる。

母体細胞のバックグラウンドに対する胎児細胞識別の確率および／または選択性を向上させるために、２種類以上の選択的標識を実施してもよい。２種類以上の標識は、上記の単一標識に用いられる標識のいずれかの組み合わせであってよい。したがって、組み合わせた標識を、２種類以上の異なるハイブリダイゼーションプローブ（同じ胎児性ＲＮＡ、あるいはより好ましくは異なる胎児性ＲＮＡとのハイブリダイゼーション用のＤＮＡプローブとＰＮＡまたはＬＮＡプローブの組み合わせなど）を用いることにより実施してよい。また、２種類以上の異なるＤＮＡプローブ（またはＰＮＡプローブ、または特異的ハイブリダイゼーション可能な同様のプローブ）を、異なる胎児性ＲＮＡとのハイブリダイゼーションに用いてもよい。同様に、同じ胎児抗原に対する特性を有する、あるいは異なる抗原に特異性を有する、異なる標識物質の組み合わせを用いてもよい。さらなる実施態様において、ヌクレオチドプローブおよび標識物質の組み合わせによる標識を実施できる。

蛍光色素分子は、検出手段の波長域において、かつさらに任意選択の第２の標識との好適な組み合わせにおいて放射するように選択される。特に、蛍光色素分子は、それぞれ４９５ｎｍおよび５２０～５３０ｎｍにおいて励起するＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはＴＲＩＴＣ（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）から選択されてよい。用いることができるさらなる蛍光色素分子を、各種蛍光色素の励起および蛍光波長と共に下の表のリストに示す。

非標識の標識物質を、当該技術分野において公知のように用いてよく、例えば、非標識１次抗体に対する２次抗体を用いる第２の標識工程の利用により、抗体を上で論じたように標識する（標識した蛍光色素分子など）。この２工程により、胎児細胞からのシグナルを増強できる。さらなる検出工程を、本明細書中で後述するように間接標識を用いて含めてもよい。

蛍光標識される抗体は、少なくとも１つの蛍光色素分子で直接または間接的に標識できる。当業者であれば好適な蛍光色素分子を選択でき、それは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＢＶ４２１などのいかなる蛍光色素分子であってもよい。

２種類以上の上皮マーカーを用いる場合、これらのマーカーは、同じ蛍光色素分子に連結されてよい。その理由は、異なるマーカーを有する細胞間を区別する必要がないことが多いからである。同じことが、２種類以上の内皮マーカーを用いる場合および／または２種類以上の母体細胞マーカーを用いる場合に当てはまる。

蛍光標識される物質の間接標識は、マーカーに結合した標識物質を結合する２次抗体に、蛍光色素分子を付着することにより成し得る。

好ましい一実施態様において、２次抗体は、それぞれ４９５ｎｍおよび５２０～５３０ｎｍでの励起を有するＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはＴＲＩＴＣ（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）から選択されてよい。用いることのできるさらなる蛍光色素分子のリストを、上の表に示す。

好ましい別の一実施態様において、２次抗体は、それぞれ４９０ｎｍおよび５５５ｎｍでの励起を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５から選択されてよい。

フローサイトメーターは、より小さい粒子も選定し、それらについてもパラメーターを定量化するので、好ましくは真核細胞マーカーを用いる。当業者にとっては、そのような色素は通常、ＤＮＡ挿入色素であり、ヘキスト色素、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、７－ＡＡＤ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｓｔａｉｎ、ＳＹＴＯＸ ｓｔａｉｎ、またはＳＹＴＯ ｓｔａｉｎなどの色素であってもよい。

別の一実施態様において、色素は、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｒｕｂｙ Ｓｔａｉｎである。

本発明の目的は、母体細胞およびデブリから胎児細胞を区別するために用いられる１種類以上の測定パラメーターを用いて細胞ソーターで選別された細胞を分析することによる、単一胎児細胞の単離のための半自動化または完全自動化された方法を提供することである。測定パラメーターは、胎児識別子の算出に用いることができる。これにより、胎児性である、もしくは胎児起源性である可能性が高い、単一選別細胞を識別できる。単離した細胞は、胎児遺伝子型の遺伝子解析に利用できる。

本発明の一局面は、妊婦の生物学的試料から胎児細胞を単離する方法に関し、方法は：
（ａ）上記妊婦由来の生物学的試料を提供する工程であって、生物学的試料が細胞画分を含む、工程；
（ｂ）上記細胞画分中の細胞を、少なくとも１個の胎児細胞上皮マーカーおよび／または内皮マーカーに対する１種類以上の蛍光標識物質と接触させる工程；
（ｃ）細胞に結合した１種類以上の蛍光標識物質の検出に基づき、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、上記細胞を選別する工程；
および
（ｄ）個々の選別細胞に胎児起源識別子を割り振る工程を含む、上記選別された細胞中の胎児細胞を識別する工程、
を含む。

一つの実施態様において、細胞画分を、ＦＡＣＳ実施前に胎児細胞について濃縮する。

濃縮は、少なくとも１種類の内皮マーカーを発現する細胞を濃縮することを含んでよい。内皮マーカーの例は、本明細書中でさらに説明される。

好ましい一実施態様において、胎児起源識別子を用いて母体細胞と胎児細胞を区別する。理想的には、これは、高い確実性で行われ、そのため下記のように胎児起源を確認する必要がない。

一つの実施態様において、胎児起源識別子は、細胞を胎児性または非胎児性に分類するバイナリー識別子である。胎児起源識別子は、検証済みである胎児細胞および母体細胞の由来を含む学習データーセットを用いる人工知能、ニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、機械学習、回帰分析、または分類ツリーを利用して算出されてよい。

いくつかの実施態様において、胎児起源識別子は、バイナリーである；すなわち個々の細胞を、胎児性である可能性が高い、または胎児性である可能性が低いと分類する。他の実施態様において、識別子は、胎児起源の確率を個々の細胞に割り振る。

いくつかの実施態様において、胎児起源識別子を、胎児細胞であることが検証されたものに基づいて算出する。以下でさらに説明するように、個別に選別された細胞について胎児遺伝子型を取得することにより、胎児細胞の起源を検証するなど。

胎児起源識別子は、ＦＡＣＳで各細胞について検出されたパラメーターに基づいて算出される。すなわち、方法は、特定の胎児起源識別子を、選別された個々の細胞に割り振る。１つの母体試料に由来する細胞を選別した後に、出力結果は、胎児起源識別子と関連する細胞の選別されたアレイであってよい。データを、個々の選別細胞をその特定の胎児起源識別子と関連付けることができるように構造化する。

細胞遺伝子解析の次の工程において、胎児起源である最も高い確率が割り当てられた細胞から開始してよく、必要に応じて、次に高い値などで継続できる。胎児細胞中のＤＮＡの分析には、胎児由来のわずか１個の細胞が必要とされる。より確実であるためには、胎児由来の２個以上の細胞（例えば胎児由来の少なくとも３個の細胞など）を分析することが好ましい。

確率は、起源が検証された胎児細胞および母体細胞を含む学習データーセットを用いる回帰から取得された関数により算出されてよい。

好ましい一実施態様において、回帰分析は、ロジスティック回帰である。

当業者であれば、ロジスティック回帰が自然対数または常用対数のいずれかであることを理解するであろう。ロジスティック回帰は、定数パラメーターおよび確率を算出するために、蛍光の定量から得られた、パラメーターの特定値を含む。

一つの実施態様において、生物学的試料は、末梢血試料などの血液試料である。

血液試料は、５～３０ｍｌの容積を有してよい。試料は、血液試料に好適なチューブ中に取得されてよい。

好ましい別の一実施態様において、血液試料は、２～１００ｍＬ（３～７０、５～５０ｍＬ、５～３０ｍＬおよび１０～３０ｍＬなど）の容積を有してよい。

一つの実施態様において、細胞画分を、好適には生物学的試料を遠心分離することにより、生物学的試料から分離する。生物学的試料の遠心分離は好ましくは、０～２５分間、より好ましくは０～１５分間、および最も好ましくは５～１０分間である。試料に加える遠心力は好ましくは、０～５０００Ｇ、より好ましくは５００～３０００Ｇ、および最も好ましくは１０００～２０００Ｇ（１６００Ｇなど）である。

当業者であれば、血液試料を血漿画分および細胞画分に分離する遠心分離を理解しているであろう。細胞画分は、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）および胎児栄養膜細胞、胎児の絨毛外栄養膜細胞、ならびに血管内胎児栄養膜細胞から成るであろう。

別の一実施態様において、生物学的試料は、子宮頸部塗抹である。綿棒からの粘液をまず、酢酸またはＤＤＴを用いて溶解してよい。本工程後に得られた細胞画分を次に、パラホルムアルデヒドで固定する。子宮頸部塗抹由来の細胞画分は、胎児細胞（細胞性栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞および／または間質栄養膜細胞などの栄養膜細胞）および扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、白血球および赤血球を含む。その後、胎児細胞を、ＨＬＡ－Ｇおよび／またはＣＤ１０５／ＣＤ１４１を用いて濃縮し、本明細書中の血液試料に関する記載の方法で、染色してよい。

本発明の一実施態様において、母体試料の細胞固定は、母体試料中の胎児細胞の安定性を大幅に増加させ、胎児細胞の濃縮および識別を可能にする（例えば、本明細書中でさらに記載されるように）。ひとつの実施態様において、固定法を、サンプリング直後の未濃縮試料（すなわち第１の実施態様に記載の方法の工程）に実施してよく、その結果母体試料中の細胞成分が固定される。同時に、固定はとても軽度であるため、母体赤血球を次の溶解工程で選択的に溶解できる。

固定は好ましくは、１～６０分間実施される。より好ましくは、固定は、５～３０分間実施され、および最も好ましくは、固定は、５～１５分間（１０分間など）実施される。

固定溶液は好ましくは、０．５％～７．５％のパラホルムアルデヒド、より好ましくは１％～６％のパラホルムアルデヒド、および最も好ましくは１．５％～２％のパラホルムアルデヒドを含む。

パラホルムアルデヒドに加えて、固定溶液は好ましくは、０．０５Ｍ～０．３Ｍ濃度の塩を含む。より好ましくは、塩濃度は、０．１Ｍ～０．２Ｍ、および最も好ましくは０．１２５Ｍ～０．１７５Ｍの濃度である。

好ましくは、固定工程後に、工程（ａ）の固定試料を溶解緩衝液と接触させることを含む、赤血球の溶解の工程を実施してもよい。

溶解緩衝液は通常、非イオン性界面活性剤、好ましくはトリトンＸ－１００を含む。界面活性剤の好ましい濃度は、０．０１％（ｗ／ｗ）～０．５％、より好ましくは０．０５％～０．３％、および最も好ましくは０．１％である。

好ましい一実施態様において、溶解工程を、固定工程の直後に実施する。つまり、固定および溶解の両方を、第１の実施態様に記載の方法の工程（ａ）の後かつ工程（ｂ）の前に実施する。すなわち、溶解液を、試料に直接添加する；例えば、固定後１０分間。溶解は通常、１分間～１２０分間、より好ましくは５～６０分間、および最も好ましくは６～１０分間行われる。

溶解緩衝液は、赤血球溶血に加えて、白血球の細胞膜に小型の開口を生成することもあり、これは、標識物質が細胞膜を透過しそれらの標的抗原に結合することを可能にする。

胎児細胞の起源を、個別に選別された細胞について胎児遺伝子型を得ることにより検証する。遺伝子型が母体遺伝子型と異なる場合、細胞は胎児起源のものであると考えられる。このような検証は、短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）により実施できる。

別の一実施態様において、検証は、最初にゲノムを増幅すること、およびその一部を短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）に供することにより実施できる。

別の一実施態様において、検証は、全ゲノム増幅後に一塩基多型（ＳＮＰ）を分析することにより、すなわちＳＮＰアレイで、実施される。

さらなる一実施態様において、胎児起源を、以下でさらに説明するような、遺伝マーカー検出に好適な方法のいずれかにより検証する。例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）など。

第二の局面において、本発明は胎児中の遺伝的異常を決定する方法に関し、方法は：
（ａ）本明細書中に記載の方法によって単離される１個以上の胎児細胞を取得する工程；
および
（ｂ）胎児細胞のゲノム中の遺伝的異常に関連する１種類以上の遺伝マーカーを検出する工程、
を含む。

遺伝マーカーは、ＲＦＬＰ、サザンブロット解析、マイクロアレイを基盤とする比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）、全ゲノム増幅、全ゲノムスキャン、ＳＮＰアレイ、ポロニーシーケンシング、ショットガンシーケンシング、超並列シーケンシング法（ＭＰＳＳ）、サンガー配列決定法、ＰＣＲを基盤とする方法および次世代シーケンシング法から成る群から選択される１種類以上の方法を用いて検出される。

次世代シーケンシング法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：プロトン／ＰＧＭシーケンシングおよび／またはＳＯＬｉＤシーケンシングから成る群から選択できる。

遺伝的異常は、異数性、モノソミー、ポリソミー、トリソミー、コピー数のバリエーション（ＣＮＶ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または単一遺伝子病である。

いくつかの実施態様において、単一胎児細胞のＤＮＡ内容を、遺伝マーカーを検出し確認するための方法を実施可能にするために、増幅する必要がある。

複数の方法が、高忠実度全ゲノム増幅のために開発されており、複数置換増幅（ＭＤＡ）、縮退オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ－ＰＣＲ）およびプライマー伸長プレ増幅法（ＰＥＰ）を含む。ＤＯＰ－ＰＣＲおよびＰＥＰは、標準的ＰＣＲ技術に基づく一方で、ＭＤＡは、等温反応条件で実施できる。

胎児ＤＮＡの検出／分析を、以下の方法で実施できる：ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いたＳＮＰ遺伝子型決定、ｑＰＣＲおよびＰＣＲを基盤とする変異検出、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、短い縦列反復／マイクロサテライトの分析、サンガー配列決定法、ＲＦＬＰおよびサザンブロット分析ならびにアレイ技術（比較ゲノムハイブリダイゼーションなど）。

本明細書中の方法およびおよびシステムに基づいて決定され得る胎児の状態は、胎児の存在および／または胎児の病態（胎児の異数性など）を含む。このような胎児の異常は、例えば、１３トリソミー、１８トリソミー、２１トリソミー（ダウン症候群）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）および他の性染色体または常染色体の数の異常であり得る。

本明細書中の方法を用いて検出可できる他の胎児病態としては、Ｉｐ３６の重複、ｄｕｐ（１７）（ｐｌｌ．２ｐｌｌ．２）症候群、ダウン症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、ｄｕｐ（２２）（ｑｌｌ．２ｑｌｌ．２）症候群、ネコ眼症候群などの、部分異数性が挙げられる。

一つの実施態様において、検出すべき胎児異常は、性染色体または常染色体における１種類以上の欠失による。このような異常としては、猫鳴き症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、ウィリアムズ・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マギニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、帆心臓顔症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損症、カルマン症候群、小眼球症・線状皮膚欠損症候群、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体精巣決定因子、アゾスペルミア（因子ａ）、アゾスペルミア（因子ｂ）、アゾスペルミア（因子ｃ）またはＩｐ３６の欠失が挙げられる。

いくつかの場合において、胎児異常は、ＸＯ症候群などの、染色体数の異常な減少または増加である。

実施例
本明細書の実施例の節で説明される抗体は、下の表に示される特異的抗体である。

抗体の名称にＦＩＴＣまたはＰＥが付くものは、直接コンジュゲートされた抗体である。

実施例１：ＭＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮と染色、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の第２濃縮、それに続くＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒを用いる胎児細胞の走査と選定
血液試料を、１０～１４週の妊娠期間の１３人の妊婦から採取した。試料を、下記の方法を用いて処理し胎児細胞を濃縮した。

血液処理
全量３０ｍＬの末梢血を、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（登録商標）チューブ（Ｓｔｒｅｃｋ、Ｏｍａｈａ、ＵＳＡ）に採取した。血液試料を、１０００～２０００ｇで２～１０分間遠心分離し、血漿を除いた。血液試料を、リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）中の１～１０％ホルムアルデヒド緩衝液中で２～１０分間固定し、その後赤血球を、ＰＢＳ中の０．１～１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００界面活性剤中で６～１０分間溶血させた。細胞をその後、ＰＢＳおよび０．５％ウシ血清アルブミン緩衝液中で洗浄し、胎児細胞濃縮前にペレットにした。

Ｍｉｌｔｅｎｙｉの磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いる胎児細胞の濃縮と染色
胎児細胞濃縮を、ＭＡＣＳを用いて実施した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。「血液処理」後のペレット化した非濃縮細胞を、ＣＤ１０５およびＣＤ１４１抗体（マイクロビーズ）と１５分間～１時間インキュベートし、細胞懸濁液を、濃縮のためにＭＡＣＳカラムに添加した。担持細胞を、１５ｍＬチューブに投入し洗浄し（１０分間の遠心分離）その後、抗体染色のため第２のカラムに濃縮した細胞を添加した。染色を、１５分間～１時間、胎児細胞を標的とするサイトケラチン１次抗体カクテルならびに母体白血球を標的とするＣＤ１４およびＣＤ４５抗体と濃縮細胞画分をインキュベートすることによりカラム上で行った。１次抗体とのインキュベーション後に、カラム中の細胞を、ＰＢＳで３回すすいだ。その後、蛍光色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）（胎児細胞上のＣＫ類を標的とする）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＡＦ５５５）（母体白血球上のＣＤ１４およびＣＤ４５を標的とする）で標識した２次抗体を添加し、細胞を、１５分間～１時間インキュベートした。染色細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した後、取り出しＦＡＣＳまで４℃で保存した。

ＦＡＣＳを用いる胎児細胞濃縮
２０μＬの５μＭヘキスト３３３４２を、ＭＡＣＳで濃縮した細胞に添加した。細胞を、濃縮の別の工程のために、ＦＡＣＳ機にかけた（図２）。胎児細胞を、４０５ｎｍ（ヘキスト３３３４２）、４８８ｎｍ（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８）および５６１ｎｍ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５）のレーザーにて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で選別した。蛍光シグナルを、各帯域通過フィルター：４５０／５０ｎｍ、５３０／３０ｎｍおよび５８５／４２ｎｍ、を用いて、収集した。蛍光補正およびダブレット除去を行わなかった。光電子増倍管の電圧を、次のパラメーター：ＦＳＣ：３００、ＳＳＣ：３９０、ＡＦ４８８：３６０、ＡＦ５５５：２３６、ヘキスト：５００、に設定し、およびＦＳＣ－Ｈ閾値は、５０００であった。１００μｍのノズルを用い、ＦＡＣＳ機を、循環胎児細胞が稀であるため降伏モードで選別するように設定した。全ての細胞を、前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）プロットに含めた。ヘキスト^＋画分から、領域（ゲートＧ１）をＡＦ４８８／ＡＦ５５５蛍光プロット中に設けて、目的細胞を選別した。選別した細胞の解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ ＵＳＡ）を用いて行った。ＸＹ座標でのゲートＧ１の一例を、図３に示す。平均で２２４４細胞を選別した。細胞を、ガラススライド上に塗抹し、ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（蛍光スキャナー細胞ピッカー）を用いて分類した。選別細胞中に１０７個の胎児細胞が存在し、平均で試料当たり７．９個の胎児細胞であった（表３）。

実施例２：ＭＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮と染色、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の単一細胞選別
３０ｍＬの血液試料を、１０～１４週の妊娠期間の１３人の妊婦から採取した。試料を処理し、胎児細胞を、磁気ビーズ上で濃縮し、上記の方法を用いて染色し、実施例１に記載のように設定したＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ機にかけた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＰＥ）に対するＦＡＣＳグラフ上の選別ゲート（Ｇ７）を用いて、１秒当たりおおよそ１００～６００イベントのイベントレートで、５μｌのＴＥ緩衝液を含む単一ＰＣＲチューブ（複数）にそのゲートで全ての細胞を個別に回収した（図５）。選別した細胞を、－８０℃で凍結した。このゲートを用いて、平均で１７個の細胞を、各試料から収集した。細胞を次に、短い縦列反復（ＳＴＲ）の分析に供して、これらの細胞の起源（胎児性または母性）を明らかにした（図４）。ＳＴＲ分析の前に、胎児細胞を、製造元の指示にしたがいＰｒｅｐＧｅｍ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｚｙｇｅｍ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を用いて溶解した。ＳＴＲ遺伝子型プロファイルを、ＡＢＩ３５００遺伝子分析装置を用いる断片サイズキャピラリー電気泳動により作成した。データ解析を、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ－Ｘ断片サイズ解析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で行った。単一選別細胞に関するＳＴＲ分析からの結果を、表４および図６に示す。

細胞の起源（胎児性または母性）をＳＴＲ分析により解釈した。１３の連続する試料を、ＭＡＣＳを用いて、ＣＤ１０５およびＣＤ１４１マイクロビーズで濃縮し、続いてサイトケラチン、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキスト染色を用いてＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩで単一細胞選別した。４～４７個の細胞を選別し、ＳＴＲ分析は、選別した細胞中３～３６個の胎児細胞を明らかにし、平均で試料あたり９．６個の胎児細胞を有した。

連続する１３試料から４～４７個の細胞を選別し、平均で１７．５個の細胞であった（表４）。３～３６個の胎児細胞を、ＳＴＲ分析により識別し、平均で９．６個の胎児細胞であった。実施例１（７．９個胎児細胞が識別された）と比較して、これは、単一細胞の単離が、ＭＡＣＳで濃縮した試料をＦＡＣＳで選別する場合に可能であることを示している。

この時点で、全ての単一選別された細胞の起源（胎児性または母性）が明らかになった。また、すべての細胞に関して、ＦＡＣＳ機での５つの異なるパラメーター（前方散乱（ＦＳＣ－Ａ）、側方散乱（ＳＳＣ－Ａ）、ヘキストＢｌｕｅ－Ａ（核染色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－Ａ（胎児細胞上のＣＫ抗体を標的とする）、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＰＥ－Ａ）（母体白血球上のＣＤ１４およびＣＤ４５を標的とする）の値が既知となった。全てのこの情報に基づき、モデルを、ＳＴＲ情報が利用できない将来の試料について局在する胎児細胞の確率を予測するために、ロジスティック回帰と呼ばれる数学的方法を用いて構築した。

モデル：
胎児細胞を予測するためのモデルは、ロジスティック回帰と呼ばれる数学的方法に基づき、これは、すべての試料に対し単一選別細胞が胎児性であるか否かの確率を与える。

ロジスティック関数は、以下である：

ここでＸ１、Ｘ２…Ｘｐは、各単一選別細胞について測定される特異的な変数である。上記のように、本明細書中に記載の実施例の場合、ＦＡＣＳ機により測定される５つの変数（ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ、ヘキストＢｌｕｅ－Ａ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－Ａ、およびＰＥ－Ａ）を有する。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５はそれぞれ、すべての細胞についてＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ、ヘキストＢｌｕｅ－Ａ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－Ａ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＰＥ－Ａ）に対し記録された値に対応する。

β０、β１、β２… βｐは、方程式中の係数または定数である。ここでは、６つの係数があり、β０は独立しており（５つの変数が全てゼロである場合の確率を反映する）であり、β１、β２、β３、β４、およびβ５はそれぞれ、細胞が胎児性または母性である確率に対するＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ、ヘキストＢｌｕｅ－Ａ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－Ａ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＰＥ－Ａ）の寄与を反映する。しかし、この寄与は、それらの絶対値により反映されない。この６つの係数は、細胞の起源（胎児性または母性）および各細胞に関する５つの変数すべての値が既知である（現在のデータセットでは、それは１２１個の胎児細胞および９０個の母体細胞から成る）場合の「学習」データセットから算出される一定値である。これらのβの値は、「学習」データセットにおける全細胞について胎児細胞が可能な限り高い確率（１に近い）になり、かつ母体細胞が可能な限り低い確率（０に近い）になるように、計算される。表５に示すこれらのβ値（β０、β１、β２、β３、β４およびβ５）は、本発明者らのデータに固有である。

試料中の全ての単一選別細胞について本アルゴリズムを用いると、ｐ（Ｘ）は、０と１の間の値となる。所定の細胞に対するｐ（Ｘ）の値が大きいほど、アルゴリズムは、その細胞が胎児細胞である確率をより高く見積もる。胎児性である確率が最も高い細胞の５０％のみに注目することにより胎児細胞の数を濃縮できるかを試験するために、３つの単一細胞選別試料について本モデルを運用した。胎児細胞の量は、選別後に３８～８３％の差異があり、最も高い確率の細胞に注目することによってこれが大幅に増加した。この結果を、表６に示す。

全３試料で、胎児細胞数は、胎児細胞である高い確率を有すると示された試料の第１の半量において増加した。これは、処理能力を促進し、また単一胎児細胞の下流遺伝子解析に関するＣＯＧＳを低下させるかもしれない。

上記のアプローチを用いて異なるＦＡＣＳプロット上で胎児細胞の位置を予測するためのモデルの実施が、達成され；そのワークフローは、図７のようである。細胞の単一選別後に、全ての細胞中のＤＮＡを、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を用いて増幅する。ＷＧＡ産物の画分を次に用いてＳＴＲ分析を実施する。胎児性であると判明した細胞からのＤＮＡの残りを次いで、ａＣＧＨまたは他の妥当な下流アプローチを用いる遺伝子解析に利用する。

実施例３：ＦＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮、それに続くＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒを用いる胎児細胞の走査および選定
ＭＡＣＳ濃縮を用いる胎児細胞濃縮を必要としない胎児細胞のＦＡＣＳ分離の可能性を探るため、１０ｍＬの血液試料を、１０～１４週間の妊娠期間の８人の妊婦から採取した。血液試料を処理し、白血球を、実施例１に記載のようにペレットにした。血液処理後に、細胞を、４つの試料では多様な濃度のＣＫ抗体のみのカクテルで、別の４つの試料ではＣＫ抗体ならびにＣＤ１４およびＣＤ４５抗体のカクテルで染色した。Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ＰＥ）に関するＦＡＣＳプロット上のゲートＧ１に存在する細胞を、実施例１でのように選別した。平均で５５ｍｉｌｌイベントが記録され、２２，１４０個の細胞が、すべての試料から選別された。細胞を、ガラススライド上に塗抹し、ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（蛍光スキャナー細胞ピッカー）用いて分類した。平均で、１０ｍＬの全血から４個の胎児細胞を回収し、濃縮がＦＡＣＳのみを用いて行われ得ることを示す（表７）。

実施例４：ＭＡＣＳを用いる胎児細胞を濃縮し染色、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の単一細胞選別
複数のＦＡＣＳ機における本発明の適用性を探るために、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩの代わりにＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）において、実施例２に示すように例を実施した。以下の例で、胎児細胞が、血液処理され、ＭＡＣＳプラットフォームで内皮マーカー（ＣＤ１０５およびＣＤ１４１）に特異的な抗体を用いて濃縮され、その後、実施例１に記載されるように上皮マーカー（ＣＫ）について染色された血液３０ｍＬからの同定され得ることを示す。濃縮され染色された細胞は、サイトケラチン、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキスト染色を用いてＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で単一細胞選別された。

ＦＡＣＳを用いる単一細胞選別
ＦＡＣＳの直前に、２０μＬの５μＭヘキスト３３３４２溶液を、濃縮細胞ペレットに添加して核を染色した。

濃縮し染色した細胞を、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、および５６１ｎｍのレーザーでＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で選別した。蛍光シグナルを、各帯域通過フィルター（４４８／４５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）、５２７／３２ｎｍ（ＡＦ４８８）および５８５／４０ｎｍ（ＡＦ５５５））を用いて収集した。蛍光補正およびダブレット除去を行わなかった。光電子増倍管の電圧を、次のパラメーターに設定した：ＦＳＣ：２７８、ＳＳＣ：５３０、ＡＦ４８８：３３６、ＡＦ５５５：２７１、ヘキスト：４７０およびＦＳＣ閾値：２９３９。１００μｍのノズルを適用し、ＦＡＣＳ機を、循環する胎児細胞が稀であるため降伏モードで選別するように設定した。

まず、側方散乱（ＳＳＣ）が非常に高値である全てのイベント（デブリ）を除外し、残りの細胞を、ヘキスト^＋イベントについてゲートした。続いて、ヘキスト^＋イベントを、ＣＫ^＋かつＣＤ４５^－かつＣＤ１４^－についてゲートした。ゲーティング方略の一例を、図８に示す。細胞を、１秒当たりおおよそ１００～６００イベントのるイベントレートで、５μｌのＴＥ緩衝液を含む２００μｌのＰＣＲチューブに個別に選別した。選別された細胞を、－８０℃で凍結した。細胞を次に、実施例２に記載されるように、それらの起源（胎児性または母性）を明らかにするために、短い縦列反復（ＳＴＲ）の分析に供した。

実施例４の実験結果
表８から分かるように、１０～２６個の細胞を、連続する９つの試料において選別し、その平均は１７．９個であった。ＳＴＲ分析により、０～１６個の胎児細胞が、平均７．０個の胎児細胞で、試料当たり識別された。実施例１（７．９個の胎児細胞が識別された）および実施例２（９．６個の胎児細胞が単離された）と比較して、ＦＡＣＳ機の選択が本発明の結果に影響を与えないことを示している。

連続する９試料を、ＭＡＣＳを用いてＣＤ１０５およびＣＤ１４１マイクロビーズで濃縮し、続いてサイトケラチン、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキスト染色を用いてＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙで単一細胞選別した。１０～２６個の細胞が選別され、ＳＴＲ分析は、選別細胞中に０～１６個の胎児細胞を見いだし、平均で試料あたり７．０個であった。

実施例５：ＦＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の単一細胞選別
ＭＡＣＳを用いた濃縮を回避できるかを探るために、ＭＡＣＳ濃縮の代わりにＦＡＣＳ濃縮を行い、その後ＦＡＣＳ機で単一細胞選別を実施した。換言すると、細胞を「二重ＦＡＣＳ」に供した。ＦＡＣＳ濃縮は、大部分の母体細胞およびデブリを除去し、これは、母体性の混入のない胎児細胞のその後の単一細胞選別を可能にした。２回のＦＡＣＳの両方における胎児細胞の識別は、サイトケラチン、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキスト染色のみに基づき、内皮マーカーは用いなかった。

１０ｍＬの血液試料を、１０～１４週間の妊娠期間の１０人の妊婦から採取した。血液試料を、実施例１に記載されるように処理した。

胎児細胞染色
血液処理後、チューブ中でペレットにした細胞を、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、汎ＣＫ（ＣＫワイドスペクトラム）、ＣＤ１４、およびＣＤ４５を標的とする１次抗体で１５分間～１時間染色した。細胞を次に、ＰＢＳで洗浄し、５５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を除いた。次に、ＡＦ４８８（ＣＫ類を標的とする）およびＡＦ５５５（ＣＤ４５＋ＣＤ１４を標的とする）で標識された２次抗体を添加し、１５分間～１時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、上清を除いて５００μｌにした。

ＦＡＣＳ濃縮および単一細胞選別
ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙでの選別直前に、細胞を、５００μＬの２０μＭヘキスト３３３４２溶液で染色し、ＰＢＳを加えて４ｍＬの最終容積にした。ＦＡＣＳ設定は、実施例４に記載したものと同一であった。

まず、側方散乱（ＳＳＣ）が非常に高値である全てのイベント（デブリ）を除外し、残りの細胞を次に、ヘキスト^＋イベントについてゲートした。続いて、ヘキスト^＋イベントを、中程度～高レベルのＣＫを発現しており（ＣＫ^{中程度から高}）かつＣＤ４５^－ＣＤ１４^－であるものについてゲートした。ゲーティングの一例を、図９に示す。細胞を、１秒当たりおおよそ５，０００～２０，０００イベントのイベントレートで、２５μＬのＰＢＳを含む１．５ｍＬエペンドルフチューブにバルク選別した。選別された細胞を、最終容積５００μＬに希釈し、次に、ＣＫの高発現の細胞（ＣＫ^高）についてのみゲートすることを除き同じゲーティング方略を用いて再び選別した。ゲーティングの一例を、図１０に示す。細胞を、１秒当たりおおよそ１００～６００イベントのイベントレートで、５μＬのＴＥ緩衝液を含むＰＣＲチューブに単一細胞選別した。イベントレートを、降伏モードで選別するようにＦＡＣＳ機を設定したので、母体細胞の混入を避けるためこの低い値に設定した。選別された細胞を、上記のように実施したＳＴＲ分析の前に－８０℃で凍結した。

実施例５の実験結果
表９は、第１および第２選別からの選別細胞数ならびにＳＴＲ分析で識別された胎児細胞数を表している。第１選別から、おおよそ１５，０００～３３，０００細胞が選別され、第２選別では、５～３２細胞が選別された。第２選別からの細胞を次に、ＳＴＲ分析し、それは１０ｍＬの血液当たり０～９個の胎児細胞を明らかにし、平均で２．４個の胎児細胞であった。これは、胎児細胞単離が、ＦＡＣＳおよび上皮マーカーならびにＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキストの染色を用いることのみで行われ得ることを示している。

連続する１０試料を、ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ機で「二重選別」した。第１の選別はおおよそ１５，０００～３２，０００細胞を生じ、この細胞を次に、再びＦＡＣＳにかけ単一細胞選別した。５～３２細胞が選別され、ＳＴＲ分析は、単一細胞選別した細胞中に０～９個の胎児細胞が存在し、平均２．４個であることを明らかにした。

実施例６：ＦＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の単一細胞選別：胎児内皮マーカー
本実施例では、「二重ＦＡＣＳ」が、内皮マーカー染色にのみ基づいて（上皮マーカーの染色は無し）胎児細胞を識別できることを示す。

１０ｍＬの血液試料を、１０～１４週間の妊娠期間の妊婦から採取した。血液試料を、実施例１に記載のように処理した。

胎児細胞染色
血液処理後、細胞を、以下の抗体の１つまたは複数を標的とする抗体で１５分間～１時間染色した：ＣＤ１０５－ＦＩＴＣ、ＣＤ１４１－ＦＩＴＣおよびＣＤ９０－ＦＩＴＣ（表１０中の抗体の組み合わせを参照のこと）。さらに、ＣＤ１４およびＣＤ４５に対する１次抗体、ならびにＡＦ５５５で標識された２次抗体を、母体細胞の染色に用いた。細胞を次に、ＰＢＳで洗浄し、５５０ｇで１０分間遠心分離し、上清を除いて５００μＬにした。
ＦＡＣＳ濃縮および単一細胞選別

ＦＡＣＳ直前に、細胞を、５００μＬの２０μＭヘキスト３３３４２溶液で染色し、ＰＢＳを加えて最終容積を４ｍＬとした。ＦＡＣＳ設定は、ＡＦ４８８に関する光電子増倍管電圧を、直接コンジュゲートしたＣＤ１０５、ＣＤ１４１、およびＣＤ９０について４６１に設定したことを除いて、実施例４のものと同一であった。

まず、側方散乱（ＳＳＣ）が非常に高値である全てのイベントを除外し、低ＳＳＣ画分を次に、ヘキスト^＋イベントについてゲートした。続いて、ヘキスト^＋イベントを、中程度～高レベルでＣＤ１０５＋ＣＤ１４１＋ＣＤ９０を発現するものについてゲートした。全細胞が、ＣＤ４５^－およびＣＤ１４^－についてゲートされた。ゲーティングの一例を、図１１に示す。細胞を、１秒当たりおおよそ５，０００～２０，０００イベントのイベントレートで、２５μＬのＰＢＳを含む１．５ｍＬエペンドルフチューブにバルク選別した。選別された細胞を、最終容積５００μＬに希釈し、次に、高レベルのＣＤ１０５＋ＣＤ１４１＋ＣＤ９０を発現する細胞のみを選別したこと除き同じゲーティング方略を用いて再び選別した。ゲーティングの一例を、図１２に示す。細胞を、１秒当たりおおよそ１００～６００イベントのイベントレートで、５μＬのＴＥ緩衝液を含むＰＣＲチューブに単一細胞選別した。単一細胞選別した細胞を、実施例２に記載のように実施したＳＴＲ分析の前に、－８０℃で凍結した。

試料ＨＯ１０７－Ａを、ＣＤ１０５＋ＣＤ１４１＋ＣＤ９０を標的とする抗体で染色し、「二重ＦＡＣＳ」を実施することにより、１個の胎児細胞を識別した。試料３０９１－Ｂでは、ＣＤ１０５およびＣＤ１４１のみを染色し、「二重ＦＡＣＳ」後に１個の胎児細胞がまた検出された。

実施例６の実験結果
表１０は、異なる組み合わせの内皮マーカーで染色した２つの試料を示す。第１選別は、おおよそ３０，０００～４５，０００個の細胞を与え、第２選別は、１０～２０個の細胞を与えた。１個の胎児細胞が、両方の場合で検出された。

実施例７：ＦＡＣＳを用いる胎児細胞の濃縮、それに続くＦＡＣＳを用いる胎児細胞の単一細胞選別：異なる母体細胞特異的マーカー
上記の実施例において、ＣＤ４５およびＣＤ１４の染色を、母体白血球の識別に用い、一方でヘキストを、核染色に用いた。これら染色の目的は、細胞とデブリの分離、および母体細胞と胎児細胞の分離を向上させることであった。本実施例において、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびヘキストが胎児胞細の単一細胞選別に必要であるか否かを調べた。

１０ｍＬの血液試料を、１０～１４週間の妊娠期間の５人の妊婦から採取した。血液試料を、実施例１に記載されるように処理した。全ての試料を、実施例５に記載されるようにＣＫ抗体で染色した。さらに、全ての試料を、表１１に特に明記されていない限り実施例５に記載のように、ヘキスト、ＣＤ４５およびＣＤ１４で染色した。ひとつの試料において、白血球を、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、およびＣＤ１９を標的とする抗体（すべてＰＥに直接コンジュゲートされる）で１５分間～１時間染色した。全ての試料を、ＣＫ染色ならびに白血球染色およびヘキスト染色を用いてＦＡＣＳにより濃縮した（それらが実施例５に記載のように試料に含まれてた場合）。最後に、細胞を、濃縮ＦＡＣＳと同じ染色を用いて、ＦＡＣＳ機で単一細胞選別した。単一細胞選別した細胞を、ＳＴＲにより分析した。

実施例７の実験結果
ヘキスト、ＣＤ４５またはＣＤ１４のいずれでも染色されなかった、試料ＡＡＬ３０２－ＢについてのＦＡＣＳプロットを、図１３Ａに示す。細胞の分離は、大幅に低下された。主たる集団から分離された少数のイベントを選別したが、ＳＴＲ分析は、全ての選別イベントがＤＮＡを含まなかった；すなわちデブリのみが選別されたことを示した。これは、ヘキストなどの核染色が、単一細胞選別からデブリを除去するために必要であることを示している。

ヘキスト：
ヘキストを加えるが母体細胞染色をしない場合（試料ＡＡＬ３０２－Ａ）、明確な分離が得られなかった（図１３Ｂ）。母体細胞のみがＳＴＲにより識別され、母体マーカー染色が母体細胞からの胎児細胞分離を大幅に向上させることを示している。

ＣＤ１４およびＣＤ４５：
母体細胞をＣＤ１４で染色するがＣＤ４５では染色しない場合（試料ＫＯ３８１）、分離は得られたが、胎児細胞は識別されなかった（図１４Ａ）。しかし、ＣＤ４５染色のみを実施しＣＤ１４染色をしない場合（試料ＫＯ３８０、図１４Ｂ）、３個の胎児細胞が識別され、ＣＤ４５染色が必須であることを示している。

他の白血球マーカー：
ＣＤ４５は、それが白血球の全亜群（単球、顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）で発現されるので、共通の白血球抗原としても知られている。そこで、白血球の全亜群のそれぞれに対応するマーカーがＣＤ４５の代替となり得るかを調べるために、上の実施例５に記載されるようにＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１５（顆粒球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、およびＣＤ１９（Ｂ細胞）ならびにＣＫおよびヘキストの染色を行った。これは、３個の胎児細胞をもたらし（表１２）、ＣＤ４５が他の複数の白血球マーカーから成る群で代替され得ることを示している。

ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、およびＣＤ１９は、末梢血中の異なる亜群の白血球を標的とする。全亜群を標的とするＣＤ４５の代わりに異なる亜群を染色することによって、３個の胎児細胞が識別された。

項目
項目１：胎児細胞を単離する方法であって：
（１）胎児を身ごもっている女性由来の生物学的試料を提供する工程；
（２）上記試料を胎児細胞に関して濃縮する工程；
（３）上記試料を少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程；
（４）上記濃縮試料から蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で少なくとも１個の胎児細胞を単一細胞選別する工程、
を含む、方法。

項目２：出生前診断の方法であって：
（１）項目１に記載の方法によって単離される少なくとも１個の胎児細胞を取得する工程；
（２）上記胎児細胞から遺伝子型を取得する工程；
および
（３）胎児の表現型を診断する工程、
を含む、方法。

項目３：出生前診断の方法であって：
（１）胎児を身ごもっている女性由来の生物学的試料を提供する工程；
（２）上記試料を胎児細胞に関して濃縮する工程；
（３）上記試料を少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程；
（４）上記濃縮試料から蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で少なくとも１個の胎児細胞を単一細胞選別する工程、
（５）上記胎児細胞の遺伝子型を取得する工程；
および
（６）胎児の表現型を診断する工程、
を含む、方法。

項目４：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記蛍光標識物質が、核、胎児細胞マーカーおよび／または母体細胞マーカーに対するものである、方法。

項目５：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記少なくとも１種類の蛍光標識物質が：
（ｉ）核に対する蛍光標識物質；
（ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質；
および
（ｉｉｉ）胎児細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
の群のそれぞれから選択される、方法。

項目６：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記試料が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により濃縮される、方法。

項目７：項目６に記載の方法であって、濃縮工程に先だって、上記試料に含まれる細胞を胎児細胞マーカーに対する少なくとも１種類の磁気標識された物質と接触させる工程を実施する、方法。

項目８：項目１～５のいずれかに記載の方法であって、試料が、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で濃縮される、方法。

項目９：項目８に記載の方法であって、濃縮工程に先だって、上記生物学的試料に含まれる細胞を：
（ｉ）核に対する蛍光標識物質；
（ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質；
および
（ｉｉｉ）胎児細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
の群のそれぞれから選択される少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程を実施する、方法。

項目１０：項目９に記載の方法であって、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）での濃縮が、上記蛍光標識物質由来の蛍光に基づく、方法。

項目１１：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記単一細胞選別した上記少なくとも１個の胎児細胞が、
（ｉ）胎児細胞マーカーに対する上記蛍光標識物質の正の選択；
（ｉｉ）核に対する上記蛍光標識物質の正の選択；
および
（ｉｉｉ）母体細胞マーカーに対する上記蛍光標識物質の負の選択；
に基づいて蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で選別される、方法

項目１２：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記胎児細胞が、絨毛外栄養膜細胞、血管内栄養膜細胞、細胞性栄養膜細胞および／または合胞体栄養膜細胞などの、胎児栄養膜細胞である、方法。

項目１３：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、胎児栄養膜細胞マーカーに対する上記磁気および／または蛍光標識物質が、内皮マーカーまたは上皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、方法。

項目１４：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、胎児栄養膜細胞マーカーに対する上記磁気および／または蛍光標識物質が、内皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、方法。

項目１５：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記内皮マーカーが、Ｔｈｙ－１（ＣＤ９０）、トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）、ヒト・エンドグリン（ＣＤ１０５）、ヒト・ビメンチン（Ｖｉｍ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１；Ｆｌｔ－１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）、血管内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦＲ－３）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、内皮蛋白質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ１４６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ５、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ３および／またはＣＤ５９から選択される、方法。

項目１６：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記内皮マーカーが、ＣＤ１０５、ＣＤ９０および／またはＣＤ１４１である、方法。

項目１７：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記内皮マーカーが、ＣＤ１０５および／またはＣＤ１４１である、方法。

項目１８：上記の項目のいずれか１項に記載の方法であって、胎児栄養膜細胞マーカーに対する上記磁気および／または蛍光標識物質が、上皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、方法。

項目１９：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記上皮マーカーが、サイトケラチンである、方法。

項目２０：上記の項目のいずれか１項に記載の方法であって、上記上皮マーカーが、ヒト・サイトケラチン１（ＣＫ１）、ヒト・サイトケラチン２（ＣＫ２）、ヒト・サイトケラチン３（ＣＫ３）、ヒト・サイトケラチン４（ＣＫ４）、ヒト・サイトケラチン５（ＣＫ５）、ヒト・サイトケラチン６（ＣＫ６）、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン９（ＣＫ９）、ヒト・サイトケラチン１０（ＣＫ１０）、ヒト・サイトケラチン１３（ＣＫ１３）、ヒト・サイトケラチン１４（ＣＫ１４）、ヒト・サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、ヒト・サイトケラチン１６（ＣＫ１６）、ヒト・サイトケラチン１７（ＣＫ１７）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）などのサイトケラチンである、方法。

項目２１：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記上皮マーカーが、サイトケラチン、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）および／またはヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）である、方法。

項目２２：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記上皮マーカーが、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）および／またはヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）である、方法。

項目２３：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記蛍光標識物質が、抗体、ヌクレオチドプローブ、受容体リガンド、および／または他の特異的結合分子である、方法。

項目２４：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記少なくとも１種類の蛍光標識物質が、少なくとも１つの蛍光色素分子により直接または間接的に標識される、方法。

項目２５：項目４０に記載の方法であって、上記蛍光色素分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、およびＢＶ４２１から成る群から選択される、方法。

項目２６：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、核に対する上記蛍光標識物質が、ヘキスト色素、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、７－ＡＡＤ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｓｔａｉｎ、ＳＹＴＯＸ Ｓｔａｉｎ、またはＳＹＴＯ Ｓｔａｉｎのいずれかから選択される、方法。

項目２７：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、核に対する上記蛍光標識物質が、ヘキスト３３３４２である、方法。

項目２８：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、母体細胞マーカーに対する上記蛍光標識物質が、白血球に対する蛍光標識物質である、方法。

項目２９：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記白血球マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、および／またはＣＤ１９から選択される、方法。

項目３０：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記白血球マーカーが、ＣＤ４５およびＣＤ１４である、方法。

項目３１：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記白血球マーカーが、ＣＤ４５である、方法。

項目３２：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記遺伝子型が、ＳＴＲ分析によって取得される、方法。

項目３３：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記遺伝子型が、ＳＮＰ分析によって取得される、方法。

項目３４：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記表現型が、胎児細胞のゲノムにおける遺伝的異常に関連する１種類以上のマーカーを検出することによって診断される、方法。

項目３５：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記遺伝的異常が、マイクロアレイを基盤とする比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）、全ゲノム増幅、全ゲノムスキャン、ＳＮＰアレイ、ポロニーシーケンシング、ショットガンシーケンシング、超並列シーケンシング法（ＭＰＳＳ）、サンガー配列決定法、ＰＣＲを基盤とする方法および次世代シーケンシング法から選択される１種類以上の方法によって検出される、方法。

項目３６：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記次世代シーケンシング法が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：プロトン／ＰＧＭシーケンシングおよび／またはＳＯＬｉＤシーケンシングから成る群から選択できる、方法。

項目３７：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記遺伝的異常が、異数性、モノソミー、ポリソミー、トリソミー、コピー数のバリエーション（ＣＮＶ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または単一遺伝子病である、方法。

項目３８：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記生物学的試料が、細胞画分を含む、方法。

項目３９：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記細胞画分が、母体細胞および胎児細胞の両方を含む、方法。

項目４０：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記生物学的試料が、血液試料である、方法。

項目４１：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記血液試料が、５～３０ｍＬである、方法。

項目４２：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記血液試料が、３０ｍＬの血液試料である、方法。

項目４３：上記の項目のいずれかに記載の方法であって、上記血液試料が、１０ｍＬの血液試料である、方法。

項目４４：出生前診断の方法であって：
（１）胎児を身ごもっている女性由来の血液試料を提供する工程；
（２）上記血液試料に含まれる細胞を胎児栄養膜細胞マーカーに対する少なくとも１種類の標識物質と接触させる工程；
（３）マイクロ流体素子により上記試料を胎児栄養膜細胞に関して濃縮する工程；
（４）上記試料を：
（ｉ）核に対する蛍光標識物質；
（ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質；
および
（ｉｉｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
の群のそれぞれから選択される少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程：
（５）少なくとも１個の胎児栄養膜細胞を
（ｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する上記蛍光標識物質の正の選択；
（ｉｉ）核に対する上記蛍光標識物質の正の選択；
および
（ｉｉｉ）母体細胞マーカーに対する上記蛍光標識物質の負の選択、
に基づき上記濃縮試料から蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で単一細胞選別する工程：
（６）上記胎児栄養膜細胞の遺伝子型を取得する工程；
および
（７）胎児の表現型を診断する工程、
を含む、方法。

要素
要素１：妊婦の生物学的試料から胎児細胞を単離する方法であって、
（ａ）上記妊婦由来の生物学的試料を提供する工程であって、生物学的試料が細胞画分を含む、工程；
（ｂ）上記細胞画分に含まれる細胞を、少なくとも１個の胎児細胞上皮マーカーおよび／または内皮マーカーに対する１種類以上の蛍光標識物質と接触させる工程；
（ｃ）細胞に結合した上記１種類以上の蛍光標識物質の検出に基づき蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により上記細胞を選別する工程；
および
（ｄ）個々の選別細胞に胎児起源識別子を割り振る工程を含む、上記選別細胞中の胎児細胞を識別する工程、
を含む、方法。

要素２：上記細胞画分が、ＦＡＣＳの前に胎児細胞に関して濃縮される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３：上記濃縮が、少なくとも１種類の内皮マーカーを発現する細胞を濃縮することを含む、要素２に記載の方法。

要素４：濃縮が、磁気活性化細胞選別を含む、要素２または３に記載の方法。

要素５：上記ＦＡＣＳが、各選別細胞について複数のパラメーターを定量化することを含む、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素６：上記パラメーターが、前方散乱および側方散乱などの散乱；核染色色素からの蛍光；少なくとも１種類の胎児性マーカーに結合した蛍光標識物質からの蛍光；および少なくとも１種類の母性マーカーに結合した蛍光標識物質からの蛍光である、要素５に記載の方法。

要素７：上記胎児性マーカーが、１種類以上の上皮マーカー（１種類以上のサイトケラチンなど）であり、および／または上記母性マーカーが、血球マーカー（ＣＤ１４および／またはＣＤ４５など）である、要素６に記載の方法。

要素８：さらなる１つのパラメーターが、内皮マーカー（ＣＤ１０５および／またはＣＤ１４１など）に対する１種類以上の蛍光標識物質からの蛍光である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素９：上記胎児起源識別子が、胎児性または非胎児性である細胞を分類するバイナリー識別子である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１０：上記胎児起源識別子が、胎児起源の確率である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１１：上記胎児起源識別子が、胎児細胞および母体細胞を含む学習セットを用いる人工知能、ニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、機械学習、回帰分析、または分類ツリーを用いて算出される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１２：上記回帰分析が、ロジスティック回帰である、要素１１に記載の方法。

要素１３：上記ロジスティック回帰が、定数パラメーターおよび確率を算出するための検出パラメーターの特定の値を含む、要素１２に記載の方法。

要素１４：上記選別細胞が、少なくとも１種類の上皮マーカーおよび／または内皮マーカーを発現しかつ血球に特異的な少なくとも１種類の細胞マーカーを発現しない細胞である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１５：少なくとも１種類の上皮マーカーについて陽性でありかつ上記少なくとも１種類の血球マーカーについて陰性または低値である細胞が、コンパートメントに選別され、好ましくは各コンパートメントが、１個の細胞のみを含む、要素１４に記載の方法。

要素１６：上記生物学的試料が、末梢血試料または子宮頸部塗抹である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１７：細胞画分が、上記末梢血試料の血漿から分離される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１８：上記細胞画分が、遠心分離によって上記血漿画分から分離される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素１９：上記細胞画分が、赤血球、白血球および胎児栄養膜細胞、胎児の絨毛外栄養膜細胞、および血管内胎児栄養膜細胞を含む、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２０：上記血漿画分から分離された後に血球を固定する工程をさらに含み、固定が好ましくは、パラホルムアルデヒド固定である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２１：上記血漿画分からの上記細胞画分の分離後に界面活性剤を用いて上記細胞画分の赤血球を選択的に溶血させる工程をさらに含み、上記溶解が、上記細胞画分の残りの細胞も透過性にする、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２２：上記生物学的試料が、子宮頸部塗抹である、要素１に記載の方法。

要素２３：上記子宮頸部塗抹が、粘液を溶解するために酢酸またはＤＤＴに供され、その後固定され、固定が好ましくは、パラホルムアルデヒド固定である、要素２２に記載の方法。

要素２４：子宮頸部塗抹由来の上記細胞画分が、胎児細胞および扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、白血球および赤血球を含む、要素２２および２３に記載の方法。

要素２５：上記胎児細胞が、細胞性栄養膜細胞および／または合胞体栄養膜細胞などの、栄養膜細胞である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２６：上記単離された胎児細胞が、母体遺伝子型とは異なる胎児遺伝子型を有することによって胎児細胞であると検証される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２７：単離された胎児細胞が、全ゲノム増幅に供される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素２８：上記検証が、短い縦列反復または一塩基多型（ＳＮＰ）の検出によって実施される、要素２６または２７に記載の方法。

要素２９：胎児起源の最も高い確率を有する２０個の細胞が、全ゲノム検証に供され、および／または最も高い確率を有する１５個の細胞など、例えば最も高い確率を有する１０個の細胞、最も高い確率を有する７個の細胞など、例えば最も高い確率を有する５個の細胞、最も高い確率を有する３個の細胞などの、胎児細胞であると検証される、要素２６または２７に記載の方法。

要素３０：１人の妊娠中の母親由来の１つの生物学的試料中の少なくとも１個の胎児細胞の識別をもたらし、生物学的試料が、少なくとも１５０ｍｉｏ（１５０ｘ１０^６）個の細胞、少なくとも２個の胎児細胞など、例えば少なくとも３個の胎児細胞を含む、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３１：上記少なくとも１種類の上皮マーカーが、ヒト・サイトケラチン１（ＣＫ１）、ヒト・サイトケラチン２（ＣＫ２）、ヒト・サイトケラチン３（ＣＫ３）、ヒト・サイトケラチン４（ＣＫ４）、ヒト・サイトケラチン５（ＣＫ５）、ヒト・サイトケラチン６（ＣＫ６）、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン１０（ＣＫ１０）、ヒト・サイトケラチン１３（ＣＫ１３）、ヒト・サイトケラチン１４（ＣＫ１４）、ヒト・サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、ヒト・サイトケラチン１６（ＣＫ１６）、ヒト・サイトケラチン１７（ＣＫ１７）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）から成る群から選択される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３２：上記少なくとも１種類の上皮マーカーが、ＣＫ７、ＣＫ１８またはそれらの組み合わせである、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３３：上皮マーカーに対する抗体が、同じ蛍光色素分子に連結される、要素３１および３２に記載の方法。

要素３４：上記少なくとも１種類の内皮マーカーが、トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）、ヒト・エンドグリン（ＣＤ１０５）、ヒト・ビメンチン（Ｖｉｍ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１；Ｆｌｔ－１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）、血管内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦＲ－３）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、内皮蛋白質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）から成る群から選択される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３５：上記少なくとも１種類の内皮マーカーが、ＣＤ１０５、ＣＤ１４１またはそれらの組み合わせである、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３６：上皮マーカーに対する抗体が、同じ蛍光色素分子で標識される、要素３４および３５に記載の方法。

要素３７：血球に特異的な上記少なくとも１種類の細胞マーカーが、ＣＤ１４および／またはＣＤ４５であり、好ましくは異なる血球マーカーに対する抗体が、同じ蛍光色素分子で標識される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３８：上記同定された胎児細胞が、上記少なくとも１種類の上皮マーカーおよび／または内皮マーカーを発現し、血球に特異的な上記少なくとも１種類の細胞マーカーを発現しない、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素３９：上記少なくとも１種類の核染用蛍光色素が、ＤＮＡ挿入色素、例えばヘキスト色素、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、７－ＡＡＤ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｒｕｂｙ Ｓｔａｉｎである、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素４０：上記１種類以上の蛍光標識物質が、少なくとも１つの蛍光色素分子により直接または間接的に標識される、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素４１：上記蛍光色素分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、およびＢＶ４２１から成る群から選択される、要素４０に記載の方法。

要素４２：上記蛍光標識物質が、２次標識物質により間接的に標識される、要素４０に記載の方法。

要素４３：上記蛍光標識物質が、抗体、ヌクレオチドプローブ、受容体リガンド、および／または他の特異的結合分子である、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素４４：上記ヌクレオチドプローブが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＬＮＡプローブである、要素４３に記載の方法。

要素４５：上記単離された胎児細胞のゲノムにおける遺伝的異常に関連する１種類以上のマーカーを検出する工程をさらに含む、上記の要素のいずれかに記載の方法。

要素４６：上記１種類以上の遺伝マーカーが、異数性、モノソミー、ポリソミー、トリソミー、コピー数のバリエーション（ＣＮＶ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または単一遺伝子病に関連する、要素４５に記載の方法。

要素４７：胎児における遺伝的異常を決定する方法であって、（ａ）上記の要素１～４６のいずれかに記載の方法により単離される１個以上の胎児細胞を取得する工程；
および
（ｂ）上記胎児細胞のゲノム中の上記遺伝的異常に関連する１種類以上の遺伝マーカーを検出する工程、
を含む、方法。

要素４８：上記１種類以上の遺伝マーカーが、マイクロアレイを基盤とする比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）、全ゲノム増幅、全ゲノムスキャン、ポロニーシーケンシング、ショットガンシーケンシング、超並列シーケンシング法（ＭＰＳＳ）、サンガー配列決定法、ＰＣＲを基盤とする方法および次世代シーケンシング法から成る群から選択される１種類以上の方法を用いて検出される、要素４７に記載の方法。

要素４９：上記次世代シーケンシング法が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：プロトン／ＰＧＭシーケンシングおよび／またはＳＯＬｉＤシーケンシングから成る群から選択され得る、要素４８に記載の方法。

要素５０：上記遺伝的異常が、異数性、モノソミー、ポリソミー、トリソミー、コピー数のバリエーション（ＣＮＶ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または単一遺伝子病である、要素４７に記載の方法。

Claims (38)

1. 出生前診断の方法であって
   （１）胎児を身ごもっている女性由来の血液試料を提供する工程、
   （２）前記血液試料に含まれる細胞を胎児栄養膜細胞マーカーに対する少なくとも１種類の磁気標識物質と接触させる工程、
   （３）前記試料を磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により胎児栄養膜細胞に関し濃縮する工程、
   （４）前記濃縮された細胞を
   （ｉ）核に対する蛍光標識物質、
   （ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質、および
   （ｉｉｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
   の群のそれぞれから選択される少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程
   （５）蛍光標識された細胞を蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で（ｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する前記蛍光標識物質の正の選択、
   （ｉｉ）核に対する前記蛍光標識物質の正の選択、および
   （ｉｉｉ）母体細胞マーカーに対する前記蛍光標識物質の負の選択、
   に基づいき前記濃縮試料から単一細胞選別する工程
   （６）単一選別された細胞から遺伝子型を取得することにより個別に選別された細胞に胎児起源識別子を割り振る工程を含む、前記選別された細胞中の胎児栄養膜細胞を識別する工程、および
   （７）胎児の表現型を診断する工程、
   を含む、方法。
2. 出生前診断の方法であって
   （１）胎児を身ごもっている女性由来の血液試料を提供する工程、
   （２）前記血液試料に含まれる細胞を
   （ｉ）核に対する蛍光標識物質、
   （ｉｉ）母体細胞マーカーに対する蛍光標識物質、および
   （ｉｉｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する蛍光標識物質、
   の群のそれぞれから選択される少なくとも１種類の蛍光標識物質と接触させる工程
   （３）前記試料を前記蛍光標識物質からの蛍光に基づき蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）で胎児栄養膜細胞に関し濃縮する工程、
   （４）蛍光標識された細胞をＦＡＣＳで
   （ｉ）胎児栄養膜細胞マーカーに対する前記蛍光標識物質の正の選択、
   （ｉｉ）核に対する前記蛍光標識物質の正の選択、および
   （ｉｉｉ）母体細胞マーカーに対する前記蛍光標識物質についての負の選択、
   に基づき前記濃縮した試料から単一細胞選別する工程、
   （５）前記胎児栄養膜細胞から遺伝子型を取得することにより個別に選別された細胞に胎児起源識別子を割り振る工程を含む、前記選別された細胞中の栄養膜細胞を識別する工程、および
   （６）胎児の表現型を診断する工程、
   を含む、方法。
3. 胎児栄養膜細胞マーカーに対する前記磁気および／または蛍光標識物質が、内皮マーカーまたは上皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
4. 胎児栄養膜細胞マーカーに対する前記磁気および／または蛍光標識物質が、内皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 前記内皮マーカーが、Ｔｈｙ－１（ＣＤ９０）、トロンボモジュリン（ＣＤ１４１）、ヒト・エンドグリン（ＣＤ１０５）、ヒト・ビメンチン（Ｖｉｍ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ）、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ－１；Ｆｌｔ－１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）、血管内皮増殖因子受容体３（ＶＥＧＦＲ－３）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ－１）、内皮蛋白質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ１４６、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＢ５、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ３および／またはＣＤ５９から選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記内皮マーカーが、ＣＤ１０５、ＣＤ９０および／またはＣＤ１４１である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
7. 前記内皮マーカーが、ＣＤ１０５および／またはＣＤ１４１である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 胎児栄養膜細胞マーカーに対する前記磁気および／または蛍光標識物質が、上皮マーカーに対する磁気および／または蛍光標識物質である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記上皮マーカーが、サイトケラチンである、上記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記上皮マーカーが、ヒト・サイトケラチン１（ＣＫ１）、ヒト・サイトケラチン２（ＣＫ２）、ヒト・サイトケラチン３（ＣＫ３）、ヒト・サイトケラチン４（ＣＫ４）、ヒト・サイトケラチン５（ＣＫ５）、ヒト・サイトケラチン６（ＣＫ６）、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン９（ＣＫ９）、ヒト・サイトケラチン１０（ＣＫ１０）、ヒト・サイトケラチン１３（ＣＫ１３）、ヒト・サイトケラチン１４（ＣＫ１４）、ヒト・サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、ヒト・サイトケラチン１６（ＣＫ１６）、ヒト・サイトケラチン１７（ＣＫ１７）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）などのサイトケラチンである、上記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記上皮マーカーが、サイトケラチン、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）および／またはヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記上皮マーカーが、ヒト・サイトケラチン７（ＣＫ７）、ヒト・サイトケラチン８（ＣＫ８）、ヒト・サイトケラチン１８（ＣＫ１８）および／またはヒト・サイトケラチン１９（ＣＫ１９）である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記蛍光標識物質が、抗体、ヌクレオチドプローブ、受容体リガンド、および／または他の特異的結合分子である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記少なくとも１種類の蛍光標識物質が、少なくとも１つの蛍光色素分子により直接的に標識される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
15. 前記少なくとも１種類の蛍光標識物質が、少なくとも１つの蛍光色素分子により間接的に標識される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
16. 前記蛍光色素分子が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、およびＢＶ４２１から成る群から選択される、請求項１４および１５に記載の方法。
17. 核に対する前記蛍光標識物質が、ヘキスト色素、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、７－ＡＡＤ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｓｔａｉｎ、ＳＹＴＯＸ Ｓｔａｉｎ、またはＳＹＴＯ Ｓｔａｉｎのいずれかから選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
18. 核に対する前記蛍光標識物質が、ヘキスト３３３４２である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
19. 母体細胞マーカーに対する前記蛍光標識物質が、白血球マーカーに対する蛍光標識物質である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
20. 前記白血球マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、および／またはＣＤ１９から選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
21. 前記白血球マーカーが、ＣＤ４５およびＣＤ１４である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
22. 前記白血球マーカーが、ＣＤ４５である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
23. 前記遺伝子型が、ＳＴＲ分析により取得される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
24. 前記遺伝子型が、ＳＮＰ分析により取得される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
25. 前記表現型が、胎児細胞のゲノムにおける遺伝的異常に関連する１種類以上のマーカーを検出することにより診断される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
26. 前記遺伝的異常が、マイクロアレイを基盤とする比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、短い縦列反復の分析（ＳＴＲ分析）、全ゲノム増幅、全ゲノムスキャン、ＳＮＰアレイ、ポロニーシーケンシング、ショットガンシーケンシング、超並列シーケンシング法（ＭＰＳＳ）、サンガー配列決定法、ＰＣＲを基盤とする方法および次世代シーケンシング法から選択される１種類以上の方法により検出される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
27. 前記次世代シーケンシング法が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：プロトン／ＰＧＭシーケンシングおよび／またはＳＯＬｉＤシーケンシングから成る群から選択され得る、上記請求項のいずれかに記載の方法。
28. 前記遺伝的異常が、異数性、モノソミー、ポリソミー、トリソミー、コピー数のバリエーション（ＣＮＶ）、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、または単一遺伝子病である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
29. 前記血液試料が、５～３０ｍＬである、上記請求項のいずれかに記載の方法。
30. 前記血液試料が、３０ｍＬの血液試料である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
31. 前記血液試料が、１０ｍＬの血液試料である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
32. 前記血液試料が、細胞画分を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
33. 細胞画分が、前記血液試料の血漿から分離される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
34. 前記細胞画分が、遠心分離により前記血漿画分から分離される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
35. 前記細胞画分が、母体細胞および胎児細胞の両方を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
36. 前記細胞画分が、赤血球、白血球および胎児栄養膜細胞、胎児の絨毛外栄養膜細胞、および血管内胎児栄養膜細胞を含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
37. 前記血漿画分から分離された後に血球を固定する工程をさらに含み、固定が、好ましくはパラホルムアルデヒド固定である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
38. 前記血漿画分からの前記細胞画分の分離後に界面活性剤を用いて前記細胞画分の赤血球を選択的に溶血させる工程をさらに含み、前記溶解が、前記細胞画分中の残りの細胞も透過性にする、上記請求項のいずれかに記載の方法。

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