ES2305481T3 - Anticuerpos contra el antigeno cancerigeno tmeff2 y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22, 24, 26 y 28; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 32 y 34.
Description
Anticuerpos contra el antígeno cancerígeno
TMEFF2 y usos de los mismos.
La invención se refiere a la identificación y
generación de anticuerpos que se unen específicamente a proteínas
TMEFF2 que están implicadas en cáncer; y al uso de tales
anticuerpos y composiciones que los comprenden en el diagnóstico,
pronóstico y terapia de cáncer.
El cáncer de próstata es el cáncer más
frecuentemente diagnosticado la segunda causa destacada de muerte
por cáncer en varones en Norteamérica y Europa del norte. La
detección temprana del cáncer de próstata usando una prueba sérica
para detectar el antígeno específico de la próstata (PSA) ha
mejorado de manera espectacular el tratamiento de la enfermedad
(Oesterling, 1992, J. Am. Med. Assoc. 267:2236-2238
y DiVita et al. (1997) Cancer: Principles and Practices of
Oncology, 5ª ed. Lippincott-Raven pub.). El
tratamiento del cáncer de próstata consiste en gran medida en
prostatectomía quirúrgica, radioterapia, terapia de ablación
androgénica y quimioterapia. Aunque muchos pacientes con cáncer de
próstata se tratan eficazmente, todas las terapias actuales pueden
inducir graves efectos secundarios que reducen la calidad de vida.
Por ejemplo, los pacientes que presentan enfermedad metastásica se
tratan lo más frecuentemente con terapia de ablación androgénica. La
castración química o quirúrgica ha sido el tratamiento principal
para el cáncer de próstata metastásico sintomático durante más de
50 años. Aunque esta terapia de privación de andrógenos
testiculares habitualmente da como resultado una estabilización o
regresión de la enfermedad (en el 80% de los pacientes), finalmente
se desarrolla la progresión del cáncer de próstata metastásico
(Panvichian et al., Cancer Control
3(6):493-500 (1996); Afrin y Stuart, 1994,
J.S.C. Med. Assoc. 90:231- 236). La enfermedad metastásica se
considera actualmente incurable. Por tanto, los objetivos
principales del tratamiento son prolongar la supervivencia y mejorar
la calidad de vida (Rago, Cancer Control
5(6):513-521 (1998)).
Claramente, la identificación de dianas
terapéuticas y marcadores de diagnóstico novedosos es esencial para
mejorar el tratamiento actual de los pacientes con cáncer de
próstata. Avances recientes en medicina molecular han aumentado el
interés en antígenos de superficie de células específicas de tumor
que podrían servir como dianas para diversas estrategias
inmunoterapéuticas o de molécula pequeña. Los antígenos adecuados
para estrategias inmunoterapéuticas deben expresarse altamente en
tejidos cancerígenos y de manera ideal no en tejidos adultos
normales. Un antígeno de este tipo es TMEFF2.
La proteína TMEFF2 contiene dos dominios
similares a folastatina y un dominio similar a EGF conservado. El
gen que codifica para la proteína se caracterizó por primera vez a
partir de una biblioteca de ADNc de cerebro humano (véase Uchida,
et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun.
266:593-602), y se aisló más tarde a partir de una
biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (véase Horie, et
al. (2000) Genomics 67:146-152). Uchida et
al. también dan a conocer antisueros policlonales y un
anticuerpo monoclonal contra TMEFF2. Véase también, por ejemplo,
Online Mendelian Inheritance in Man, número 605734; Unigene Cluster
Hs.22791; LocusLink 23671; y otros sitios vinculados. TMEFF2 se ha
denominado también tomorregulina, TR, gen 1 de poliposis
hiperplásica, HPP1 y TENB2. La secuencia de ácido nucleico de
TMEFF2 puede identificarse mediante los números de registro de la
ATCC AF264150, AB004064, AB017269 y AF179274. La secuencia de
aminoácidos de TMEFF2 puede identificarse mediante los números de
registro de la ATCC AAF91397, BAA90820, BAA87897 y AAD55776. El
número de identificación de UniGene Cluster de TMEFF2 es hs.22791,
el número de identificación de Locuslink es 23671 y el número de
identificación de OMIM es 605734.
También se ha implicado al gen en ciertos
estados cancerosos. Young, et al. (2001) Proc. Nat'l Acad.
Sci. USA 98:265-270 notificaron su expresión en
pólipos colorrectales. Glynne-Jones, et al.
(2001) Int. J. Cancer 94:178-184 notificaron que
podría ser un marcador para el cáncer de próstata.
Tratamientos tales como cirugía, radioterapia y
crioterapia son potencialmente curativos cuando el cáncer permanece
localizado. Por lo tanto, la detección temprana del cáncer es
importante para un pronóstico positivo para el tratamiento.
Por tanto, serían deseables anticuerpos que
puedan usarse para el diagnóstico y pronóstico y el tratamiento
eficaz de cáncer, e incluyendo particularmente cáncer metastásico.
En consecuencia, se proporcionan en el presente documento
composiciones y usos que pueden usarse en el diagnóstico, pronóstico
y la terapia de ciertos cánceres.
La presente invención proporciona anticuerpos
anti-TMEFF2 que de manera sorprendente se
internalizan bien y son particularmente útiles para preparar
anticuerpos conjugados para fines terapéuticos. En algunas
realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son
terapéuticamente útiles en personas diagnosticadas con cáncer y
otros estados proliferativos, incluyendo estados proliferativos
benignos. En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención
pueden usarse para tratar estados proliferativos de la próstata
incluyendo, por ejemplo, hiperplasia prostática benigna y cáncer de
próstata. En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención
pueden usarse para tratar estados proliferativos malignos y
benignos del cerebro incluyendo, por ejemplo, glioblastomas,
oligodendrogliomas, astrocitomas anaplásicos, meningiomas,
meduloblastomas y neuroblastomas.
En particular, la presente invención proporciona
anticuerpos anti-TMEFF2 que son particularmente
útiles como agentes citotóxicos selectivos para células que
expresan TMEFF2. Sin desear restringirse por la teoría, se cree que
los anticuerpos de la invención reconocen un epítopo de TMEFF2 que
efectúa un aumento de la internalización, y por tanto una
destrucción celular potenciada, cuando está conjugado con un resto
citotóxico.
La presente invención proporciona anticuerpos
que inhiben de manera competitiva la unión de TMEFF2 nº 19 (número
de registro de la ATCC PTA-4127) a TMEFF2. En
algunas realizaciones, los anticuerpos están conjugados además con
un componente efector. El componente efector puede ser un marcador
(por ejemplo, un marcador fluorescente) o puede ser un resto
citotóxico (por ejemplo, un radioisótopo o un producto químico
citotóxico). Un producto citotóxico a modo de ejemplo es
auristatina.
Los anticuerpos de la invención pueden ser
anticuerpos completos o pueden ser fragmentos de anticuerpo. En
algunas realizaciones, la inmunoglobulina es un anticuerpo
humanizado. Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invención es
TMEFF2 nº 19 (Número de registro de la ATCC
PTA-4127).
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente
aceptable y el anticuerpo de la invención. En estas realizaciones,
el anticuerpo puede estar conjugado además con un componente
efector. El componente efector puede ser un marcador (por ejemplo,
un marcador fluorescente) o puede ser un resto citotóxico (por
ejemplo, un radioisótopo o un producto químico citotóxico). Un
producto químico citotóxico a modo de ejemplo es auristatina. Los
anticuerpos de las composiciones farmacéuticas pueden ser
anticuerpos completos o pueden ser fragmentos de anticuerpo. En
algunas realizaciones, la inmunoglobulina es un anticuerpo
humanizado. Un anticuerpo a modo de ejemplo TMEFF2 nº 19 (Número de
registro de la ATCC PTA-4127).
La invención proporciona además inmunoensayos
que usan las inmunoglobulinas de la invención. Estos implican
detectar una célula de cáncer de próstata en una muestra biológica
de un paciente poniendo en contacto la muestra biológica con un
anticuerpo de la invención. El anticuerpo está normalmente
conjugado con un marcador tal como un marcador fluorescente.
La invención proporciona la inhibición de la
proliferación de una célula asociada del cáncer de próstata. Esto
comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo de la
invención. En la mayoría de las realizaciones, la célula cancerígena
está en un paciente, normalmente un ser humano. El paciente puede
estar sometiéndose a un régimen terapéutico para tratar un cáncer
de próstata metastásico o puede sospecharse que tiene un cáncer de
próstata. La invención también proporciona tratar un cáncer de
próstata con un anticuerpo frente a TMEFF2, en el que dicho cáncer
de próstata se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de
próstata primario, cáncer de próstata metastásico, cáncer de
próstata localmente avanzado, cáncer de próstata andrógeno
independiente, cáncer de próstata que se ha tratado con terapia
neoadyuvante y cáncer de próstata que es resistente al tratamiento
con terapia neoadyuvante.
La presente invención proporciona reactivos y
usos novedosos contra TMEFF2 para el tratamiento, diagnóstico y
pronóstico de ciertos cánceres. En particular, la presente
invención proporciona anticuerpos anti-TMEFF2 que
son particularmente útiles como agentes citotóxicos selectivos para
células que expresan TMEFF2. Sin desear restringirse por la teoría,
se cree que los anticuerpos de la invención reconocen un epítopo de
TMEFF2 que efectúa una internalización aumentada y por tanto una
destrucción celular potenciada, cuando están conjugados con un resto
citotóxico. Además, los anticuerpos de la invención son útiles
porque reconocen la forma no glicosilada de la proteína. Esto es
ventajoso porque los anticuerpos que reconocen la parte glicosilada
de la proteína sólo pueden reconocer un subconjunto de las proteínas
expresadas. La invención se basa, en parte, en el análisis de
aproximadamente 100 sobrenadantes de hibridoma. Se llevó a cabo el
mapeado de epítopos de anticuerpos que mostraban unión de alta
afinidad a través de análisis de unión competitiva. Usando esta
metodología, se identificaron anticuerpos que reconocían varios
epítopos individuales. Entonces se evaluaron los anticuerpos para
determinar la muerte celular dependiente de TMEFF2 in vitro.
Usando estos métodos, se identificaron anticuerpos que provocaban
una muerte celular significativa.
"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido
que comprende una región de entramado de un gen de inmunoglobulina,
o fragmentos de la misma, que se une y reconoce específicamente un
antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los
genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta,
épsilon y mu, así como los miles de genes de regiones variables de
inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican o bien como
kappa o bien como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como
gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases
de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Normalmente, la región de unión a antígeno de un anticuerpo o su
equivalente funcional será la más crítica en especificidad y
afinidad de unión. Véase Paul, Fundamental Immunology. Sin embargo,
existen métodos recombinantes para quimerizar y generar clases
cambiadas y funciones efectoras.
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Una unidad estructural de inmunoglobulina
(anticuerpo) a modo de ejemplo comprende un tetrámero de cuatro
polipéptidos. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos
de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena
"ligera" (aproximadamente de 25 kD) y una "pesada"
(aproximadamente de 50-70 kD). El extremo
N-terminal de cada cadena define una región variable
de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable
principalmente del reconocimiento del antígeno. Las expresiones
cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se
refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.
Existen anticuerpos, por ejemplo, como
inmunoglobulinas intactas o como un número de varios fragmentos
bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas
peptidasas. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un
anticuerpo por debajo de los puentes disulfuro en la región de
bisagra para producir F(ab')_{2}, un dímero de Fab que por
sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CHI
mediante un puente disulfuro. El F(ab')_{2} puede
reducirse en condiciones suaves para romper el puente disulfuro en
la región de bisagra, convirtiendo de ese modo el dímero
F(ab')_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es
esencialmente Fab con parte de la región de bisagra (véase
Fundamental Immunology (Paul ed., 3ª ed. 1993). Aunque se definen
varios fragmentos de anticuerpo en cuanto a la digestión de un
anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que tales
fragmentos pueden sintetizarse de novo o bien químicamente o bien
usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término
anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, también
incluye fragmentos de anticuerpo o bien producidos mediante la
modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo
usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena
sencilla) o bien los identificados usando bibliotecas de
presentación en fagos (véase, por ejemplo, McCafferty, et al.
(1990) Nature 348:552-554).
Para la preparación de anticuerpos, por ejemplo,
anticuerpos recombinantes, monoclonales o policlonales, pueden
usarse muchas técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo,
Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; Kozbor,
et al. (1983) Immunology Today 4:72; Cole, et al.,
págs. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy (1985); Coligan (1991) Current Protocols in Immunology;
Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual; y Goding
(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed.).
Pueden adaptarse técnicas para la producción de anticuerpos de
cadena sencilla (Patente estadounidense 4.946.778) para producir
anticuerpos frente a polipéptidos de esta invención. Además, pueden
usarse ratones transgénicos u otros organismos tales como otros
mamíferos para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente,
puede usarse la tecnología de presentación en fagos para
identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen
específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo,
McCafferty, et al. (1990) Nature 348:552-554;
Marks, et al. (1992) Biotechnology
10:779-783).
Un "anticuerpo químérico" es una molécula
de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una parte de la
misma, está alterada, sustituida o intercambiada de modo que el
sitio de unión a antígeno (región variable) está unido a una región
constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o
especie, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas
propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo una enzima,
toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la
región variable, o una parte de la misma, está alterada, sustituida
o intercambiada por una región variable que tiene una especificidad
de antígeno diferente o alterada.
"Epítopo" o "determinante antigénico"
se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo.
Pueden formarse epítopos tanto a partir de aminoácidos contiguos
como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento
terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de
aminoácidos contiguos se conservan normalmente con la exposición a
disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados
mediante plegamiento terciario normalmente se pierden con el
tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye
normalmente al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 ó
8-10 aminoácidos en una única conformación
espacial. Los métodos de determinación de la conformación espacial
de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y
resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo,
"Epitope Mapping Protocols" en Morris (ed. 1996) Methods in
Molecular Biology, Vol. 66.
La expresión "proteína TMEFF2" o
"polinucleótido de TMEFF2" se refiere a variantes, alelos,
mutantes y homólogos interespecie polimórficos de polipéptido y de
ácido nucleico que: (1) tienen una secuencia de nucleótidos que
tiene una identidad en la secuencia de nucleótidos aproximadamente
superior al 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferiblemente el
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o una identidad en la
secuencia de nucleótidos superior, preferiblemente a lo largo de
una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o
más nucleótidos, con respecto a una secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO: 1; (2) se unen a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos
policlonales, producidos contra un inmunógeno que comprende una
secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y variantes modificadas de manera
conservativa de la misma; (3) hibridan específicamente en
condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de ácido
nucleico, o el complemento de la misma de SEQ ID NO: 1 y variantes
modificadas de manera conservativa de la misma o (4) tienen una
secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de
aminoácidos aproximadamente superior al 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, preferiblemente el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%
o 99% o una identidad en la secuencia de aminoácidos superior,
preferiblemente a lo largo de una región de al menos
aproximadamente 25, 50, 100, 200, o más aminoácidos, con respecto a
una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Una secuencia
polinucleotídica o polipeptídica es normalmente de un mamífero
incluyendo, pero sin limitarse a, un primate, por ejemplo, un ser
humano; un roedor, por ejemplo, una rata, un ratón, un hámster; una
vaca, un cerdo, un caballo, una oveja u otro mamífero. Un
"polipéptido TMEFF2" y un "polinucleótido de TMEFF2",
incluyen tanto formas recombinantes como formas que se producen de
manera natural. Véase, por ejemplo, LocusLink 23671.
Una proteína o ácido nucleico de TMEFF2 de
"longitud completa" se refiere a una secuencia polipeptídica o
polinucleotídica de cáncer de próstata, o una variante de la misma,
que contiene todos los elementos normalmente contenidos en una o más
secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas de TMEFF2 de tipo
natural, que se producen de manera natural. Por ejemplo, un ácido
nucleico de TMEFF2 de longitud completa comprenderá normalmente
todos los exones que codifican para la proteína que se produce de
manera natural, de longitud completa. La "longitud completa"
puede ser antes o tras diversas fases de procesamiento o corte y
empalme tras la traducción, incluyendo corte y empalme
alternativo.
"Muestra biológica", tal como se usa en el
presente documento, es una muestra de tejido o fluido biológico que
contiene ácidos nucleicos o polipéptidos, por ejemplo, de una
proteína, polinucleótido o transcrito de TMEFF2. Tales muestras
incluyen, pero no se limitan a, tejido aislado de primates, por
ejemplo, seres humanos o roedores, por ejemplo, ratones y ratas.
Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos
tales como muestras de biopsias y autopsias, secciones congeladas
tomadas para fines histológicos, sangre, plasma, suero, esputos,
heces, lágrimas, mucosidades, cabellos, piel, etc. Las muestras
biológicas también incluyen explantes y cultivos celulares
primarios y/o transformados derivados de tejidos del paciente.
Normalmente, se obtiene una muestra biológica a partir de un
organismo eucariota, lo más preferiblemente un mamífero tal como un
primate, por ejemplo un chimpancé o un ser humano; una vaca; un
perro; un gato; un roedor, por ejemplo, una cobaya, una rata, un
ratón; un conejo; o un ave; un reptil; o un pez.
"Proporcionar una muestra biológica"
significa obtener una muestra biológica para su uso en los métodos
descritos en esta invención. Lo más frecuentemente, esto se
realizará extrayendo una muestra de células de un animal, pero
también puede lograrse usando células previamente aisladas (por
ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o para otro
fin). Serán particularmente útiles tejidos de archivo, que tienen
una historia de tratamiento o resultado.
La expresión "estadio del cáncer de
próstata" o equivalentes gramaticales de la misma se refieren al
tamaño de un cáncer y si se ha diseminado más allá de su sitio
original. El cáncer de próstata se divide generalmente en cuatro
estadios, desde pequeño y localizado (estadio 1) hasta diseminado
en el tejido circundante (estadio 3 y 4). Si el cáncer se ha
diseminado a otras partes del organismo, esto se conoce como cáncer
de próstata secundario (o cáncer de próstata metastásico). Hay dos
sistemas de clasificación por estadios del cáncer de próstata, el
sistema convencional de la Asociación Urológica Americana (American
Urological Association) y un nuevo sistema basado en la detección
del cáncer de próstata mediante pruebas de antígeno de la próstata
en suero (PSA). El nuevo sistema se conoce como el sistema de Tumor,
Ganglios y metástasis o TNM. En el sistema convencional de la AUA,
el estadio A corresponde a un cáncer de próstata no sospechoso
clínicamente. El estadio B corresponde a un tumor confinado en la
glándula prostática (localizado). El estadio C corresponde a un
tumor por fuera de la cápsula prostática, y el estadio D corresponde
a la metástasis en el ganglio linfático pélvico. El estadio D2 es
un cáncer metastásico distante en los ganglios linfáticos
distantes, órganos, tejido blando o hueso.
En el sistema TNM los estadios incluyen T1: el
tumor está dentro de la glándula prostática y es demasiado pequeño
para detectarse durante un examen rectal, pero puede detectarse a
través de pruebas tales como una prueba de PSA. Generalmente, no
hay síntomas. T2: el tumor está todavía dentro de la glándula
prostática pero es lo suficientemente grande para sentirse durante
un examen rectal digital o ponerse de manifiesto con ultrasonidos.
A menudo no hay síntomas. T3/T4: el cáncer se ha diseminado más
allá de la glándula prostática en los tejidos circundantes. Este se
conoce como cáncer de próstata localmente avanzado. Los tumores T1 y
T2 se conocen como cáncer de próstata temprano. T3 y T4 se conoces
como cáncer de próstata localmente avanzado. Si están afectados los
ganglios linfáticos, huesos u otras partes del cuerpo, se denomina
cáncer secundario o metastásico. "Cáncer de próstata localmente
avanzado" se refiere a cáncer de próstata que muestra algunas
pruebas de metástasis, o metástasis en desarrollo.
La expresión "terapia neoadyuvante" también
conocida como "terapia de privación de andrógenos
neoadyuvante" se refiere al tratamiento del cáncer de próstata
administrando fármacos bloqueantes de la hormona adyuvante antes de
la cirugía.
Los términos "idéntico" o "identidad"
en porcentaje, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o
secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o
subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado
de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (por
ejemplo, aproximadamente el 60% de identidad, preferiblemente un
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99%, o una identidad superior a lo largo de una región
especificada, cuando se comparan y alinean para una correspondencia
máxima a lo largo de un intervalo de comparación o región
designada) tal como se mide usando algoritmos de comparación de
secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto descritos a
continuación, o mediante alineamiento manual e inspección visual
(véase, por ejemplo, el sitio de Internet del NCBI ("National
Center for biotechnology Information", Centro nacional para la
Información Biotecnológica) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o
similares). Se dice entonces que tales secuencias son
"sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere
a, o puede aplicarse a, el cumplimiento de una secuencia de prueba.
La definición también incluye secuencias que tienen deleciones y/o
adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones, así como las
que se producen de manera natural, por ejemplo, variantes
polimórficas o alélicas, y variantes preparadas por el hombre. Tal
como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden
explicar huecos y similares. Preferiblemente, existe identidad a lo
largo de una región que tiene al menos 25 aminoácidos o nucleótidos
de longitud, o más preferiblemente a lo largo de una región que
tiene 50-100 aminoácidos o nucleótidos de
longitud.
Para la comparación de secuencias, normalmente
una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se
comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de
comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y
de referencia en un ordenador, se designan coordenadas de
subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del
programa de algoritmo de secuencia. Preferiblemente, pueden usarse
los parámetros del programa por defecto, o pueden designarse
parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias
calcula entonces las identidades de secuencia en porcentaje para las
secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia,
basándose en los parámetros del programa.
Un "intervalo de comparación", tal como se
usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de
una de las varias posiciones contiguas seleccionadas del grupo que
consiste normalmente en desde aproximadamente 20 hasta 600, de
manera habitual de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, de
manera más habitual de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en
el que puede compararse una secuencia con una secuencia de
referencia del mismo número de posiciones contiguas tras alienar
óptimamente las dos secuencias. Se conocen bien en la técnica
métodos de alineamiento de secuencias para comparación. Puede
realizarse el alineamiento óptimo de secuencias para comparación,
por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de
alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitudes de
Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444,
mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP,
BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Genetics de la
Universidad de Wisconsin, Grupo Computacional de Genética, 575
Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e
inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (eds.
1995 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology).
Los ejemplos preferidos de algoritmos que son
adecuados para determinar la identidad de secuencia y la similitud
de secuencia en porcentaje incluyen los algoritmos BLAST y BLAST
2.0, que se describen en Altschul, et al. (1977) Nuc. Acids
Res. 25:3389-3402 y Altschul, et al. (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST y BLAST 2.0 se
usan, con los parámetros descritos en el presente documento, para
determinar la identidad de secuencia en porcentaje para los ácidos
nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar
análisis mediante BLAST está disponible públicamente a través del
Centro Nacional para la Información Biotecnológica
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer
lugar identificar pares de secuencia de puntuación alta (HSP)
identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de
consulta, que o bien se aparean o bien satisfacen alguna puntuación
T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la
misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina
umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al.,
citado anteriormente). Estas coincidencias de palabras vecinas
iniciales actúan como simientes para iniciar búsquedas para
encontrar HSP mayores que las contienen. Las coincidencias de
palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada
secuencia para que pueda aumentarse el alineamiento acumulativo. Se
calculan las puntuaciones acumulativas usando, por ejemplo, para
secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de
recompensa para un par de residuos apareados; siempre > 0) y N
(puntuación de penalización para residuos con apareamiento erróneo;
siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz
de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. Se detiene la
extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección
cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo cae mediante la
cantidad X desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulativa
llega hasta cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más
alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el
final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W,
T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El
programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa una longitud
de palabra por defecto (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5,
N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de
aminoácidos, el programa BLASTP usa un longitud de palabra por
defecto de 3, una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación
BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:10915), alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5,
N=-4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
90:5873-5787). Una medición de la similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más
pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad por la que se produciría un apareamiento entre dos
secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo,
un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de
referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una
comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de
referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente
inferior a aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente inferior a
aproximadamente 0,001. Los valores de log pueden ser números
negativos grandes, por ejemplo 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110,
150, 170, etc.
Una indicación de que dos secuencias de ácido
nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el
polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene
reactividad cruzada inmunológica con los anticuerpos producidos
contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal
como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es
normalmente idéntico de manera sustancial a un segundo polipéptido,
por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo por
sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias
de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos
moléculas o sus complementos hibridan entre sí en condiciones
rigurosas, tal como se describe a continuación. Aún otra indicación
de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente
idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar
las secuencias.
\newpage
Una "célula huésped" es una célula que se
produce de manera natural o una célula transformada que contiene un
vector de expresión y sustenta la replicación o expresión del
vector de expresión. Células huésped pueden ser células cultivadas,
explantes, células in vivo y similares. Células huésped
pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células
eucariotas tales como células de levaduras, insectos, anfibios o
mamíferos tales como CHO, HeLa y similares (véase, por ejemplo, el
catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo o su sitio de
Internet, www.atcc.org).
Los términos "aislado", "purificado" o
"biológicamente puro" se refieren a material que está
sustancial o esencialmente libre de componentes que lo acompañan
normalmente tal como se encuentra en su estado nativo. La pureza y
homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de química
analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o
cromatografía de líquidos de alta resolución. Una proteína o ácido
nucleico que es la especie predominante presente en una preparación
está sustancialmente purificada. En particular, un ácido nucleico
aislado está separado de algunos marcos de lectura abiertos que
flanquean de manera natural al gen y que codifican para proteínas
diferentes de la proteína codificada por el gen. El término
"purificado" en algunas realizaciones indica que un ácido
nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel
electroforético. Preferiblemente, significa que el ácido nucleico o
proteína es al menos pura al 85%, más preferiblemente al menos pura
al 95% y lo más preferiblemente al menos pura al 99%. "Pureza"
o "purificación" en otras realizaciones significa eliminar al
menos un contaminante de la composición que va a purificarse. En
este sentido, la purificación no requiere que el compuesto
purificado sea homogéneo, por ejemplo, puro al 100%.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente
documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido.
Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o
más residuos de aminoácido son un mimético químico artificial de un
aminoácido que se produce de manera natural correspondiente, así
como a polímeros de aminoácidos que se producen de manera natural,
aquéllos que contienen residuos modificados y polímero de
aminoácidos que se producen de manera no natural.
El término "aminoácido" se refiere a
aminoácidos sintéticos y que se producen de manera natural, así
como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que
funcionan de manera similar a los aminoácidos que se producen de
manera natural. Los aminoácidos que se producen de manera natural
son los codificados por el código genético, así como los
aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina,
y-carboxiglutamato y 0-fosfoserina.
Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma
estructura química básica que un aminoácido que se produce de
manera natural, por ejemplo, un carbono a que está unido a un
hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por
ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina
metil sulfonio. Tales análogos pueden tener grupos R modificados
(por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas
modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que
un aminoácido que se produce de manera natural. Miméticos de
aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una
estructura que es diferente de la estructura química general de un
aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido que
se produce de manera natural.
Los aminoácidos pueden denominarse en el
presente documento o bien mediante sus símbolos de tres letras
comúnmente conocidos o bien mediante los símbolos de una letra
recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica
("Biochemical Nomenclature Commission") de la
IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden
denominarse mediante sus códigos de una única letra comúnmente
aceptados.
"Variantes modificadas conservativamente"
se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico.
Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes
modificadas conservativamente se refiere a los ácidos nucleicos que
codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente
idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica para una
secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas o
asociadas, por ejemplo, contiguas de manera natural. Debido a la
degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos
funcionalmente idénticos codifican para la mayoría de las
proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican
todos para el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en
la que se especifica una alanina por un codón, el codón puede
alterarse hasta otro de los codones correspondientes descritos sin
alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido
nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de
variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido
nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido
también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un
experto reconocerá que en ciertos contextos puede modificarse cada
codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el
único codón para la metionina, y TGG, que es habitualmente el único
codón para el triptófano) para proporcionar una molécula
funcionalmente idéntica. En consecuencia, a menudo están implícitas
variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido en una secuencia descrita con respecto al producto de
expresión, pero no con respecto a secuencias de sonda reales.
Como con las secuencias de aminoácidos, un
experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones
individuales en una secuencia de ácido nucleico, peptídica,
polipeptidica o de proteína que alteran, añaden o delecionan un
único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la
secuencia codificada son una "variante modificada
conservativamente" en la que la alteración da como resultado la
sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.
Se conocen bien en la técnica tablas de sustituciones conservativas
que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Tales
variantes modificadas conservativamente son además de y no excluyen
variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la
invención. Sustituciones conservativas típicas de uno por otro: 1)
alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico
(E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K);
5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6)
fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (1IV); 7) serina (S),
treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (véase, por ejemplo,
Creighton (1984) Proteins).
Pueden describirse estructuras macromoleculares
tales como estructuras polipeptídicas en cuanto a diversos niveles
de organización. Para una discusión general de esta organización,
véase, por ejemplo, Alberts, et al. (1994) Molecular Biology
of the Cell (3a ed.) y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical
Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules.
"Estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos
de un péptido particular. "Estructura secundaria" se refiere a
estructuras localmente ordenadas, tridimensionales dentro de un
polipéptido. Estas estructuras se conocen comúnmente como dominios.
Los dominios son partes de un polipéptido que a menudo forman una
unidad compacta del polipéptido y que tienen normalmente de 25 a
aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Los dominios típicos
están constituidos por secciones de organización menor tales como
tramos de lámina R y hélices a. "Estructura terciaria" se
refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero
polipeptídico. "Estructura cuaternaria" se refiere a la
estructura tridimensional formada, habitualmente mediante la
asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los
términos anisotrópicos también se conocen como términos de
energía.
Un "marcador" o "resto detectable" es
una composición detectable por medios espectroscópicos,
fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios
físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen colorantes
fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo, tales
como las usadas comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o
haptenos y proteínas u otras entidades que pueden detectarse, por
ejemplo, mediante la incorporación de un radiomarcador en el péptido
o usarse para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el
péptido. El radioisótopo puede ser, por ejemplo ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{35}S o ^{125}I. En algunos casos, particularmente
usando anticuerpos contra las proteínas de la invención, los
radioisótopos se usan como restos tóxicos, tal como se describe a
continuación. Los marcadores pueden incorporarse en los
anticuerpos, proteínas y ácidos nucleicos de TMEFF2 en cualquier
posición. Puede emplearse un método conocido en la técnica para
conjugar el anticuerpo con el marcador, incluyendo los métodos
descritos por Hunter, et al. (1962) Nature 144:945; David,
et al. (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al.
(1981) J. Immunol. Meth. 40:219; y Nygren (1982) J. Histochem. and
Cytochem. 30:407. La vida de las composiciones de péptidos
radiomarcados o anticuerpos radiomarcados puede extenderse mediante
la adición de sustancias que estabilizan el péptido o anticuerpo
radiomarcado y lo protegen de la degradación. Puede usarse
cualquier sustancia o combinación de sustancias que estabilizan el
péptido o anticuerpo radiomarcado incluyendo las sustancias dadas a
conocer en la patente estadounidense número 5.961.955.
Un "efector" o "resto efector" o
"componente efector" es una molécula que está enlazada (o
unida o conjugada), o bien covalentemente a través de un conector o
un enlace químico, o bien no covalentemente a través de enlaces
iónicos, de van der Waals, electrostáticos o puentes de hidrógeno, a
un anticuerpo. El "efector" puede ser una variedad de
moléculas incluyendo, por ejemplo, restos de detección que incluyen
compuestos radiactivos, compuestos fluorescentes, una enzima o
sustrato, marcadores tales como marcadores de epítopo, una toxina;
restos activables, un agente quimioterapéutico, una lipasa; un
antibiótico; o un radioisótopo que emite radiación "dura", por
ejemplo, beta.
El término "recombinante" cuando se usa con
referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína o
vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se
ha modificado mediante la introducción de una proteína o ácido
nucleico heterólogo o la alteración de una proteína o ácido
nucleico nativo, o que la célula se deriva de una célula así
modificada. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes
expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no
recombinantes) de la célula o expresan genes nativos que de otra
manera se expresan de manera anómala, se subexpresan o no se
expresan en absoluto. Mediante la expresión "ácido nucleico
recombinante" se quiere decir en el presente documento un ácido
nucleico, originalmente formado in vitro, en general,
mediante la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, usando
polimerasas y endonucleasas, en una forma no encontrada normalmente
en la naturaleza. De esta manera, se logra el ligamiento operativo
de diferentes secuencias. Por tanto, un ácido nucleico aislado, en
forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro
mediante ligamiento de moléculas de ADN que normalmente no se unen,
se consideran ambos recombinantes para los fines de esta invención.
Se entiende que una vez que se prepara un ácido nucleico
recombinante y se reintroduce en una célula u organismo huésped, se
replicará de manera no recombinante, por ejemplo, usando la
maquinaria celular in vivo de la célula huésped en lugar de
manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos
nucleicos, una vez producidos de manera recombinante, aunque
posteriormente se repliquen de manera no recombinante, se
consideran todavía recombinantes para los fines de la invención. De
manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína
preparada usando técnicas recombinantes, por ejemplo, a través de la
expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se describió
anteriormente.
El término "heterólogo" cuando se usa con
referencia a partes de un ácido nucleico indica que el ácido
nucleico comprende dos o más subsecuencias que normalmente no se
encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por
ejemplo, el ácido nucleico se produce normalmente de manera
recombinante, teniendo dos o más secuencias, por ejemplo, a partir
de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido
nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente
y una región codificante a partir de otra fuente. De manera similar,
una proteína heteróloga se referirá a menudo a dos o más
subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en
la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Un "promotor" se define como una serie de
secuencias control de ácido nucleico que dirigen la transcripción
de un ácido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, un
promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del
sitio de iniciación de la transcripción, tales como, en el caso de
un promotor del tipo de la polimerasa II, un elemento TATA. Un
promotor también incluye opcionalmente elementos represores o
potenciadores distales, que pueden ubicarse como máximo a mil pares
de bases desde el sitio de iniciación de la transcripción. Un
promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la
mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor
"inductible" es un promotor que es activo en regulación
ambiental o de desarrollo. La expresión "operativamente unido"
se refiere a un ligamiento funcional entre una secuencia control de
la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor, o una serie
de sitios de unión de factores de transcripción) y una segunda
secuencia de ácido nucleico, en el que la secuencia control de la
expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente
a la segunda secuencia.
Un "vector de expresión" es un constructo
de ácido nucleico, generado de manera recombinante o sintética, con
una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten
la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula
huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido,
virus o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, el vector de
expresión incluye un ácido nucleico que va a transcribirse
operativamente unido a un promotor.
La frase "se une específica (o
selectivamente)" a un anticuerpo o "específica (o
selectivamente) inmunorreactivo con", cuando se refiere a una
proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es
determinante de la presencia de la proteína, en una población
heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por lo tanto,
en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos
especificados se unen a unas secuencias proteicas particulares al
menos dos veces el fondo y más normalmente más de 10 a 100 veces el
fondo.
La unión específica de un antibiótico en tales
condiciones requiere que se seleccione un anticuerpo por su
especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, pueden
seleccionarse anticuerpos policlonales producidos frente a una
proteína particular, variantes polimórficas, alelos, ortólogos y
variantes modificadas conservativamente, o variantes de corte y
empalme, o partes de los mismos, para obtener sólo aquellos
anticuerpos policlonales que son específicamente inmnorreactivos
con TMEFF2 y no con otras proteínas. Esta selección puede lograrse
quitando los anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con otras
moléculas. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo
para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con
una proteína particular. Por ejemplo, se usan de manera rutinaria
inmunoensayos por ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos
específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por
ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual para
una descripción de formatos y condiciones que pueden usarse para
determinar la inmunorreactividad específica).
"Célula tumoral" se refiere a células
precancerosas, cancerosas y normales en un tumor.
"Células de cáncer", células
"transformadas" o "transformación" en cultivo de tejidos,
se refiere a cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no
implican necesariamente la captación de nuevo material genético.
Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus
transformante y la incorporación de nuevo ADN genómico, o la
captación de ADN exógeno, también puede surgir espontáneamente o
tras la exposición a un carcinógeno, mutando de ese modo un gen
endógeno. La transformación está asociada con cambios fenotípicos,
tales como la inmortalización de células, control aberrante del
crecimiento, cambios no morfológicos y/o malignidad (véase,
Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique (3ª ed.).
Los ácidos nucleicos de la invención pueden
usarse para preparar una variedad de vectores de expresión para
expresar polipéptidos TMEFF2 que luego pueden usarse para producir
anticuerpos de la invención, tal como se describe a continuación.
Los expertos en la técnica conocen bien los vectores de expresión y
la tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Ausubel,
citado anteriormente, y Fernandez y Hoeffler (eds. 1999) Gene
Expression Systems) y se usan para expresar proteínas. Los vectores
de expresión pueden ser o bien vectores extracromosómicos
autorreplicativos o bien vectores que se integran en un genoma
huésped. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen un ácido
nucleico regulador de la transcripción o traducción operativamente
unido al ácido nucleico que codifica para la proteína TMEFF2. La
expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN
usadas para la expresión de una secuencia codificante
operativamente unida en un organismo huésped particular. Las
secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo,
incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un
sito de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas
utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando está colocado es una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una
presecuencia o secuencia líder secretora está operativamente unido
al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o
potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante
si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a
ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si
está colocado de modo que facilite la traducción. Generalmente,
"operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que
están uniéndose son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder
secretora, son contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los
potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra
normalmente mediante ligamiento en sitios de restricción
convenientes. Si no existen tales sitios, se usan adaptadores o
conectores de oligonucleótido sintéticos según la práctica
convencional. El ácido nucleico regulador de la transcripción y
traducción será generalmente apropiado para la célula huésped usada
para expresar la proteína TMEFF2. Se conocen en la técnica
numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias
reguladoras adecuadas.
En general, las secuencias reguladoras de la
transcripción y traducción pueden incluir, pero no se limitan a
secuencias promotoras, sitios de unión a ribosoma, secuencias de
iniciación y parada de la transcripción, secuencias de iniciación y
parada de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. En
una realización preferida, las secuencias reguladoras incluyen un
promotor y secuencias de iniciación y parada de la
transcripción.
Las secuencias promotoras codifican para o bien
promotores constitutivos o bien inducibles. Los promotores pueden
ser o bien promotores que se producen de manera natural o bien
promotores híbridos. Se conocen también en la técnica promotores
híbridos, que combinan elementos de más de un promotor, y son útiles
en la presente invención.
Además, un vector de expresión puede comprender
elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede
tener dos sistemas de replicación, permitiéndole así que se
mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o de
insecto para la expresión o en un huésped procariota para la
clonación y amplificación. Además, para vectores de expresión de
integración, el vector de expresión contiene al menos una secuencia
homóloga al genoma de la célula huésped, y preferiblemente dos
secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. El
vector de integración puede dirigirse a un locus específico en la
célula huésped seleccionando la secuencia homóloga apropiada para
su inclusión en el vector. Se conocen bien en la técnica
constructos para vectores de integración (por ejemplo Fernandez y
Hoeffler, citado anteriormente).
Además, en una realización preferida, el vector
de expresión contiene un gen de un marcador seleccionable para
permitir la selección de las células huésped transformadas. Se
conocen bien en la técnica genes de selección y variarán con la
célula huésped usada.
Las proteínas TMEFF2 de la presente invención se
producen cultivando una célula huésped transformada con un vector
de expresión que contiene ácido nucleico que codifica para una
proteína TMEFF2, en las condiciones apropiadas para inducir o
provocar la expresión de la proteína TMEFF2. Las condiciones
apropiadas para la expresión de la proteína TMEFF2 variarán con la
elección del vector de expresión y la célula huésped, y las
determinará fácilmente un experto en la técnica a través de
optimización o experimentación de rutina. Por ejemplo, el uso de
promotores constitutivos en el vector de expresión requerirá la
optimización del crecimiento y la proliferación de la célula
huésped, mientras que el uso de un promotor inducible requiere las
condiciones de crecimiento apropiadas para la inducción. Además, en
algunas realizaciones, el momento de la recogida es importante. Por
ejemplo, los sistemas de baculovirus usados en la expresión en
células de insecto son virus líticos, y por tanto la selección del
momento de la recogida puede ser crucial para el rendimiento del
producto.
Las células huésped apropiadas incluyen células
de levaduras, bacterias, arqueobacterias, hongos e insectos y
animales, incluyendo células de mamíferos. De particular interés
son Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras, E. coli,
Bacillus subtilis, células Sf9, células C129, células 293,
células de Neurospora, BHK, CHO, COS, HeLa, HUVEC (células
endoteliales de la vena umbilical humana), células THP1 (una línea
celular de macrófagos) y otras diversas líneas celulares y células
humanas.
En una realización preferida, las proteínas
TMEFF2 se expresan en células de mamíferos. También se conocen en
la técnica sistemas de expresión en mamíferos, e incluyen sistemas
adenovirales y retrovirales. Un sistema de vector de expresión es un
sistema de vector retroviral tal como se describe generalmente en
los documentos PCT/US97/01019 y PCT/L1 S97/01048, ambos de los
cuales se incorporan expresamente al presente documento como
referencia. De uso particular como promotores de mamíferos son los
promotores de genes virales de mamíferos, dado que los genes
virales a menudo se expresan altamente y tienen un amplio espectro
de huéspedes. Los ejemplos incluyen el promotor temprano de SV40,
el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, el promotor
tardío principal del adenovirus, el promotor del virus herpes
simplex y el promotor de CMV (véase, por ejemplo, Fernandez y
Hoeffler, citado anteriormente). Normalmente, las secuencias de
poliadenilación y de terminación de la transcripción reconocidas por
células de mamíferos son regiones reguladoras ubicadas en 3' con
respecto al codón de parada de la traducción y por tanto, junto con
los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. Los
ejemplos de señales de poliadenilación y terminadoras de la
transcripción incluyen las derivadas de SV40.
Los métodos de introducción de ácido nucleico
exógeno en huéspedes mamíferos, así como otros huéspedes, se
conocen bien en la técnica, y variarán con la célula huésped usada.
Las técnicas incluyen transfección mediada por dextrano,
precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por
polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, infección
viral, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en
liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos.
En algunas realizaciones, las proteínas TMEFF2
se expresan en sistemas bacterianos. Se conocen bien en la técnica
sistemas de expresión bacterianos. También pueden usarse promotores
de bacteriófagos y se conocen en la técnica. Además, también son
útiles promotores sintéticos y promotores híbridos; por ejemplo, el
promotor tac es un híbrido de las secuencias promotoras trp y lac.
Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se
producen de manera natural de origen no bacteriano que tienen la
capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción. Además de una secuencia promotora que funciona, es
deseable un sitio de unión a ribosoma eficaz. El vector de expresión
también puede incluir una secuencia de péptido señal que
proporciona la secreción de la proteína TMEFF2 en bacterias. La
proteína se secreta o bien en el medio de crecimiento (bacterias
gram positivas) o bien en el espacio periplásmico, ubicado entre la
membrana interna y externa de la célula (bacterias gram negativas).
El vector de expresión bacteriano también puede incluir un gen de
un marcador seleccionable para permitir la selección de cepas
bacterianas que se han transformado. Los genes de selección
adecuados incluyen genes que hacen a las bacterias resistentes a
fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina,
kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables
también incluyen genes biosintéticos, tales como los de las rutas
biosintéticas de la histidina, el triptófano y la leucina. Estos
componentes se ensamblan en los vectores de expresión. Los vectores
de expresión para bacterias se conocen bien en la técnica e
incluyen vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus
cremoris y Streptococcus lividans, entre otros (por
ejemplo, Fernandez y Hoeffler, citado anteriormente). Los vectores
de expresión bacterianos se transforman en células huésped
bacterianas usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales
como tratamiento con cloruro de calcio, electroporación y otras.
En una realización, los polipéptidos TMEFF2 se
producen en células de insecto. Los vectores de expresión para la
transformación de células de insecto, y en particular, vectores de
expresión basados en baculovirus, se conocen bien en la
técnica.
Los polipéptidos TMEFF2 también pueden
producirse en células de levaduras. Los sistemas de expresión en
levaduras se conocen bien en la técnica e incluyen vectores de
expresión para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans y
C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis y
K. lactis, Pichia guillerimondii y P. pastoris,
Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica.
Los polipéptidos TMEFF2 también pueden
prepararse como una proteína de fusión, usando técnicas bien
conocidas en la técnica. Por tanto, por ejemplo, para la creación
de anticuerpos monoclonales, si el epítopo deseado es pequeño, puede
fusionarse la proteína TMEFF2 con una proteína portadora para
formar un inmunógeno. Alternativamente, la proteína TMEFF2 puede
prepararse como una proteína de fusión para aumentar la expresión, o
por otras razones. Por ejemplo, cuando la proteína TMEFF2 es un
péptido TMEFF2, el ácido nucleico que codifica para el péptido
puede unirse a otro ácido nucleico para fines de expresión.
Normalmente, los polipéptidos TMEFF2 se
purifican o aíslan tras su expresión. Las proteínas TMEFF2 pueden
aislarse o purificarse de una variedad de formas conocidas por los
expertos en la técnica dependiendo de qué otros componentes están
presentes en la muestra. Los métodos de purificación convencionales
incluyen técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y
cromatográficas, incluyendo cromatografía de intercambio fónico,
hidrófoba, de afinidad y HPLC en fase inversa, y cromatoenfoque.
Por ejemplo, la proteína TMEFF2 puede purificarse usando una
columna de anticuerpo anti-proteína TMEFF2
convencional. También son útiles técnicas de ultrafiltración y
diafiltración, junto con concentración de proteínas. Para una
orientación general en técnicas de purificación adecuadas, véase
Scopes, Protein Purification (1982). El grado de purificación
necesario variará dependiendo del uso de la proteína TMEFF2. En
algunos casos, no será necesaria la purificación.
Un experto reconocerá que la proteína expresada
no necesita tener la secuencia de TMEFF2 de tipo natural sino que
puede ser un derivado o variante en comparación con la secuencia de
tipo natural. Normalmente, estas variantes se encuentran dentro de
una o más de tres clases: variantes por sustitución, inserción o
deleción. Estas variantes se preparan habitualmente mediante
mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que
codifica para la proteína, usando mutagénesis por casete o por PCR
u otras técnicas bien conocidas en la técnica, para producir ADN
que codifica para la variante, y expresando después el ADN en
cultivo celular recombinante tal como se resumió anteriormente. Sin
embargo, pueden prepararse fragmentos de proteínas variantes que
tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos
mediante síntesis in vitro usando técnicas establecidas. Las
variantes de secuencia de aminoácidos se caracterizan por la
naturaleza predeterminada de la variación, una característica que
las distingue de la variación entre especies o alélica que se
produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de la
proteína TMEFF2. Las variantes muestran normalmente la misma
actividad biológica cualitativa que el análogo que se produce de
manera natural, aunque también pueden seleccionarse variantes que
tienen características modificadas tal como se resumirá más
completamente a continuación.
Los polipéptidos TMEFF2 de la presente invención
también pueden modificarse de una forma para formar moléculas
quiméricas que comprenden un polipéptido TMEFF2 fusionado con otra
secuencia de aminoácidos o polipeptídica heteróloga. En una
realización, una molécula quimérica de este tipo comprende una
fusión del polipéptido TMEFF2 con un polipéptido marcador que
proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un
anticuerpo anti-marcador. El marcador de epítopo se
coloca generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal del
polipéptido TMEFF2. La presencia de tales formas con epítopo
marcado de un polipéptido TMEFF2 puede detectarse usando un
anticuerpo contra el polipéptido marcador. También, la provisión
del marcador de epítopo permite que el polipéptido TMEFF2 se
purifique fácilmente mediante purificación por afinidad usando un
anticuerpo anti- marcador u otro tipo de matriz de afinidad que se
une al marcador de epítopo. En una realización alternativa, la
molécula quimérica puede comprender una fusión de un polipéptido
TMEFF2 con una inmunoglobulina o una región particular de una
inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica,
una fusión de este tipo podría ser con una región Fc de una
molécula de IgG.
Se conocen bien en la técnica diversos
polipéptidos marcadores y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos
incluyen marcadores de poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); marcadores de HIS6 y
de quelación de metales, el polipéptido marcador HA de la gripe y
su anticuerpo 12CA5 (Field, et al (1988) Mol. Cell. Biol.
8:2159-2165); el marcador c-myc y
los anticuerpos 8F9, 307, 6E10, G4, B7 y 9E10 frente al mismo
(Evan, et al. (1985) Molecular and Cellular Biology
5:3610-3616); y el marcador de glucoproteína D (gD)
del virus herpes simplex y su anticuerpo (Paborsky, et al.
(1990) Protein Engineering 3(6):547-553).
Otros polipéptidos marcadores incluyen el péptido FLAG (Hopp, et
al. (1988) BioTechnology 6:1204-1210); el
péptido del epítopo KT3 (Martin, et al. (1992) Science
255:192-194); el péptido del epítopo de la tubulina
(Skinner, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:
15163-15166); el marcador peptídico de la proteína
del gen 10 de T7 (Lutz-Freyermuth, et al.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
6393-6397).
Una vez que se produce la proteína TMEFF2, se
usa para generar anticuerpos, por ejemplo para inmunoterapia o
inmunodiagnóstico. Tal como se indicó anteriormente, los
anticuerpos de la invención reconocen el mismo epítopo que el
reconocido por TMEFF2 nº 19 (número de registro de la ATCC
PTA-4127). La capacidad de un anticuerpo particular
para reconocer el mismo epítopo que otro anticuerpo está
determinada normalmente por la capacidad de un anticuerpo de inhibir
competitivamente la unión del segundo anticuerpo al antígeno.
Pueden usarse muchos de varios ensayos de unión competitiva para
medir la competición entre dos anticuerpos frente al mismo
antígeno. Un ensayo a modo de ejemplo es un ensayo con Biacore tal
como se describe en los ejemplos, a continuación. En resumen, en
estos ensayos, pueden mapearse los sitios de unión en términos
estructurales sometiendo a prueba la capacidad de los
interaccionantes, por ejemplo, diferentes anticuerpos, para inhibir
la unión de otro. La inyección de dos muestras de anticuerpo
consecutivas en concentración suficiente puede identificar pares de
anticuerpos que compiten por el mismo epítopo de unión. Las
muestras de anticuerpo deben tener el potencial de alcanzar una
saturación significativa con cada inyección. La unión neta de la
segunda inyección de anticuerpo es indicativa para el análisis del
epítopo de unión. Pueden usarse dos niveles de respuesta para
describir los límites de la competición perfecta frente a la unión
no competitiva debida a distintos epítopos. La cantidad relativa de
respuesta de unión de la segunda inyección de anticuerpo en relación
con la unión de epítopos de unión idénticos y distintos determina
el grado de superposición de epítopos.
Pueden usarse otros inmunoensayos convencionales
conocidos en la técnica en la presente invención. Por ejemplo,
pueden diferenciarse anticuerpos por el epítopo al que se unen
usando un ensayo de ELISA tipo "sandwich". Éste se lleva a cabo
usando un anticuerpo de captura para recubrir la superficie de un
pocillo. Entonces se añade una concentración de subsaturación de
antígeno marcado a la superficie de captura. Esta proteína se unirá
al anticuerpo a través de una interacción anticuerpo:epítopo
específica. Tras lavar, se añade al ELISA un segundo anticuerpo,
que se ha unido covalentemente a un resto detectable (por ejemplo,
HRP, definiéndose el anticuerpo marcado como el anticuerpo de
detección). Si este anticuerpo reconoce el mismo epítopo que el
anticuerpo de captura, no podrá unirse a la proteína diana ya que
ese epítopo particular ya no estará disponible para la unión. Sin
embargo, si este segundo anticuerpo reconoce un epítopo diferente en
la proteína diana, podrá unirse y esta unión puede detectarse
cuantificando el nivel de actividad (y por tanto el anticuerpo
unido) usando un sustrato pertinente. Se define el fondo usando un
único anticuerpo tanto como anticuerpo de captura como de detección,
mientras que puede establecerse la señal máxima mediante la captura
con un anticuerpo específico de antígeno y la detección con un
anticuerpo frente al marcador en el antígeno. Usando las señales de
fondo y máxima como referencias, pueden evaluarse los anticuerpos
de una manera apareada para determinar la especificidad de
epítopo.
Se considera que un primer anticuerpo inhibe
competitivamente la unión de un segundo anticuerpo si la unión del
segundo anticuerpo al antígeno se reduce en al menos el 30%,
habitualmente en al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60% o 75%, y
a menudo en al menos aproximadamente el 90%, en presencia del primer
anticuerpo usando cualquiera de los ensayos descritos
anteriormente.
El experto en la técnica conoce métodos de
preparación de anticuerpos policlonales (por ejemplo, Coligan,
citado anteriormente; y Harlow y Lane, citado anteriormente).
Pueden producirse anticuerpos policlonales en un mamífero, por
ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización
y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente de
inmunización y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante
inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. El agente de
inmunización puede incluir una proteína codificada por un ácido
nucleico de las figuras o fragmento del mismo o una proteína de
fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización
con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que
está inmunizándose. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas
incluyen pero no se limitan a hemocianina de lapa californiana,
albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de
soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen
adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM
(monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético).
El protocolo de inmunización puede seleccionarlo un experto en la
técnica sin experimentación excesiva.
Alternativamente, los anticuerpos pueden ser
anticuerpos monoclonales. Pueden prepararse anticuerpos
monoclonales usando métodos del hibridoma, tales como los descritos
Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. En un método del
hibridoma, normalmente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal
huésped apropiado con un agente de inmunización para obtener
linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán
específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los
linfocitos pueden inmunizarse in vitro. El agente de
inmunización incluirá normalmente un polipéptido codificado por un
ácido nucleico de las tablas 1-2, un fragmento del
mismo o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan o
bien linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean
células de origen humano o bien células del bazo o células de
ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos.
Entonces se fusionan los linfocitos con una línea celular
inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (págs.
59-103 en Goding (1986) Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice). Las líneas celulares inmortalizadas son
habitualmente células de mamíferos transformadas, particularmente
células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano.
Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o
ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias
que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células
inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio
HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de células
deficientes en HGPRT.
En una realización, los anticuerpos son
anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son
anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados,
que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos
diferentes o que tienen especificidades de unión por dos epítopos
del mismo antígeno. En una realización, una de las especificidades
de unión es por una proteína TMEFF2, la otra es por cualquier otro
antígeno del cáncer de próstata. Alternativamente, la tecnología de
tipo tetrámero puede crear reactivos multivalentes.
En una realización preferida, los anticuerpos
frente a la proteína TMEFF2 pueden reducir o eliminar células del
cáncer de próstata. Es decir, la adición de anticuerpos
anti-TMEFF2 (o bien policlonales o bien
preferiblemente monoclonales) al tejido de cáncer de próstata (o
células que contienen TMEFF2) puede reducir o eliminar el cáncer de
próstata. Generalmente, se prefiere al menos una disminución del
25% en la actividad, crecimiento, tamaño o similares, prefiriéndose
particularmente al menos aproximadamente el 50% y prefiriéndose
especialmente aproximadamente una disminución del
95-100%.
En una realización preferida, los anticuerpos
frente a las proteínas TMEFF2 son anticuerpos humanizados (por
ejemplo, Xenerex Biosciences, Medarex, Inc., Abgenix, Inc., Protein
Design Labs, Inc.). Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos
(por ejemplo, murinos), son moléculas quiméricas de
inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las
mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras
subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen
secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. Los
anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que se sustituyen residuos de una
región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por
residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador)
tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad,
selectividad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se
sustituyen residuos de la región de entramado Fv de la
inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Los
anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no
se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de
entramado o CDR importadas. En general, un anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos
dominios variables, en los que todas las regiones CDR corresponden
a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente
todas las regiones de entramado (FR) son las de una secuencia
consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una
inmunoglobulina humana (Jones, et al. (1986) Nature
321:522-525; Riechmann, et al. (1988) Nature
332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct.
Biol. 2:593-596). La humanización puede realizarse
esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones,
et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann,
et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen,
et al. (1988) Science 239:1534-1536),
sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedor por las
correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En
consecuencia, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos
quiméricos (patente estadounidense número 4.816.567), en los que
sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha
sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no
humana.
También pueden producirse anticuerpos humanos
usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom y Winter (1991) J.
Mol. Biol. 227:381; Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol.
222:581). También están disponibles las técnicas de Cole, et
al. y Boerner, et al. para la preparación de anticuerpos
monoclonales humanos (pág. 77 en Cole, et al. (1985)
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy; y Boerner, et al.
(1991) J. Immunol. 147(1):86-95). De manera
similar, pueden prepararse anticuerpos humanos introduciendo locus
de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo,
ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han
inactivado parcial o completamente. Tras la exposición, se observa
la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente
con la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo
la transposición génica, ensamblaje y repertorio de anticuerpos.
Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes
estadounidenses números 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;
5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas:
Marks, et al. (1992) Bio/Technology 10:
779-783; Lonberg, et al. (1994) Nature
368:856-859; Morrison (1994) Nature
368:812-13; Fishwild, et al. (1996) Nature
Biotechnology 14:845-51; Neuberger (1996) Nature
Biotechnology 14:826; y Lonberg y Huszar (1995) Intern. Rev. I mm
unol. 13:65-93.
Por inmunoterapia se quiere decir tratamiento
del cáncer de próstata con un anticuerpo producido contra las
proteínas TMEFF2. Tal como se usa en el presente documento, la
inmunoterapia puede ser pasiva o activa. La inmunoterapia pasiva tal
como se define en el presente documento es la transferencia de un
anticuerpo a un receptor (paciente). La inmunización activa es la
inducción de respuestas de células T y/o anticuerpos en un receptor
(paciente). La inducción de una respuesta inmunitaria es el
resultado de proporcionar al receptor un antígeno frente al cual se
producen anticuerpos. Tal como se aprecia por un experto en la
técnica, el antígeno puede proporcionarse inyectando un polipéptido
contra el cual se desea producir anticuerpos en un receptor, o
poniendo en contacto el receptor con un ácido nucleico que puede
expresar el antígeno y en condiciones para la expresión del
antígeno, conduciendo a una respuesta inmunitaria.
\newpage
En algunas realizaciones, el anticuerpo se
conjuga con un resto efector. El resto efector puede ser cualquiera
de varias moléculas, incluyendo restos de marcaje tales como
marcadores radiactivos o marcadores fluorescentes, o puede ser un
resto terapéutico. En un aspecto, el resto terapéutico es una
molécula pequeña que modula la actividad de la proteína TMEFF2. En
otro aspecto, el resto terapéutico modula la actividad de moléculas
asociadas con o en proximidad estrecha con la proteína TMEFF2.
En otras realizaciones, el resto terapéutico es
un agente citotóxico. En este método, el direccionamiento del
agente citotóxico hacia tejido o células de cáncer de próstata da
como resultado una reducción en el número de células afectadas,
reduciendo de ese modo los síntomas asociados con el cáncer de
próstata. Los agentes citotóxicos son numerosos y variados e
incluyen, pero no se limitan a fármacos citotóxicos o toxinas o
fragmentos activos de tales toxinas. Las toxinas adecuadas y sus
fragmentos correspondientes incluyen la cadena A de difteria,
cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina,
curcina, crotina, phenomycin, enomycin, auristatina y similares.
Los agentes citotóxicos también incluyen productos radioquímicos
preparados mediante la conjugación de radioisótopos con anticuerpos
producidos contra proteínas del cáncer de próstata, o la unión de
un radionúclido a un agente quelante que se ha unido covalentemente
al anticuerpo. El direccionamiento del resto terapéutico hacia
proteínas transmembrana del cáncer de próstata no sólo sirve para
aumentar la concentración local de resto terapéutico en la zona
afectada por el cáncer de próstata, sino que también sirve para
reducir efectos secundarios perjudiciales que pueden estar asociados
con el resto terapéutico.
\vskip1.000000\baselineskip
La afinidad de unión para un antígeno diana se
mide o se determina normalmente mediante ensayos convencionales de
anticuerpo-antígeno, tales como ensayos
competitivos con Biacore, ensayos de saturación, o inmunoensayos
tales como ELISA o RIA.
Pueden usarse tales ensayos para determinar la
constante de disociación del anticuerpo. La expresión "constante
de disociación" se refiere a la afinidad de un anticuerpo por un
antígeno. Existe especificidad de unión entre un anticuerpo y un
antígeno si la constante de disociación (K_{D} = 1/K, en la que K
es la constante de afinidad) del anticuerpo es < 1 \muM,
preferiblemente < 100 nM y lo más preferiblemente < 0,1 nM.
Las moléculas de anticuerpo tendrán normalmente una K_{D} en los
intervalos más bajos. K_{D} = [Ab-Ag]/[Ab][Ag] en
la que [Ab] es la concentración en equilibrio del anticuerpo, [Ag]
es la concentración en equilibrio del antígeno y
[Ab-Ag] es la concentración en equilibrio del
complejo anticuerpo-antígeno. Normalmente, las
interacciones de unión entre el antígeno y el anticuerpo incluyen
asociaciones no covalentes reversibles tales como atracción
electrostática, fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrógeno.
Los anticuerpos de la invención se unen
específicamente a las proteínas TMEFF2. Por "unirse
específicamente" en el presente documento se quiere decir que
los anticuerpos se unen a la proteína con una KD de al menos
aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente
1 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 \muM o
mejor, y los más preferiblemente, 0,01 \muM o mejor.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden usarse los anticuerpos de la invención
para detectar TMEFF2 o células que expresan TMEFF2 usando
cualquiera de varios ensayos de unión inmunológica bien reconocidos
(véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4.366.241;
4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los
inmunoensayos generales, véase también Asai (ed. 1993) Methods in
Cell Biology Vol. 37, Academic Press, Nueva York; Stites & Terr
(eds. 1991) Basic and Clinical Immunology 7ª Ed.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
la detección de células que expresan TMEFF2. Se realiza una biopsia
en el sujeto y se somete a prueba el tejido recogido in
vitro. Entonces se pone en contacto el tejido o las células del
tejido con un anticuerpo anti-TMEFF2 de la
invención. Cualquier complejo inmunitario que resulte indica la
presencia de una proteína TMEFF2 en la muestra de biopsia. Para
facilitar tal detección, el anticuerpo puede radiomarcarse o
acoplarse a una molécula efectora que es un marcador detectable,
tal como un radiomarcador. Alternativamente, las células pueden
detectarse in vivo usando sistemas de típicos de formación de
imágenes. Entonces, se determina la ubicación del marcador mediante
cualquiera de los métodos conocidos para detectar el marcador.
Puede usarse un método convencional para visualizar la formación de
imágenes de diagnóstico. Por ejemplo, pueden usarse isótopos
paramagnéticos para IRM. La internalización del anticuerpo puede ser
importante para prolongar la vida dentro del organismo más allá de
la proporcionada por la unión extracelular, que será susceptible al
aclaramiento mediante el entorno enzimático extracelular acoplado
con el aclaramiento circulatorio.
Las proteínas TMEFF2 también pueden detectarse
usando métodos convencionales de inmunoensayo y los anticuerpos de
la invención. Los métodos convencionales incluyen, por ejemplo,
radioinmunoanálisis, inmunoensayos de tipo sándwich (incluyendo
ELISA), ensayos de immunofluorescencia, inmunotransferencia de tipo
Western, cromatografía de afinidad (ligando de afinidad unido a una
fase sólida), y detección in situ con anticuerpos
marcados.
Los anticuerpos de la invención pueden
formularse en composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, la
invención también proporciona usos y composiciones para administrar
una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo
anti-TMEFF2. La dosis exacta dependerá del fin del
tratamiento, y podrá establecerse por un experto en la técnica
usando técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Ansel, et al.
(1999) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Lieberman
(1992) Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3),
Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd
(1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical
Compounding Amer. Pharm. Assn.; y Pickar (1999) Dosage Calculations
Thomson. Pueden ser necesarios ajustes para la degradación del
cáncer, administración sistémica frente a localizada, y tasa de
síntesis de nuevas proteínas, así como la edad, el peso corporal,
la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la
administración, la interacción con el fármaco y la gravedad del
estado, y podrán establecerse con experimentación rutinaria por los
expertos en la técnica. El documento U.S.S.N. 09/687.576 da a
conocer además el uso de composiciones y métodos de diagnóstico y
tratamiento en el cáncer de próstata.
Un "paciente" para los fines de la presente
invención incluye tanto seres humanos como otros animales,
particularmente mamíferos. Por lo tanto, los usos son aplicables
tanto al tratamiento de seres humanos como a aplicaciones
veterinarias. En la realización preferida el paciente es un
mamífero, preferiblemente un primate, y en la realización más
preferida el paciente es un ser humano.
La administración de los anticuerpos de la
presente invención puede realizarse en una variedad de modos tal
como se discutió anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a,
por vía oral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía
intranasal, por vía transdérmica, por vía intraperitoneal, por vía
intramuscular, por vía intrapulmonar, por vía vaginal, por vía
rectal o por vía intraocular.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención comprenden un anticuerpo de la invención en una forma
adecuada para la administración a un paciente. En la realización
preferida, las composiciones farmacéuticas están en una forma
soluble en agua, tal como estando presentes como sales
farmacéuticamente aceptables, lo que pretende incluir sales de
adición tanto de ácido como de base. "Sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que
conservan la eficacia biológica de las bases libres y que no son
indeseables biológicamente o de otra manera, formadas con ácidos
inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido
sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos
orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido
glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido
malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido
cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido
metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.
"Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables"
incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sales
de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc,
cobre, manganeso, aluminio y similares. Se prefieren
particularmente las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y
magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas
farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias,
secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas
sustituidas que se producen de manera natural, aminas cíclicas y
resinas básicas de intercambio fónico, tales como isopropilamina,
trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y
etanolamina.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
incluir uno o más de los siguientes: proteínas portadoras tales
como albúmina sérica; tampones; cargas tales como celulosa
microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes de unión;
edulcorantes y otros agentes aromatizantes; agentes colorantes; y
polietilenglicol.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrase en una variedad de formas farmacéuticas unitarias
dependiendo de la administración. Por ejemplo, las formas
farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración oral
incluyen, pero no se limitan a polvos, comprimidos, píldoras,
cápsulas y pastillas para chupar. Se reconoce que los anticuerpos,
cuando se administran por vía oral, deben protegerse de la
digestión. Esto se logra normalmente o bien complejando las
moléculas con una composición para hacerlas más resistentes a la
hidrólisis ácida y enzimática, o bien empaquetando las moléculas en
un vehículo resistente de manera apropiada, tal como un liposoma o
una barrera de protección. En la técnica se conocen bien medios de
protección de los agentes de la digestión.
Las composiciones para la administración
comprenderán comúnmente un anticuerpo de la invención disuelto en
un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un
vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos,
por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas
disoluciones son estériles y generalmente están libres de materia no
deseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante
técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a
las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y de
tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad y
similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro
de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La
concentración del agente activo en estas formulaciones puede variar
ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los
volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares según
el modo particular de administración seleccionado y de las
necesidades del paciente (por ejemplo, (1980) Remington's
Pharmaceutical Science (18ª ed.); y Hardman, et al. (eds.
2001) Goodman & Gilman: The Pharmacological Basis of
Therapeutics).
Por lo tanto, una composición farmacéutica
típica para la administración intravenosa sería de aproximadamente
0,1 a 10 mg por paciente al día. Pueden usarse dosificaciones de
desde 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente al día,
particularmente cuando se administra el fármaco en un sitio aislado
y no en la circulación sanguínea, tal como en una cavidad del
cuerpo o en una luz de un órgano. En la administración tópica, son
posibles dosificaciones sustancialmente más altas. Los métodos
reales para preparar composiciones que pueden administrase por vía
parenteral se conocerán o serán evidentes para los expertos en la
técnica, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science y Goodman
y Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, citado
anteriormente.
Las composiciones que contienen anticuerpos de
la invención pueden administrarse para tratamientos terapéuticos o
profilácticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se
administran a un paciente que padece una enfermedad (por ejemplo,
un cáncer) en una cantidad suficiente para curar o al menos detener
parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad
adecuada para lograr esto se define como una "dosis
terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso
dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de
la salud del paciente. Pueden administrarse administraciones únicas
o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y
de la frecuencia según se requiera y se tolere por el paciente. En
cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad
suficiente de los agentes de esta invención para tratar de manera
eficaz al paciente. Una cantidad de modulador que puede prevenir o
ralentizar el desarrollo del cáncer en un mamífero se denomina una
"dosis profilácticamente eficaz". La dosis particular
requerida para un tratamiento profiláctico dependerá de la afección
y del historial del mamífero, el cáncer particular que está
previniéndose, así como otros factores tales como la edad, el peso,
el género, la vía de administración, la eficacia, etc. Tales
tratamientos profilácticos pueden usarse, por ejemplo, en un
mamífero que ha tenido previamente cáncer para evitar una recidiva
del cáncer, o en un mamífero que se sospecha que tiene una
probabilidad significativa de desarrollar un cáncer.
Se apreciará que los presentes compuestos de
modulación de las proteínas del cáncer de próstata pueden
administrarse solos o en combinación con compuestos de modulación
del cáncer de próstata adicionales o con otro agente terapéutico,
por ejemplo, otros agentes o tratamientos anticancerígenos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la
invención pueden usarse para preparar liposomas dirigidos para la
administración de una composición terapéutica deseada (por ejemplo,
agentes anticancerígenos) a una célula diana (por ejemplo, una
célula de cáncer de próstata). La preparación y el uso de
inmunoliposomas para la administración dirigida de fármacos
antitumorales se revisan en Mastrobattista, et al. (1999)
Advanced Drug Delivery Reviews 40:103-127.
Los liposomas son estructuras vesiculares
basadas en bicapas lipídicas. Pueden tener un diámetro de tan sólo
20 nm y de tanto como 10 p.m. Pueden ser unilamelares (sólo una
bicapa rodea un núcleo acuoso) o multilamelares (varias bicapas
orientadas concéntricamente alrededor de un núcleo acuoso). Los
liposomas de la presente invención están formados por lípidos de
formación de vesículas convencionales, que generalmente incluyen
fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, tal
como colesterol. La selección de lípidos está guiada generalmente
por la consideración de, por ejemplo, el tamaño de los liposomas y
la estabilidad de los liposomas en la circulación sanguínea.
En la técnica se conoce bien el direccionamiento
de liposomas usando una variedad de agentes de direccionamiento
(por ejemplo, anticuerpos monoclonales de la invención). Véanse,
por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.957.773 y
4.603.044). Pueden usarse métodos convencionales para acoplar
agentes de direccionamiento a los liposomas. Pueden construirse
liposomas dirigidos por anticuerpo usando, por ejemplo, liposomas
que incorporan proteína A. Véanse, Renneisen, et al. (1990)
J. Biol. Chem. 265:16337-16342; y Leonetti, et
al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:2448-2451.
Está disponible una variedad de métodos para
preparar liposomas, tal como se describe en, por ejemplo, Szoka,
et al. (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; patentes
estadounidenses números 4.235.871; 4.501.728; y 4.837.028. Un método
produce vesículas multilamelares de tamaños heterogéneos. En este
método, se disuelven lípidos que forman vesículas en un disolvente
o sistema de disolvente orgánico adecuado y se secan a vacío o bajo
un gas inerte para formar una película lipídica fina. Si se desea,
la película puede redisolverse en un disolvente adecuado, tal como
butano) terciario, y luego liofilizarse para formar una mezcla
lipídica más homogénea que está en forma similar a polvo más
fácilmente hidratada. Esta película se cubre con una disolución
acuosa del fármaco dirigido y el componente de direccionamiento
(anticuerpo) y se deja hidratar, normalmente a lo largo de un
periodo de 15-60 minutos con agitación. La
distribución de tamaño de las vesículas multilamelares resultantes
puede desplazarse hacia tamaños más pequeños hidratando los lípidos
en condiciones de agitación más enérgica o añadiendo detergentes de
solubilización tales como desoxicolato.
Para su uso en las aplicaciones de diagnóstico,
investigación y terapéuticas sugeridas anteriormente, también se
proporcionan kits por la invención. En las aplicaciones de
diagnóstico e investigación, tales kits pueden incluir cualquiera o
todos de los siguientes: reactivos de ensayo, tampones y
anticuerpos específicos de TMEFF2 de la invención. Un producto
terapéutico puede incluir solución salina estéril u otra base en
suspensión y emulsión farmacéuticamente aceptable.
Además, los kits pueden incluir materiales de
instrucciones que contienen indicaciones (por ejemplo, protocolos)
para la puesta en práctica de los métodos de esta invención. Aunque
los materiales de instrucciones comprenden normalmente materiales
escritos o impresos, no se limitan a éstos. Esta invención contempla
cualquier medio que pueda almacenar tales instrucciones y
comunicarlas a un usuario final. Tales medios incluyen, pero no se
limitan a medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo,
discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por
ejemplo, CD ROM) y similares. Tales medios pueden incluir
direcciones de sitios de Internet que proporcionan tales materiales
de instrucciones.
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Se seleccionaron aproximadamente 12
sobrenadantes de hibridomas anti-TMEFF2 de una
reserva inicial de aproximadamente cien, basándose en las tasas de
disociación (kd) para la unión a la proteína
TMEFF2-FLAG inmovilizada covalentemente tal como se
midió mediante BlAcore^{TM}. Se escogieron para la purificación a
gran escala los sobrenadantes que mostraron las constantes de tasa
de disociación más bajas. Las secuencias de las regiones variables
de los anticuerpos TMEFF2 nº 19, TMEFF2 nº 10, TMEFF2 nº 18, TMEFF2
nº 20, TMEFF2 nº 21 se presentan en la tabla 1. Se llevó a cabo una
evaluación cinética en cada anticuerpo purificado midiendo la unión
a TMEFF2-FLAG a lo largo de un intervalo de
concentraciones de antígeno. Entonces se determinaron las constantes
de afinidad (KD) usando el procedimiento de ajuste global descrito
en el BlAapplications Handbook Biacore AB, BlAapplications
Handbook, versión AB, 1998, Application Notes, Nota 101 (junio de
1995); Daiss, et al. (1994) Methods: A companion to Methods
in Enzymology Volumen 6, págs. 143-156. Además, se
llevó a cabo mapeo de epítopos por emparejamiento a través de un
análisis de unión competitiva. Esto se logró exponiendo la
superficie de TMEFF2-FLAG a una cantidad en
saturación de una muestra de anticuerpo y midiendo el nivel de
respuesta de un segundo anticuerpo inyectado. Usando esta
metodología se seleccionaron anticuerpos que reconocían varios
epítopos individuales para un estudio adicional.
Se acopló covalentemente cada anticuerpo de
interés a la toxina sintética auristatina (Int. J. Oncol.
15:367-72 (1999)) (pAE), un derivado de dolastatina
10, y se evaluó para determinar la muerte celular dependiente de
TMEFF2 in vitro. Se ejecutó el ensayo de muerte celular
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-23(1996))
determinando en primer lugar una densidad celular que muestra
crecimiento celular lineal a lo largo de varios días. Entonces se
incubaron poblaciones de células en división con múltiples
concentraciones de anticuerpos frente a TMEFF2 conjugados con
toxina (o un control negativo) durante una hora, seguido por la
eliminación del anticuerpo y lavado moderado. Cuatro días después,
se determinó la viabilidad celular usando el ensayo Celltiter 96
(Promega). De esta manera, se comparó una línea celular de cáncer
de próstata que expresaba de manera estable TMEFF2
(PC3-TMEFF2) con la línea celular parental que no
es (PC3).
Se han evaluado dos anticuerpos correspondientes
a epítopos distintos, tal como se determina mediante BlAcore, para
determinar su habilidad para interferir con la supervivencia
celular in vitro. Uno de estos anticuerpos, TMEFF2 nº
19-pAE, parece que estimula una muerte celular
significativa en células PC3-TMEFF2, pero no en la
línea parental. El otro anticuerpo, nº 21-pAE,
también provoca muerte celular, pero con algo menos de potencia que
nº 19-pAE. Un anticuerpo de control negativo que no
reconoce un marcador de superficie celular en células PC3,
TIB-pAE, no afecta a la supervivencia celular en
cualquier línea celular. Adicionalmente, otra línea de cáncer de
próstata, LnCAP, que se ha determinado que expresa pequeñas
cantidades de TMEFF2 de superficie, también presentó sensibilidad a
nº 19-pAE en comparación con
TIB-pAE. Estos resultados muestran que nº
19-pAE es un agente citotóxico potente y selectivo
en células que expresan TMEFF2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Pueden detectarse cantidades relativamente bajas
de la proteína TMEFF2 en la superficie celular de líneas celulares
de cáncer, tal como se evaluó mediante análisis de FACS usando el
anticuerpo TMEFF2 nº 19. Por tanto, fue sorprendente la eficacia
del anticuerpo nº 19 conjugado con toxina en la destrucción de
células que expresan específicamente esta diana. Sin embargo,
experimentos diseñados para evaluar la capacidad de las
combinaciones de anticuerpo específico:diana para internalizarse
han generado datos novedosos que explican la eficacia de los
anticuerpos anti-TMEFF2 conjugados con toxina en la
destrucción. Ha resultado evidente que esta proteína diana
particular muestra una tasa de internalización increíblemente alta.
En estos experimentos de internalización, se incuban células que
expresan TMEFF2 a diferentes temperaturas, y durante diferentes
períodos de tiempo, en presencia de anticuerpo
anti-TMEFF2. Tras la incubación con anticuerpo
anti-TMEFF2 durante 1 hora a 4ºC, se lavan las
células y se incuban adicionalmente con un anticuerpo
anti-ratón marcado fluorescentemente. Mediante
microscopia fluorescente, se observa un nivel bajo de unión de
anticuerpo específico a la TMEFF2 en la superficie celular. En
contraposición, cuando las células se incuban a 37ºC durante 1
hora, una temperatura que permite la internalización y el tráfico
de proteínas, y entonces se someten a permeabilización y tinción
con el anticuerpo anti-ratón marcado
fluorescentemente, se detecta la mayoría de la fluorescencia dentro
de las células. Tales datos indican que la combinación de
anticuerpo específico:diana se ha internalizado, un resultado que
se confirma adicionalmente sometiendo las células a una etapa de
separación con ácido antes de la etapa de detección. La separación
con ácido elimina toda la proteína todavía presente en la
superficie celular dejando sólo las proteínas anticuerpo:diana
internalizadas. En contraposición a otras combinaciones de
anticuerpo:diana tales como herceptina:Her2 y
anti-efrinaA3:efrinaA3, estos experimentos han
mostrado que la proteína TMEFF2, reconocida por los anticuerpos
específicos anti-TMEFF2, se internaliza a una
velocidad muy rápida y también que se observa internalización casi
completa de la proteína de la superficie celular en el plazo de un
periodo de 1 hora. Estos datos, que muestran la internalización
sorprendentemente eficaz de TMEFF2, explican la eficacia de los
anticuerpos anti-TMEFF2 conjugados con toxina en la
destrucción.
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Usando técnicas convencionales tal como se
describió anteriormente, se generaron anticuerpos TMEFF2 nº 19
humanizados. En la tabla 2 se presentan las secuencias de cuatro
regiones variables de cadena pesada humanizadas y tres regiones
variables de cadena ligera humanizadas. Pueden usarse las regiones
variables de cadena ligera y pesada para combinarse en sitios de
unión, y entre las combinaciones sometidas a prueba, conservar la
afinidad de unión. Estos anticuerpos pueden usarse en modelos de
ratón in vivo para inhibir el crecimiento de células
tumorales in vivo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El gen de TMEFF2 se expresa alta y
específicamente en muestras clínicas de cáncer de próstata. Para
demostrar que el producto de proteína del gen de TMEFF2 es una
diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de próstata, se
modeló la línea celular de cáncer de próstata humana LNCAP en
ratones SCID (con inmunodeficiencia combinada grave). El análisis
de la expresión génica muestra que TMEFF2 se expresa altamente en
células LNCAP que se hicieron crecer sobre plástico en cultivo de
tejidos y también cuando crecieron como tumores de injerto
heterólogo en ratones SCID.
Para determinar los efectos in vivo de
anticuerpos anti-TMEFF2 conjugados con toxina (nº
19-pMMVCAE), se hicieron crecer células LNCAP como
tumores de injerto heterólogo en ratones SCID. Tras alcanzar los
tumores un cierto tamaño (promedio de 100 mm^{3}), se
distribuyeron los animales en 3 grupos y se sometieron a
tratamiento con o bien a) vehículo de control, b) nº
19-pMMVCAE, o bien c) control de
isotipo-MMVCAE (un anticuerpo que no reconoce
moléculas en la superficie de las células LNCAP). Se usaron
anticuerpos conjugados a 0,25 mg/kg de equivalente de fármaco
(\sim5 mg/kg de conjugado anticuerpo-fármaco), y
se administraron a intervalos de 4 días. Se midió el tamaño del
tumor dos veces por semana. Se monitorizó el peso de los animales
durante todo el experimento y se midieron los niveles séricos de
PSA (antígeno específico de la próstata) a diversos intervalos de
tiempo durante el experimento.
\newpage
Los resultados mostraron que el tratamiento con
nº 19-pMMVCAE redujo significativamente el
crecimiento tumoral de LNCAP. De hecho, los tumores de LNCAP
establecidos experimentaron una regresión en tamaño (hasta menos de
100 mm3), los niveles séricos de PSA (un marcador sustituto para la
carga de tumor de próstata) cayeron significativamente (<10
ng/ml), mientras el peso del animal permaneció constante y los
animales parecían sanos. Esto es en contraposición a los ratones
que recibieron o bien el vehículo de control o bien el control de
isotipo-MMVCAE. Los tumores en estos ratones
crecieron rápidamente y tuvieron que sacrificarse a los
50-60 días tras la implantación del tumor debido al
gran tamaño de los tumores (>500 mm^{3}). Además, los animales
perdieron una cantidad de peso considerable, parecían moribundos y
tenían niveles séricos de PSA significativamente mayores (>350
ng/ml). El tratamiento con nº 19-pMMVCAE humanizado
(véase el ejemplo 2) de ratones que portan tumores de LNCAP obtuvo
resultados similares a los observados con el anticuerpo murino, por
ejemplo, los tumores establecidos experimentaron una regresión, los
niveles séricos de PSA cayeron y los animales parecían sanos.
Estos resultados indican que la proteína TMEFF2
es una nueva diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de
próstata y otras enfermedades prostáticas (tales como hiperplasia
prostática benigna - HPB) que muestran expresión de TMEFF2. De
hecho, el tratamiento anti-TMEFF2 permitirá un
tratamiento más eficaz del cáncer de próstata y de los pacientes con
HPB mientras se reduce la necesidad de cirugía, radiación y
tratamiento quimioterápico.
Para determinar cómo es de frecuente la proteína
TMEFF2 diana en pacientes con cáncer de próstata, se realizó una
immunohistoquímica (IHC) en muestras clínicas derivadas de
prostatectomías radicales de pacientes que mostraban cáncer de
próstata localizado (grados 3-5 de Gleason). Además,
se analizó un pequeño número de metástasis en ganglios linfáticos
de muestras de cáncer de próstata y de cáncer de próstata en
estadio D2 avanzado.
Para realizar la IHC en estas muestras clínicas,
se usó un anticuerpo monoclonal dirigido contra TMEFF2 (clon nº 19)
en micromatrices de tejidos y portaobjetos individuales de muestras
de cáncer de próstata. Se generaron micromatrices de tejidos
incorporando biopsias del núcleo del tejido de 1,0 mm en
micromatrices de tejidos de densidad media (Beecher Instruments,
Silver Spring, MD) empleando la técnica descrita por Kononen, et
al. (1998) Nature Med 4:844-847). Se marcaron
secciones de molde teñidas con hematoxilina y eosina de los bloques
donantes de parafina de prostatectomía radical para determinar zonas
de hiperplasia nodular y cáncer por un histopatólogo. Usando estas
secciones como guía, se tomaron muestras de 1-2
núcleos de hiperplasia nodular adyacente al cáncer (52 cm del
cáncer) y de 2-4 núcleos de cáncer de los bloques
donantes de parafina de cada una de las muestras de prostatectomía
radical y se incorporaron directamente en bloques de series de
receptores. Se incluyó un núcleo de cada uno de los patrones de
Gleason primario, secundario y terciario representados en los
cánceres. Se montaron la muestra de metástasis en ganglios
linfáticos, de próstata normal y las muestras en estadio D2 como
secciones de tejido convencional.
Se realizó la tinción inmunohistoquímica (IHC)
para detectar TMEFF2 en muestras de tejido incrustadas en parafina,
procesadas de manera rutinaria. Se cortaron secciones de cuatro pm
de estas muestras, se montaron en portaobjetos de adhesión
Superfrost Plus (Lomb Scientific, Sydney, Australia) y se calentaron
en un horno de convección a 75ºC durante 2 horas para estimular la
adherencia al portaobjetos. Se usaron microgránulos incrustados en
parafina de líneas celulares de cáncer de próstata LNCAP y
PC-3 como controles positivo y negativo,
respectivamente. Se desparafinaron las secciones y se rehidrataron
antes del desenmascaramiento en tampón EDTA/citrato y entonces se
tiñeron con anticuerpo anti-TMEFF2. Se detectó la
señal anti-TMEFF2 usando polímero marcado EnVision
Plus de DAKO (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) con
3,3'-diaminobencidina líquida Plus (DAKO
Corporation, Carpinteria, CA) como sustrato. Se realizó la tinción
por contraste con hematoxilina y disolución de viraje a azul de
Scott. Toda la immunotinción de TMEFF2 fue citoplasmática y se
clasificó la intensidad de tinción en la densidad de gránulos
citoplasmáticos como negativa, débil, moderada, o fuerte.
Los resultados muestran que la tinción
anti-TMEFF2 se restringía exclusivamente al
citoplasma y las membranas de células epiteliales prostáticas sin
tinción nuclear o del estroma. El tejido prostático benigno presentó
algo de expresión de proteína TMEFF2 con tinción de débil a
moderada observada en muestras de próstata normal y tinción de
débil a moderada observada en la hiperplasia prostática benigna
(muestras de HPB). La expresión en áreas de hiperplasia adyacente
al cáncer también mostró tinción moderada en la mayoría de los
casos examinados. La cohorte de cáncer de próstata (n=241) presentó
tinción de débil a fuerte en 176 casos, demostrando que una gran
parte de los pacientes con cáncer de próstata muestran expresión de
TMEFF2. También se detectó positividad a TMEFF2 en 4/6 de los casos
de enfermedad localmente avanzada (estadio D2) y 3/5 de las
lesiones metastásicas en ganglios linfáticos, indicando que la
expresión de esta diana se conserva en la enfermedad en estadio
avanzado.
La intensidad de la immunotinción para la
proteína TMEFF2 en tejidos corporales normales que no son de
próstata fue consecuente con los niveles de expresión de ARN
detectados en el perfil de transcripto. Sólo el cerebro mostró
niveles bajos de expresión de TMEFF2. No se detectó expresión en los
siguientes tejidos normales: vejiga, cuello uterino, intestino
delgado, médula espinal, miometrio, páncreas, piel, colon, hígado,
corazón, riñón, testículos, pulmón, glándulas suprarrenales,
músculo esquelético, bazo y ganglios linfáticos. Estos datos
confirman la especificidad de TMEFF2 para la próstata y el cáncer de
próstata.
Estos resultados, combinados con la destrucción
mediada por el conjugado anticuerpo-fármaco de
células tumorales que expresan TMEFF2, indican que TMEFF2 es una
buena diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de
próstata.
El cáncer de próstata es una enfermedad regulada
por hormonas que afecta a los hombres en los últimos años de su
vida. El cáncer de próstata sin tratar metastatiza hacia ganglios
linfáticos y huesos en casos avanzados. En tales casos, el
tratamiento actual consiste en antagonizar el estímulo de
crecimiento androgénico que alimenta al tumor mediante terapia de
ablación hormonal química o quirúrgica (Galbraith y Duchesne.
(1997) Eur. J. Cancer 33:545-554). Una consecuencia
desafortunada de tratamiento antiandrogénico es el desarrollo de
cáncer andrógeno independiente. Los genes regulados por andrógenos,
tales como el gen que codifica para el antígeno específico de la
próstata (PSA), se desactivan con la terapia de ablación hormonal,
pero reaparecen cuando el tumor se vuelve andrógeno independiente
(Akakura et al. (1993) Cancer
71:2782-2790).
Para estudiar la progresión del cáncer de
próstata andrógeno dependiente a cáncer de próstata andrógeno
independiente, se propagó el modelo de injerto heterólogo de cáncer
de próstata CWR22 humano en ratones atímicos (véase Pretlow, et
al. (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85:394-398). El
injerto heterólogo de CWR22 es andrógeno dependiente cuando se hizo
crecer en ratones macho atímicos. Pueden derivarse sublíneas
andrógeno independientes estableciendo en primer lugar tumores
andrógeno dependientes en ratones macho. Entonces se castran los
ratones para eliminar la fuente primaria de estímulo de crecimiento
(andrógenos), dando como resultado la regresión del tumor. En un
plazo de 3-4 meses los acontecimientos moleculares
provocan que los tumores experimenten una recaída y empiezan a
crecer como tumores andrógeno independientes. Véase, por ejemplo,
Nagabhushan, et al. (1996) Cancer Res.
56:3042-3046; Amler, et al. (2000) Cancer
Res. 60:6134-6141; y Bubendorf, et al. (1999)
J. Natl. Cancer Inst. 91:1758-1764.
Usando el modelo de injerto heterólogo de CWR22,
se monitorizaron previamente los cambios en la expresión génica que
se producen durante la transición desde la dependencia androgénica
hasta la independencia androgénica (véase el documento WO02098358).
Se hicieron crecer tumores subcutáneamente en ratones macho
atímicos. Se recogieron los tumores a diferentes tiempos tras la
castración. Los puntos de tiempo oscilaron desde 0 hasta 125 días
tras la castración. La castración dio como resultado la regresión
del tumor. En el día 120 y siguientes, los tumores experimentaron
una recaída y empezaron a crecer en ausencia de andrógeno.
Se logró el perfil de expresión génica de los
tumores recogidos usando la micromatriz de oligonucleótidos Eos
Hu03 (Affymetrix Eos Hu03). Los resultados identificaron varios
cientos de genes que mostraron cambios significativos en la
expresión génica asociados con la terapia de ablación androgénica.
Algunos genes estaban asociados con la fase de crecimiento
andrógeno-dependiente de los tumores CWR22 (antes
de la castración y 1-5 días tras la castración),
algunos genes estaban asociados con la fase de retirada de
andrógenos (10-82 días tras la castración,
caracterizada por la regresión del tumor y/o la estasis del
crecimiento del tumor) y algunos genes estaban asociados con el
crecimiento andrógeno-independiente de CWR22
(superior a 120 días tras la castración). Véase el documento
W002098358.
El gen que codifica para TMEFF2 mostró niveles
de expresión altos durante todo el experimento de retirada de
andrógenos. Los niveles de expresión más altos se observaron en los
injertos heterólogos de CWR22 andrógeno dependientes (en los que se
confirmó mediante immunohistoquímica la presencia de proteína
TMEFF2) y en los tumores CWR22 andrógeno independientes emergentes
(>120 días tras la castración). Se detectó expresión menor, pero
todavía significativa en tumores 10-82 días tras la
castración (fase de retirada de andrógenos).
Para prevenir el cáncer de próstata
andrógeno-independiente, se tratan ratones que
portan el tumor CWR22, después de la terapia de ablación
androgénica, con anticuerpo anti-TMEFF2 conjugado
con auristatina E (nº 19-pMMVCAE). El objetivo es
mostrar que el tratamiento tras la castración con nº
19-pMMVCAE durante la fase de retirada de
andrógenos (10-82 días tras la castración) dará
como resultado un retraso en la aparición de crecimiento del tumor
CWR22 andrógeno-independiente. Se hacen crecer
tumores CWR22 en ratones macho immunodeficientes durante
2-3 semanas. Entonces se castran los ratones para
inducir regresión del tumor y entrar en la fase de retirada de
andrógeno. Veinte días tras la castración, se tratan los tumores
con nº 19-pMMVCAE tal como se describe en el
ejemplo 3. Se manifestaría un efecto significativo de nº
19-pMMVCAE en un retraso en la aparición de
independencia androgénica (por ejemplo, 5 meses o más tras la
castración). Esto sugeriría que pacientes con cáncer de próstata en
estadio avanzado, que se tratan con terapia de ablación
androgénica, se beneficiarían enormemente del tratamiento con nº
19-pMMVCAE humanizado. Estos pacientes como mínimo
disfrutarían de un período de supervivencia más largo tras la
terapia de ablación androgénica y posiblemente se curarían del
cáncer de próstata.
Un efecto no significativo en el tratamiento con
nº 19-pMMVCAE puede deberse a varios factores
potenciales: (a) los tumores CWR22 de injerto heterólogo pueden ser
resistentes a la auristatina E; (b) las células tumorales pueden no
internalizar eficazmente el nº 19-pMMVCAE durante la
fase de retirada de andrógenos; o (c) la expresión de proteína
TMEFF2 puede disminuir significativamente durante la fase de
retirada de andrógenos. Están disponibles modificaciones en el
tratamiento para abordar estas cuestiones.
Para tratar el cáncer de próstata
andrógeno-independiente, se tratan ratones que
portan el tumor CWR22 en el momento de aparición de la
independencia androgénica con nº 19-pMMVCAE. El
objetivo es mostrar que el tratamiento tras la castración con nº
19-pMMVCAE durante la aparición de la independencia
androgénica (>120 días tras la castración) dará como resultado la
regresión de tumores CWR22
andrógeno-independientes. Se hacen crecer tumores
CWR22 en ratones macho immunodeficientes durante 2-3
semanas. Entonces se castran los ratones para inducir la regresión
del tumor y entrar en la fase de retirada de andrógenos. Diez días
después de que los tumores empiecen a crecer de un modo
andrógeno-independiente, se tratan los tumores con
nº 19-pMMVCAE tal como se describió en el ejemplo
3. Un efecto significativo de nº 19-pMMVCAE se
manifestaría por sí mismo en la regresión de tumores
andrógeno-independientes. Esto sugeriría que
pacientes que se trataron con terapia de ablación androgénica y que
sufrieron recidiva en forma de crecimiento de tumor y metástasis
andrógeno- independiente se beneficiarían enormemente del
tratamiento con el tratamiento con nº 19-pMMVCAE
humanizado. Estos pacientes, que actualmente no tienen un
tratamiento alternativo, como mínimo disfrutarían de un período de
supervivencia más largo tras la aparición del cáncer de próstata
andrógeno-independiente y posiblemente se curarían
de la enfermedad.
Se entiende que los ejemplos descritos
anteriormente no sirven de ninguna manera para limitar el verdadero
alcance de esta invención, sino que se presentan para fines
ilustrativos. GenBank se conoce en la técnica, véase, por ejemplo,
Benson, et al. (1998) Nucleic Acids Research
26:1-7. Las secuencias también están disponibles en
otras bases de datos, por ejemplo, European Molecular Biology
Laboratory (EMBL) y DNA Database de Japón (DDBJ).
<110> Protein Design Labs, Inc.
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<120> ANTICUERPOS CONTRA EL ANTÍGENO
CANCERÍGENO TMEFF2 Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> P 3124EU
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<140> EP03744243
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<141>
07-03-2003
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<150> US60/362.837
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<151>
08-03-2002
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<150> US60/436.812
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<151>
27-12-2002
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<160> 34
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<170> PatentIn versión 3.2
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<223> Anticuerpo humanizado
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<400> 31
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<210> 32
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Anticuerpo humanizado
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 324
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Anticuerpo humanizado
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<400> 33
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<210> 34
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Anticuerpo humanizado
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<400> 34
Claims (15)
1. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno
del mismo que comprende:
(a) una región variable de cadena pesada que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en SEQ ID NO: 22, 24, 26 y 28; y
(b) una región variable de cadena ligera que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en SEQ ID NO: 30, 32 y 34.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que:
la región variable de cadena pesada comprende
SEQ ID NO: 22 y la región variable de cadena ligera comprende SEQ
ID NO: 30;
la región variable de cadena pesada comprende
SEQ ID NO: 22 y la región variable de cadena ligera comprende SEQ
ID NO: 32;
la región variable de cadena pesada comprende
SEQ ID NO: 28 y la región variable de cadena ligera comprende SEQ
ID NO: 32;
la región variable de cadena pesada comprende
SEQ ID NO: 24 y la región variable de cadena ligera comprende SEQ
ID NO: 34; o
la región variable de cadena pesada comprende
SEQ ID NO: 26 y la región variable de cadena ligera comprende SEQ
ID NO: 34.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que el anticuerpo está conjugado además con un componente efector
seleccionado del grupo que consiste en un marcador detectable, un
radioisótopo, un agente quimioterapéutico y un producto químico
citotóxico.
4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el
que el producto químico citotóxico es auristatina.
5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab o
F(ab)2.
6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que la región variable de cadena pesada está codificada por una
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 21, 23, 25 y 27; y la región variable de cadena ligera
está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29, 31 y 33.
7. Composición farmacéutica que comprende un
excipiente farmacéuticamente aceptable y el anticuerpo según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, en la que el producto químico citotóxico es
auristatina.
9. Método de detección de una célula de cáncer
de próstata en una muestra biológica de un paciente, comprendiendo
el método poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo
según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 6 6.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el anticuerpo está conjugado además con un marcador detectable.
11. Uso de un anticuerpo según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento del cáncer de próstata de un
paciente.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el
paciente es un primate.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
paciente está sometiéndose a un régimen terapéutico para tratar un
cáncer de próstata metastásico.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que se
sospecha que el paciente tiene un cáncer de próstata
metastásico.
15. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que el cáncer de próstata
metastásico se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de
próstata primario, cáncer de próstata metastásico, cáncer de
próstata localmente avanzado, cáncer de próstata andrógeno
independiente, cáncer de próstata que se ha tratado con terapia
neoadyuvante y cáncer de próstata que es resistente al tratamiento
con terapia neoadyuvante.
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