KR20210011999A - 단일특이성 및 다중특이성 항-tmeff2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

단일특이성 및 다중특이성 항-tmeff2 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210011999A
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tmeff2
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antigen binding
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필립 쿠퍼
로빈 에른스트
라자르쿠마 가네산
콜렌 케인
마이클 러셀
산자야 싱
사샤데비 벤카타라마니
솅-지운 우
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에 제공된 본 발명은 단일특이성 및 다중특이성 항-TMEFF2 항체, 및 기술된 항체의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

단일특이성 및 다중특이성 항-TMEFF2 항체 및 이의 용도
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2019년 1월 31일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI5160WOPCT1_SL.txt이며, 크기가 144,156 바이트이다.
기술분야
본 명세서에 제공된 본 발명은 단일특이성 및 다중특이성 항-TMEFF2 항체, 및 기술된 항체의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.
전립선암은 전세계적으로 남성 중에서 두 번째로 흔한 암이고, 암-관련 사망의 여섯 번째 주요 원인이다. 전세계적으로, 매해마다 대략 1,100,000건의 새로운 사례 및 300,000건의 사망이 있으며, 이는 전체 암 사망의 4%를 차지한다. 남성 6명 중 1명이 평생 동안 이 질병으로 진단될 것으로 추정된다. 전립선암 위험은 연령과 강하게 상관된다: 사례의 약 3/4이 65세 이상의 남성에서 발생하며, 이때 70 내지 74세 남성에서 가장 많은 수의 사례가 발생한다. 사후 데이터에 따르면, 50대 남성의 약 절반 및 80세 남성의 80%가 전립선에서 암의 조직학적 증거를 가지고 있는 것으로 추정된다. 초기 단계에서, 5년 생존율은 100%에 가깝다. 그러나, 암이 전이되면, 5년 생존율은 28%로 떨어지고, 진행-단계 전립선암에 대한 효과적인 치료에 대한 필요성이 남아 있다.
고환 안드로겐 박탈 요법은 보통 (환자의 80%에서) 질병의 안정화 또는 퇴행을 초래한다. 전립선암에 대한 현재의 치료는 수술, 방사선 및 호르몬 요법을 포함한다. 전형적으로, 방사성 약제학적 작용제인 암 백신 시풀류셀(sipuleucel)-T(예컨대, 라듐-223 클로라이드), 2차 호르몬 요법(예컨대, 아비라테론 또는 엔잘루타미드), 및/또는 화학요법(도세탁셀 및 카바지탁셀)이 순차적으로 호르몬 요법에 첨가된다. 이들 치료 각각은 수개월 동안 암의 성장을 지연시키고 이 질병에 의해 야기된 증상을 고식시킬 수 있지만, 결국 전이성 전립선암의 진행이 발생한다. 호르몬 요법에 의한 테스토스테론 수준의 저하에도 불구하고 전립선암이 성장할 때, 치료 옵션이 제한된다.
따라서, 전립선암을 치료하기 위한 추가적인 치료제 개발이 필요하다.
본 발명은 TMEFF2의 서열 번호 110의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL), 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL, 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL, 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL, 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL, 또는 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명은 또한 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57) 또는 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내에서 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 서열을 갖는 단리된 항-TMEFF2 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 단리된 항-TMEFF2 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 단리된 항-TMEFF2 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL; 및/또는
서열 번호 32의 HC 및 서열 번호 35의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL; 및/또는
서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 36의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL; 및/또는
서열 번호 34의 HC 및 서열 번호 37의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL; 및/또는
서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 38의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 및/또는
서열 번호 91의 HC 및 서열 번호 92의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL; 및/또는
서열 번호 93의 HC 및 서열 번호 94의 LC를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하거나, 서열 번호 25, 26, 27, 87 또는 89의 항-TMEFF2 항체 VH 및/또는 서열 번호 28, 29, 30, 31, 88 또는 90의 VL을 인코딩하거나, 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 또는 102의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항체 또는 항원 결합 단편이 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 본 발명의 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 결합하는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 TMEFF2의 서열 번호 110의 막 근위 영역에 결합한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL), 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL, 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL, 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL, 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL, 또는 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 TMEFF2 상의 서열 번호 57 또는 서열 번호 58의 에피토프(epitope)에 결합한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 35의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 HC1, 서열 번호 35의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 생성하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은,
2개의 동일한 HC1 및 2개의 동일한 LC1을 갖는 단일특이성 2가 TMEFF2 항체와, 2개의 동일한 HC2 및 2개의 동일한 LC2를 갖는 단일특이성 2가 CD3 항체를 약 1:1 몰비의 혼합물로 조합하는 단계;
혼합물 내로 환원제를 도입하는 단계;
혼합물을 약 90분 내지 약 6시간 인큐베이션하는 단계;
환원제를 제거하는 단계; 및
HC1, LC1, HC2 및 LC2를 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 선택된 항-TMEFF2 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 정렬을 나타낸다. VH 영역들은 각 행의 시작 부분에서 이들의 서열 번호에 의해 식별된다.
도 2는 선택된 항-TMEFF2 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 정렬을 나타낸다. VH 영역들은 각 행의 시작 부분에서 이들의 서열 번호에 의해 식별된다.
도 3은 선택된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체에 의한 증가된 카스파제 3/7 활성에 의해 측정되는 바와 같은 시간 경과에 따른 LnCaP 세포의 사멸을 나타낸다.
도 4는 수컷 NGS 마우스의 생체외 LnCaP 전립선암 모델에서 선택된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체에 의한 종양 이식 후 시간 경과에 따른 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다.
도 5a는 수컷 NGS 마우스의 생체외 LnCaP 전립선암 모델에서 0.5 mg/㎏ TMCB93으로 처리된 각각의 마우스의 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다.
도 5b는 수컷 NGS 마우스의 생체외 LnCaP 전립선암 모델에서 0.5 mg/㎏ TMCB132로 처리된 각각의 마우스의 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다.
도 6은 T 세포 인간화 NSG 마우스에서 확립된 LNCaP 이종이식편에서의 TMEB762xCD3B376의 효능을 나타낸다.
도 7은 TMCB132의 투여에 반응하여 LnCaP 전립선암 세포에서의 T 세포 활성화를 나타낸다.
도 8은 TMCB132의 T 세포-매개 세포독성을 나타낸다.
도 9는 T 세포 인간화 마우스에서 TMCB132의 항종양 효능을 나타낸다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
문맥상 달리 명확하게 요구되지 않는 한, 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐서 "포함하다", "포함하는" 등의 단어는 배타적이거나 총망라한 의미와는 대조적으로, 포괄적인 의미; 즉, "~을(를) 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다"라는 의미로 해석되어야 한다.
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "결합한다"는 항체가 항원 또는 항원 내의 에피토프에 대해 다른 항원들에 대한 친화도보다 더 큰 친화도로 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 5×10-8 M 이하, 예를 들어 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-12 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하며, 이때 전형적으로 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 그의 KD보다 적어도 100배 더 적다. 해리 상수는 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하여 측정될 수 있다. 그러나, 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하는 항체는 다른 관련 항원들, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스(cynomolgus), 사이노(cyno)), 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 침프(chimp))로부터의 동일한 항원과의 교차 반응성을 가질 수 있다. 단일특이성 항체는 하나의 항원 또는 하나의 에피토프와 결합하지만, 이중특이성 항체는 2개의 별개의 항원 또는 2개의 별개의 에피토프와 결합한다.
"항체"는 광의로 의미되며, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함한 단일클론 항체, 항원 결합 단편, 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성 등), 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. "전장 항체"는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지 CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
"상보성 결정 영역"(CDR)은 항원에 결합하는 항체 영역이다. CDR은 하기와 같은 다양한 도해(delineation)를 사용하여 정의될 수 있다: Kabat(문헌[Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50])(문헌[Kabat Et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]), Chothia(문헌[Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17]), IMGT(문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]) 및 AbM(문헌[Martin and Thornton (1996) J Bmol Biol 263: 800-15]). 다양한 도해와 가변 영역 넘버링 사이의 상응성이 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[ Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77; 문헌[Honegger and Pluckthun, (2001) J Mol Biol 309:657-70]; 문헌[International ImMunoGeneTics (IMGT) database]; 웹 리소스, www. imgt.org 참조). UCL Business PLC의 abYsis와 같은 이용가능한 프로그램을 사용하여 CDR을 상세하게 설명할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에 달리 명시적으로 기재되어 있지 않는 한, 상기에 기재된 방법들인 카바트, 초티아, IMGT 또는 AbM 중 임의의 것에 의해 정의된 CDR을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형(isotype) IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
"항원 결합 단편"은 항원에 결합하는 면역 글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 단편은 합성 폴리펩티드이거나, 효소적으로 얻을 수 있는 폴리펩티드이거나, 유전자 조작된 폴리펩티드일 수 있으며, VH, VL, VH 및 VL, Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편, 1개의 VH 도메인 또는 1개의 VL 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb), 상어 가변 IgNAR 도메인, 낙타화(camelized) VH 도메인, 항체의 CDR을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위, 예컨대 FR3-CDR3-FR4 부분, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에 분자내에서, 또는 분자간에 쌍을 이루어서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성할 수 있으며, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1998/44001호, WO1988/01649호, WO1994/13804호, 및 WO1992/01047호에 기재되어 있다.
"단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 분자 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하는데, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 항체 중쇄로부터 C 말단 라이신의 제거와 같은 가능성 있는 잘 알려진 변경, 또는 아미노산 이성질화 또는 탈아미드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화와 같은 번역 후 변형을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 전형적으로 1개의 항원 에피토프에 결합한다. 이중특이성 단일클론 항체는 2개의 별개의 항원 에피토프에 결합한다. 단일클론 항체는 항체 집단 내에 불균질한 글리코실화를 가질 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성, 예컨대 이중특이성 1가, 2가 또는 다가일 수 있다.
"단리된"은 분자가 생성되는 시스템, 예컨대 재조합 세포의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되고/되거나 정제된 분자(예컨대 합성 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 예컨대 항체)의 상동 집단뿐만 아니라, 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질을 지칭한다. "단리된 항체"는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 항체를 지칭하며, 더 높은 순도로, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 단리된 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는, 하나 이상의 CDR이 비인간 종으로부터 유래되고, 적어도 하나의 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식세포계열(germline) 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"인간 항체"는 인간 대상체에게 투여될 때 최소한의 면역 반응을 갖도록 최적화된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 가변 영역은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부분을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체는, 인간 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 예시적인 시스템은, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자도입 비인간 동물, 예컨대 마우스 또는 래트를 포함한다. "인간 항체"는 전형적으로, 인간 항체 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 얻는 데 사용되는 시스템간의 차이, 체세포 돌연변이의 도입 또는 프레임워크 또는 CDR 내로의 치환의 의도적인 도입, 또는 둘 모두로 인해 인간에서 발현된 면역글로불린과 비교하여 아미노산 차이를 함유한다. 전형적으로, 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 또는, 예를 들어 문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다.
적어도 하나의 CDR이 비인간 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"재조합체"는, 상이한 공급원으로부터의 세그먼트들이 결합되어 재조합 DNA, 항체 또는 단백질을 생성할 때 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 DNA, 항체 및 다른 단백질을 지칭한다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.
"이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 사이노몰거스(Macaca cynomolgus)(사이노몰거스, 사이노), 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)로부터의 동일한 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
"다중특이성"은 2개 이상의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개 이상의 별개의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 다중특이성 항체는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 사이노몰거스(Macaca cynomolgus)(사이노몰거스, 사이노), 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)로부터의 동일한 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
"변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"벡터"는 생물 시스템 내에서 복제가 가능하거나, 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 생물 시스템, 예컨대 세포, 바이러스, 동물, 식물, 및 벡터를 복제할 수 있는 생물 성분을 이용하는 재구성된 생물 시스템에서 이러한 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 요소, 예컨대 복제 기점, 폴리아데닐화 신호, 또는 선택 마커를 함유한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 다른 균등한 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 합성 분자를 지칭한다. cDNA는 예시적인 합성 폴리뉴클레오티드이다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합으로 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
"TMEFF2"는 EGF 유사 및 2개의 폴리스타틴(follistatin) 유사 도메인 2를 갖는 인간 막관통 단백질을 지칭하며, 이는 토모레굴린(tomoregulin) 2로도 불린다. 전장 인간 TMEFF2의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다. TMEFF2의 세포외 도메인은 서열 번호 2에 나타나 있으며, 전장 TMEFF2의 잔기 40-374에 걸쳐 있다. TMEFF2 세포외 도메인은 3개의 별개의 서브도메인, 카잘(Kazal)-유사 1(잔기 85-137), 카잘-유사 2(잔기 176-229) 및 EGF 도메인(잔기 261-301)을 지닌다. TMEFF2 EGF 도메인은 서열 번호 3에 나타나 있다. TMEFF2 "막 근위 영역"은 EGF 도메인 및 N-C-말단 링커 영역(예를 들어, 서열 번호 1의 전장 인간 TMEFF2의 잔기 230-320)을 포함하는, 서열 번호110의 TMEFF2 영역을 지칭한다. 본 명세서에서 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비-인간 종으로부터의 것으로서 명시적으로 특정되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 하는 것이다. 따라서, "TMEFF2"는 비인간 종, 예컨대, "마우스 TMEFF2" 또는 "원숭이 TMEFF2" 등으로부터의 것으로서 특정되지 않는 한, 인간 TMEFF2를 의미한다.
서열 번호 1 (전장 인간 TMEFF2)
Figure pct00001
서열 번호 2 (인간 TMEFF2의 세포외 도메인)
Figure pct00002
TMEFF2 EGF 도메인 서열 번호 3
Figure pct00003
TMEFF2 막 근위 영역 서열 번호 110
Figure pct00004
"CD3"은, 다분자 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로서 T 세포 상에서 발현되고, 하기의 2개 또는 4개의 수용체 사슬의 회합으로부터 형성된 동종이량체 또는 이종이량체로 이루어진 항원을 지칭한다: CD3 엡실론(epsilon), CD3 델타, CD3 제타 및 CD3 감마. 인간 CD3 엡실론은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비-인간 종으로부터의 것으로서 명시적으로 특정되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 하는 것이다. 따라서, "CD3"은 비인간 종, 예컨대, "마우스 CD3" 또는 "원숭이 CD3" 등으로부터의 것으로서 특정되지 않는 한, 인간 CD3을 의미한다.
서열 번호 4 (인간 CD3 엡실론)
Figure pct00005
서열 번호 5(인간 CD3 엡실론 세포외 도메인)
Figure pct00006
"이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체", TMEFF2/CD3 항체, TMEFF2xCD3 항체 등은 TMEFF2 및 CD3에 결합하는 항체를 지칭한다.
"와 병용하여"는 둘 이상의 치료제가 대상체에게 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 또는 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여됨을 의미한다.
"TMEFF2 양성 암"은 측정가능한 수준의 TMEFF2 단백질을 나타내는 암 조직 또는 암 세포를 지칭한다. TMEFF2 단백질의 수준은, 예를 들어 살아 있거나 또는 용해된 세포에 대해 ELISA, 면역형광, 유세포측정 또는 방사면역검정을 사용하는 잘 알려진 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
"샘플"은 대상체 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라, 대상체로부터 단리된 유사한 유체, 세포, 또는 조직의 집합을 지칭한다. 예시적인 샘플은 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 타액, 낭액, 눈물 방울, 배설물, 객담, 분비 조직 및 장기의 점막 분비물, 질 분비물, 복수액, 예컨대 비-고형 종양과 연계된 것들, 흉강, 심낭, 복막강, 복강, 및 다른 체강의 유체, 기관지 세척에 의해 수집된 유체, 대상체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액, 예를 들어, 세포 또는 장기 컨디셔닝된 배지를 포함하는 세포 및 장기 배양 배지, 세척액 등, 조직 생검물, 세침 흡인물, 또는 외과적으로 절제된 종양 조직이다.
"암 세포" 또는 "종양 세포"는 생체내, 생체외, 또는 조직 배양에서의 암성, 전암성, 또는 형질전환 세포를 지칭하며, 이는 자발적이거나 유도된 표현형 변화를 갖는다. 이러한 변화가 반드시 새로운 유전 물질의 흡수를 수반하지는 않는다. 형질전환이 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 도입, 또는 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있기는 하지만, 이는 또한 자발적으로 또는 발암물질에 대한 노출 후에 일어날 수 있으며, 그럼으로써 내인성 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 형질전환/암은 시험관내, 생체내 및 생체외에서 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주 내의 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 비정상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성종양, 종양 특이적 마커 수준의 조절(modulation), 침습성, 종양 성장에 의해 예시된다(문헌[Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)]).
"약"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값이 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 어떻게 그 값이 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 제한사항에 부분적으로 좌우될 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시 형태와 관련하여 실시예에서 또는 명세서에서의 어딘가 다른 곳에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따른 1 표준 편차, 또는 최대 5%의 범위 어느 쪽이든 더 큰 값 이내에 있음을 의미한다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 언급된 경우를 제외하고는, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호교환 가능하게 사용된다.
"치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭하며, 여기서 목적은 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애를 예방 또는 둔화(감퇴)시키는 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질병 정도의 저하, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함한다. "치료"는 또한 대상체가 치료를 받지 않고 있을 경우에 예상되는 생존과 비교할 때 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 자들은 이미 질환 또는 장애를 가진 자들뿐만 아니라 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 자들을 포함한다.
"치료적 유효량"은 필요한 용량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 치료제 또는 치료제들의 병용물이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 효과적인 치료제 또는 치료제들의 병용물의 예시적인 지표는, 예를 들어 환자의 개선된 웰빙(well-being)을 포함한다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다.
표 1에 제시되어 있는 바와 같은 종래의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다:
[표 1]
Figure pct00007
물질의 조성물
본 발명은 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 항-TMEFF2 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이성 항체, 및 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
항-TMEFF2 항체
TMEFF2 발현은 다른 정상 조직에 비해 전립선 조직 및 전립선 선암에서 상당히 풍부화된다. 막성 TMEFF2는 질병 진행 내내 유지되어, 항-종양 치료제에 대한 가능한 표적으로서 역할을 한다. TMEFF2는 프로테아제에 의해 절단되어 가용성 형태의 항원을 생성하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서, TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 항체는, 막 TMEFF2에 대한 항체 결합을 최대화하고 생성된 항체가 가용성 TMEFF2 형태에 결합할 가능성을 최소화하도록 생성되었다.
본 발명은 TMEFF2의 서열 번호 110의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체는 세포에 의해 내재화되지 않는다. 어떠한 특정 이론에 의해서도 구애되고자 함이 없이, 비-내재화 항-TMEFF2 항체는 내재화 항-TMEFF2 항체와 비교할 때 TMEFF2의 내재화 및 열화의 결여로 인한 항체 이펙터 기능에 의해 매개되는 개선된 발암성 효과를 가질 것으로 예상될 수 있다.
"막 근위 영역에 대한 결합"은 수소/중수소 교환(H/D 교환)을 사용하여 식별된 항체 에피토프 잔기의 90%가 TMEFF2의 막 근위 영역 내에 존재함을 의미한다. 에피토프 잔기는 H/D 교환을 통한 중수소화 수준의 적어도 5% 차이로 시험 항체에 의해 보호되는 것들이다. 예시적인 이러한 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 TMEB675, TMEB570, TMEB674, TMEB565, TMEB762 및 TMEB757이다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57) 또는 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내에서 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다. 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57) 내의 예시적인 항-TMEFF2 항체 결합은 TMEB570이다. 잔기 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내의 예시적인 항-TMEFF2 항체 결합은 TMEB675이다. TMEB675 변이체 TMEB762 및 TMEB757은 또한 잔기 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내에서 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합할 것으로 예상된다.
H/D 교환 검정에서는, 재조합적으로 발현된 TMEFF2 ECD를 중수소화된 물 중에서 항체의 존재 또는 부재 하에서 미리 결정된 시간 동안 인큐베이션하여, 항체에 의해 보호되지 않은 교환가능한 수소 원자에서의 중수소 혼입을 발생시킨 후, 단백질의 프로테아제 분해를 수행하고 LC-MS를 사용하여 펩티드 단편을 분석한다. H/D 교환 검정은 공지된 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 프로토콜은 실시예 5에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL), 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL, 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL, 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL, 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL, 또는 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 시험 항체의 결합에 대한 경쟁은 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 비표지 참조 항체의 존재 하에서 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 MSD Sulfo-Tag™ NHS-에스테르―표지된 시험 항체의 결합이 ELISA 또는 Biacore 분석에 의해 평가될 수 있거나, 경쟁을 보여주기 위해 유세포측정이 사용될 수 있다. 시험 항체는 시험 항체가 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 참조 항체의 결합을 85% 이상, 예를 들어 90% 이상, 또는 95% 이상으로 억제할 때 참조 항체와 TMEFF2에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명은 또한
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22;
각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23;
각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24;
각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22; 또는
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.4 × 10-9 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다.
TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 항체의 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 당업자에게 알려진 ProteOn XPR36, Biacore 3000 또는 KinExA 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 검정을 이용한다. TMEFF2에 대한 항체의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 오스몰 농도(osmolarity), pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon 및 Koff)의 측정은 전형적으로 표준화된 조건, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다. 예를 들어, Biacore 3000 또는 ProteOn을 사용하는 친화도 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)는 전형적인 검출 한계 내에서의 측정에 대해 전형적으로 5 내지 33% 이내일 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, KD 값을 지칭 할 때, "약"이라는 용어는 검정에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10-9 M의 KD에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33×10-9 M이다.
본 발명은 또한 VH3_3-23(서열 번호 53) 또는 VH1_1-69(서열 번호 54)로부터 유래된 중쇄 가변 영역(VH) 프레임워크를 포함하는, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 VKI_L11(서열 번호 55) 또는 VKIIII_A27(서열 번호 56)로부터 유래된 경쇄 가변 영역(VL) 프레임워크를 포함하는, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 53의 VH3_3-23 및 서열 번호 55의 VKI_L11로부터 유래된 VH 프레임워크 및 VL 프레임워크를 포함하는, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 54의 VH1_1-69 및 서열 번호 56의 VKIII_A27로부터 유래된 VH 프레임워크 및 VL 프레임워크를 포함하는, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 54의 VH1_1-69 및 서열 번호 55의 VKI_L11로부터 유래된 VH 프레임워크 및 VL 프레임워크를 포함하는, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 프레임워크 또는 생식세포계열 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는, 본 명세서에 논의된 바와 같이 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터, 예컨대 유전자도입 마우스, 래트 또는 닭으로부터 또는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 얻어진 항체를 지칭한다. 생식세포계열 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 포함하는 항체는 그것이 유래된 서열에 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있는데, 이는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 의도적인 치환에 기인한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 39의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 42의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 HC 및 서열 번호 35의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 46의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 49의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 40의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 43의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 36의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, LC는 서열 번호 50의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 44의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC 및 서열 번호 37의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 48의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, LC는 서열 번호 51의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 40의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 45의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 38의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, LC는 서열 번호 52의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 95의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 96의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC 및 서열 번호 92의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 97의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, LC는 서열 번호 98의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, VH는 서열 번호 99의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, VL은 서열 번호 100의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC 및 서열 번호 94의 LC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, HC는 서열 번호 101의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, LC는 서열 번호 102의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다중특이성 항체이다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중특이성 항체이다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 T 세포 항원에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 항-TMEFF2 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3 엡실론에 결합한다.
본 발명의 예시적인 항-TMEFF2 항체의 VH, VL, HCDR, LCDR, HC 및 LC 서열이 표 5 내지 표 12에 나타나 있다.
실시예에 예시된 실시 형태가 중쇄로부터의 하나의 가변 도메인 및 경쇄로부터의 하나의 가변 도메인으로 된 가변 영역들의 쌍을 포함할지라도, 숙련자는 대안적인 실시 형태가 단일의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인들을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일의 가변 도메인을 사용하여, TMEFF2에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원 결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 개시된 계통적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 접근법에서는, VH 또는 VL 사슬 클론 중 하나를 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여, 다른 사슬(VL 또는 VH)을 인코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-사슬 특이적 항원-결합 도메인을 알려진 방법 및 본 명세서에 기재된 것들을 사용하여 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다. 따라서, 개별적인 VH 및 VL 폴리펩티드 사슬은 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 개시된 방법을 사용하여 추가적인 항-TMEFF2 항체를 식별하기에 유용하다.
상동 항체
표 9에 나타낸 VH 또는 VL 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변이체는 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 변이체는, 모 항체와 비교할 때 상동 항체가 개선된 기능적 특성, 예컨대, TMEFF2에 대한 비견되는 결합 또는 향상된 안정성을 유지하거나 갖는 한, VH 및/또는 VL 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 서열 동일성은 본 발명의 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 상동 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.4 × 10-9 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 상동 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 모두는 선택적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 어떤 치환은 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 25, 26, 27, 87 또는 89의 VH와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 선택적으로, 서열 번호의 서열에서의 어떠한 변이도 CDR 내에 있지 않다.
본 발명은 또한 서열 번호 28, 29, 30, 31, 88 또는 90의 VL과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 선택적으로, 서열 번호의 서열에서의 어떠한 변이도 CDR 내에 있지 않다.
선택된 항-TMEFF2 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열의 정렬을 도 1에 나타내고, 선택된 항-TMEFF2 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열의 정렬을 도 2에 나타내고 있다. VH 및 VL 사슬은 각 행의 시작 부분에서 이들의 서열 번호로 식별된다. VH 및/또는 VL에서 치환이 일어날 수 있는 부위는 항체 간에 상이한 잔기 위치이다. 예를 들어, 치환은 서열 번호 25, 27, 87 및 89의 VH 내의 잔기 위치 14, 20, 54, 56, 59, 76, 82, 84, 93, 107(서열 번호 25에 기초한 넘버링)에서 이루어질 수 있다. 유사하게, 치환은 서열 번호 28, 30, 88 및 90의 VL 내의 잔기 위치 1, 95 및 107에서 이루어질 수 있다. 이루어질 수 있는 예시적인 치환은 보존적인 아미노산 치환, 또는 각각의 항-TMEFF2 항체의 상응하는 잔기 위치에 존재하는 아미노산 잔기로의 치환이다.
2개의 서열들 사이의 % 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 × 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다.
2개의 아미노산 서열들 사이의 % 동일성은, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열들 사이의 % 동일성은, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량(length weight)을 사용하여, (www. Gcg.com에서 입수가능한) GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 포함되어 있는 문헌[Needleman and Wunsch (J Mol Biol 48:444-453 (1970))]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
본 발명은 또한 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열들을 포함하는 VH 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열들을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, CDR 서열들 중 하나 이상은 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 표 5 내지 표 12에 나타낸 항체) 또는 그의 보존적 변형에 기초하는 명시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 본 발명의 모 항체의 원하는 기능적 특성을 유지한다.
일부 실시 형태에서, 보존적 변형을 갖는 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.4 × 10-9 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된다.
일부 실시 형태에서, 보존적 변형을 갖는 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 보존적 변형을 제공한다.
"보존적 변형"은 아미노산 변형을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 주지 않거나 그를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24]). 본 발명의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이생성(미국 특허 제4,683,195호)에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 생성되는 항체 변이체들은 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 그들의 특성에 대해 시험될 수 있다.
면역접합체
"면역접합체"는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 본 발명의 항체를 지칭한다.
본 발명은 또한 이종성 분자에 접합된 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 이종성 분자는 검출가능 표지이다.
검출가능 표지에 접합된 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다양한 샘플에서의 TMEFF2의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다. 검출가능 표지에는, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합될 때, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단을 통해 후자를 검출가능하게 하는 조성물을 포함한다.
예시적인 검출가능 표지에는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드 입자, 형광 염료, 고 전자밀도 시약(electron-dense reagent), 효소(예를 들어, ELISA에서 통상적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌, 합텐, 발광 분자, 화학발광 분자, 형광색소, 형광단, 형광 켄칭제(quenching agent), 착색된 분자, 방사성 동위원소, 신틸레이트(scintillate), 아비딘, 스트렙트아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속, 효소, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, 루시페라제, 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르 및 발색 기질이 포함된다.
검출가능 표지는, 예컨대, 검출가능 표지가 방사성 동위원소인 경우, 신호를 자발적으로 방출할 수 있다. 다른 경우에, 검출가능 표지는 외부장(external field)에 의해 자극된 후 신호를 방출한다.
예시적인 방사성 동위원소는 γ-방출, 오거(Auger)-방출, β-방출, 알파-방출 또는 양전자-방출 방사성 동위원소일 수 있다. 예시적인 방사성 동위원소는 3H, 11C, 13C, 15N, 18F, 19F, 55Co, 57Co, 60Co, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 72As, 75Br, 86Y, 89Zr, 90Sr, 94mTc, 99mTc, 115In, 123I, 124I, 125I, 131I, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 226Ra, 225Ac 및 227Ac를 포함한다.
예시적인 금속 원자는 원자번호가 20보다 큰 금속, 예컨대 칼슘 원자, 스칸듐 원자, 티타늄 원자, 바나듐 원자, 크롬 원자, 망간 원자, 철 원자, 코발트 원자, 니켈 원자, 구리 원자, 아연 원자, 갈륨 원자, 게르마늄 원자, 비소 원자, 셀레늄 원자, 브롬 원자, 크립톤 원자, 루비듐 원자, 스트론튬 원자, 이트륨 원자, 지르코늄 원자, 니오븀 원자, 몰리브덴 원자, 테크네튬 원자, 루테늄 원자, 로듐 원자, 팔라듐 원자, 은 원자, 카드뮴 원자, 인듐 원자, 주석 원자, 안티몬 원자, 텔루륨 원자, 요오드 원자, 제논 원자, 세슘 원자, 바륨 원자, 란타늄 원자, 하프늄 원자, 탄탈룸 원자, 텅스텐 원자, 레늄 원자, 오스뮴 원자, 이리듐 원자, 백금 원자, 금 원자, 수은 원자, 탈륨 원자, 납 원자, 비스무트 원자, 프란슘 원자, 라듐 원자, 악티늄 원자, 세륨 원자, 프라세오디뮴 원자, 네오디뮴 원자, 프로메튬 원자, 사마륨 원자, 유로퓸 원자, 가돌리늄 원자, 테르븀 원자, 디스프로슘 원자, 홀뮴 원자, 에르븀 원자, 툴륨 원자, 이터븀 원자, 루테튬 원자, 토륨 원자, 프로트악티늄 원자, 우라늄 원자, 넵투늄 원자, 플루토늄 원자, 아메리슘 원자, 퀴륨 원자, 버클륨 원자, 캘리포늄 원자, 아인슈타이늄 원자, 페르뮴 원자, 멘델레븀 원자, 노벨륨 원자 또는 로렌슘 원자이다.
적합한 염료는, 예를 들어 5(6)-카르복시플루오레세인, IRDye 680RD 말레이미드 또는 IRDye 800CW, 루테늄 폴리피리딜 염료 등과 같은 임의의 구매가능한 염료를 포함한다.
적합한 형광단은 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인 티오세미카르바지드, 로다민, Texas Red, CyDyes(예를 들어, Cy3, Cy5, Cy5.5), Alexa Fluor(예를 들어, Alexa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), 근적외선(NIR)(700 내지 900 nm) 형광 염료, 및 카르보시아닌 및 아미노스티릴 염료이다.
검출가능 표지에 접합된 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조영제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 공지된 방법을 사용하여 검출가능 표지에 접합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 검출가능 표지는 킬레이팅제로 착화된다.
일부 실시 형태에서, 검출가능 표지는 링커를 통해 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된다.
검출가능 표지는 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 직접적으로, 또는 간접적으로, 연결될 수 있다. 적절한 링커는 본 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 보결분자족(prosthetic group), 비페놀계 링커(N-석신이미딜-벤조에이트의 유도체; 도데카보레이트), 마크로사이클릭 및 비환형 킬레이트제 둘 모두의 킬레이트 모이어티, 예컨대 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA)의 유도체, S-2-(4-아이소티오시아네이토벤질)-1,4,7-트라이아자사이클로노난-1,4,7-트라이아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2작용성 유도체(예컨대 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠) 및 다른 킬레이트 모이어티가 포함한다. 적절한 펩티드 링커가 잘 알려져 있다.
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다. 어떠한 특정 이론에 의해서도 구애되고자 함이 없이, TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는 이중특이성 항체는 종양 세포의 T 세포 매개 사멸을 매개하는 데 있어서 더 효율적일 수 있다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL), 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL, 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL, 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL, 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL, 또는 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.4 × 10-9 M 이하의 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된다.
일부 실시 형태에서, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 제1 도메인은
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22;
각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23;
각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24;
각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22; 또는
각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 제2 도메인은
각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65; 또는
각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 제1 도메인은
서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL;
서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL;
서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL;
서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL;
서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 또는
서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 제2 도메인은
서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL; 또는
서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제2 도메인은 서열 번호 59의 VH 및 서열 번호 111의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 35의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 HC1, 서열 번호 35의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 92의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 94의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
조작되고 변형된 항체
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모 항체와 대비하여 유사하거나 변경된 특성을 갖는 변형된 항체를 생성하도록 추가로 조작될 수 있다. VH, VL, VH 및 VL, 불변 영역, 중쇄 프레임워크, 경쇄 프레임워크, 또는 6개의 CDR 중 어느 하나 또는 전부가 본 발명의 항체에서 조작될 수 있다.
본 발명의 항체는 CDR 이식에 의해 조작될 수 있다. 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 서열이 상이한 프레임워크 서열에 이식될 수 있다. CDR 이식은 알려진 방법 및 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 행해질 수 있다.
사용될 수 있는 프레임워크 서열은 생식세포계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 간행된 참조문헌으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 생식세포계열 DNA 및 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 인코딩된 단백질 서열은 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®)(www. Imgt.org)에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 항체의 기존 프레임워크 서열을 대체하기 위해 사용될 수 있는 프레임워크 서열은 VH 또는 VL의 전장에 걸쳐, 또는 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 길이에 걸쳐 모 가변 도메인에 대해 가장 높은 % 동일성을 나타내는 것들일 수 있다. 또한, VH 및 VL CDR1 및 CDR2 길이 또는 동일한 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 및 HCDR2 정준(canonical) 구조에 기초하여 적절한 프레임워크를 추가로 선택할 수 있다. 미국 특허 제8,748,356호에 기재된 인간 프레임워크 적응화(human framework adaptation) 또는 미국 특허 제7,709,226호에 기재된 초인간화(superhumanization)와 같은 알려진 방법을 사용하여 적절한 프레임워크를 선택할 수 있다.
모 항체 및 조작된 항체의 프레임워크 서열은, 예를 들어 복귀돌연변이(backmutation)에 의해 추가로 변형되어 생성된 항체의 항원에 대한 결합을 회복시키고/시키거나 개선할 수 있는데, 이는, 예를 들어 미국 특허 제6,180,370호에 기재된 바와 같다. 모 항체 및 조작된 항체의 프레임워크 서열은 프레임워크 영역 내의 (또는 대안적으로는 하나 이상의 CDR 영역 내의) 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하고, 이로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 이러한 접근법은 "탈면역화"라고도 지칭되며, 미국 특허 출원 공개 제20070014796호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
TMEFF2 및/또는 CD3에 대한 항체의 친화도를 조절하기 위해 본 발명의 항체의 CDR 잔기를 돌연변이화할 수 있다.
번역-후 변형의 위험을 최소화하기 위해 본 발명의 항체의 CDR 잔기를 돌연변이화할 수 있다. 탈아미노화(NS), 산촉매 가수분해(DP), 이성질화(DS) 또는 산화(W)를 위한 추정 모티프의 아미노산 잔기를 임의의 천연 발생 아미노산으로 치환하여 모티프의 돌연변이를 유발할 수 있으며, 생성된 항체를 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 이들의 작용성 및 안정성에 대해 시험할 수 있다.
안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화성, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하도록 변형된 본 발명의 항체는 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 개별 도메인들의 고유의 안정성에 영향을 미치는 그들의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 쌍형성(pairing)에 영향을 주는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 및 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크; 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중에서의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 비롯한 수많은 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn et al., (2001) J Mol Biol 305:989-1010]). 잠재적인 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하거나 또는 소정 경우에는 분자 모델링에 의해 확인할 수 있으며, 확인된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키기 위한 방법들 중 하나는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정되는 바와 같은 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그의 안정성과는 상관관계에 있고, 용액 중에서의 풀림(unfolding) 및 변성, 그리고 단백질이 풀리는 경향에 따라 좌우되는 분해 과정에 대한 그의 감수성과는 역상관관계에 있다(문헌[Remmele et al., (2000) Biopharm 13:36-46]). 수많은 연구로부터 DSC에 의해 열 안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 순위 간의 상관관계가 밝혀졌다(문헌[Gupta et al., (2003) AAPS PharmSci 5E8]; 문헌[Zhang et al., (2004) J Pharm Sci 93:3076-89]; 문헌[Maa et al., (1996) Int J Pharm 140:155-68]; 문헌[Bedu-Addo et al., (2004) Pharm Res 21:1353-61]; 문헌[Remmele et al., (1997) Pharm Res 15:200-8]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 대해 영향을 준다는 것을 시사한다.
C 말단 라이신(CTL)을 혈류 내의 내인성 순환 카복시펩티다제에 의해 주입된 항체로부터 제거할 수 있다(문헌[Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412]). 미국 특허 출원 공개 제20140273092호에 기재된 바와 같이, 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA ― Fe3 +의 농도를 제어하여 제조 시에 CTL 제거를 최대 수준 미만으로 제어할 수 있다. 항체 내의 CTL 함량을 알려진 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 항체에 Fc 치환을 실행하여 항체 이펙터 작용 및/또는 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 전통적인 면역 작용에서, 면역 시스템의 세포와 항체-항원 복합체의 상호작용은 이펙터 작용, 예컨대 항체-의존성 세포독성, 비만 세포 탈과립, 및 식작용에서부터 면역조절 신호, 예컨대 림프구 증식 및 항체 분비의 조절에 이르기까지 다수의 반응을 유발한다. 모든 이러한 상호작용은 세포 상의 특성화된 세포 표면 수용체에 대한 면역 복합체 또는 항체의 Fc 도메인의 결합을 통해 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발되는 세포 반응의 다양성은 Fc 수용체의 이종성으로부터 유발된다: FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), 및 FcγRIII(CD16)은 활성화 Fcγ 수용체(즉, 면역 시스템을 향상시킴)이고, FcγRIIB(CD32B)는 억제성 Fcγ 수용체(즉, 면역 시스템을 감쇠시킴)이다. FcRn 수용체에 대한 결합은 항체 반감기를 조절한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 Fc 영역 내에 적어도 하나의 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 Fc 영역 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 치환을 포함한다.
Fc 위치는 항체 반감기를 조절하도록 치환될 수 있다. 항체의 반감기를 증가시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 치환은 치환 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A이다. 항체의 반감기를 감소시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 치환은 치환 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A, T307A/E380A/N434A, H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A, 및 H435R로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 Fc 영역 내에 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 활성화 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 항체의 결합을 감소시키고/시키거나 Fc 이펙터 작용, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 식작용(ADCP)을 감소시키는 하나 이상의 치환을 Fc 영역 내에 포함한다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 감소시키기 위해 그리고 후속으로 이펙터 기능을 감소시키기 위해 치환될 수 있는 Fc 위치는 IgG1 상의 치환 L234A/L235A, IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 F234A/L235A, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A, 모든 Ig 동종형 상의 N297A, IgG2 상의 V234A/G237A, IgG1 상의 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 H268Q/V309L/A330S/P331S, IgG1 상의 S267E/L328F, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다.
잘 알려진 S228P 치환이 IgG4 안정성을 향상시키도록 IgG4 항체에서 이루어질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 S228P 치환을 포함하는데, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 F234A, L235A 또는 F234A/L235A 치환을 포함하는데, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 S228P, F234A 및 L235A 치환을 포함하는데, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
상동 항체, 보존적 변형을 갖는 항체 및 조작되고 변형된 항체를 생성하는 방법
모 항체에 비교하여 변경된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 항체를 표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있으며, 잘 알려진 방법 및 실시예에서 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 항체 결합 또는 다른 관심 있는 특성에 대한 효과를 평가할 수 있다.
항체 동종형 및 동종이인자형(allotype)
본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG1 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG2 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG4 동종형이다.
치료 항체의 면역원성은 주입 반응의 위험성 증가 및 치료 반응의 지속 기간의 감소와 관련이 있다(문헌[Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08]). 치료 항체가 숙주에서 면역 반응을 유도하는 정도는 항체의 동종이인자형에 의해 부분적으로 결정될 수 있다(문헌[Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21]). 항체 동종이인자형은 항체의 불변 영역 서열의 특정 위치에서의 아미노산 서열 변이와 관련이 있다. 표 2는 선택된 IgG1, IgG2, 및 IgG4 동종이인자형을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 G2m(n) 동종이인자형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 G2m(n-) 동종이인자형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 G2m(n)/(n-) 동종이인자형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 nG4m(a) 동종이인자형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 G1m(17) 동종이인자형이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 G1m(17,1) 동종이인자형이다.
[표 2]
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항-이디오타입 항체
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 본 발명의 항-TMEFF2 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다.
항-이디오타입(Id) 항체는 항체의 항원 결정기(예를 들어, 파라토프 또는 CDR)를 인식하는 항체이다. Id 항체는 항원-차단성 또는 비차단성일 수 있다. 항원-차단성 Id는 샘플 내의 유리 항체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-TMEFF2 항체)를 검출하는 데 사용될 수 있다. 비차단성 Id는 샘플 내의 총 항체(유리 항체, 항원에 부분 결합된 항체, 또는 항원에 완전 결합된 항체)를 검출하는 데 사용될 수 있다. Id 항체는 항-Id가 준비되어 있는 항체로 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다.
항-Id 항체는 또한 면역원으로서 사용되어 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하여, 이른바 항-항-Id 항체를 생성할 수 있다. 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프적으로(epitopically) 동일할 수 있다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정기에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론들을 확인할 수 있다. 항-Id 항체는 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 기법에 의해 유도체화되고/되거나 변이될(그럼으로써, 항-Id 항체 변이체를 생성할) 수 있다.
본 발명의 단일특이성 항체의 생성
일부 실시 형태에서, 항-TMEFF2 항체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 항-TMEFF2 항체는 인간화된다.
본 발명의 단일특이성 항체는 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법이 단일클론 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트, 또는 원숭이가 인간, 침팬지 또는 마카크(macaque) TMEFF2 또는 TMEFF2의 단편, 예컨대 TMEFF2의 막 근위 도메인으로 면역화된 후, 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, 단일클론 Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 단일 불멸화(immortalized) 하이브리도마 세포로부터 발생되는 콜로니를 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 결합의 특이성, 교차-반응성 또는 그의 결여, 및 친화성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
본 발명의 항-TMEFF2 항체를 생성하기 위해 다양한 숙주 동물이 사용될 수 있다. 예를 들어, Balb/c 마우스가 마우스 항-인간 TMEFF2 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. Balb/c 마우스 및 다른 인간 이외의 동물에서 제조된 항체는 더 인간-유사한 서열을 생성하기 위하여 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간 수용자 프레임워크의 선택을 포함하는 예시적인 인간화 기술이 공지되어 있으며, CDR 이식(미국 특허 제5,225,539호), SDR 이식(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499]), 특이성 결정 잔기 재표면화(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 인간 프레임워크 적응화(미국 특허 제8,748,356호), 또는 초인간화(미국 특허 제7,709, 226호)를 포함한다. 이러한 방법에서는, 모 항체의 CDR을 인간 프레임워크에 전달하며, 이는 모 프레임워크에 대한 이들의 전체 상동성에 기초하여, CDR 길이의 유사성, 표준 구조 동일성 또는 이들의 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
인간화 항체는, 국제 특허 출원 공개 WO1090/007861호 및 WO1992/22653호에 기재된 것들과 같은 기술로 결합 친화성을 보존하기 위해 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입시키거나(복귀돌연변이), 예를 들어 항체의 친화성을 개선하기 위해 변이를 임의의 CDR에 도입시켜 원하는 항원에 대한 이들의 선택성 또는 친화성을 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그의 게놈 내에 담지하는 마우스, 래트 또는 닭과 같은 유전자도입 동물을 사용하여 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 미국 특허 제6,150,584호, 국제 특허 출원 공개 WO99/45962호, 국제 특허 출원 공개 WO2002/066630호, WO2002/43478호, WO2002/043478호, 및 WO1990/04036호, 문헌[Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9]; 문헌[Green et al (1994) Nature Genet. 7:13-21]; 문헌[Green & Jakobovits (1998) Exp. Med. 188:483-95]; 문헌[Lonberg and Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65-93]; 문헌[Bruggemann et al., (1991) Eur J Immunol 21:1323- 1326]; 문헌[Fishwild et al., (1996) Nat Biotechnol 14:845-851]; 문헌[Mendez et al., (1997) Nat Genet 15:146-156]; 문헌[Green (1999) J Immunol Methods 231:11-23]; 문헌[Yang et al., (1999) Cancer Res 59:1236-1243]; 문헌[
Figure pct00009
and Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458]에 기재되어 있다. 이러한 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실될 수 있고, 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 미니유전자(minigene)를 사용하여, 하나 이상의 완전하거나 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌를 동물의 게놈으로 삽입할 수 있다. Regeneron(www.Regeneron.com), Harbour Antibodies(www.Harbourantibodies.com), Open Monoclonal Technology, Inc.(OMT)(www.Omtinc.net), KyMab(www.Kymab.com), Trianni(www.Trianni.com) 및 Ablexis(www. Ablexis.com)와 같은 회사와 제휴하여, 전술된 바와 같은 기술을 사용하여, 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 부분들, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 형성하지 않거나 쌍을 형성한 항체 가변 영역들을 발현시키도록 조작된다(문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]; 문헌[Krebs et al., (2001) J Immunol Meth 254:67-84]; 문헌[Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314]; 문헌[Sheets et al., (1998) PITAS (USA) 95:6157-6162]; 문헌[Hoogenboom and Winter, (1991) J Mol Biol 227:381]; 문헌[Marks et al., (1991) J Mol Biol 222:581]). 본 발명의 항체는, 문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 국제 특허 출원 공개 WO09/085462호에 기재된 바와 같이, 예를 들어 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 라이브러리는 인간 및/또는 사이노 TMEFF2 또는 CD3에 결합하는 파지에 대해 스크리닝될 수 있고, 획득된 양성 클론은 추가로 특성화될 수 있고, Fab가 클론 용해물로부터 단리되어 전장 IgG로서 발현될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5, 580,717호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기재되어 있다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기법, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 수행될 수 있다. 면역원성 항원은 정제된 단백질, 또는 전 세포 또는 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 항원은 상기 항원 또는 그의 일부분을 인코딩하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 드 노보(de novo)로 형성될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체의 생성
본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 본 명세서의 단리된 TMEFF2 결합 VH/VL 도메인을, 본 명세서에 기재된 것들 및 공개적으로 입수가능한 것들을 포함하는 임의의 CD3 결합 VH/VL 도메인과 조합함으로써 생성될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 CD3 결합 VH/VL 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 CD3B219 및 CD3B376의 것들이다. 사용될 수 있는 예시적인 TMEFF2 결합 VH/VL 도메인은 항체 TMEB675, TMEB570, TMEB674, TMEB565, TMEB762 및 TMEB757의 것들이다. 생성된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2 및 CD3에 대한 그들의 결합에 대해, 그리고 TMEFF2-발현 세포(예컨대, LNCaP)의 T 세포 매개 사멸과 같은 원하는 기능적 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화물-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프, 즉 TMEFF2 상의 에피토프 및 CD3 상의 에피토프와 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 항체는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 DuoBody® Technology를 사용하여 생성될 수 있다. IgG1 항체의 경우에는 하나의 중쇄 내의 돌연변이 F405L 및 다른 중쇄 내의 K409R을 사용할 수 있다. IgG2 항체의 경우, 야생형 IgG2, 및 F405L 및 R409K 치환을 가진 IgG2 항체를 사용할 수 있다. IgG4 항체의 경우, 야생형 IgG4, 및 F405L 및 R409K 치환을 가진 IgG4 항체를 사용할 수 있다. 이중특이성 항체를 생성하기 위해, Fc 영역 내에 전술된 돌연변이를 갖도록 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체가 조작되고, 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성체화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG1 동종형이며 서열 번호 84의 야생형 IgG1과 비교할 때 제1 중쇄(HC1) 내에 F405L 치환을 그리고 제2 중쇄(HC2) 내에 K409R 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG4 동종형이며 서열 번호 85의 야생형 IgG4와 비교할 때 HC2 내에 F405L/R409K 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 IgG4 동종형이며 서열 번호 85의 야생형 IgG4와 비교할 때 HC1 내에 S228P, F234A 및 L235A 치환 및 HC2 내에 S228P, F234A, L235A, F405L 및 R409K 치환을 포함한다.
서열 번호 84 야생형 IgG1
Figure pct00010
서열 번호 85 야생형 IgG4
Figure pct00011
서열 번호 103 IgG1 F405L
Figure pct00012
서열 번호 109 IgG1 K409R
Figure pct00013
서열 번호 104 IgG4 F405L/R409K
Figure pct00014
이중특이성 항체는 또한 노브-인-홀(Knob-in-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기적-일치(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y(Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono), 및 Biclonic(Merus)과 같은 설계를 사용하여 생성될 수 있다.
"노브-인-홀(knob-in-hole)" 전략에서(예를 들어, 국제 출원 공개 제WO 2006/028936호 참조), 인간 IgG 내의 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
Fab 아암 교환을 촉진하기 위해 "노브-인-홀" 전략을 이용하는 것에 더하여, 크로스맙(CrossMAb) 기법은 생성되는 이중특이성 항체의 정확한 경쇄 쌍형성을 보장하기 위해 하나의 하프 아암에서 CH1/CL 도메인 교환을 활용한다(예컨대, 미국 특허 제8,242,247호 참조).
한쪽 또는 양쪽 아암에서, 이중특이성 항체 내의 중쇄 내에서 또는 중쇄와 경쇄 사이에서 가변 또는 불변 도메인, 또는 두 도메인 모두를 교환함으로써 본 발명의 전장 이중특이성 항체를 생성하기 위하여 다른 크로스-오버 전략이 사용될 수 있다. 이들 교환은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2009/080254호, WO2009/080251호, WO2009/018386호 및 WO2009/080252호에 기재된 바와 같이 VH-CH1을 VL-CL로, VH를 VL로, CH3을 CL로 그리고 CH3을 CH1로 교환하는 것을 포함한다.
하나의 CH3 표면에서 양으로 하전된 잔기를, 그리고 제2 CH3 표면에서 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 제2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
본 발명의 이중특이성 항체를 생성하기 위하여 SEEDbody 기술이 이용될 수 있다. SEEDbody는, 그의 불변 도메인에서, 선택된 IgG 잔기가 IgA 잔기로 치환되어 있어서, 이종이량체화를 촉진시키는데, 이는 미국 특허 출원 공개 제20070287170호에 기재된 바와 같다.
돌연변이는 전형적으로 표준 방법을 사용하여 항체의 불변 도메인과 같은 분자에 대해 DNA 수준에서 이루어진다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에 제공된 가변 도메인 절편을 인코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 벡터 상에 포함되어 항체 또는 항원 결합 단편을 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 상보적 데옥시핵산 (cDNA)일 수 있고, 적합한 숙주에서의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 잘 알려진 기술이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드(및 이것이 인코딩하는 펩티드)는 리더(leader) 서열을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 리더 서열은 제한 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 VH, 본 발명의 항체의 VL, 본 발명의 항체의 중쇄, 또는 본 발명의 항체의 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 25, 26, 27, 87 또는 89의 VH를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 28, 29, 30, 31, 88 또는 90의 VL을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2/항-CD3 항체의 HC1, LC1, HC2 또는 LC2를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 32, 33, 34, 91 또는 93의 HC1을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 35, 36, 37, 38, 92 또는 94의 LC1을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 76 또는 78의 HC2를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 77 또는 79의 LC2를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 또는 102의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 105, 106, 80, 81, 107, 108, 82, 및 83의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항체의 VH 또는 VL 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 의도된 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현용 벡터, 트랜스포존 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 예를 들어, 불변 영역에 선택적으로 연결된, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및/또는 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 제어 서열은 신호 서열, 프로모터 (예를 들어, 천연 관련 프로모터 또는 이종 프로모터), 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 항체를 발현하도록 선택된 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되었으면, 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질의 고수준 발현에 적합한 조건 하에서 유지된다.
본 발명의 범주 내의 재조합 발현 벡터는 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 항체의 VH, VL, HC 또는 LC와 같은 적어도 하나의 재조합 단백질을 인코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 핵산 단편을 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터는 또한 하나 이상의 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.
척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터가 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)]에 의해 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체- 또는 항원 결합 단편-코딩 서열은 강력한 구성적 프로모터, 예컨대 하기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓여 있다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 기타. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)(EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 코딩 서열은 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 독시사이클린-유도성 프로모터, 하나 이상의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)를 함유하는 프로모터, 예컨대 단백질 키나제 R 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제, Mx 유전자, ADAR1 등의 제어 하에 놓여 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커, 예를 들어 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자), 글루타민 신타제 유전자, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK, HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸푸린 선택을 위한 세균성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
사용할 수 있는 예시적인 벡터는 Bacterial: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (미국 캘리포니아주 라호이아 소재의 Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia), 및 진핵세포 벡터 pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (스트라타진), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) 및 pEE12.4 (Lonza)이다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 25의 VH 및/또는 서열 번호 28의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 39의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 42의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 26의 VH 및/또는 서열 번호 29의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 40의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 43의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 27의 VH 및/또는 서열 번호 30의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 41의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 44의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 26의 VH 및/또는 서열 번호 31의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 40의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 45의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 87의 VH 및/또는 서열 번호 88의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 95의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 96의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 89의 VH 및/또는 서열 번호 90의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 99의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 100의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 66의 VH 및/또는 서열 번호 67의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 105의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 106의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 74의 VH 및/또는 서열 번호 75의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 107의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 108의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 32의 HC 및/또는 서열 번호 35의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 46의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 49의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 33의 HC 및/또는 서열 번호 36의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 50의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 34의 HC 및/또는 서열 번호 37의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 48의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 51의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 33의 HC 및/또는 서열 번호 38의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 47의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 52의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 91의 VH 및/또는 서열 번호 92의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 97의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 98의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 93의 VH 및/또는 서열 번호 94의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 101의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 102의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 76의 HC 및/또는 서열 번호 77의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 80의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 81의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 78의 HC 및/또는 서열 번호 79의 LC를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 82의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열 번호 83의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 벡터는 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 유전자로 다양한 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 항-TMEFF2 항체 또는 항원 결합 단편 생성 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
세포 내로의 외래 유전자의 도입을 위한 기법이 공지되어 있으며, 본 발명의 재조합 세포를 작제하는 데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 벡터가 내부에 도입된 세포를 지칭한다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손, 그리고 또한 특정 대상 세포로부터 생성된 안정한 세포주도 지칭하고자 함이 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 후손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.
그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균강(bacilli), 예컨대 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 원핵 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae)) 및 피키아(Pichia)가 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC (American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0 (영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC (European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHOK1SV(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 Lonza Biologics), Potelligent® CHOK2SV (Lonza), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합-양성 세포는 원하는 표현형, 예컨대 고수준 발현, 향상된 성장 특성, 또는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해 원하는 생화학적 특성을 갖는 단백질을 산출하는 능력을 나타내는 하위클론을 위해 증폭 및 스크리닝된다. 이들 표현형은 주어진 하위클론의 고유 특성에 기인하거나 돌연변이에 기인할 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 불일치 수복의 억제, 또는 그러한 방법들의 조합의 사용을 통해 발생될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생성하는 방법을 제공하며, 본 방법은 항체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 항체의 제조 방법 및 그의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일단 (화학적으로 또는 재조합적으로) 합성되면, 전 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 다른 항체 단편, 예컨대 VH 및/또는 VL은 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제, 겔 전기영동 등을 포함한 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(전반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982))] 참조). 대상 항체는 실질적으로 순수할 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85% 순수하거나, 적어도 약 85% 내지 90% 순수하거나, 적어도 약 90% 내지 95% 순수하거나, 또는 적어도 약 98% 내지 99%, 또는 그 이상으로 순수할 수 있는데, 예를 들어 대상 항체 이외의 세포 잔해, 거대분자 등과 같은 오염물이 없다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 벡터 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 형질전환, 배양, 항체 발현 및 정제는 잘 알려진 방법을 사용하여 행해진다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체를 생성하는 방법을 제공하는데, 본 방법은,
항체의 VH를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 항체의 VL을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 도입시키는 단계;
숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환시키는 단계;
VL 및 VH가 발현되고 항체를 형성하는 조건 하에서 배양 배지 중에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
약제학적 조성물/투여
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. "담체"는 본 발명의 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 적어도 약 1 중량%까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체의 투여 방식은 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 또는 당업자에 의해 이해되는 다른 수단과 같은 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다.
본 발명의 항체는 또한 암과 같은 질병의 발생 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg/㎏ 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다.
항-TMEFF2 항체 및 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체의 사용 방법
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함한다.
다수의 유전자가 전립선암의 발생에 관여해 왔다. 전립선암의 발생과 진행에 관여하고 따라서 새로운 항-전립선암 치료의 유망한 표적인 단백질들 중 하나는 EGF 유사 도메인 및 2개의 폴리스타틴(Follistatin) 유사 도메인(TMEFF2)을 갖는 막관통 단백질이다. TMEFF2는 2개의 폴리스타틴 유사(FS) 도메인, EGF 유사 도메인, 막관통(TM) 도메인 및 짧은 세포질 꼬리로 구성된 I형 막관통 단백질이다. TMEFF2 단백질의 최고 발현은 2개의 기관, 즉 뇌 및 전립선에서 검출되었다(문헌[Liang et al. 2000]; 문헌[Horie et al. 2000]). TMEFF2의 상승된 발현은 전립선암 세포주 및 임상 샘플에서 또한 발견되었는데(문헌[Glynne-Jones et al. 2001]; 문헌[Gery et al. 2002]); 문헌[Afar et al. 2004]), 이는 TMEFF2가 전립선암 진행에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. Tmeff2 유전자의 발현은 안드로겐 수용체의 제어 하에 있다. 많은 수의 안드로겐-의존성 암 환자는 높은 수준의 TMEFF2 mRNA를 나타내었다.
따라서, 항-TMEFF2 항체는 전립선암의 진단, 예후 또는 치료를 위해 중요한 도구가 될 가능성을 가질 수 있다.
"암"은 조직병리학적 유형 또는 침습성의 병기와 무관하게 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성종양으로 변환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것으로 의미된다. 예시적인 TMEFF 양성 암은 전립선암을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 선암종이다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 전이성 전립선암이다. 일부 실시 형태에서, 전립선암은 직장, 림프절 또는 뼈, 또는 이들의 임의의 조합으로 전이된다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 재발성 또는 불응성 전립선암이다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 거세저항성 전립선암이다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 안드로겐 박탈 요법에 민감성이다.
일부 실시 형태에서, 전립선암은 안드로겐 박탈 요법에 민감성이 아니다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암을 치료하는 데 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 전립선암을 치료하는 데 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2 양성 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 35의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 HC1, 서열 번호 35의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함한다.
본 발명은 또한 전립선암과 같은 TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체는 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함한다.
본 발명의 항체는 제2 치료제와 병용하여 투여될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 수술, 화학요법, 안드로겐 박탈 요법 또는 방사선, 또는 이들의 임의의 조합이다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항-TMEFF2 항체 또는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 치료적 용도에 또는 진단 키트로서 사용될 수 있다. 키트는 샘플 내의 TMEFF2, CD3 또는 TMEFF2 및 CD3의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 키트는 본 발명의 항체 및 항체를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 하기를 포함한 하나 이상의 다른 요소들을 포함할 수 있다: 사용 설명서; 다른 시약, 예를 들어 표지, 치료제, 또는 항체를 표지 또는 치료제에 킬레이팅하거나 달리 커플링하기에 유용한 작용제, 또는 방사성 방호 조성물; 투여를 위하여 항체를 준비하기 위한 장치 또는 다른 재료; 약제학적으로 허용되는 담체; 및 대상체에게 투여하기 위한 장치 또는 다른 재료.
일부 실시 형태에서, 키트는 용기 내의 본 발명의 항체 및 키트의 사용 설명서를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트 내의 항체는 표지되어 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 항-TMEFF2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 발명은 또한 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체를 포함하는 키트를 제공하는데, 제1 도메인은 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
TMEFF2 또는 CD3의 검출 방법
본 발명은 또한 샘플 내의 TMEFF2를 검출하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 샘플을 획득하는 단계, 샘플을 본 발명의 항-TMEFF2 항체와 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 TMEFF2에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 내의 TMEFF2 및 CD3을 검출하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 샘플을 획득하는 단계, 샘플을 본 발명의 TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체와 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 TMEFF2 및 CD3에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다.
TMEFF2 또는 TMEFF2 및 CD3에 결합된 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예시적인 방법은 형광 또는 화학발광 표지, 또는 방사성 표지를 사용한 항체의 직접 표지화, 또는 용이하게 검출가능한 모이어티, 예컨대 비오틴, 효소 또는 에피토프 태그의 본 발명의 항체에 대한 부착을 포함한다. 예시적인 표지 및 모이어티는 루테늄, 111In-DOTA, 111In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 고추냉이 퍼옥사이드, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 폴리-히스티딘(HIS 태그), 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 플로오론 염료, 옥사진 염료, 페난트리딘 염료, 로다민 염료 및 Alexafluor® 염료이다.
본 발명의 항체는 샘플 내의 TMEFF2 또는 TMEFF2 및 CD3을 검출하기 위한 다양한 검정에 사용될 수 있다. 예시적인 검정은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정이다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참조하여 설명할 것이다.
실시예 1: 항원 생성
인간 세포외 도메인(ECD) TMEFF2를 UniProt 수탁 번호 Q9UIK5 서열에 기초하여 생성하였다. ECD 작제물은 C-말단에 6X His-태그 및 Avi-태그 서열을 갖도록 설계되었다(작제물 TMEW1; 서열 번호 6) FS2 및 EGF 도메인(아미노산 151 내지 320)을 함유하는 작제물은 6X His-태그 및 avi태그 서열과 인간 혈청 알부민(HSA) 융합으로서 설계되었다(작제물 TMEW7; 서열 번호 7) TMEFF2 막 근위 도메인(잔기 230 내지 320)을 함유하는 작제물은 6x His 태그를 갖도록 설계되거나(작제물 TMEW19; 서열 번호 8) 또는 His-태그와 래트 IgG1 Fc에 융합되었다(작제물 TMEW20; 서열 번호 9). TMEFF2의 잔기 230 내지 320은 TMEFF2의 잔기 261 내지 301에 걸쳐 있는 EGF 도메인을 함유한다. 인간 TMEFF2 ECD 발현 작제물을 제조자 프로토콜에 따라 Expifectamine을 사용하여 HEK293 유래 세포, Expi293(Gibco/Thermo Fisher Scientific) 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 수확하기 전에 회전 진탕기(orbital shaker) 상에서 8% CO2를 사용하여 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 발현된 세포를 원심분리에 의해 제거하였고, his-태그를 갖는 가용성 TMEFF2 단백질을 Ni Sepharose 6 Fast Flow 수지(GE Healthcare)를 사용하여 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배지로부터 정제한 다음, Dubelcco's Phosphate Saline 완충액 pH 7.2(1x DPBS)에서 SUPERDEX 200 분취 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(GE Healthcare)를 수행하였다. 생성된 항원의 아미노산 서열이 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00015
실시예 2. 항-TMEFF2 항체의 생성
인간 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 유전자도입 래트를 이용한 항체 생성(OmniRat®)
OmniRat®는 완전한 인간 IgL 유전자좌(Jκ-Cκ에 연결된 12개의 Vκ 및 Jλ-Cλ에 연결된 16개의 Vλ)와 함께 키메라 인간/래트 IgH 유전자좌 (래트 CH 유전자좌에 연결된 자연 구성의 22개의 인간 VH, 모든 인간 D 및 JH 세그먼트를 포함)를 함유한다. (예컨대, 문헌[Osborn, et al. (2013) J Immunol 190(4): 1481-1490] 참조). 따라서, 래트는 래트 면역글로불린의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입유전자는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 완전한 인간 가변 영역을 갖는 고친화도 키메라 인간/래트 IgG 단일클론 항체를 생성한다. OmniRat®의 제조 및 사용, 및 그러한 래트가 지닌 게놈 변형은 WO14/093908호에 기재되어 있다.
OmniRat를 인간 TMEFF2 작제물 FS2-EGF-Tev-HSA(C34S)-His-Avi태그(TMEW7, 서열 번호 7)로 면역화하였고, 작제물 spTMEFF2(230-320)G3S-래트IgG1Fc(TMEW20, 서열 번호 9)로 부스팅하였다. 89일의 면역화 계획(regimen) 후, 래트로부터의 림프절을 수확하여 하이브리도마를 생성하는데 사용하였고, 하이브리도마 상청액을 ELISA 및/또는 SPARCL(Spatial Proximity Analyte Reagent Capture Luminescence)에 의한 인간 TMEFF2-FL-ECD-His-Avi태그(TMEW1) 단백질에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. TMEFF ECD, FS2-EGF, 또는 EGF 도메인 단독 TMEFF2에 대한 결합의 2차 ELISA 및 SPARCL 스크리닝에 대해 몇몇 상청액을 선택하였다. 스크리닝 결과에 기초하여, 몇몇 하이브리도마 클론을 서열분석하고, 발현시키고, 기능성에 대해 특성화하였다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터의 항체 생성
TMEFF2 결합 Fab를 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 2세트의 드 노보 pIX 파지 디스플레이 라이브러리로부터 표준 방법을 사용하여 선택하였다. 간략하게 말하면, 인간 스캐폴드를 다양화함으로써, V3.0 및 V5.0으로 지칭되는, 2세트의 라이브러리를 생성하였는데, 여기서는 생식세포계열 VH 유전자 IGHV1-69*01, IGHV3-23*01, 및 IGHV5-51*01을 H3 루프를 통해 인간 IGHJ-4 미니유전자와 재조합하고(IGHJ-6 미니유전자를 또한 V5.0에 사용하였음), 인간 생식세포계열 VL카파 유전자 O12(IGKV1-39*01), L6(IGKV3-11*01), A27(IGKV3-20*01), 및 B3(IGKV4-1*01)을 IGKJ-1 미니유전자와 재조합하여 완전한 VH 및 VL 도메인을 조립하였다. 단백질 및 펩티드 항원과 빈번하게 접촉하는 H1, H2, L1, L2 및 L3 루프 주위의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 위치들을 다양화를 위해 선택하였다. 선택된 위치들에서의 서열 다양성을 각각의 IGHV 또는 IGLV 유전자들의 IGHV 또는 IGLV 생식세포계열 유전자 패밀리 내의 각각의 위치에서 발생하는 잔기들로 제한하였다. V3.0 라이브러리의 경우 길이 7 내지 14개 아미노산이고 V5.0 라이브러리의 경우 길이 6 내지 19개 아미노산인 짧은 크기 내지 중간 크기의 합성 루프를 이용함으로써 H3 루프에서의 다양성을 생성하였다. 인간 항체에서 관찰되는 아미노산의 변형을 모방하도록 H3에서의 아미노산 분포를 설계하였다. 라이브러리를 생성하는 데 이용된 스캐폴드들은 그들의 인간 VH 및 VL 생식세포계열 유전자 기원에 따라 명명하였다. V3.0 및 V5.0 세트들 둘 모두의 경우, 3개의 중쇄 라이브러리 각각을 4개의 생식세포계열 경쇄 또는 생식세포계열 경쇄 라이브러리와 조합하여 선택 실험에 사용되는 라이브러리의 각각의 세트에 대한 12개의 특유의 VH:VL 조합을 생성하였다.
V 영역 클로닝
파지의 하이브리도마 세포 용해물로부터의 총 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy 96 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 생성된 RNA를 Drop Sense를 사용하여 정량화하였고, -80℃에서 저장하거나 RT-PCR(Invitrogen)에 의한 Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System을 사용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 각각 중쇄, 카파 사슬, 및 람다 사슬의 불변 영역에 어닐링된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 최대 3 ㎍의 정제된 RNA, 유전자 특이적 프라이머, dNTP 믹스(mix), 반응 완충액, 25 mM MgCl2, DTT, RNaseOUT™(40 U/μl, Invitrogen), 및 SuperScript™ III RT(200 U/μl, Invitrogen Cat# 18080-051)로 구성된 RT-PCR 반응 혼합물을 50℃에서 50분 동안 그리고 85℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 단일 가닥 cDNA를 ―20℃에서 저장하거나, PCR 증폭을 위해 직접 사용하였다. PCR 반응을 백금 Pfx 중합효소(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. v 영역 단편을, 최적화된 PCR 조건을 사용하여, 각각 리더 서열 및 중쇄, 카파 사슬 및 람다 사슬의 불변 영역에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 어닐링으로 증폭시켰다. 생성된 PCR 단편을 서열분석하고, 회수된 v 영역의 아미노산 서열을 코돈 최적화시키고, S228P, F234A 및 L235A 돌연변이(IgG4PAA 동종형)를 갖는 IgG4 불변 영역을 지닌 pUnder 기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
Expi293 소규모 형질감염 및 정제
면역화 캠페인 또는 파지 디스플레이로부터 식별된 선택된 항체를 클로닝하고, IgG1PAA로서 발현시키고, 소규모 2 ml로 정제하였다. Expi293™ 세포(ThermoFisher Scientific)를 Expi293™ 발현 배지 내에 1.25 × 105 내지 2.25 × 105개의 생존 세포/mL 밀도로 접종하고, 37℃, 7% CO2에서 125 mL 내지 2 L 진탕 플라스크에서 배양하였다. 밀도가 98 내지 99% 생존율로 3 × 106 내지 5 × 106개의 생존 세포/mL에서 로그 상 성장(log phase growth)에 도달할 때 세포를 계대배양하였다.
형질감염 날에, 생존 세포 밀도 및 퍼센트 생존율을 결정하였다. 제조자의 형질감염 프로토콜(ThermoFisher Publication Number MAN0007814)에 따라 세포를 3 × 106개의 생존 세포/mL의 밀도로 형질감염시켰다. 정제 전 15분 동안 850xG에서 원심분리함으로써 형질감염 후 일수 6에서 배양물을 수확하였다. mAb Select Sure 수지(GE Healthcare)를 사용하여 청징화된 상청액으로부터 항체를 정제하고 PBS 내로 투석시켰다. 단백질 농도를 DropSense 기기(Trinean)를 사용하여 여과액에 대한 A280 측정에 의해 결정하였다.
실시예 3. 항-TMEFF2 항체의 특성화
항-TMEFF2 항체는 고친화도로 TMEFF2에 결합함
TMEFF2 ECD(TMEW1: TMEFF2-FL ECD-His-Avi태그) 및/또는 막 근위 영역(TMEW19: spTMEFF2(230-320)G3S-H6)에 대한 선택된 IgG4PAA 항-TMEFF2 항체의 결합을 Proteon(TMEB674, TMEB675, TMEB 565 및 TMEB570) 또는 Biacore SPR(TMEB762 및 TMEB757)을 사용하여 평가하였다. 선택된 항체의 결합에 대한 속도론적 파라미터(kinetic parameter)는 표 4에 나타나 있다. 항-TMEFF2 항체는 피코몰 친화도(picomolar affinity)를 갖는 TMEFF2 ECD 및 TMEFF2 막 근위 영역 둘 모두에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
[표 4]
Figure pct00016
ProteOn SPR
인간 TMEFF2의 ECD 및 막 근위 영역에 대한 항-TMEFF2 mAb의 결합을 ProteOn SPR(Bio-Rad)로 측정하였다. 정제된 mAb(PBST 중 1 ㎍/ml의 최종 농도로 희석됨)를 검정에서 리간드로서 사용하였고, Fc 포획을 통해 염소 항-인간(GAH) IgG Fc에 고정시켰다. GAH IgG Fc의 아민 커플링을 위해, EDC(40 mM)와 NHS(10 mM)의 1:1 혼합물을 주입 직전에 혼합하여 칩 표면을 활성화시키고, 수직 배향으로 주입하였다. 이어서, 아세테이트 완충액(pH 5.0) 중의 GAH-Fc(30 ㎍/ml) 항체를 30 μl/min으로 300초 동안 수직 배향으로 표면 위에서 유동시켰다. 후속하여, 동일한 배향으로 1 M 에탄올아민(pH 8.5)을 주입함으로써 표면 내의 임의의 남아 있는 반응성 카르복실기를 비활성화시켰다. 고정화를 위해 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 항체를 수평 방향으로 표면 위에서 유동시켰다. 5개 농도의 3배 희석 시리즈(100 내지 600 nM 범위의 최고 농도)의 인간 TMEFF2 ECD 또는 막 근위 영역을 수직 배향으로 분석물로서 유동시켜 포획된 분자에 결합시켰다. 완충액 샘플을 또한 수직 방향으로 6번째 채널 내에 주입하여 기준 신호 내의 임의의 드리프트(drift)를 모니터링하였다. 모든 농도에 대한 회합 및 해리 상을 100 μL/min의 유량으로 각각 3분 및 30분(또는 15분)에 걸쳐 모니터링하였다. 결합 표면을 다음 상호작용 사이클 동안 0.8% 인산의 18초 펄스(pulse)를 사용하여 재생시켜 결합된 항원을 제거하였다. 반응 데이터로부터 두 세트의 참조 데이터를 감산함으로써 원시 데이터를 처리하였다: 1) 항원과 빈 칩(empty chip) 표면 사이의 비특이적 상호작용을 보정하기 위한 인터-스폿(inter-spot) 신호; 2) 비특이적 기준 드리프트를 보정하기 위한 빈 채널 신호(단지 PBST만이 칩 위로 유동됨).
Biacore 8K SPR
인간 TMEFF2 ECD에 대한 항-TMEFF2 mAb의 결합을 Biacore 8K SPR로 측정하였다. 검정의 포맷은 고밀도 항-인간 Fc 표면을 사용하여 mAb를 포획한 후 단일 사이클 속도론적 방법을 사용하여 인간 TMEFF2 농도 적정을 주입하는 것이었다. 염소 항-인간 Fc IgG(Jackson Immunoresearch, Cat# 109-005-098)를 HBSP(GE) 완충액 중 30 μL/min의 유량으로 CM5 Sensor Chip(GE) 상의 플로우 셀 1 및 플로우 셀 2 상에서 10 mM 아세테이트 완충액, pH 4.5 중 30 ㎍/mL로 아민 커플링을 통해 직접 고정시켰다 mAb를 플로우 셀 2 상에서 0.5 ㎍/ml(~200 내지 300 RU)로 항-인간 Fc IgG 표면 상에 포획하였다. 이어서, 러닝 완충액(running buffer)을 HBSP + 100 ug/ml BSA로 변화시켰다. 3배 희석 시리즈에서 30 nM 농도의 TMEFF2 ECD를 단일 사이클 속도론적 방법을 사용하여 저농도로부터 고농도로 주입하였다. 최종 또는 최고 농도 주입 30분 후 해리 속도(off-rate)를 모니터링하였고, 이어서 0.8% 인산(Bio-Rad)을 사용하여 표면을 재생시켰다. 동일한 mAb를 포획하고 샘플 런(sample run)의 동일한 조건을 사용하는 완충액 블랭크 런을 또한 완료하였다. 반응 데이터로부터 두 세트의 참조 데이터를 감산함으로써 원시 데이터를 처리하였다: 1) 샘플 플로우 셀 2로부터 감산된 기준 플로우 셀 1 및 2) 실험 런으로부터 러닝되는 완충액 블랭크. 각각의 mAb에 대한 모든 농도에서의 처리된 데이터를 1:1 단순 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 전체적으로 피팅하여 속도론적 상수(kinetic constant)(kon, koff) 및 친화도 상수(KD)의 추정치를 추출하였다.
항-TMEFF2 항체의 열 안정성
TMEB675는 Tm = 52℃에서 풀림이 시작되어 60.4℃에서 첫 번째 열 전이(Tm1)가 일어나면서, DSC(시차 주사 열량측정법)에 의한 통상의 열 안정성 프로파일보다 낮은 것을 보여주었다. TMEB675의 서열의 면밀한 검사(실시예 4 참조)는 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 내에서 체세포 초돌연변이(Somatic HyperMutation, SHM)의 존재를 보여주었다. 몇몇 재조작된 변이체를 서브클로닝하고, 발현시키고, 정제하고, DSC에 의해 프로파일화하였다. 생성된 mAb TMEB762 및 TMEFB757은 바람직한 열 안정성 프로파일(각각 Tm1 = 69.4℃ 및 Tm1 = 69.7℃)을 나타내었다. TMEB675와 비교하여, TMEB762는 중쇄 내에서 R14P, P20L 및 H81Q의 아미노산 변형을 가진 반면, TMEFB757은 중쇄 내에서 R14P 및 P20L의 아미노산 변형을 가졌다. TMEB675와 비교하여, TMEB762는 경쇄 내에서 A1D 및 A91P의 아미노산 변형을 가진 반면, TMEFB757은 경쇄 내에서 A91P 변형을 가졌다. 잔기 넘버링은 카밧에 따른다. TMEFF2 ECD에 대한 TMEB675, TMEB762의 결합의 속도론적 파라미터는 표 4에 나타나 있다.
실시예 4. 항-TMEFF2 항체의 구조적 특성화
항체의 cDNA 서열 및 아미노산 번역을 표준 기술을 사용하여 얻었다. 폴리펩티드 서열 결정 후에, 가변 영역 또는 전장 항체를 인코딩하는 일부 항체 cDNA를 규모-확대 발현을 위한 표준 방법을 사용하여 코돈 최적화하였다.
표 5는 선택된 항-TMEFF2 항체의 HCDR1 및 HCDR2 아미노산 서열을 나타낸다.
표 6은 선택된 항-TMEFF2 항체의 HCDR3 아미노산 서열을 나타낸다.
표 7은 선택된 항-TMEFF2 항체의 LCDR1 및 LCDR2 아미노산 서열을 나타낸다.
표 8은 선택된 항-TMEFF2 항체의 LCDR3 아미노산 서열을 나타낸다.
표 9는 선택된 항-TMEFF2 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다.
표 10은 선택된 항-TMEFF2 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열 번호를 나타낸다.
표 11은 선택된 항-TMEFF2 항체의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다.
표 12는 선택된 항-TMEFF2 항체의 경쇄 아미노산 서열을 나타낸다.
표 13은 다양한 항-TMEFF2 항체 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 번호를 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00017
[표 6]
Figure pct00018
[표 7]
Figure pct00019
[표 8]
Figure pct00020
[표 9]
Figure pct00021
[표 10]
Figure pct00022
[표 11]
Figure pct00023
[표 12]
Figure pct00024
[표 13]
Figure pct00025
서열 번호 39 (TMEB675 VH cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGAGAGGAGGAAGCCTGAGACCCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC
서열 번호 40 (TMEB570, TMEB565 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAGCTCCTATTACATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGTGGCATTATCCCAATCAGTGGGCGTGCTAATTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGACGGCTACAGTAGTGGACGTAGCACAACATACGCATTTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCGAGT
서열 번호 41 (TMEB674 VH cDNA)
GAAGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTCCTGGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCAGCGGCGGAGGCAGCTTTACCAGCTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAACAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCCCATGACTGCTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
서열 번호 42 (TMEB675 VL cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACGCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
서열 번호 43 (TMEB570 VL cDNA)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTTCCACATACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTACGGTGCCTCCTATCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTACGGTCACAGCCCGATTACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAA
서열 번호 44 (TMEB674 VL cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGGAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACAGCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAGG
서열 번호 45 (TMEB565 VL cDNA)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTGCCACCTATTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTACGGTGCATCCTCCCGTGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTACGGCTATAACCCAATTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAA
서열 번호 46 (TMEB675 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGAGAGGAGGAAGCCTGAGACCCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 47 (TMEB570, TMEB565 HC cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAGCTCCTATTACATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGTGGCATTATCCCAATCAGTGGGCGTGCTAATTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGACGGCTACAGTAGTGGACGTAGCACAACATACGCATTTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCGAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 48 (TMEB674 HC cDNA)
GAAGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTCCTGGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGTGATCAGCGGCGGAGGCAGCTTTACCAGCTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAACAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCTTCTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCCCATGACTGCTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 49 (TMEB675 LC cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACGCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열 번호 50 (TMEB570 LC cDNA)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTTCCACATACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTACGGTGCCTCCTATCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTACGGTCACAGCCCGATTACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열 번호 51 (TMEB674 LC cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGGAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACAGCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAGGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열 번호 52 (TMEB565 LC cDNA)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTGCCACCTATTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTACGGTGCATCCTCCCGTGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTACGGCTATAACCCAATTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열 번호 95 (TMEB762 VH cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC
서열 번호 96 (TMEB762 VL cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
서열 번호 97 (TMEB762 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 98 (TMEB762 LC cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
서열 번호 99 (TMEB757 VH cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC
서열 번호 100 (TMEB757 VL cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
서열 번호 101 (TMEB757 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGAGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAGCAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 102 (TMEB757 LC cDNA)
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAGCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
선택된 항-TMEFF2 항체에 대한 프레임워크는 표 14에 나타나 있다.
[표 14]
Figure pct00026
서열 번호 53 (VH3_3-23 프레임워크)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS
서열 번호 54 (VH1_1-69 프레임워크)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
서열 번호 55 (VKI_L11 프레임워크)
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYC LQDYNYP
서열 번호 56 (VKIII_A27 프레임워크)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
실시예 5. 항-TMEFF2 항체의 에피토프 맵핑
TMEB570 및 TMEB675의 에피토프 맵핑을 H/D 교환을 사용하여 수행하였다. TMEW1(서열 번호 6)을 이들 검정에서 TMEFF2의 공급원으로서 사용하였다.
130 μL의 대조군 완충액(50 mM 인산염, 100 mM 염화나트륨 pH 7.4) 중 10 ㎍의 TMEW1을, 130 μL의 4 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.85 M TCEP 완충액을 첨가하였고(최종 pH 2.5) 혼합물을 10℃에서 3분 동안 인큐베이션함으로써 변성시켰다. 이어서, 사내(in-house) 패킹된 펩신/프로테아제 XIII(w/w, 1:1) 컬럼(2.1 × 30 mm)을 사용하여 혼합물에 대해 온-컬럼(on-column) 펩신/프로테아제 XIII 분해를 수행하였다. 생성된 펩티드를 Q ExactiveTM 하이브리드 사중극자-오비트랩 질량 분석계(Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)(Thermo)에 결합된 Waters Acquity UPLC로 구성된 UPLC-MS 시스템을 사용하여 분석하였다. 2 내지 34% 용매 B(아세토니트릴 중 0.2% 포름산)로부터 16.5분 구배로 50 × 1 mm C8 컬럼 상에서 펩티드를 분리하였다. 용매 A는 물 중 0.2% 포름산이었다. 주입 밸브 및 펩신/프로테아제 XIII 컬럼 및 이들의 관련 연결 튜브를 10℃로 유지된 냉각 박스 내부에서 유지시켰다. 제2 스위칭 밸브, C8 컬럼 및 이들의 관련 연결 스테인리스강 튜브를 -6℃로 유지된 다른 냉각된 순환 박스 내부에 두었다. 마스코트(Mascot)를 사용하여 TMEW1 서열에 대한 MS/MS 데이터의 검색을 통해 펩티드 동정을 행하였다. 전구체 및 생성물 이온에 대한 질량 허용오차는 각각 7 ppm 및 0.02 Da이었다.
10 μL의 TMEW1(5 ㎍) 또는 10 μL의 TMEW1 및 TMEB570 또는 TMEB675 혼합물(5 ㎍:15 ㎍)을 10℃에서 0초, 30초, 360초, 3600초, 또는 14400초 동안 120 μL 중수소 산화물 표지 완충액(50mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨 pH 7.4)과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 시점에서 수소/중수소(H/D) 교환을 이중으로 수행하였다. 130 μL의 4 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.85 M TCEP 완충액을 첨가하여(최종 pH 2.5) 수소/중수소 교환을 켄칭하였다. 후속하여, 켄칭된 샘플에 대해 전술된 바와 같이 온-컬럼 펩신/프로테아제 XIII 분해 및 LC-MS 분석을 수행하였다. MS 전용 방식(MS only mode)으로 질량 스펙트럼을 기록하였다.
원시 MS 데이터를 H/D 교환 MS 데이터 분석용 소프트웨어인 HDX WorkBench를 사용하여 처리하였다(문헌[Pascal et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23 (9), 1512-1521]). 중수소화된 펩티드와 그의 천연 형태(t0) 사이의 평균 질량 차이를 사용하여 중수소 수준을 계산하였다. 약 97 내지 99%의 단백질이 특이적 펩티드로 맵핑될 수 있었다. 중수소 축적 곡선은 펩티드에 대한 교환 시간에 걸쳐 기울기에 유의한 차이를 나타내었다.
TMEB570 에피토프: TMEW1은 잔기 235 내지 249(서열 번호 2에 따른 잔기 넘버링)에서의 중수소 흡수의 약간의 감소를 나타내었으며, 예를 들어, 막 근위 영역 내의 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57)를 TMEB570에 결합 시 H/D 교환으로부터 보호하였다.
TMEB675 에피토프: TMEW1은 잔기 252 내지 268(서열 번호 2에 따른 잔기 넘버링)에서의 중수소 흡수의 약간의 감소를 나타내었으며, 예를 들어, 막 근위 영역 내의 잔기 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58)을 TMEB675에 결합 시 H/D/교환으로부터 보호하였다.
따라서, TMEB570 TMEFF2 에피토프 잔기는 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57)를 포함하고 TMEB675 에피토프 잔기는 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58)을 포함하였다. 두 항체 모두 막 근위 영역 내에서 TMEFF2에 결합하였다.
실시예 6. 항-CD3 항체의 생성
항-CD3 항체 CD3B219는 미국 특허 제9850310호에 기재되어 있다.
OmniRat(OMT™)를 면역화함으로써 추가의 항-CD3 항체를 생성하였다. 획득된 하이브리도마 상청액을 인간 및 사이노몰구스 CD3+ T 림프구에 대한 결합에 대해 스크리닝하였고, 클론을 단리하고 서열분석하고, 일부 경우에는, 추가로 조작하였다. S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 이펙터-침묵 IgG4를 포함하는 다양한 동종형으로서 또는 L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S 및 P331S 돌연변이를 갖는 IgG1으로서 항-CD3 항체를 클로닝하였다. 생성된 2개의 항-CD3 항체를 CD3B376 및 CD3B450으로 명명하였다.
인간 T 세포에 대한 CD3B376 및 CD3B450의 시험관내 결합 친화도를 항원 특이적 표적 아암과 교차한 후에 유세포측정에 의해 결정하였다. 인간 T 세포에 대해 예비 연구를 수행하여 항-CD3 추적자 분자(KdT)의 포화 결합 상수를 결정하였다. 이어서, 고정 농도의 추적자([T])를 적정 농도(titrated concentration)의 시험 mAb와의 경쟁 결합 검정에 사용하였다. 하기 식을 사용하여 결합 친화도(Kd)를 결정하기 위해 시험 분자의 IC50(50% 억제가 달성되는 농도) 값을 사용하였다: Kd = IC50/(1+([T]/KdT)). 5명의 인간 공여자를 사용하여 추적자, 구매가능한 AlexaFluor488 SP34-2 항-CD3(BioScience #557705)의 포화 결합 상수(KdT)를 결정하였다(데이터 표시되지 않음).
추적자의 포화 결합 상수(KdT) 결정
방법: 인간 pan T 세포를 사용될 때까지 질소 탱크 내에 냉동 저장하였다. T 세포를 해동시키고, PBS로 세척하고, FACS 염색 완충액 중에 재현탁시키고, (생존율을 기록하면서) 계수하고, 0.5×106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 원적색 생/사 염색제(Far Red Live/Dead stain)(Life Technologies, AKA Invitrogen # L34974)(바이알 내로 50 μL의 DMSO)를 1×106개 세포당 1 μL로 첨가하고; FcR 차단제(Miltenyi Biotec #130-059-901)(0.5×106개 세포당 1:20 희석의 1mL)를 각각 10분 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 50,000개 세포/웰로 플레이팅하고 세척하였다. AlexaFluor488 SP-34 항-CD3의 증가하는 농도를 4℃에서 2 시간 동안 T 세포에 첨가하였다. 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 15분 동안 고정시키고, 세척하고, 1 mM EDTA를 함유하는 FACS 염색 완충액 중에 재현탁시켰다.
iQue Intellicyte 유세포측정기를 사용하여 결합을 측정하였다. 세포를 T 세포 집단, 이어서 세포 단일체(singlet), 이어서 라이브 세포 (FL4)에 대해 게이팅하였다. 염색(FL1)의 기하학적 평균을 각각의 웰에 대해 결정하였다.
획득된 평균 형광 세기 값을 항체 분자 농도의 함수로서 플롯팅하고, 1-부위 결합 분석(총 결합)에서 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 소프트웨어는 질량 작용의 법칙을 따르는 수용체(인간 Pan T 세포 상의 CD3)에 대한 항체 분자의 결합을 설명하는 상응하는 Kd 값을 계산한다. 식은 다음과 같다: Y = (Bmax × X) / (Kd + X); 여기서, Bmax는 최대 결합이며; Kd는 최대 결합의 절반에 도달하는 데 필요한 리간드의 농도이다.
결과: Kd 값을 각각의 공여자에 대해 유도하고, 평균 값을 얻었다. 인간 T 세포에 대한 포화 결합 상수(KdT)는 5.6 ± 1.0 nM(n= 4)인 것으로 유도되었으며, 이전에 언급된 식을 사용하여 Kd 결합 친화도를 결정하였다.
경쟁 검정에 의한 항-CD3 mAb의 결합 친화도 결정
CD3B376 및 CD3B450을 사용하여 경쟁 결합 연구를 수행하였다. 인간 pan T 세포를 사용하여 mAb의 결합 친화도를 결정하였다. 사용된 추적자는 구매가능한 AlexaFluor488 SP-34 항-CD3(바이오사이언스 #557705)이었으며, 이러한 추적자에 대한 포화 결합 상수는 상기에 기재되어 있다.
T 세포를 사용될 때까지 질소 탱크 내에 냉동 저장하였다. T 세포를 해동시키고, PBS로 세척하고, FACS 염색 완충액 중에 재현탁시키고, 생존율을 기록하면서 계수하고, 0.5×106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 원적색 생/사 염색제(Far Red Live/Dead stain)(Life Technologies, AKA Invitrogen # L34974)(바이알 내로 50 μL의 DMSO)를 1×106개 세포당 1 μL로 첨가하고; FcR 차단제(Miltenyi Biotec #130-059-901)(0.5×106개 세포당 1:20 희석의 1mL)를 각각 10분 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 50,000개 세포/웰로 플레이팅하고 세척하였다.
mAb(및 동종형 대조군)를 1000 또는 200 ㎍/mL(2X)의 시작 농도에서 1:2로 연속 희석하였고, 고정 농도의 추적자(5 ㎍/mL; 2X)를 함께 혼합하여 1X 농도를 제공하였다. 따라서, 추적자의 최종(1X) 농도는 2.5 ㎍/mL = 16.6 nM이었다. 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 T 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 15분 동안 고정시키고, 세척하고, 1 mM EDTA를 함유하는 FACS 염색 완충액 중에 재현탁시켰다.
iQue Intellicyte 유세포측정기를 사용하여 결합을 측정하였다. 세포를 T 세포 집단, 이어서 세포 단일체, 이어서 라이브 세포 (FL4)에 대해 게이팅하였다. 염색(FL1)의 기하학적 평균을 각각의 웰에 대해 결정하였다. 획득된 평균 형광 세기 값을 로그 항체 분자 농도의 함수로서 플롯팅하고(nM로 변환함), EC50/IC50 값(nM 단위)이 유도되는 S자형 용량-반응(가변 기울기)에서 Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 결합 친화도((Kd)를 다음 식을 사용하여 유도하였다: Kd = IC50/(1+([T]/KdT)). 여기서, Kd는 경쟁자(비표지된 분자)의 친화도이고; 시험 화합물의 nM의 IC50; [T]는 추적자의 농도(16.6 nM)이고; KdT는 포화 결합에 의해 결정된 추적자의 Kd이다(인간의 경우 5.6 nM).
CD3B376 결합 부위는 2가 형태 및 1가 형태 둘 모두에서 CD3B450보다 더 타이트하였다.
[표 15]
Figure pct00027
CD3B219, CD3B376 및 CD3B450의 CDR, VH 및 VL 아미노산 서열이 표 16에 나타나 있다.
[표 16]
Figure pct00028
서열 번호 76 CD3B219 HC; (IgG4 S228P, F234A, L235A, F405L 및 R409K)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열 번호 77 CD3B219 LC
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
서열 번호 78 CD3B376 HC (IgG4 S228P, F234A, L235A, F405L 및 R409K)
QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열 번호 79 CD3B376 LC
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
표 17은 항-CD3 항체 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 번호를 나타낸다.
[표 17]
Figure pct00029
서열 번호 105 CD3B219 VH cDNA
GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCCCGGATCAGAAGCAAGTACAACAATTACGCCACCTACTACGCCGCCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCATCT
서열 번호 106 CD3B219 VL cDNA
CAGACCGTCGTGACCCAGGAACCTAGCCTGACCGTGTCTCCTGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCTCCCAGAGGACTGATCGGCGGCACCAACAAGAGAGCCCCTGGCACCCCTGCCAGATTCAGCGGATCTCTGCTGGGAGGAAAGGCCGCCCTGACACTGTCTGGCGTGCAGCCTGAAGATGAGGCCGAGTACTACTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTG
서열 번호 80 CD3B219 HC cDNA
GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACACCTACGCCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCCCGGATCAGAAGCAAGTACAACAATTACGCCACCTACTACGCCGCCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGGCAACTTCGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCATCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCCTCCTCTACAGCAAGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 81 CD3B219 LC cDNA
CAGACCGTCGTGACCCAGGAACCTAGCCTGACCGTGTCTCCTGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCTCCCAGAGGACTGATCGGCGGCACCAACAAGAGAGCCCCTGGCACCCCTGCCAGATTCAGCGGATCTCTGCTGGGAGGAAAGGCCGCCCTGACACTGTCTGGCGTGCAGCCTGAAGATGAGGCCGAGTACTACTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
서열 번호 107 CD3B376 VH cDNA
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCTAGACTCGTGCGGCCTTCCCAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGACTCCGTGTTCAACAACAACGCCGCCTGGTCCTGGATCCGGCAGAGCCCTTCTAGAGGCCTGGAATGGCTGGGCCGGACCTACTACCGGTCCAAGTGGCTGTACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCGTGAACCCTGACACCTCCCGGAACCAGTTCACCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCTGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGGCTACTCCTCCTCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCT
서열 번호 108 CD3B376 VL cDNA
AGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTG
서열 번호 82 CD3B376 HC cDNA
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCTAGACTCGTGCGGCCTTCCCAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGACTCCGTGTTCAACAACAACGCCGCCTGGTCCTGGATCCGGCAGAGCCCTTCTAGAGGCCTGGAATGGCTGGGCCGGACCTACTACCGGTCCAAGTGGCTGTACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCGTGAACCCTGACACCTCCCGGAACCAGTTCACCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCCCTGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGGCTACTCCTCCTCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCCTCCTCTACAGCAAGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
서열 번호 83 CD3B376 LC cDNA
CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
실시예 7. 이중특이성 TMEFF2xCD3 항체의 생성
선택된 단일특이성 항-TMEFF2 및 항-CD3 항체를 IgG4/κ로서 발현시켰다. F405L 및 R409K 치환(EU 넘버링)이 항-CD3 항체 내로 이루어진 반면, 항-TMEFF2 항체는 야생형 IgG4를 가졌다. 위치 405 및 409 치환에 더하여, IgG4 mAb를 S228P, F234A 및 L235A 치환을 갖도록 조작하였다.
단일특이성 항체를 발현시키고 단백질 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe column)을 사용하는 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 용출 후, 풀(pool)을 D-PBS(pH 7.2) 내로 투석하였다.
국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 바와 같이 시험관내 Fab 아암 교환으로 단일특이성 TMEFF2 mAb와 단일특이성 CD3 mAb를 조합함으로써 이중특이성 TMEFF2xCD3 항체를 생성하였다. 간략하게 말하면, PBS(pH 7 내지 7.4) 및 75 mM 2-메르캅토에탄올아민(2-MEA) 중에서 각각의 항체를 약 1 내지 20 mg/ml로 1:1 몰비로 함께 혼합하고 2 내지 6시간 동안 25 내지 37℃에서 인큐베이팅한 후, 표준 방법을 사용하여 투석, 투석여과, 접선 유동 여과 및/또는 스핀 세포 여과를 통해 2-MEA를 제거하였다.
표준 방법을 사용하여 잔류 모 항-TMEFF2 및 항-CD3 항체를 최소화하기 위해, 시험관내 Fab-아암 교환 후에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 이중특이성 항체를 추가로 정제하였다.
표 18 및 표 19는 생성된 이중특이성 항체를 나타낸다.
[표 18]
Figure pct00030
[표 19]
Figure pct00031
실시예 8. 이중특이성 TMEFF2 x CD3 항체의 특성화
분석용 초원심분리(AUC)에 의한 순도 분석
분석용 초원심분리(AUC)는 용액 중의 거대분자의 크기, 형상, 응집 상태, 및 가역적 상호작용의 결정을 가능하게 한다. 침강 속도(SV)는 원심분리기가 회전함에 따라 거대 분자의 농도 구배가 샘플 홀더(셀)의 외부 반경으로 이동하게 하는 AUC 기법이다. 이는 분자의 크기 및 형상의 인자인 침강 계수의 결정을 가능하게 하고, 이는 각 분자마다 고유하다. 이러한 목적을 위해 Beckman Optima AUC 기기를 사용하였다. 1.2 cm Beckman 센터피스(centerpiece)(50K rpm 등급) 및 석영 윈도우를 구비한 원심분리 셀 내로 샘플을 로딩하였다. 셀을 조립하고 130 lb로 토크를 가한다. 원심분리 셀을 An-50(8개 구멍) 또는 An-60(4개 구멍) 로터(rotor)에 넣고 AUC 챔버 내에 배치하였다. 런을 개시하기 전에, AUC의 온도를 챔버 내의 로터와 함께 적어도 1시간 동안 20.5℃로 평형을 이루게 하였다. 스캔 횟수(250회 스캔), 스캔 수집 빈도 (90초), 데이터 해상도 (10 μM), 280 nm의 파장으로 mAb 샘플에 대해 40K rpm에서 런을 수행하였다. 직접 경계 피팅(direct boundary fitting) 소프트웨어 SEDANAL을 사용하여 데이터를 분석하였다. 이중특이성 항체 TMCB150 및 그의 모 mAb의 순도를 측정하였다. TMCB150은 추가의 생물물리학적 특성화를 위해 일시적으로 발현된 연구 물질에 대한 허용가능한 기준을 충족시키는 AUC에 의해 결정된 바와 같이, 97.1% 단량체, 2.8% 이량체 단량체를 나타내었지만 응집을 나타내지는 않았다. TMEB762는 95.5% 단량체, 4.5% 이량체를 나타내었지만 응집을 나타내지는 않은 반면, CD3B376은 97.7% 단량체 및 2.2% 이량체를 나타내었지만 응집을 나타내지는 않았다. 최소 2단계 정제된 분자의 5% 초과의 응집체 수준은 생물학적 활성, 용해도, 안정성 및 저장 수명에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
DSC에 의한 항-TMEFF2/CD3 이중특이성의 입체구조 안정성
TMCB150 열 풀림은 DSC(시차 주사 열량측정법)에 의해 결정되었는데, Tm= 52.6℃에서 풀림이 시작되어 61.8℃에서 첫 번째 열 전이(Tm1)가 67.6℃에서 두 번째 열 전이(Tm2)가 75.5℃에서 세 번째 열 전이(T㎥)가 나타났었다. 이전에 DSC에 의해 평가된 바와 같이 모 항체(항-TMEFF2, TMEB762 및 항-CD3, CD3B376) 열 전이 프로필에 기초하여, TMCB150의 Tm1은 CD3B376 FAB 풀림에 상응하고 TMCB150의 T㎥은 TMEB762 Fab 풀림 전이에 상응한다.
혈청 안정성
인간 혈청 성분에 대한 비특이적 결합 또는 탈표적 결합에 대한 리드(lead) 후보물질의 특성을 평가하도록 혈청 안정성 검정이 개발된다. 이는 불량한 약동학적 특성 및 생물 분포 특성을 예측할 수 있다. TMCB150의 결합 및 안정성은 형광 기반 크로마토그래피 방법을 사용하여 완충액 및 인간 혈청 둘 모두에서 평가된다. 이중특이성 항체는 Alexa Fluor 488 접합체(제조자의 지시에 따른 Invitrogen 키트)로 표지되고, Hepes 완충액 및 인간 혈청(Sigma, cat# H4522) 중에서 4℃ 및 37℃에서 2일 동안 인큐베이션되고, 이어서 형광 검출기가 구비된 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC에 의해 분석된다. 퍼센트 응집은 각각의 피크의 곡선 아래 영역의 적분으로부터 계산된다. TMCB150은 시각 0에서 Hepes 완충액 중 2.4% 응집을 나타내었고, 4℃ 및 37℃에서 2일 후 각각 2.0% 및 1.3% 응집을 나타내었다. 인간 혈청에서, TMCB150은 시각 0에서 1.7% 응집을 나타내었고, 4℃ 및 37℃ 둘 모두에서 2일 후 1.1% 응집을 나타내었다.
비특이적 결합
리드 분자의 관련되지 않은 표면으로의 비특이적 결합은 바이오센서 기술(Biacore 8K)에 의해 결정된다. 항체를 관련되지 않은 단백질로 코팅된 SPR 표면 위로 통과시킨다. 항체가 이러한 관련되지 않은 표면에 대한 유의한 결합을 나타내는 경우, 이는 불량한 생체내 특성을 갖고 제조상 문제점을 나타낼 것으로 예측된다. 리드 분자를 1 μM의 최종 농도에서 시험한다. 관련되지 않은 표면은 음으로 하전된 단백질(소이 트립신 억제제), 양으로 하전된 단백질(라이소자임 및 β-디펜신), 소수성물질(Rh-인테그린 a4b7), 인간 IgG, 점착성 단백질(Rh-CD19)을 포함한다. 적절한 대조군이 본 실험에 사용된다. 리드는 2개의 표면 위로 유동되는데, 하나는 블랭크(blank)이고, 다른 하나는 분자가 직접 고정되어 있다. 반응 단위(RU) 수준은 시험 표면 RU로부터 블랭크 RU를 감산함으로써 결정된다. TMCB150의 RU 및 모 mAb는 하기 표에 주어져 있다. 100 이상의 반응 단위는, 제조 동안 문제점들을 발생시키고 불량한 PK 특성으로 이어질 수 있는 하전된/소수성/IgG 표면에 대한 비특이적 결합에 대한 높은 위험을 예측한다. 항체들 중 어느 것도 제조 및 생체내 거동에 대해 위험이 낮거나 없는 것으로 예측하는 관련되지 않은 표면에 대한 비특이적 결합을 나타내지 않는다.
[표 20]
Figure pct00032
고농도 안정성
많은 단일클론 항체는 고농도(100 mg/ml 이상)로 제형화되어 주입 부피를 감소시켜 피하 투여를 용이하게 한다. 더욱이, 모든 단일클론 항체는 정제 과정 동안 일시적 고농도(50 mg/ml 이상)에 노출된다. 따라서, 고농도 안정성은 이들 분자에 대한 중요한 품질 속성이다. 30kDa MWCO 막을 갖는 원심 한외여과 장치를 사용하여 농축이 실시된다. 5.1 내지 5.3 mg의 각각의 단백질을 초기에 동일한 출발 농도로 희석하고, 15분 간격으로 4000xg로 원심분리하였다. 각각의 15분 원심분리 단계의 종료 시, 농축기를 원심분리기로부터 제거하고 나머지 샘플 부피의 시각적 추정치를 기록한다. 농도는 SoloVPE 기기에 의해 측정된다. 농축된 샘플을 4C 및 40C에서 2주 동안 인큐베이션하였고, 분석용 SEC에 의한 완전성(integrity)을 확인하기 위해 분취물을 일정 시간 간격으로 채취하였다. TMCB150 및 모 mAb(CD3B376 및 TMEB762)는 정상적으로 농축되었다. TMCB150의 최종 농도는 99.4 mg/mL였고, 모 mAb의 최종 농도는 52.2 mg/mL(TMEB762) 및 52.6 mg/mL(CD3B376)였다. 농도는 4C 및 40C에서 2주 동안 동일하게 유지하였고, 이는 분자가 Eppendorf 튜브에 응집 또는 흡착할 가능성이 없는 양호한 고유 특성을 갖는다는 것을 시사한다. SEC 피크 통합으로부터 측정된 바와 같은 % 종(A: 응집체; M: 단량체; F: 단편)은 아래 표에 제공된다. 고농도에서, 분자는 40C에서 2주 동안 보관한 후 4 내지 5% 응집체 및 0.3% 이하의 단편으로 그대로 유지되어 양호한 저장 수명을 예측한다.
[표 21]
Figure pct00033
속도론적 배제 검정(KinExA)에 의한 항-TMEFF2/CD3 이중특이성 항체의 친화도 결정
KinExA 3200 기기(Sapidyne Instruments, Inc.)를 사용하여, 인간 TMEFF2 세포외 도메인(ECD)에 대한 이중특이성 mAb TMCB150 및 그의 2가 TMEFF2 모 TMEB762 mAb의 용액 평형 친화도, KD를 측정하였다. 10 mM HEPES, 150 mM NaCL, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4, 0.1% BSA, 및 0.02% NaN3 중의 항-TMEFF2 mAb의 일정한 농도로 인간 TMEFF2 세포외 도메인(ECD)의 연속 희석물을 제조하였다. 반응 혼합물을 결합 상호작용이 평형에 도달할 때까지 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 지속기간은 KinExA 소프트웨어 시뮬레이션을 사용하여 결정하였다. 비스-아크릴아미드/아즈락톤 공중합체(Pierce Biotechnology, Inc.)로 구성된 예비 활성화 비드 상의 아민 커플링에 의한 TMEFF2-ECD의 직접 공유 고정화(covalent immobilization)에 의해 비드(bead)를 제조하였다. 인큐베이션 후, TMEFF2-변형된 비드를 통해 혼합물을 통과시키고 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 포획된 항체를 검출함으로써, KinExA 기기 상에서 샘플을 러닝시켜 혼합물 내의 유리 항체를 평가하였다. KinExA Pro 소프트웨어를 사용하여 데이터를 1:1 결합 모델로 피팅하였다.
[표 22]
Figure pct00034
N-말단 CD3ε 펩티드에 대한 항-TMEFF2/CD3 이중특이성 항체의 결합 친화도의 측정
속도론적 속도 상수를 Biacore 8K(GE Healthcare) 및 항-인간 Fc 바이오센서 표면을 사용하여 수행된 SPR에 의해 측정하였다. 항-인간 면역글로불린 항체를 CM4 센서 칩(GE Healthcare)의 표면에 공유적으로 결합시켰다. 관심 대상의 항체를 항-인간 면역글로불린 센서 칩 상에서 포획하고, 이어서 0.05% 계면활성제 P20(Tween™ 20) 및 100 ug/mL BSA를 함유하는 HEPES 완충 식염수 내에서 다양한 농도로 N-말단 CD3ε 펩티드를 주입하였다. 100 μL/min으로 30 μL의 0.8% 인산을 2회 펄스 주입하여 표면을 재생시켰다. 기록된 데이터는 포획된 항체를 함유하는 플로우 셀과 포획된 항체가 없는 참조 셀 사이의 SPR 신호의 차이이다. 블랭크 주입으로부터의 데이터를 참조-감산된 신호로부터 감산함으로써 신호에 대한 추가적인 기기 기여를 제거하였다. Biaevaluation 소프트웨어(Biacore, 인크.)를 사용하여 1:1 결합 모델로 모든 농도(전체적인 피팅)에서 회합 및 해리 상을 피팅함으로써 데이터를 분석하였다. 데이터는 95% CI * 표준편차/반복 횟수의 제곱근에 대한 t 값에 의해 계산되는 평균 + 95% CI(신뢰 구간)로 기록되어 있다.
[표 23]
Figure pct00035
실시예 9. 이중특이성 TMEFF2xCD3 항체는 전립선암 세포의 T 세포 매개 사멸에 효과적이다.
시험관내 전립선암 세포의 T 세포 매개 사멸.
선택된 이중특이성 TMEFF2×CD3 항체를 전립선암 세포의 T 세포 매개 사멸을 매개하는 그의 능력에 대해 평가하였다.
활성 카스파제 3/7에 의한 형광 기질의 절단을 통해 세포 사멸을 간접적으로 측정하는 카스파제 세포독성 검정을 사용하여 TMEFF2×CD3 이중특이성 항체의 T 세포 매개 사멸을 측정하였다. 기질의 절단은 형광 DNA 염료를 생성하는데, 형광은 세포 핵으로 제한된다. 반복된 형광 측정은, 동일한 좌표에서 웰(들)을 정밀하게 이미징할 수 있는 전동식 10X 대물렌즈를 사용하여 검정 과정 전체에 걸쳐 각 웰에서 수행된다. 표적 세포 집단은 규정된 크기 제한에 기초하여 그리고/또는 2차 표지의 사용을 통해 확인된다.
냉동 Pan CD3+ T 세포(미국 펜실베이니아주 콜마 소재의 Biological Specialty Corporation)를 정상적인 건강한 공여자로부터의 음성 선택에 의해 단리하였다. TMEFF2(LNCaP-AR)를 발현하는 전립선암 세포를 10% HI FBS + 보충제(Life Technologies)를 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. T 세포 및 표적 세포를 선택 시약없이 페놀 레드(Phenol Red) 무함유 RPMI + 10% FBS 및 보충제(Life Technologies) 중에서 3:1의 이펙터 대 표적 비율(E:T)로 결합시키고, 제조자 지침에 따라 0.6 uL의 NucView 카스파제 시약(Essen Bioscience)을 각 mL의 세포에 첨가하였다. 총 부피 0.1 mL 세포를 투명한 96-웰 평면 바닥 플레이트(BD Falcon)의 적절한 웰에 첨가하였다. 상기에 나타낸 바와 같이 제조된, 페놀 레드 무함유 RPMI 중의 2X 최종 농도로 TMEFF2×CD3 이중특이성 항체를 제조하고, 0.1 mL의 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션하여 웰 가장자리에서의 세포 응집을 최소화한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2로 유지된 Zoom Incucyte 기기(Essen Bioscience)로 옮겼다.
Incucyte 상에서의 프로세싱 정의는, 제조자의 지침에 따라, 테스트된 각각의 세포주에 대해 설계되었다. 카스파제 신호에서의 평탄역이 관찰될 때까지 측정을 6시간마다 수행하였고, 시험 화합물(들)의 최고 농도를 포함하는 웰(들) 내의 최대 신호로부터의 3회 이상의 연속적인 감소가 이어졌다.
검정이 완료된 후, 각각의 플레이트를 적절한 프로세싱 정의를 이용하여 분석하였다. 원시 형광 데이터를 Incucyte Zoom 소프트웨어로부터 내보내고, GraphPad Prism(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 GraphPad Software, Inc.)에 붙여넣기 하였다. 카스파제 3/7 활성을 GraphPad 내의 각각의 웰에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산함으로써 결정하였다. AUC 값은 Log10 nM 화합물의 함수로서 플롯팅하였다. 나노몰(nM)단위의 각각의 용량 곡선에 대한 EC50을 비선형 회귀 분석(4개의 파라미터 피팅, 최소 제곱법)에 따라 기록하였다. 각각의 검정은 최소 3개의 생물학적 복제물을 포함하였으며, 각각의 세포주를 5명의 건강한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 시험하였다. 비선형 회귀 모델을 사용하여 비임상 통계치에 의해 데이터를 추가로 분석하였다.
도 3은 선택된 이중특이성 TMEFF2xCD3 항체의 증가된 카스파제 3/7 활성에 의해 측정되는 바와 같은 시간 경과에 따른 LNCaP 세포의 사멸을 나타낸다.
이중특이성 TMEFF2×CD3 항체는 생체내 전립선암 종양 모델에서 효과적이다.
선택된 이중특이성 항체를 수컷 NSG 마우스의 생체외 LnCaP 전립선암 모델에서 시험하였다. 연구를 위해, 50% Cultrex 중의 106LnCaP 세포를 0.2 mL/동물로 일수 0에 우측 옆구리로의 피하 주사에 의해 투여하였다. 종양이 약 100 내지 150 ㎣의 부피에 도달할 때 동물을 무작위화하였고, 일수 15에 마우스당 206 T 세포를 복막내로 주사하였다. 각각의 그룹에 10마리의 동물을 사용하였다. 항체를 이용한 처리는 T 세포 주입 후 1 내지 3일에 시작하였다. 항체를 1주일에 2회 복막내로 투여하였다. 투여 전에, 모든 동물은 IVIG + Fc 블록을 수용하였다. 종양이 ~1200 ㎣에 도달할 때까지 종양 부피 및 체중을 주 2회 평가하였다. 치료군이 표 24에 나타나 있다. CD3B219 CD3 결합 아암 및 HIV gp120에 결합하는 널 아암(null arm)을 갖는, CD3xNull 항체를 이들 검정에서 음성 대조군으로서 사용하였다.
[표 24]
Figure pct00036
표 25는 종양 이식 후 각각의 그룹당 일자 38에서의 퍼센트 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 4는 종양 이식 후 시간 경과에 따른 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다. 도 5a는 0.5 mg/㎏ TMCB93으로 처리된 각각의 마우스의 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다. 도 5b는 0.5 mg/㎏ TMCB132로 처리된 각각의 마우스의 평균 종양 부피의 감소를 나타낸다.
[표 25]
Figure pct00037
TMEB762×CD3B376(TMCB150)의 효능을 또한, 20e6 T 세포로 인간화된 수컷 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에서 확립된 LNCaP 이종이식편에서 평가하였다. 종양 이식 후 일수 13에 동물을 평균 종양 부피에 따라 각각 10마리 동물의 그룹으로 무작위화하였다. 0.5, 0.1 및 0.05 mg/㎏의 TMEB762×CD3B376 또는 0.5 mg/㎏의 null×CD3B376 항체 대조군을 5주 동안 매주 2회 IP 투여하였다. 종양 이식 후 일수 35에, 그룹당 적어도 8마리의 동물이 남아 있을 때, 종양 부피에 의해 결정된 바와 같이 종양 성장 억제(% TGI)를 계산하였다. Null×CD3 대조군과 비교하여, 0.5 및 0.1 mg/㎏의 TMEB762×CD3B376에서 통계적으로 유의한 종양 성장 억제가 관찰되었지만, 0.05 mg/㎏에서는 관찰되지 않았다(도 6). 0.5, 0.1 및 0.05 mg/㎏의 TMEB762×CDB376은 nullxCD3 처리된 대조군과 비교하여 각각 110%, 88% 및 25%의 종양 성장 억제를 유도하였다. TMEB762×CDB376 처리는 각각 0.5 및 0.1 mg/㎏에서 7개 및 3개의 완전한 반응을 야기하였다. 피하 LNCaP 종양을 캘리퍼로 매주 2회 측정하고, 결과를 평균 종양 부피(㎣) ± SEM(그룹당 남아있는 8마리 이상의 마우스)으로 표시하였다.
TMCB132의 투여에 반응하는 T 세포 활성화
LnCaP 전립선암 세포에서의 T 세포 활성화를, 특히 TMCB132로 처리 후 72시간에 6명의 별개의 정상적인 건강한 공여자(9642, 9672, 9762, 9772, 9832, 9852)에서 CD3+/CD8+ T 세포의 CD25 양성을 평가함으로써, 유세포측정에 의해 측정하였다(도 7). 3:1 이펙터:표적 비로 첨가된 CD3+ pan T 세포의 활성화가 LnCaP 전립선암 세포에 대한 TMCB132의 투여에 반응하여 관찰되었다.
시험관내 TMCB132의 T 세포 매개 세포독성.
Incucyte 플랫폼 상에서 라이브 시간(live-time) 경과 이미징을 사용하여, 시험관내 TMCB132의 세포독성 가능성을 평가하기 위해 T 세포 매개 세포독성 검정을 사용하였다. 3:1의 (Effector:Target) 이펙터:표적 비(E:T 비)의 건강한 공여자로부터의 단리된 pan 인간 CD3+ T 세포의 존재 시, TMEFF2 양성 세포주 LnCaP에서 TMCB132를 시험하였다. 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 96시간의 기간에 걸쳐 활성 카스파제 3/7에 대한 형광 신호를 측정함으로써 모니터링하였다. TMCB132는 시간이 증가함에 따라 생존 LnCaP 세포의 용량-의존적 감소를 촉진하였다. 카스파제 3/7 활성 또는 형광 신호의 용량-의존적 증가는 T 세포의 존재 시 LnCaP 세포에서의 세포 사멸을 나타내었다(도 8). 데이터는 TMCB132가 LnCaP 종양 세포에서 T 세포 매개 사멸을 유도하는 데 효과적이라는 것을 시사한다.
T 세포 인간화 마우스에서의 확립된 SC 인간 전립선 이종이식편에서의 TMCB132의 효능.
TMCB132의 항종양 효능을 20e6 T 세포로 인간화된 수컷 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 마우스에서의 확립된 피하(SC) 인간 전립선 LNCaP 이종이식편에서 평가하였다. NSG 수컷. 종양 이식 후 일수 13에 동물을 평균 종양 부피에 따라 각각 10마리 동물의 그룹으로 무작위화하였다. 0.5, 0.1 및 0.05 mg/㎏의 TMCB132 또는 0.5 mg/㎏의 nullxCD3B219 항체 대조군을 4주 동안 매주 2회 IP 투여하였다. 종양 이식 후 일수 45에, 그룹당 적어도 7마리의 동물이 남아 있을 때, 종양 부피에 의해 결정된 바와 같이 종양 성장 억제(% TGI)를 계산하였다. NullxCD3 대조군과 비교하여, 0.5 및 0.1 mg/㎏ 및 0.05 mg/㎏의 TMCB132에서 통계적으로 유의한 종양 성장 억제가 관찰되었다(도 9, p≤ 0.0001). 0.5, 0.1 및 0.05 mg/㎏의 TMCB132는 nullxCD3 처리된 대조군과 비교하여 각각 102%, 109% 및 47%의 종양 성장 억제를 유도하였다. TMCB132 처리는 각각 0.5, 0.1 및 0.05 mg/㎏에서 3개, 2개 및 1개의 완전한 반응을 야기하였다.
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. PHILIP COOPER ROBIN ERNST RAJKUMAR GANESAN COLLEEN KANE MICHAEL RUSSELL SANJAYA SINGH SATHADEVI VENKATARAMANI SHENG-JIUN WU <120> MONOSPECIFIC AND MULTISPECIFC ANTI-TMEFF2 ANTIBODIES AND THEIR USES <130> JBI5160WOPCT1 <140> Unknown <141> Herewith <150> 62/675,957 <151> 2018-05-24 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Leu Trp Glu Ser Pro Arg Gln Cys Ser Ser Trp Thr Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Phe Cys Trp Leu Leu Leu Leu Pro Val Met Leu Leu Ile Val 20 25 30 Ala Arg Pro Val Lys Leu Ala Ala Phe Pro Thr Ser Leu Ser Asp Cys 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Gly Trp Asn Cys Ser Gly Tyr Asp Asp Arg Glu Asn 50 55 60 Asp Leu Phe Leu Cys Asp Thr Asn Thr Cys Lys Phe Asp Gly Glu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Gly Asp Thr Val Thr Cys Val Cys Gln Phe Lys Cys Asn 85 90 95 Asn Asp Tyr Val Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Glu Ser Tyr Gln Asn 100 105 110 Glu Cys Tyr Leu Arg Gln Ala Ala Cys Lys Gln Gln Ser Glu Ile Leu 115 120 125 Val Val Ser Glu Gly Ser Cys Ala 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Gly Ile Ile Pro Ile Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Val Ile Ser Gly Gly Gly Ser Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Met Pro Leu Asn Ser Pro His Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Asp Gly Tyr Ser Ser Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Met Pro Leu Asn Ser Pro His Asp Cys 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Arg 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ala Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr 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<400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Asn Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn 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gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact acgccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 43 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgtttcc acatactacc tggcgtggta tcagcagaaa 120 ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttac ggtgcctcct atcgcgcgac cggcattccg 180 gatcgcttta gcggcagcgg ttccggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa 240 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtacggtc acagcccgat tacttttggc 300 cagggcacca aagtggaaat caaa 324 <210> 44 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 gccatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcagg aacgacctgg gctggtacca 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aacatacgca tttgactatt ggggccaggg caccctggtg 360 accgtgtcga gtgcttccac caagggccca tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420 agcacctccg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600 ggcacgaaaa cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccatgcc cagcacctga ggccgccggg 720 ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac 840 tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg 1260 tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaa 1353 <210> 48 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 gaagtgcagc tgctggagag cggaggagga ctggtgcagc ctcctggcgg aagcctgaga 60 ctgagctgcg ccgctagcgg cttcaccttc agcagctaca gcatgagctg ggtgagacag 120 gctcctggca agggcctgga gtgggtgagc gtgatcagcg gcggaggcag ctttaccagc 180 tacgccgaca gcgtgaaggg caggttcacc atcagcaggg acaacagcaa caacaccctg 240 tacctgcaga tgagcagcct gagggccgag gacaccgcct tctactactg cgccaggatg 300 cccctgaaca gcccccatga ctgctgggga cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgct 360 tccaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaaaacctac 600 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660 tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc 720 ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320 tccctgtctc tgggtaaa 1338 <210> 49 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 gccatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcaga aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact acgccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 50 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 50 gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgtttcc acatactacc tggcgtggta tcagcagaaa 120 ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttac ggtgcctcct atcgcgcgac cggcattccg 180 gatcgcttta gcggcagcgg ttccggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa 240 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtacggtc acagcccgat tacttttggc 300 cagggcacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 51 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 gccatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcagg aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact acagcctgac cttcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcag gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 52 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgttgcc acctattatc ttgcgtggta tcagcagaaa 120 ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttac ggtgcatcct cccgtgcgac cggcattccg 180 gatcgcttta gcggcagcgg ttccggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa 240 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtacggct ataacccaat tacctttggc 300 cagggcacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 53 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asp Ala Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Lys Asp Tyr Ser Val 1 5 10 15 Leu <210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Leu Tyr Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 1 5 <210> 66 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 67 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Val Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Thr Leu Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Arg Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Phe Asn Asn 20 25 30 Asn Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Leu Tyr Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Val Asn Pro Asp Thr Ser Arg Asn 65 70 75 80 Gln Phe Thr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Leu 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His 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ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360 gtgaccgtgt catctgcttc caccaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 420 aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600 ttgggcacga aaacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660 aagagagttg agtccaaata tggtccccca tgcccaccat gcccagcacc tgaggccgcc 720 gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 840 aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcctc ctctacagca agctaaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1356 <210> 81 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 cagaccgtcg tgacccagga acctagcctg accgtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60 acctgcagat cttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120 aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180 cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240 cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300 ggcggaggca ccaagctgac agtgctgggt cagcccaagg ctgcacccag tgtcactctg 360 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420 gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggccg atagcagccc cgtcaaggcg 480 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 540 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 645 <210> 82 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 82 caggtgcagc tgcagcagtc tggccctaga ctcgtgcggc cttcccagac cctgtctctg 60 acctgtgcca tctccggcga ctccgtgttc aacaacaacg ccgcctggtc ctggatccgg 120 cagagccctt ctagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggctg 180 tacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccgtga accctgacac ctcccggaac 240 cagttcaccc tgcagctgaa ctccgtgacc cctgaggaca ccgccctgta ctactgcgcc 300 agaggctact cctcctcctt cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360 gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaaaacc 600 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660 aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagg ccgccggggg accatcagtc 720 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcctcctcta cagcaagcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260 aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320 ctctccctgt ctctgggtaa a 1341 <210> 83 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 cagtctgctc tgacccagcc 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 89 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg 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gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca atagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggatgccc 300 ctgaacagcc ctcacgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc cagc 354 <210> 96 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 96 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcaga aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact accccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 97 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 97 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggaggaag cctgagactc 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacagca tgagctgggt caggcaggcc 120 cctggcaaag gactggagtg ggtgagcgtg attagcggca gcggcggctt caccgattac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca atagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggatgccc 300 ctgaacagcc ctcacgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc cagcgcttcc 360 accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa aacctacact 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660 ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gaggccgccg ggggaccatc agtcttcctg 720 ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780 gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca gatggcagga ggggaatgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320 ctgtctctgg gtaaa 1335 <210> 98 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 98 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcaga aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact accccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 99 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 99 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggaggaag cctgagactc 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacagca tgagctgggt caggcaggcc 120 cctggcaaag gactggagtg ggtgagcgtg attagcggca gcggcggctt caccgattac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca atagcaagaa caccctgtac 240 ctgcacatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggatgccc 300 ctgaacagcc ctcacgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc cagc 354 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 gccatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcaga aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact accccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 101 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 gaggtgcagc tgctggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggaggaag cctgagactc 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacagca tgagctgggt caggcaggcc 120 cctggcaaag gactggagtg ggtgagcgtg attagcggca gcggcggctt caccgattac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca atagcaagaa caccctgtac 240 ctgcacatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggatgccc 300 ctgaacagcc ctcacgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc cagcgcttcc 360 accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa aacctacact 600 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660 ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gaggccgccg ggggaccatc agtcttcctg 720 ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780 gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca gatggcagga ggggaatgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320 ctgtctctgg gtaaa 1335 <210> 102 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 102 gccatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggcga cagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcca gggcatcaga aacgacctgg gctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgcagagcgg agtgcctagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag gactacaact accccctgac attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 103 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 104 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 104 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 105 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtggcccgg atcagaagca agtacaacaa ttacgccacc 180 tactacgccg cctccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacgacag caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360 gtgaccgtgt catct 375 <210> 106 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 cagaccgtcg tgacccagga acctagcctg accgtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60 acctgcagat cttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcagcag 120 aagccaggcc aggctcccag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180 cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgtg 240 cagcctgaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300 ggcggaggca ccaagctgac agtgctg 327 <210> 107 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 107 caggtgcagc tgcagcagtc tggccctaga ctcgtgcggc cttcccagac cctgtctctg 60 acctgtgcca tctccggcga ctccgtgttc aacaacaacg ccgcctggtc ctggatccgg 120 cagagccctt ctagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggctg 180 tacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccgtga accctgacac ctcccggaac 240 cagttcaccc tgcagctgaa ctccgtgacc cctgaggaca ccgccctgta ctactgcgcc 300 agaggctact cctcctcctt cgactattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtcctct 360 <210> 108 <211> 329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 108 agtctgctct gacccagcct gcctccgtgt ctggctctcc cggccagtcc atcaccatca 60 gctgtaccgg cacctcctcc aacatcggca cctacaagtt cgtgtcctgg tatcagcagc 120 accccgacaa ggcccccaaa gtgctgctgt acgaggtgtc caagcggccc tctggcgtgt 180 cctccagatt ctccggctcc aagtctggca acaccgcctc cctgaccatc agcggactgc 240 aggctgagga ccaggccgac taccactgtg tgtcctacgc tggctctggc accctgctgt 300 ttggcggagg caccaagctg accgtgctg 329 <210> 109 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 110 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Asn Thr Thr Thr Thr Thr Lys Ser Glu Asp Gly His Tyr Ala Arg Thr 1 5 10 15 Asp Tyr Ala Glu Asn Ala Asn Lys Leu Glu Glu Ser Ala Arg Glu His 20 25 30 His Ile Pro Cys Pro Glu His Tyr Asn Gly Phe Cys Met His Gly Lys 35 40 45 Cys Glu His Ser Ile Asn Met Gln Glu Pro Ser Cys Arg Cys Asp Ala 50 55 60 Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Lys Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 65 70 75 80 Val Val Pro Gly Pro Val Arg Phe Gln Tyr Val 85 90 <210> 111 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 112 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 112 His His His His His His 1 5

Claims (79)

  1. TMEFF2의 서열 번호 110의 막 근위 영역에 결합하는 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    a) 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL;
    c) 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL;
    d) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL;
    e) 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 또는
    f) 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 상기 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57) 또는 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내에서 TMEFF2의 상기 막 근위 영역에 결합하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22;
    b) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23;
    c) 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24;
    d) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22; 또는
    e) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.4 × 10-9 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 상기 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정되는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 TMEFF2의 상기 막 근위 영역에 결합하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VH3_3-23(서열 번호 53) 또는 VH1_1-69(서열 번호 54)로부터 유래된 중쇄 가변 영역(VH) 프레임워크를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, VKI_L11(서열 번호 55) 또는 VKIIII_A27(서열 번호 56)로부터 유래된 경쇄 가변 영역(VL) 프레임워크를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    a) 각각 VH3_3-23(서열 번호 53) 및 VKI_L11(서열 번호 55);
    b) 각각 VH1_1-69(서열 번호 54) 및 VKIII_A27(서열 번호 56); 또는
    c) 각각 VH1_1-69(서열 번호 54) 및 VKI_L11(서열 번호 55)로부터 유래된 VH 프레임워크 및 VL 프레임워크를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL;
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL;
    c) 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL;
    d) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL;
    e) 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 또는
    f) 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형(isotype)인, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서,
    a) 서열 번호 32의 중쇄(HC) 및 서열 번호 35의 경쇄(LC);
    b) 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 36의 LC;
    c) 서열 번호 34의 HC 및 서열 번호 37의 LC;
    d) 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 38의 LC;
    e) 서열 번호 91의 HC 및 서열 번호 92의 LC; 또는
    f) 서열 번호 93의 HC 및 서열 번호 94의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. a) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 32의 HC 및 서열 번호 35의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. a) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 36의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. a) 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 34의 HC 및 서열 번호 37의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. a) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 33의 HC 및 서열 번호 38의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. a) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 91의 HC 및 서열 번호 92의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. a) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    b) 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL; 및/또는
    c) 서열 번호 93의 HC 및 서열 번호 94의 LC를 포함하는, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중특이성 항체인, 단리된 항-TMEFF2 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이성 항체인, 단리된 항-TMEFF2 항체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 항체는 CD3, 선택적으로 CD3 입실론(epsilon)에 결합하는, 단리된 항-TMEFF2 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 이종성 분자에 접합된, 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. a) 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하거나;
    b) 서열 번호 25, 26, 27, 87 또는 89의 항-TMEFF2 항체 VH 및/또는 서열 번호 28, 29, 30, 31, 88 또는 90의 VL을 인코딩하거나;
    c) 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 또는 102의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  26. 제25항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 항체가 발현되는 조건에서 제26항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제22항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 TMEFF2 양성 암은 전립선암인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 전립선암은 재발성, 불응성, 악성 또는 거세저항성(castration resistant) 전립선암, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TMEFF2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제2 치료제와 병용하여 투여하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제2 치료제는 수술, 화학요법, 안드로겐 박탈 요법 또는 방사선, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  33. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체에 결합하는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체.
  34. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 키트.
  35. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체는 TMEFF2의 서열 번호 110의 막 근위 영역에 결합하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제35항 또는 제36 항에 있어서, 상기 항체는,
    a) 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL;
    c) 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL;
    d) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL;
    e) 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 또는
    f) 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는 참조 항체와 TMEFF2의 막 근위 영역에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 잔기 HGKCEHSINMQEPSC(서열 번호 57) 또는 DAGYTGQHCEKKDYSVL(서열 번호 58) 내에서 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 약 0.4 × 10-9 M 이하의 해리 상수(KD)로 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하고, 여기서 KD는 실온에서 pH 4.5 내지 5.0에서 아세테이트 완충액에서의 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정되는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체는 약 0.1 × 10-10 M 내지 약 0.4 × 10-9 M의 KD로 인간 TMEFF2의 막 근위 영역에 결합하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은
    a) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22;
    b) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23;
    c) 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24;
    d) 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22; 또는
    e) 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제2 도메인은
    a) 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65; 또는
    b) 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 도메인은
    a) 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL;
    b) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL;
    c) 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL;
    d) 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL;
    e) 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL; 또는
    f) 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인은
    a) 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL; 또는
    b) 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  45. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 제1 중쇄(HC1), 서열 번호 35의 제1 경쇄(LC1), 서열 번호 76의 제2 중쇄(HC2) 및 서열 번호 77의 제2 경쇄(LC2)를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  46. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 25의 VH 및 서열 번호 28의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 32의 HC1, 서열 번호 35의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  47. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  48. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 19, 21 및 23의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 36의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  49. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  50. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 14, 17, 18, 20 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 27의 VH 및 서열 번호 30의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 34의 HC1, 서열 번호 37의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  51. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  52. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 11, 13, 16, 18, 20 및 22의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 26의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 33의 HC1, 서열 번호 38의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  53. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  54. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 87의 VH 및 서열 번호 88의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 91의 HC1, 서열 번호 92의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  55. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 60, 61, 62, 63, 64 및 65의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 66의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 76의 HC2 및 서열 번호 77의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  56. TMEFF2에 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
    a) 상기 제1 도메인이 각각 서열 번호 10, 12, 15, 18, 20 및 86의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 제2 도메인이 각각 서열 번호 68, 69, 70, 71, 72 및 73의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고/하거나;
    b) 상기 제1 도메인이 서열 번호 89의 VH 및 서열 번호 90의 VL을 포함하며, 상기 제2 도메인이 서열 번호 74의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함하고/하거나;
    c) 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 93의 HC1, 서열 번호 94의 LC1, 서열 번호 78의 HC2 및 서열 번호 79의 LC2를 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  57. 제35항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형인, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  58. 제35항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HC1 내, HC2 내, 또는 HC1 및 HC2 내 위치 234에서 알라닌, 위치 235에서 알라닌, 또는 위치 234에서 알라닌 및 위치 235에서 알라닌을 포함하고, 잔기 넘버링은 EU 넘버링을 따르는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  59. 제35항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HC1 내 및 HC2 내 위치 228에서 프롤린을 포함하고, 잔기 넘버링은 EU 넘버링을 따르는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  60. 제35항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HC1 내 위치 405에서 페닐알라닌 및 위치 409에서 아르기닌을, 그리고 HC2 내 위치 405에서 류신 및 위치 409에서 라이신을 포함하는, 단리된 이중특이성 항-TMEFF2 × CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  61. 제35항 내지 제60항 중 어느 한 항의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  62. a) 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하거나
    b) 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 80, 81, 82, 83, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 및 102의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  63. 제62항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  64. 제63항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  65. 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 상기 항체가 발현되는 조건에서 제64항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서,
    a) 2개의 동일한 HC1 및 2개의 동일한 LC1을 갖는 단일특이성 2가 TMEFF2 항체와, 2개의 동일한 HC2 및 2개의 동일한 LC2를 갖는 단일특이성 2가 CD3 항체를 약 1:1 몰비의 혼합물로 조합하는 단계;
    b) 상기 혼합물 내로 환원제를 도입하는 단계;
    c) 상기 혼합물을 약 90분 내지 약 6시간 인큐베이션하는 단계;
    d) 상기 환원제를 제거하는 단계; 및
    e) HC1, LC1, HC2 및 LC2를 포함하는 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 환원제는 2-메르캅토에탄올아민(2-MEA)인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 2-MEA가 약 25 mM 내지 약 75 mM의 농도로 존재하는, 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션하는 단계는 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  70. TMEFF2 양성 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TMEFF2 양성 암을 치료하는 방법으로서, 제45항 내지 제60항 중 어느 한 항의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제61항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 TMEFF2 양성 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 TMEFF2 양성 암은 전립선암인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 전립선암은 재발성, 불응성, 악성 또는 거세저항성 전립선암, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제2 치료제와 병용하여 투여하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제2 치료제는 수술, 화학요법, 안드로겐 박탈 요법 또는 방사선, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  75. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체.
  76. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 키트.
  77. 요법에 사용하기 위한 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  78. TMEFF2 양성 암의 치료에 사용하기 위한, 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  79. TMEFF2 양성 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제45항 내지 제60항 중 어느 한 항의 단리된 이중특이성 항-TMEFF2/항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
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