BR112020023416A2 - anticorpos anti-tmeff2 monoespecíficos e multiespecíficos e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos anti-TMEFF2 monoespecíficos e multiespecíficos, e métodos de produção e uso dos anticorpos descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-TMEFF2 MONOESPECÍFICOS E MULTIESPECÍFI- COS E SEUS USOS".

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e está no presente documento incorporada a título de referência, em sua totalidade. A dita cópia em formato ASCII, criada em 31 de janeiro de 2019, foi nomeada como JBIS160WOPCT1 SL.txt e tem tamanho de 144.156 bytes.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A presente invenção no presente documento fornecida se refere a anticorpos anti- TMEFF2 monoespecíficos e multiespecíficos, e métodos de produção e uso dos anticorpos descritos.

ANTECEDENTES

[0003] O câncer de próstata é o segundo tipo de câncer mais co- mum em homens em todo o mundo, e a sexta causa principal de morte relacionada ao câncer. Globalmente, há aproximadamente 1.100.000 novos casos e 300.000 mortes por ano, compreendendo 4% de todas as mortes por câncer. Estima-se que 1 em cada 6 homens será diag- nosticado com a doença durante sua vida. O risco de câncer de prós- tata está fortemente correlacionado com a idade: cerca de três quartos dos casos ocorrem em homens com mais de 65 anos de idade, com o maior número de casos naqueles com idade entre 70 e 74 anos. Esti- ma-se, a partir de dados post mortem, que cerca da metade dos ho- mens com idade entre 50 e 60 anos e 80% dos homens com 80 anos tenham evidências histológicas de câncer na próstata. Nos estágios iniciais, a taxa de sobrevida de 5 anos é próxima de 100%. Quando o câncer tem metástase, entretanto, a taxa de sobrevida de 5 anos cai para 28%, e portanto permanece a necessidade de tratamentos efica- zes para câncer de próstata de estágio avançado.

[0004] A terapia de privação androgênica testicular geralmente re- sulta em estabilização ou regressão da doença (em 80% dos pacien- tes). Os tratamentos atuais para câncer de próstata incluem cirurgia, radioterapia e terapias hormonais. Tipicamente, a vacina contra o cân- cer sipuleucel-T, um agente radiofarmacêutico (como cloreto de rádio- 223), terapias hormonais secundárias (como abiraterona ou enzaluta- mida) e/ou quimioterapias (docetaxel e cabazitaxel) são adicionados em sequência à terapia hormonal. Embora cada um destes tratamen- tos possa atrasar o crescimento do câncer por vários meses e aliviar sintomas produzidos pela doença, o avanço do câncer de próstata me- tastático eventualmente ocorre. Quando o câncer de próstata cresce apesar da redução dos níveis de testosterona por terapia hormonal, as opções de tratamento se tornam limitadas.

[0005] Portanto, existe uma necessidade de desenvolver terapias adicionais para tratar câncer de próstata.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção fornece um anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a uma região proximal à membrana da SEQ ID NO: 110 de TMEFF?2.

[0007] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação à região proximal à membrana de TMEFF2 com um anticorpo de refe- rência que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29, a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, a VH da SEQID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31, a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, ou a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

[0008] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma região proximal à membrana de TMEFF2, sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga nos resíduos HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) ou DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58) à região proximal à membrana de TMEFF?2.

[0009] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado que tem certas sequências de região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada e cadeia leve como descrito no presen- te documento.

[0010] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado que tem certas sequências de região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve como descrito no presente documento.

[0011] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado que tem certas sequências de cadeia pesada e cadeia leve como descrito no presente documento.

[0012] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, res- pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 32 e uma LC da SEQ ID NO: 35.

[0013] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, res-

pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 36.

[0014] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, res- pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 34 e uma LC da SEQ ID NO: 37.

[0015] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, res- pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 38.

[0016] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, res- pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 91 e uma LC da SEQ ID NO: 92.

[0017] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende: uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, res- pectivamente; uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90; e/ou uma HC da SEQ ID NO: 93 e uma LC da SEQ ID NO: 94.

[0018] A invenção fornece também composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo anti-TMEFF2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0019] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo anti-TMEFF2 ou o fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo da invenção, que codifica a VH do anticorpo anti- TMEFF?2 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 87 ou 89 e/ou a VL das SEQ ID NOs: 28, 29, 30, 31, 88 ou 90, ou que compreende uma sequência de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 ou 102.

[0020] A invenção fornece também um vetor que compreende o polinucleotídeo da invenção.

[0021] A invenção fornece também uma célula hospedeira que compreende o vetor da invenção.

[0022] A invenção fornece também um método de produção do anticorpo anti-TMEFF2 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar a célula hospedeira em condições nas quais o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antíge- no é expresso, e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0023] A invenção fornece também um método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou do frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção para tratar o câncer positivo para TMEFF?2.

[0024] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção.

[0025] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0026] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3.

[0027] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o anti- corpo se liga a uma região proximal à membrana da SEQ ID NO: 110 de TMEFF2.

[0028] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo compete pela ligação à região pro- ximal à membrana de TMEFF2 com um anticorpo de referência que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29, a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ

ID NO: 31, a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, ou a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90.

[0029] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo se liga a um epítopo da SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 58 no TMEFF2.

[0030] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 32, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 35, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

[0031] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 32, uma LC1 da SEQ ID NO: 35, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0032] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0033] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2,

uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0034] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0035] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao

TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0036] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0037] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/

anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0038] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID

NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0039] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0040] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag-

mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0041] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0042] A invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo biespecífico anti-TMEFF2/anti-CD3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0043] A invenção fornece também um polinucleotídeo que codifi- ca o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção.

[0044] A invenção fornece também um método de produção de um anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico, que compreender fazer a cultura da célula hospedeira da invenção em condições nas quais o anticorpo é expresso, recuperar e purificar o anticorpo anti-TMEFF2/

anti-CD3 biespecífico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo produzido pela célula hospedeira.

[0045] A invenção fornece também um método de produção do anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou do fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, que compreende: combinar um anticorpo monoespecífico bivalente para TMEFF?2 tendo duas HC1 idênticas e duas LC1 idênticas, e um anti- corpo monoespeciífico bivalente para CD3 tendo duas HC2 idênticas e duas LC2 idênticas em uma mistura com razão molar de cerca de 1:1; introduzir um agente redutor na mistura; incubar a mistura por cerca de noventa minutos a cerca de seis horas; remover o agente redutor; e purificar o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende a HC1, a LC1, a HC2 e a LO2.

[0046] A invenção fornece também um método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, ou da composição farmacêutica da invenção, para tratar o câncer positivo para TMEFF2.

[0047] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga ao anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou ao fragmen- to de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

[0048] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0049] A Figura 1 mostra o alinhamento das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-TMEFF2 selecionado. As regiões VH são identificadas por sua SEQ ID NO: no início de cada fileira.

[0050] A Figura 2 mostra o alinhamento de regiões variáveis de cadeia leve (VL) do anticorpo anti-TMEFF2 selecionado. As regiões VH são identificadas por sua SEQ ID NO: no início de cada fileira.

[0051] A Figura 3 mostra o extermínio de células LnCaP ao longo do tempo como medido pelo aumento da atividade de caspase 3/7 por anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos selecionados.

[0052] A Figura 4 mostra a redução do volume médio do tumor ao longo do tempo após o implante do tumor, por anticorpos anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecíficos selecionados em um modelo de câncer de prós- tata LnCaP ex vivo em camundongos machos NGS.

[0053] A Figura 5A mostra a redução no volume médio do tumor de cada camundongo tratado com 0,5 mg/kg de TMCB93 em um mo- delo de câncer de próstata LnCaP ex vivo em camundongos machos NGS.

[0054] A Figura 5B mostra a redução no volume médio do tumor de cada camundongo tratado com 0,5 mg/kg de TMCB132 em um mo- delo de câncer de próstata LnCaP ex vivo em camundongos machos NGS.

[0055] A Figura 6 mostra a eficácia de TMEB762xCD3B376 em xenoenxertos LNCaP estabelecidos em camundongos NSG humani- zados com células T.

[0056] A Figura 7 mostra a ativação de células T em células de câncer de próstata LnCaP em resposta à administração de TMCB132.

[0057] A Figura 8 mostra a citotoxicidade mediada por células de T de TMCB132.

[0058] A Figura 9 mostra a eficácia antitumoral de TMCB132 em camundongos humanizados com células T.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0059] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, patentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão no presente documento incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.

[0060] Deve-se entender que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de apenas descrever modalidades particula- res e não pretende ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, como comumente compreendido pelo versa- do na técnica à qual a invenção pertence.

[0061] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles no presente documento descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos no presente documento materiais e métodos exemplificadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usa- da.

[0062] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "um", "o" e "a" incluem refe- rências no plural a menos que o teor claramente determine de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células, e similares.

[0063] A menos que o contexto exija claramente de outro modo, ao longo da descrição e das reivindicações, as palavras "compreen- de(m)", "que compreende(m)", e similares devem ser interpretadas em um sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo ou exaustivo; ou seja, no sentido de "incluindo, mas não se limitando a".

[0064] Os termos "ligação específica", "se liga especificamente", "que se liga especificamente" ou "se liga" se referem a um anticorpo que se liga a um antígeno ou a um epítopo no antígeno com maior afi-

nidade que a outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo se liga a um antígeno ou ao epítopo no antígeno com uma constante de dissocia- ção de equilíbrio (Kp) de cerca de 5 x 10º M ou menos, por exemplo cerca de 1 x 10º M ou menos, cerca de 1 x 10º M ou menos, cerca de 1 x 10º M ou menos, ou cerca de 1 x 10? M ou menos, tipicamen- te com a Kp que é ao menos cem vezes menor que sua Kp para liga- ção a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). À constante de dissociação pode ser medida com o uso de protocolos no presente documento descritos. Anticorpos que se ligam ao antígeno ou ao epítopo no antígeno podem, no entanto, apresentar reatividade cru- zada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogas), como humanos ou maca- cos, por exemplo Macaca fascicularis (cinomolgo) ou Pan troglodytes (chimpanzé). Enquanto um anticorpo monoespeciífico se liga a um an- tígeno ou a um epítopo, um anticorpo biespecífico se liga a dois antí- genos diferentes ou dois epítopos distintos.

[0065] O termo "anticorpos" tem um sentido amplo e inclui molécu- las de imunoglobulina que incluem anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, humanizados e quiméri- cos, fragmentos de ligação ao antígeno, anticorpos multiespecíficos, como anticorpos biespeciíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, etc., diméricos, tetraméricos ou multiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação ao antígeno da especificidade necessária. Os "anticorpos de comprimento total" são compreendidos de duas cadeias pesadas (HC) e duas ca- deias leves (LC) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como por multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (compreendida dos domínios CH1,

dobradiça CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma re- gião variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regi- ões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de com- plementaridade (CDR), intercaladas com regiões do framework ou ar- cabouço (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro seg- mentos de FR, dispostos do terminal amino para carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FRA4.

[0066] As "regiões determinantes de complementaridade (CDR)" são as regiões do anticorpo que se ligam a um antígeno. As CDRs po- dem ser definidas com o uso de várias delineações como Kabat (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Insti- tutes of Health, Bethesda, Md., EUA, 1991), Chothia (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17), IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77) e ADM (Martin and Thornton (1996) J Bmol Biol 263: 800-15). A correspondência entre as várias delineações e a nu- meração de região variável são descritas (consulte, por exemplo, Le- franc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77; Honegger and Pluckthun, (2001) J Mol Biol 309:657-70; base de dados do Internatio- nal ImMunoGeneTics (IMGT); recursos da Web, www. imgt.org). Pro- gramas disponíveis como abYsis junto à UCL Business PLC podem ser utilizados para delinear as CDRs. Os termos "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" e "LCDR3", como usados no presente documento, incluem as CDRs definidas por qualquer um den- tre os métodos descritos acima, Kabat, Chothia, IMGT ou IMGT, a me- nos que explicitamente indicado de outro modo no relatório descritivo.

[0067] As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, I1gD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequên- cia de aminoácidos de domínio constante da cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, 1gG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distin- tos, a saber, kappa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0068] "Fragmento de ligação ao antígeno" se refere a uma porção de uma molécula de imunoglobulina que se liga a um antígeno. Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser polipeptídeos sintéticos obteníveis enzimaticamente ou manipulados geneticamente e incluem a VH, a VL, a VH e a VL, Fab, F(ab')2, e fragmentos de Fd e Fv, anti- corpos de domínio (dAb) consistindo em um domínio VH ou um domí- nio VL, domínios variáveis de IINAR de tubarão, domínios VH cameli- zados, unidades mínimas de reconhecimento consistindo nos resíduos de aminoácido que mimetizam as CDRs de um anticorpo, como as porções de FR3-CDR3-FRA4, a HCDR1, a HCDR2 e/ou the HCDR3 e a LCDR1, a LCDR2 e/ou a LCDR3. Os domínios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domínios VH/VL podem empare- lhar de forma intramolecular ou intermolecular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos separados de anticor- po de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno mono- valente, como a cadeia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, nas publicações de patente internacionais nº. WO1998/ 44001, WO1988/01649, WO1994/13804 e WO1992/01047.

[0069] "Anticorpo monoclional" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de moléculas de anticorpo, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a po- pulação são idênticos exceto quanto a possíveis alterações bem co- nhecidas, como remoção de lisina da terminação C da cadeia pesada do anticorpo ou modificações pós-traducionais como isomerização ou desamidação de aminoácidos, oxidação de metionina, ou dsamidação de asparagina ou glutamina. Os anticorpos monoclonais tipicamente se ligam a um epítopo antigênico. Os anticorpos monoclonais biespecí- ficos se ligam a dois epítopos antigênicos diferentes. Os anticorpos monoclonais podem ter glicosilação heterogênea dentro da população de anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser monoespecífico ou multiespecífico, como biespecífico, monovalente, bivalente ou multiva- lente.

[0070] "Isolado" se refere a uma população homogênea de molé- culas (como polinucleotídeos sintéticos ou uma proteína como um an- ticorpo) que foram substancialmente separadas e/ou purificadas na direção contrária a outros componentes do sistema que as moléculas são produzidas, como uma célula recombinante, bem como uma prote- ína que foi submetida a ao menos uma etapa de purificação ou isola- mento. "Anticorpo isolado" se refere a um anticorpo que é substanci- almente isento de outro material celular e/ou produtos químicos e abrange anticorpos que são isolados a uma pureza mais alta, como 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de pureza.

[0071] "Anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo no qual ao menos uma CDR é derivada de espécies não humanas, e ao me- nos um framework ("estrutura") é derivado das sequências de imuno- globulinas humanas. O anticorpo humanizado pode incluir substitui- ções nos frameworks de modo que os frameworks podem não ser có- pias exatas da imunoglobulina humana expressa ou das sequências gênicas da linhagem germinativa da imunoglobulina humana.

[0072] "Anticorpo humano" se refere a um anticorpo que é otimi- zado para ter o mínimo de resposta imunológica quando administrado a um indivíduo humano. Regiões variáveis de anticorpos humanos são derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Se o anticorpo humano tiver uma região constante ou uma porção da região constan- te, a região constante também é derivada das sequências de imuno- globulina humana. O anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve que são "derivadas de" sequências de origem humana se as regiões variáveis do anticorpo humano são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana ou da imunoglobulina com rearranjo. Esses sis- temas exemplificadores são bibliotecas de genes de imunoglobulina humana, exibidas em fago, e animais transgênicos não humanos, co- mo camundongos ou ratos, carregando /oci de imunoglobulina huma- na. "Anticorpo humano" tipicamente contém diferenças de aminoácidos em comparação com as imunoglobulinas expressas em seres huma- nos devido às diferenças entre os sistemas usados para obter o anti- corpo humano e /loci de imunoglobulina humana, introdução de muta- ções somáticas ou introdução intencional de substituições nos fra- meworks ou nas CDRs, ou em ambos. Tipicamente, "anticorpo huma- no" é ao menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoáci- dos codificada por genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana ou de imunoglobulina com rearranjo. Em alguns casos, "anti- corpo humano" pode conter sequências de consenso do arcabouço derivadas da análise da sequência do arcabouço humano, por exem- plo, como descrito em Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86, HCDRS3 sintético incorporado a bibliotecas de gene da imunoglobulina humana expresso em fago, por exemplo, como descrito em Shiet al., (2010) J Mol Biol 397:385-96, e na publicação internacional de patente nº WO2009/085462.

[0073] Anticorpos nos quais ao menos uma CDR é derivada de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anticorpo humano".

[0074] O termo "recombinante" se refere a DNA, a anticorpos e a outras proteínas que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes quando segmentos de diferentes fontes são unidos para produzir DNA, anticorpos ou proteínas recombinantes.

[0075] "Epítopo" se refere a uma porção de um antígeno a qual um anticorpo se liga especificamente. Os epítopos tipicamente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos (como polares, não polares ou hidrofóbicos) de porções como aminoácidos ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tri- dimensionais específicas, bem como características de carga específi- cas. Um epítopo pode ser composto por aminoácidos contíguos ou descontíguos que formam uma unidade espacial conformacional. Para um epítopo não contíguo, aminoácidos de porções diferentes da se- quência linear do antígeno ficam em estreita proximidade no espaço tridimensional por meio do enovelamento da molécula de proteína.

[0076] "Biespecífico" se refere a um anticorpo que se liga especifi- camente a dois antígenos distintos ou a dois epítopos distintos dentro do mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cru- zada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como humanos ou maca- cos, por exemplo, Macaca cynomolgus (cinomolgo, cino) ou Pan tro- glodytes ou pode se ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.

[0077] "Multiespecífico" se refere a um anticorpo que se liga espe- cificamente a dois ou mais antígenos distintos ou a dois ou mais epíto- pos distintos no mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como huma- nos ou macacos, por exemplo, Macaca cynomolgus (cinomolgo, cino)

ou Pan troglodytes, ou pode se ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.

[0078] "Variante" se refere a um polipeptídeo ou um polinucleotí- deo que difere de um polipeptídeo de referência ou de um polinucleo- tídeo de referência por uma ou mais modificações, por exemplo, uma ou mais substituições, inserções ou deleções.

[0079] "Vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser duplicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido entre tais sis- temas. Polinucleotídeos de vetores contêm tipicamente elementos, como origens de replicação, sinal de poliadenilação ou marcadores de seleção, que funcionam para facilitar a duplicação ou a manutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico, como uma célula, vírus, animal, planta e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotí- deo de vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido dos mesmos, de filamento único ou de filamento duplo.

[0080] "Vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utili- zado em um sistema biológico ou em um sistema biológico reconstituí- do para direcionar a tradução de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo presente no vetor de expressão.

[0081] "Polinucleotídeo" se refere a uma molécula sintética que compreende uma cadeia de nucleotídeos ligada covalentemente por uma cadeia principal de açúcar-fosfato ou outra ligação química covalente equivalente. O cDNA é um polinucleotídeo sintético exemplificador.

[0082] "Polipeptídeo" ou "proteína" se refere a uma molécula que compreende ao menos dois resíduos de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica para formar um polipeptídeo. Pequenos polipeptídeos com menos de 50 aminoácidos podem ser chamados de "peptídeos".

[0083] "TMEFF2" se refere à proteína transmembranar humana com domínio similar a EGF (EGF-like) e dois domínios similares a folis-

tatina, também chamada de tomorregulina 2. A sequência de aminoá- cidos de TMEFF2 humana de comprimento total é mostrada na SEQ ID NO: 1. O domínio extracelular de TMEFF2 é mostrado na SEQ ID NO: 2 e abrange os resíduos 40 a 374 de TMEFF2 de comprimento total. O domínio extracelular de TMEFF2 abriga três subdomínios dis- tintos, o domínio similar a Kazal 1 (Kasal-like 1) (resíduos 85 a 137), similar a Kazal 2 (Kasal-like 2) (resíduos 176 a 229) e o domínio EGF (resíduos 261 a 301). O domínio EGF de TMEFF2 é mostrado na SEQ ID NO: 3. O termo "região proximal à membrana" de TMEFF?2 se refe- re-se região de TMEFF2 da SEQ ID NO: 110, que abrange o domínio EGF e as regiões ligantes N- C-terminal (por exemplo, os resíduos 230 a 320 de TMEFF2 humana de comprimento total da SEQ ID NO: 1). Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de prote- ína da presente invenção se referem à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, exceto quando expli- citamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Dessa forma, "TMEFF2" significa TMEFF2 humana, a menos que es- pecificado como sendo de uma espécie não humana, por exemplo "TMEFF2 de camundongo" ou "TMEFF2 de macaco", etc. SEQ ID NO: 1 (TMEFF2 humana de comprimento total)

MVLWESPRQCSSWTLCEGFCWLLLLPVMLLIVARPVKLAAFPTSLSD CQTPTGWNCSGYDDRENDLFLCDTNTCKFDGECLRIGDTVTCVCQF KCNNDYVPVCGSNGESYQNECYLRQAACKQQSEILVVSEGSCATDA GSGSGDGVHEGSGETSQKETSTCDICQFGAECDEDAEDVWCVCNID CSQTNFNPLCASDGKSYDNACQIKEASCQKQEKIEVMSLGRCQDNTT TTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYNGFCMHGKCE HSINMQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYVLIAAVIG

TIQIAVICVVVLCITRKCPRSNRIHRQKQNTGHYSSDNTTRASTRLI SEQ ID NO: 2 (domínio extracelular de TMEFF2 humana)

FPTSLSDCQTPTGWNCSGYDDRENDLFLCDTNTCKFDGECLRIGDT VTCVCQAQFKCNNDYVPVCGSNGESYQNECYLRQAACKQQSEILVVSE GSCATDAGSGSGDGVHEGSGETSQKETSTCDICQFGAECDEDAED VWCVCNIDCSQATNFNPLCASDGKSYDNACQIKEASCQKQEKIEVMSL GRCQDNTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYN GFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPV RFQYVLIAAVIGTIQIAVICVVVLCITRKCPRSNRIHRQKQNTGHYSSDN

TTRASTRLI domínio EGF de TMEFF2 (SEQ ID NO: 3

HHIPCPEHYNGFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCE região proximal à membrana de TMEFF2 da SEQ ID NO: 110

NTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYNGFCMH GKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYV

[0084] "CD3" se refere a um antígeno que é expresso em células T como parte do complexo de receptores de células T (TOR) e que con- siste em um homodímero ou heterodímero formado a partir da associ- ação de duas ou quatro cadeias de receptores: CD3 épsilon, CD3 del- ta, CD3 zeta e CD3 gama. O CD3 épsilon humano pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteína da presente inven- ção se referem à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, exceto quando explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Dessa forma, "CD3" signifi- ca CD3 humano, a menos que especificado como sendo de uma es- pécie não humana, por exemplo "CD3 de camundongo" ou "CD3 de macaco", etc.

SEQ ID NO: 4 (CD3 épsilon humano)

MOQOSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVI LTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQS GYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICIT GGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVYTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNP

DYEPIRKGQRDLYSGLNQORRI SEQ ID NO: 5 (domínio extracelular de CD3 épsilon humano)

DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDE DDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRAR VCENCMEMD

[0085] "Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico", anticorpo para TMEFF2/CD3, anticorpo para TMEFF2 x CD3 e similares se refe- rem a um anticorpo que se liga a TMEFF2 e CD3.

[0086] . "Em combinação com" significa que duas ou mais terapias são administradas a um indivíduo juntas em uma mistura, simultanea- mente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.

[0087] "Câncer positivo para TMEFF2" se refere a um tecido cance- roso ou a uma célula cancerosa que apresenta nível mensurável de pro- teína TMEFF2. O nível de proteína TMEFF2 pode ser medido com o uso de ensaios bem conhecidos, por exemplo ELISA, imunofluorescência, citometria de fluxo ou radioimunoensaio em células vivas ou lisadas.

[0088] "Amostra" se refere a uma coleção de fluidos, células ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células ou tecidos presentes em um indivíduo. Amostras exemplificadoras são de fluidos biológicos como sangue, soro e fluidos serosos, plasma, lin- fa, urina, saliva, fluido cístico, lágrimas, fezes, escarro, secreções mu- cosas dos tecidos e órgãos secretórios, secreções vaginais, líquidos de ascite, como os associados com tumores não sólidos, fluidos das cavidades pleurais, pericárdicas, peritoneais, abdominais e outras, flui- dos coletados por lavagem brônquica, soluções líquidas em contato com um indivíduo ou fonte biológica, por exemplo, meio de cultura de células e órgãos, incluindo meio condicionado para células ou órgãos, líquidos de lavagem e similares, biópsias de tecidos, aspirações por agulha fina ou tecido tumoral ressecado cirurgicamente.

[0089] Uma "célula de câncer" ou uma "célula tumoral" se refere a uma célula cancerosa, pré-cancerosa ou transformada, in vivo, ex vivo ou em cultura de tecidos, que tem alterações fenotípicas induzidas ou espontâneas. Essas alterações não envolvem necessariamente a absorção de novo material genético. Embora a transformação possa provir de infecção com um vírus transformante e incorporação de novo ácido nucleico genômico, ou absorção de ácido nucleico exógeno, ela pode ocorrer também espontaneamente ou após exposição a um car- cinógeno, causando assim a mutação de um gene endógeno. A trans- formação/o câncer é exemplificada (exemplificado) por alterações mor- fológicas, imortalização de células, controle de crescimento aberrante, formação de focos, proliferação, malignidade, modulação dos teores de marcadores específicos para tumores, invasividade, crescimento tumoral em hospedeiros animais adequados como camundongos nu- de, e similares, in vitro, in vivo, e ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" (3º ed. 1994)).

[0090] "Cerca de" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor específico como determinado pelo versado na técnica, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, as limitações do sistema de medição. Exceto onde explicitamen- te indicado em contrário nos Exemplos ou em outro local do Relatório Descritivo no contexto de um teste específico, um resultado específico ou uma modalidade específica, o termo "cerca de" significa dentro de 1 (um) desvio padrão de acordo com a prática da técnica, ou uma faixa de até 5%, o que for maior.

[0091] "Indivíduo" inclui qualquer ser humano ou animal não- humano. "Animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exem- plo mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ove- lhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. Exce- to onde indicado de outra forma, os termos "paciente" ou "indivíduo"

são usados de forma intercambiável.

[0092] Os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto ao tra- tamento terapêutico como ao profilático ou a medidas preventivas em que o objetivo é prevenir ou reduzir (diminuir) uma alteração ou distúr- bio fisiológico indesejado. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem o alívio dos sintomas, a diminuição da extensão da doença, estabilização do estado de doença (isto é, não piora), atraso ou abran- damento do avanço da doença, melhora ou mitigação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tra- tamento" pode também significar prolongar a sobrevida em compara- ção com a sobrevida esperada se um indivíduo não estava recebendo tratamento. Indivíduos que necessitam de tratamento incluem os que já apresentam a doença ou distúrbio, bem como aqueles propensos a apresentar a condição ou distúrbio ou os indivíduos cuja condição ou distúrbio precisa ser prevenido.

[0093] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se refere uma quan- tidade eficaz, em doses e durante os intervalos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz pode variar dependendo de fatores, como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da habilidade da terapia ou uma combinação de terapias, para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Indicadores exemplificadores de uma terapêutica eficaz ou combinação de agentes terapêuticos que incluem, por exemplo, bem- estar aprimorado do paciente.

[0094] A numeração dos resíduos de aminoácidos na região cons- tante de anticorpo ao longo do relatório descritivo está de acordo com o Índice EU, como descrito em Kabat et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), salvo indicação explicitamente em contrário.

[0095] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras con- vencionais são usados na presente invenção como mostrado na Tabe- la 1.

Tabela 1.

me e Rg ssa fi geme e ser Te pm pe Composições de matéria

[0096] A presente invenção apresenta anticorpos anti-TMEFF2 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpos multiespecií- ficos que compreendem os fragmentos de ligação ao antígeno dos an- ticorpos anti-TMEFF2 da invenção, e anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. A presente inven- ção fornece polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam os anticor- pos da invenção ou ácidos nucleicos complementares dos mesmos, vetores, células hospedeiras e métodos para produzir e usar os mes- mos. Anticorpos anti-TMEFF2

[0097] A expressão de TMEFF2 é significativamente enriquecida em tecido prostático e adenocarcinoma de próstata em relação a ou- tros tecidos normais. TMEFF2 de membrana é retido durante a pro- gressão da doença, servindo como um possível alvo para terapias anti- tumorais. TMEFF2 é conhecido por ser clivado por uma protease, re- sultando em formas solúveis do antígeno. Na presente invenção foram gerados anticorpos dirigidos à região proximal à membrana de TMEFF2 para maximizar a ligação do anticorpo a TMEFF2 de mem- brana e minimizar a possibilidade dos anticorpos resultantes de liga- rem às formas solúveis de TMEFF2.

[0098] A invenção fornece um anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a uma região proximal à membrana da SEQ ID NO: 110 de TMEFF?2. Os anti- corpos anti-TMEFF2 da invenção que se ligam à região proximal à membrana de TMEFF2 não são internalizados pelas células. Sem ater- se a qualquer teoria em particular, pode-se esperar que anticorpos an- ti-TMEFF2 não internalizantes tenham efeito oncogênico aprimorado mediado por funções efetoras de anticorpo resultantes da falta de in- ternalização e degradação de TMEFF2 quando comparado a anticor- pos anti-TMEFF?2 internalizantes.

[0099] "Se liga a uma região proximal à membrana" significa que 90% dos resíduos do epítopo do anticorpo identificados com o uso de troca hidrogênio/deutério (troca H/D) residem na região proximal à membrana de TMEFF2. Os resíduos do epítopo são aqueles que são protegidos pelo anticorpo de teste por ao menos 5% de diferença nos níveis de deuteração através da troca de H/D. Exemplos desses anti- corpos são TMEB675, TMEB570, TMEB674, TMEB565, TMEB762 e TMEB757 como descritos no presente documento.

[0100] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga nos resíduos HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) ou DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58) à região proximal à membrana de TMEFF2. Um anti- corpo anti-TMEFF2 exemplificador que se liga nos resíduos HGK- CEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) é TMEB570. Um anticorpo anti- TMEFF2 exemplificador que se liga nos resíduos DAGYTGQHCEKK- DYSVL (SEQ ID NO: 58) é TMEB675. Espera-se também que varian- tes de TMEB675, TMEB762 e TMEB757 se liguem à região proximal à membrana de TMEFF2 nos resíduos DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58).

[0101] Em um ensaio de troca H/D, o ECD de TMEFF2 expresso por recombinação é incubado na presença ou ausência do anticorpo em água deuterada durante tempos predeterminados resultando na incorporação de deutério em átomos de hidrogênio permutáveis que não estão protegidos pelo anticorpo, seguido de digestão por protease da proteína e análises dos fragmentos peptídicos com o uso de LC- MS. O ensaio de troca H/D pode ser realizado com o uso de protocolos conhecidos. Um protocolo exemplificador é descrito no Exemplo 5.

[0102] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete pela ligação à região proximal à membrana de TMEFF2 com um anti- corpo de referência que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID

NO: 29, a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31, a VH da SEQID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, ou a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

[0103] A competição pela ligação de um anticorpo de teste à regi- ão proximal à membrana de TMEFF2 com o anticorpo de referência pode ser analisada in vitro com o uso de métodos bem conhecidos. Por exemplo, a ligação do anticorpo de teste marcado com éster de NHS MSD Sulfo-Tag'Y à região proximal à membrana de TMEFF2 na presença de um anticorpo de referência não marcado pode ser avalia- da por ELISA, ou análises Biacore ou citometria de fluxo podem ser usadas para demonstrar a competição. O anticorpo de teste compete pela ligação ao TMEFF2 com o anticorpo de referência quando o anti- corpo de teste inibe a ligação do anticorpo de referência à região pro- ximal à membrana de TMEFF2 em 80% ou mais, por exemplo, 85% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais.

[0104] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma região determinante de complementaridade de cadeia pe- sada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente; SEQ ID NOs: 11,13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente; SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente; SEQ ID NOs: 11,13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente.

[0105] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região pro- ximal à membrana de TMEFF2 com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de cerca de 0,4 x 10º M ou menor, em que a Kp é me- dida com o uso de ressonância plasmônica de superfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à temperatura ambiente.

[0106] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região pro- ximal à membrana de TMEFF2 humano com a K p»- entre cerca de 0,1 x 107º M e cerca de 0,4 x 10º M.

[0107] A afinidade de um anticorpo à região proximal à membrana de TMEFF2 pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. Um método exemplificador utiliza instru- mentação ProteOn XPR36, Biacore 3000 ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica. A afini- dade medida de um anticorpo ao TMEFF2 pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e de outros parâmetros de ligação (por exemplo, Ko, Kassociação (Kon), Kdissociação (Kotr)) São tipicamente feitas sob condições padronizadas e com um tampão padronizado, como o tam- pão no presente documento descrito. O versado na técnica vai enten- der que o erro interno das medições de afinidade, por exemplo, usan- do Biacore 3000 ou ProteOn (medido como desvio padrão, DP) pode tipicamente estar dentro de 5-33% para as medições dentro dos limites de detecção típicos. Portanto, o termo "cerca de" quando se refere a um valor de Kp reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico para uma Kp de 1x10º M é de até +0,33x10º M.

[0108] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, que compreende uma estru- tura de região variável de cadeia pesada VH derivada de VH3 3-23 da SEQ ID NO: 53) ou VH1 1-69 (SEQ ID NO: 54).

[0109] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso-

lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, que compreende uma estru- tura de região variável de cadeia leve derivada de VKI L11 (SEQ ID NO: 55) ou VKIIII A27 (SEQ ID NO: 56).

[0110] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, que compreende uma estru- tura de VH e uma estrutura de VL derivadas de VH3 3-23 da SEQ ID NO: 53 e VKI L11 da SEQ ID NO: 55, respectivamente.

[0111] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, que compreende uma estru- tura de VH e uma estrutura de VL derivadas de VH1 1-69 da SEQ ID NO: 54 e VKIII A27 da SEQ ID NO: 56, respectivamente.

[0112] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à região proximal à membrana de TMEFF2, que compreende uma estru- tura de VH e uma estrutura de VL derivadas de VH1 1-69 da SEQ ID NO: 54 e VKI L11 da SEQ ID NO: 55, respectivamente.

[0113] Os anticorpos que compreendem regiões variáveis de ca- deia pesada ou de cadeia leve "derivadas de" uma sequência de estru- tura específica ou de uma linhagem germinativa específica se referem a anticorpos obtidos a partir de um sistema que usa genes de imuno- globulina de linhagem germinativa humana, como de camundongos, ratos ou galinhas transgênicas ou de bibliotecas de apresentação em fago como discutido no presente documento. Um anticorpo contendo sequência de arcabouço específica derivada de sequência de linha- gem germinativa pode conter diferenças de aminoácidos em compara- ção com a sequência que foi derivada, devido, por exemplo, às muta- ções somáticas de ocorrência natural ou substituições intencionais.

[0114] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, res- pectivamente.

[0115] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28.

[0116] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 39 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 42.

[0117] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC da SEQ ID NO: 32 e uma LC da SEQ ID NO: 35.

[0118] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 46 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 49.

[0119] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, res- pectivamente.

[0120] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29.

[0121] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 40 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 43.

[0122] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma

HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 36.

[0123] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 47 e a LC é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 50.

[0124] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, res- pectivamente.

[0125] Em algumas modalidades, o anticorpo antiTMEFF2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30.

[0126] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 41 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 44.

[0127] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC da SEQ ID NO: 34 e uma LC da SEQ ID NO: 37.

[0128] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 48 e a LC é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 51.

[0129] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, res- pectivamente.

[0130] Em algumas modalidades, o anticorpo antiTMEFF2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31.

[0131] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli-

nucleotídeo da SEQ ID NO: 40 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 45.

[0132] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 38.

[0133] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 47 e a LC é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 52.

[0134] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, res- pectivamente.

[0135] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88.

[0136] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 95 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 96.

[0137] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC da SEQ ID NO: 91 e uma LC da SEQ ID NO: 92.

[0138] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 97 e a LC é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 98.

[0139] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, res- pectivamente.

[0140] Em algumas modalidades, o anticorpo antiTMEFF2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90.

[0141] Em algumas modalidades, o VH é codificado por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 99 e a VL é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 100.

[0142] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC da SEQ ID NO: 93 e uma LC da SEQ ID NO: 94.

[0143] Em algumas modalidades, a HC é codificada por um poli- nucleotídeo da SEQ ID NO: 101 e a LC é codificada por um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 102.

[0144] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo mul- tiespecífico.

[0145] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF?2 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo bi- específico.

[0146] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- TMEFF? isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um antígeno de células T.

[0147] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- TMEFF? isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao CD3.

[0148] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- TMEFF? isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao CD3 épsilon.

[0149] As sequências da VH, da VL, da HCDR, da LCDR, da HC e da LC dos anticorpos anti-TMEFF2 exemplificadores da invenção são mostradas nas Tabelas 5 a 12.

[0150] Embora as modalidades ilustradas nos Exemplos compre- endam pares de domínios variáveis, um de uma cadeia pesada e um de uma cadeia leve, um versado na técnica reconhecerá que modali- dades alternativas podem compreender domínios variáveis únicos de cadeia pesada ou leve. O domínio variável único pode ser usado para fazer a triagem de domínios variáveis capazes de formar um fragmento de ligação ao antígeno específico de dois domínios capazes de se |i- gar ao TMEFF2. A triagem pode ser realizada por métodos de triagem por apresentação em fago (phage display) com o uso, por exemplo, de abordagem combinatória dupla hierárquica descrita na publicação de patente internacional nº WO1992/01047. Nessa abordagem, uma co- lônia individual que contém um clone de cadeia de VH ou de cadeia de VL é usada para infectar uma biblioteca de clones completa que codifi- ca a outra cadeia (VL ou VH), e o domínio de ligação ao antígeno es- pecífico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de apresentação em fago usando métodos conhecidos e aqueles no presente documento descritos. Portanto, as cadeias poli- peptídicas VH e VL individuais são úteis na identificação de anticorpos anti-TMEFF2 adicionais com o uso dos métodos descritos na publica- ção de patente internacional. nº WO1992/01047.

Anticorpos homólogos

[0151] As variantes dos anticorpos anti-TMEFF2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção que compreendem as sequências de aminoácidos da VH ou da VL mostradas na Tabela 9 estão no escopo da invenção. Por exemplo, as variantes podem com- preender uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, on- ze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos na VH e/ou na VL, contanto que os anticorpos homólogos retenham ou tenham propriedades funcionais melhoradas quando comparados aos anticorpos parentais, como ligação comparável ao TMEFF2 ou estabi-

lidade melhorada. Em algumas modalidades, a identidade da sequên- cia pode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma sequência de aminoácidos da VL ou VH da in- venção.

[0152] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção se |i- gam à região proximal à membrana de TMEFF2 com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de cerca de 0,4 x 10º M ou menor, em que a Kp é medida com o uso de ressonância plasmônica de su- perfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à temperatura ambiente.

[0153] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ho- mólogos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos se |i- gam à região proximal à membrana de TMEFF2 humano com a Kp entre cerca de 0,1 x 10º M e cerca de 0,4 x 10º M.

[0154] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0155] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0156] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre-

ende a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0157] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0158] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0159] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90, sendo que a VH, a VL, ou tanto a VH como a VL, opcionalmente compreendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições de aminoácidos. Opcionalmen- te, quaisquer substituições não estão dentro das CDRs.

[0160] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VH que tem a sequência de aminoácidos com ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a

VH das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 87 ou 89. Opcionalmente, qualquer variação nas sequências das SEQ ID NOs: não está dentro das CDRs.

[0161] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende a VL que tem a sequência de aminoácidos com ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a VL das SEQ ID NOs: 28, 29, 30, 31, 88 ou 90. Opcionalmente, qual- quer variação nas sequências das SEQ ID NOs: não está dentro das CDRs.

[0162] O alinhamento das sequências de aminoácidos dos domí- nios VH de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados é mostrado na Figu- ra 1, e o alinhamento das sequências de aminoácidos dos domínios VL de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados é mostrado na Figura 2. As cadeias VH e VL são identificadas por sua SEQ ID NO: no início de cada fileira. Os sítios possíveis de substituições no VH e/ou no VL são as posições de resíduo que diferem entre os anticorpos. Por exemplo, as substituições podem ser feitas nas posições de resíduo 14, 20, 54, 56, 59, 76, 82, 84, 93, 107 na VH das SEQ ID NOs: 25, 27, 87 e 89 (numeração com base na SEQ ID NO: 25). De modo similar, as substi- tuições podem ser feitas nas posições de resíduo 1, 95 e 107 na VL das SEQ ID NOs: 28, 30, 88 e 90. Substituições exemplificadoras que podem ser feitas são substituições conservativas de aminoácido, ou substituições com resíduos de aminoácido presentes na posição de resíduo correspondente em cada anticorpo anti-TMEFF2.

[0163] A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas se- quências (isto é, % de identidade= nº de posições idênticas/nº total de posições x 100), levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, as quais precisam ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências.

[0164] A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada com o uso do algoritmo de E. Me- yers e W. Miller (Comput Appl Biosci 4:11-17 (1988)), que foi incorpo- rado no programa ALIGN (versão 2.0) com o uso de uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade por comprimento de lacu- na de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. Além disso, a porcenta- gem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman e Wunsch (J Mol Biol 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www. Gcg.com), com o uso de uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso por lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso por comprimento de 1, 2,3,4,5, ou 6. Anticorpos com modificações conservadoras

[0165] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende a VH que compreende as sequências da HCDR1, da HCDR2 e da HCDR3, e a VL que compreende as sequências da LCDR1, da LCDR?2 e da LCDR3, sendo que uma ou mais das sequências de CDR compreendem as sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos no presente documento descritos (por exemplo, anti- corpos mostrados nas Tabela 5 a 12) , ou modificações conservativas dos mesmos, e sendo que os anticorpos retêm as propriedades funci- onais desejadas dos anticorpos parentais.

[0166] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que têm modifica- ções conservativas se ligam à região proximal à membrana de TMEFF2 com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de cerca de 0,4 x 10º M ou menor, em que a Kp é medida com o uso de ressonância plasmônica de superfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à tempe-

ratura ambiente.

[0167] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que têm modifica- ções conservativas se ligam à região proximal à membrana de TMEFF2 humano com a K p» entre cerca de 0,1 x 10º M e cerca de 0,4Xx10 ºM.

[0168] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, res- pectivamente, e modificações conservativas das mesmas.

[0169] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e modificações conservativas das mesmas.

[0170] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, res- pectivamente, e modificações conservativas das mesmas.

[0171] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, res- pectivamente, e modificações conservativas das mesmas.

[0172] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR?2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, res-

pectivamente, e modificações conservativas das mesmas.

[0173] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0174] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0175] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0176] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0177] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0178] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF?2 iso- lado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compre- ende a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90, e modifica- ções conservativas da mesma.

[0179] "Modificações conservadoras" se referem a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as carac- terísticas de ligação do anticorpo contendo as modificações de amino- ácidos. Modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares são bem definidos e incluem aminoácidos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais básicas (por exemplo, lisi- na, arginina, histidina), cadeias laterais não polares (por exemplo, ala- nina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), ca- deias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagi- na, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, triptofano), cadeias laterais aromáticas (por exemplo, fenilalanina, triptofano, histidina, tiro- sina), cadeias laterais alifáticas (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), amida (por exemplo, asparagina, glutamina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais contendo enxofre (cisteína, meti- onina). Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo pode tam- bém ser substituído por alanina, como foi previamente descrito para mutagênese por varredura de alanina (MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55 a 67; Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1 a 24). Substituições de aminoácido para os anticorpos da inven- ção podem ser realizadas por meio de métodos conhecidos, por exemplo, pela mutagênese por PCR (patente U.S. nº 4.683.195). Al- ternativamente, as bibliotecas de variantes podem ser geradas, por exemplo, usando códons aleatórios (NNK) ou não aleatórios, por exemplo, códons DVK, que codificam 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). As variantes de anticorpo resul- tantes podem ser avaliadas quanto as suas características usando-se Os ensaios no presente documento descritos. Imunoconjugados

[0180] Um "imunoconjugado" se refere ao anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas.

[0181] A invenção fornece também um imunoconjugado que com- preende o anticorpo isolado da invenção ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado a uma molécula heteróloga.

[0182] Em algumas modalidades, a molécula heteróloga é um marcador detectável.

[0183] O anticorpo isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção conjugado a um marcador detectável pode ser usado para avaliar a expressão de TMEFF2 em uma variedade de amostras. O marcador detectável inclui composições que, quando con- jugadas ao anticorpo isolado ou ao fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, tornam este último detectável, através de mei- os espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos.

[0184] Marcadores detectáveis exemplificadores incluem isótopos radioativos, microesferas magnéticas, microesferas metálicas, partícu- las coloidais, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), bioti- na, digoxigenina, haptenos, moléculas luminescentes, moléculas quemiluminescentes, fluorocromos, fluoróforos, agentes de arrefeci- mento brusco fluorescente, moléculas coloridas, isótopos radioativos, cintilatos, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, poli-histidina, Ni?*, marcadores Flag, marca- dores myc, metais pesados, enzimas, fosfatase alcalina, peroxidase, luciferase, doadores/receptores de elétrons, ésteres de acridínio e substratos colorimétricos.

[0185] Um marcador detectável pode emitir um sinal espontanea- mente, como quando o marcador detectável é um isótopo radioativo. Em outros casos, o marcador detectável emite um sinal após ser esti- mulado por um campo externo.

[0186] Isótopos radioativos exemplificadores podem ser emissores de y, emissores de Auger, emissores de B, emissor alfa ou isótopo ra- dioativo emissor de pósitrons. Isótopos radioativos exemplificadores incluem 3H, 11C, 18C, SN, 18F, 1ºF, Co, Co, %ºCo, 6ºCu, ººCu, Cu, Cu, Ga, 72As, 7SBr, s6Y, 897r, Sr, 2AmTC, 2mTC, 15h, 1231, 1241, 1251, 1H, 211 At, 212Bj, 213Bj, 223Ra, 226Ra, 225AC e 227AC.

[0187] Átomos de metal exemplificadores são metais com um nú- mero atômico maior que 20, como átomos de cálcio, átomos de es- cândio, átomos de titânio, átomos de vanádio, átomos de cromo, áto- mos de manganês, átomos de ferro, átomos de cobalto, átomos de níquel, átomos de cobre, átomos de zinco, átomos de gálio, átomos de germânio, átomos de arsênico, átomos de selênio, átomos de bromo, átomos de criptônio, átomos de rubídio, átomos de estrôncio, átomos de ítrio, átomos de zircônio, átomos de nióbio, átomos de molibdênio, átomos de tecnécio, átomos de rutênio, átomos de ródio, átomos de paládio, átomos de prata, átomos de cádmio, átomos de índio, átomos de estanho, átomos de antimônio, átomos de telúrio, átomos de iodo, átomos de xenônio, átomos de césio, átomos de bário, átomos de lan- tânio, átomos de háfnio, átomos de tântalo, átomos de tungstênio, átomos de rênio, átomos de ósmio, átomos de irídio, átomos de plati- na, átomos de ouro, átomos de mercúrio, átomos de tálio, átomos de chumbo, átomos de bismuto, átomos de frâncio, átomos de rádio, áto- mos de actínio, átomos de cério, átomos de praseodímio átomos, áto- mos de neodímio, átomos de promécio, átomos de samário, átomos de európio, átomos de gadolínio, átomos de térbio, átomos de disprósio, átomos de hólmio, átomos de érbio, átomos de túlio, átomos de itérbio, átomos de lutécio, átomos de tório, átomos de protactínio, átomos de urânio, átomos de neptúnio, átomos de plutônio, átomos de amerício, átomos de cúrio, átomos de berquélio, átomos de califórnio, átomos de einstênio, átomos de férmio, átomos de mendelévio, átomos de nobélio ou átomos de laurêncio.

[0188] Corantes adequados incluem quaisquer corantes comercial- mente disponíveis, como, por exemplo, 5(6)-carboxifluoresceína, IRDye 680RD maleimida ou IRDye 800CW, corantes de polipiridil rutênio e similares.

[0189] Os fluoróforos adequados são isocianato de fluoresceína (FITC), fluoresceína tiosemicarbazida, rodamina, Texas Red, Corantes Cy (por exemplo, Cy3, Cy5, Cy5.5), Alexa Fluors (por exemplo, Ale- xa488, Alexa555, Alexa594; Alexa647), corantes fluorescentes de in- fravermelho próximo (NIR) (700 - 900 nm), e corantes de carbocianina e aminoestirila.

[0190] O anticorpo isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção conjugado a um marcador detectável pode ser usado como um agente de imageamento.

[0191] O anticorpo isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção pode ser conjugado a um marcador detectável com o uso de métodos conhecidos.

[0192] Em algumas modalidades, o marcador detectável é com- plexado com um agente quelante.

[0193] Em algumas modalidades, o marcador detectável é conju- gado aos anticorpos ou aos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção através de um ligante.

[0194] O marcador detectável pode ser ligado diretamente, ou indi- retamente, ao anticorpo ou ao fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção com o uso de métodos conhecidos. Os ligantes adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, grupos prostéticos, ligantes não fenólicos (derivados de N-succimidil-benzo- atos; dodecaborato), porções quelantes de ambos os quelantes ma- crocíclicos e acíclicos, como derivados de ácido 1,4,7,10-tetra-azaci- clododecano-1,4,7, 10, triacético (DOTA), derivados de ácido dietileno- triaminapenta-acético (DTPA), derivados de ácido S-2-(4-Isotiociana-

tobenzil)-1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) e derivados de ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclodocedan-1,4,8,11-tetra-acético (TETA), N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeido), compostos bis-azido (como bis (p azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazônioben- zoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro 2,4-dinitrobenzeno) e outras porções quelantes. Os ligantes de peptídeo adequados são bem conhecidos.

Anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos

[0195] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3.

[0196] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o anti- corpo se liga à região proximal à membrana de TMEFF2. Embora não desejando limitar-se por qualquer teoria particular, os anticorpos bies- pecíficos que se ligam à região proximal à membrana de TMEFF2 po- dem ser mais eficientes na mediação do extermínio de células tumo- rais mediada por células T.

[0197] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o anti- corpo compete pela ligação à região proximal à membrana de TMEFF2 com um anticorpo de referência que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29, a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30, a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31, a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88, ou a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90.

[0198] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região proximal à membrana de TMEFF2 com uma constante de dissociação (Kp) de cerca de 0,4 x 10º M ou menor, em que a Kp é medida com o uso de ressonância plasmônica de superfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à temperatura ambiente.

[0199] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região proximal à membrana de TMEFF2 humano com a K p» entre cerca de 0,1 x 10º M e cerca de 0,4 x 10º M.

[0200] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente; SEQ ID NOs: 11,13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente; SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente; o SEQ ID NOs: 11,13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente.

[0201] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o segundo domínio compreende a HCDR1, a

HCDR?2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; ou SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente.

[0202] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o primeiro domínio compreende: a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28; a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29; a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30; a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31; a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88; ou a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90.

[0203] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, sendo que o segundo domínio compreende: a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; ou a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0204] Em algumas modalidades, o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 59 e a VL da SEQ ID NO: 111.

[0205] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 32, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 35, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

[0206] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 32, uma LC1 da SEQ ID NO: 35, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0207] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a

LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0208] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0209] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID

NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0210] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0211] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que:

o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0212] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0213] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 91, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 92, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

[0214] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID

NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0215] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 93, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 94, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

[0216] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou um fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79. Anticorpos manipulados e modificados

[0217] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos da invenção podem ser adicionalmente manipulados para ge- rar anticorpos modificados com propriedades similares ou alteradas quando comparados aos anticorpos parentais. A VH, o VL, oVHeo VL, as regiões constantes, a estrutura de cadeia pesada, a estrutura de cadeia leve ou qualquer ou todas as seis CDRs podem ser manipu- ladas nos anticorpos da invenção.

[0218] Os anticorpos da invenção podem ser modificados por en- xertia de CDR. Uma ou mais sequências de CDR dos anticorpos da invenção podem ser enxertados a uma diferente sequência do arca- bouço. A enxertia de CDR pode ser feita usando-se os métodos co- nhecidos e os métodos no presente documento descritos.

[0219] As sequências de estrutura a serem usadas podem ser ob- tidas junto às bases de dados públicas de DNA ou referências publica- das que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem ger- minativa. Por exemplo, o DNA da linhagem germinativa e as sequên- cias de proteínas codificadas para genes de domínios variáveis de ca- deia pesada e leve podem ser encontrados em IMGTG, o sistema in- ternacional de informação ImMunoGeneTics& www. Imgt.org. As se- quências de estrutura que podem ser usadas para substituir as se- quências de estrutura existentes dos anticorpos da invenção podem ser aquelas que mostram a porcentagem mais alta (%) de identidade para os domínios variáveis parentais ao longo de todo o comprimento do VH ou do VL, ou ao longo do comprimento da FR1, FR2, FR3 e FRA4. Além disso, estruturas adequadas podem, ainda, ser seleciona-

das com base nos comprimentos de CDR1 e CDR2 do VH e do VL ou estrutura canônica idêntica de LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 e HCDR?2. Estruturas adequadas podem ser selecionadas com o uso de métodos conhecidos, como a adaptação da estrutura humana descrita na patente U.S. nº 8.748.356 ou super-humanização descrita na pa- tente U.S. nº 7.709.226.

[0220] As sequências da estrutura dos anticorpos parentais e ma- nipulados podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por retromutações para restaurar e/ou melhorar a ligação dos anticorpos gerados ao antígeno, como descrito, por exemplo, na patente U.S. nº

6.180.370. As sequências da estrutura dos anticorpos parentais e mani- pulados podem ser adicionalmente modificadas por mutação de um ou mais resíduos dentro da região da estrutura (ou alternativamente dentro de uma ou mais regiões CDR) para remover os epítopos de células T para assim reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abor- dagem é também chamada de "desimunização" e está descrita em maio- res detalhes na publicação de patente U.S.. No. US20070014796.

[0221] Os resíduos de CDR dos anticorpos da invenção podem ser mutados para modular a afinidade dos anticorpos para TMEFF2 e/ou CDB3.

[0222] Os resíduos de CDR dos anticorpos da invenção podem ser mutados para minimizar o risco de modificações pós-traducionais. Os resíduos de aminoácidos de motivos putativos para a desaminação (NS), hidrólise catalisada por ácido (DP), isomerização (DS), ou oxida- ção (W) podem ser substituídos com qualquer um dos aminoácidos de ocorrência natural para mutagenizar os motivos, e os anticorpos resul- tantes podem ser testados quanto à sua funcionalidade e estabilidade com o uso dos métodos no presente documento descritos.

[0223] Os anticorpos da invenção modificados para melhorar a es- tabilidade, a seletividade, a reatividade cruzada, a afinidade, a imuno-

genicidade ou outras propriedades biológicas ou biofísicas desejadas estão no escopo da invenção.

A estabilidade de um anticorpo é influ- enciada por inúmeros fatores, incluindo (1) o empacotamento do nú- cleo dos domínios individuais que afetam sua estabilidade intrínseca, (2) as interações de interface proteína/proteína que têm impacto no pareamento de HC e LC, (3) a disposição de resíduos polares e carre- gados, (4) a rede de ligação H a resíduos polares e carregados; e (5) a distribuição dos resíduos polares e carregados na superfície entre ou- tras forças intra e intermoleculares (Worn et al., (2001) J Mol Biol 305:989-1010). Resíduos com o potencial para desestabilizar estrutu- ras podem ser identificados com base na estrutura cristalina do anti- corpo ou através de modelagem molecular em determinados casos, e o efeito dos resíduos sobre a estabilidade do anticorpo pode ser testa- do através da geração e da avaliação de variantes que abrigam muta- ções nos resíduos identificados.

Uma das maneiras de aumentar a es- tabilidade do anticorpo é aumentar a temperatura de transição térmica de ponto médio (Tm) como medida por Calorimetria de Varredura Dife- rencial (CVD). De modo geral, a Tm da proteína está correlacionada com sua estabilidade e inversamente correlacionada com sua susceti- bilidade ao desdobramento e desnaturação em solução e aos proces- sos de degradação que dependem da tendência da proteína a se des- dobrar (Remmele et al., (2000) Biopharm 13:36-46). Inúmeros estudos revelaram a correlação entre a classificação da estabilidade física das formulações medida como estabilidade térmica por calorimetria de var- redura diferencial (CVD) e a estabilidade física medida por outros mé- todos (Gupta et a/., (2003) AAPS PharmSci 5E8; Zhang et al., (2004) J Pharm Sci 93:3076-89; Maa et al., (1996) /nt J Pharm 140:155-68; Be- du-Addo et al., (2004) Pharm Res 21:1353-61; Remmele et a/l., (1997) Pharm Res 15:200-8). Os estudos de formulação sugerem que uma Tm de Fab implica na estabilidade física de longo prazo de um mAb cor-

respondente.

[0224] Lisina do terminal C (CTL) pode ser removida de anticorpos injetados por carboxipeptidases endógenas que circulam na corrente sanguínea (Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412). Durante a fabricação, a remoção de CTL pode ser controlada para menos do que o nível máximo pelo controle de concentração de Zn?* extracelu- lar, EDTA ou EDTA — Fe*?* como descrito na publicação de patente U.S. nº US20140273092. O teor de CTL nos anticorpos pode ser me- dido com o uso de métodos conhecidos.

[0225] Substituições de Fc podem ser realizadas no anticorpo da invenção para modular as funções efetoras de anticorpo e/ou as pro- priedades farmacocinéticas. Na função imune tradicional, a interação de complexos antígeno-anticorpo com células do sistema imune resul- ta em uma ampla variedade de respostas, variando de funções efeto- ras como citotoxicidade dependente de anticorpo, desgranulação de mastócitos e fagocitose até sinais imunomodulatórios como regulação da proliferação de linfócitos e secreção de anticorpos. Todas essas interações são iniciadas através da ligação do domínio Fc de anticor- pos ou complexos imunes a receptores de superfície celular especiali- zados em células. A diversidade de respostas celulares desencadea- das por anticorpos e complexos imunes resulta da heterogeneidade dos receptores Fc: FcyRI (CD64), FeyRlla (CD32A), e FeyRIll (CD16) ativam receptores Fcy (isto é, intensificam o sistema imune) enquanto que FecyRllb (CD32B) é um receptor Fcy inibitório (isto é, amortecimen- to do sistema imune). A ligação ao receptor FcºRn modula a meia-vida do anticorpo.

[0226] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem ao menos uma substituição em uma região Fc.

[0227] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze substituições na região Fc.

[0228] Posições em Fc podem ser substituídas para modular a meia-vida do anticorpo. Exemplos de substituições singulares ou de combinação que podem ser feitas para aumentar a meia-vida do anti- corpo são substituições M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/ M428L, N434A e T307A/ESSOA/N434A. Exemplos de substituições singulares ou de combinação que podem ser feitas para reduzir a meia-vida do anticorpo são substituições H435A, P257I/N434H, D376V/ N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T3O8P/N434A e H435R.

[0229] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem ao menos uma substituição na região Fc selecionada do grupo que consiste em M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/ M428L, N434A, T307A/ESSOA/N434A, H435A, P257I/N434H, D376V/ N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A e H435R.

[0230] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem ao menos uma substituição na região Fc que reduz a liga- ção do anticorpo a um receptor Fcy de ativação (FcyR) e/ou reduz as funções efetoras de Fc como a ligação de C1qg, a citotoxicidade de- pendente de complemento (CDC), a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou a fagocitose (ADCP).

[0231] As posições em Fc que podem ser substituídas para reduzir a ligação do anticorpo ao FcyR de ativação e subsequentemente redu- zir a função efetora são substituições de L234A/L235A em 1IgG1, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/ASSOS/P331S em IgG2, F234A/ L235A em IgG4, S228P/F234A/L235A em IgG4, N297A em todos os isótipos de Ig, V234A/G237A em IgG2, K214T/E233P/L234V/L235A/

G236-deletado/A327G/P331A/D365E/L358M em IgG1, H268Q/V309L/ A3S30S/P331S em IgG2, S267E/L328F em IgG1, L234F/L235E/D265A em IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A3S30S/P331S em IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S em IgG4, eS228P/F234A/L235A/ G236-deletado/G237A/P238S em IgG4.

[0232] Uma substituição S228P bem conhecida pode ser feita em anticorpos IgG4 para melhorar a estabilidade Ig9G4.

[0233] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem uma substituição S228P, sendo que a numeração de resí- duos está de acordo com o índice EU.

[0234] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem uma substituição de F234A, L235A ou F234A/L235A, sendo que a numeração de resíduos está de acordo com o índice EU.

[0235] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção com- preendem uma substituição de S228P, F234A e L235A, sendo que a numeração de resíduos está de acordo com o índice EU. Métodos de geração de anticorpos homólogos, anticorpos com modifi- cações conservadoras, e anticorpos manipulados e modificados.

[0236] Os anticorpos da invenção que têm sequências de aminoá- cidos alteradas quando comparados com os anticorpos parentais po- dem ser gerados com o uso de tecnologias de clonagem e expressão padrões. Por exemplo, a mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação ao anticorpo, ou outra propriedade de inte- resse, pode ser avaliada com uso de métodos bem conhecidos em e os métodos descritos no presente documento nos Exemplos.

Isótipos e alótipos de anticorpos

[0237] Os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecíficos da invenção podem ser um isótipo I9G1, IgG2, Ig9G3 ou IgG4.

[0238] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um isótipo I9G1.

[0239] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um isótipo I9G2.

[0240] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um isótipo I9G3.

[0241] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são de isótipo I9G4.

[0242] A imunogenicidade de anticorpos terapêuticos está associ- ada a um risco aumentado de reações de infusão e diminuição da du- ração de resposta terapêutica (Baert et al/., (2003) N Engl J Med 348:602-08). A extensão na qual os anticorpos terapêuticos induzem uma resposta imune no hospedeiro pode ser determinada em parte pelo alótipo do anticorpo (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21). O alótipo de anticorpo está relacionado às variações de sequência de aminoácidos em locais específicos nas sequências da região constante do anticorpo. A Tabela 2 mostra os alótipos de IgG1, IgG2 e IgG4 selecionados.

[0243] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo G2m(n).

[0244] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo G2m(n-).

[0245] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo G2m(n)/(n-).

[0246] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo nG4m(a).

[0247] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo G1m(17).

[0248] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 ou os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção são um alótipo G1m(17,1). Tabela 2 resíduo: Índice EU) e gg ger [Pr em q 5 me es) Ee AAA ame Samanta petm sm A

SUA NS O RC O O Anticorpos anti-idiotípicos

[0249] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 ou ao anticorpo an- ti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico da invenção.

[0250] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28.

[0251] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29.

[0252] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30.

[0253] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31.

[0254] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88.

[0255] A invenção fornece também um anticorpo anti-idiotípico que se liga especificamente ao anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

[0256] Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reco- nhece os determinantes antigênicos (por exemplo, o parátopo ou CDRs) do anticorpo. O anticorpo Id pode ser bloqueador ou não blo- queador de antígeno. O Id bloqueador de antígeno pode ser usado pa- ra detectar o anticorpo livre em uma amostra (por exemplo, anticorpo anti-TMEFF2 da invenção no presente documento descrito). O Id não bloqueador pode ser usado para detectar o anticorpo total (livre, parci- almente ligado ao antígeno, ou totalmente ligado ao antígeno) em uma amostra. Um anticorpo Id pode ser preparado por imunização de um animal com um anticorpo ao qual um anti-ld está sendo preparado.

[0257] Um anticorpo anti-ld pode também ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imunológica em ainda um ou- tro animal, produzindo um chamado anticorpo anti-anti-ld. Um anti-anti- Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original que induziu o anti-

Id. Dessa forma, por meio do uso dos anticorpos para os determinan- tes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones idênticos que expressam anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-ld podem ser variados (produzindo assim variantes de anticorpo anti-ld) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, como como aquelas descritas em outro lugar na presente invenção Geração dos anticorpos monoespecíficos da invenção

[0258] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 são humanos.

[0259] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TMEFF2 são humanizados.

[0260] Os anticorpos monoespeciíficos da invenção podem ser ge- rados com o uso de várias tecnologias. Por exemplo, o método de hi- bridoma de Kohler e Milstein, Nature 256:495, 1975, pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais. No método de hibridoma, um ca- mundongo ou outro animal hospedeiro, como um hamster, rato ou ma- caco, é imunizado com TMEFF2 ou fragmentos de TMEFF2 humano, de chimpanzé ou de macaco do gênero Macaca, como o domínio pro- ximal à membrana de TMEFF2, seguido pela fusão de células de baço dos animais imunizados com células de mieloma com o uso de méto- dos convencionais para formar células de hibridoma (Gooding, Mono- clonal Antibodies: Principles and Practice, páginas de 59 a 103 (Aca- demic Press, 1986)). As colônias produzidas a partir de células de hi- bridoma únicas imortalizadas são selecionadas quanto à produção de anticorpos com propriedades desejáveis, como especificidade de liga- ção, reatividade cruzada ou falta da mesma, e afinidade pelo antígeno.

[0261] Vários animais hospedeiros podem ser usados para produ- zir os anticorpos anti-TMEFF2 da invenção. Por exemplo, camundon- gos Balb/c podem ser usados para gerar anticorpos anti-TMEFF2 hu- mano de camundongo. Os anticorpos produzidos em camundongos

Balb/c e outros animais não humanos podem ser humanizados usan- do-se várias tecnologias para gerar sequências similares às humanas.

[0262] Técnicas de humanização exemplificadoras, incluindo a se- leção de arcabouços do aceptor humano, são conhecidas e incluem enxerto de CDR (patente US nº 5.225.539), enxerto de SDR (patente US nº 6.818.749), Resurfacing (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489 a 499), Specificity Determining Residues Resurfacing (publicação de pa- tente US nº 2010/0261620), adaptação da estrutura humana (patente U.S. nº 8.748.356) ou super-humanização (patente U.S. nº 7.709, 226). Nesses métodos, as CDRs de anticorpo parentais são transferi- das para estruturas humanas que podem ser selecionadas com base em sua homologia total para as estruturas parentais, com base na si- milaridade do comprimento da CDR, na identidade da estrutura canô- nica ou uma combinação dos mesmos.

[0263] Os anticorpos humanizados podem ser adicionalmente oti- mizados para melhorar sua seletividade ou afinidade para um antígeno desejado através da incorporação dos resíduos de suporte de estrutu- ra alterada para preservar a afinidade da ligação (retromutações) por técnicas, como aquelas descritas nas publicações de patentes interna- cionais nºs. WO1090/007861 e WO1992/22653, ou pela introdução de variação em qualquer uma das CDRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo.

[0264] Animais transgênicos, como camundongos, ratos ou gali- nhas carregando loci da imunoglobulina (Ig) humana no seu genoma podem ser usados para gerar anticorpos humanos contra uma proteí- na-alvo e são descritos, por exemplo, na patente US nº 6.150.584, na publicação de patente internacional nº WOS99/45962, nas publicações de patentes internacionais nºs WOZ2002/066630, WO2002/43478, WOZ2002/043478 e WO1990/04036, Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9; Green et al (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jako-

bovits (1998) Exp. Med. 188:483-95; Lonberg and Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65-93; Bruggemann et a/., (1991) Eur J Immunol 21:1323- 1326; Fishwild et a/., (1996) Nat Biotechnol 14:845-851; Mendez et al., (1997) Nat Genet 15:146-156; Green (1999) J Immunol Methods 231:11-23; Yang et al., (1999) Cancer Res 59:1236-1243; Brúggemann and Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458. Os loci de imunoglobulina endógena nesses animais podem ser interrom- pidos ou deletados, e ao menos um locus de imunoglobulina humana completo ou parcial pode ser inserido no genoma do animal usando recombinação homóloga ou não homóloga, usando transcromossomos ou usando minigenes. Empresas como a Regeneron (www. Regene- ron.com), Harbour Antibodies (www. Harbourantibodies.com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (www. Omtinc.net), KyYMab (www. Kymab.com), Trianni (www. Trianni.com) e Ablexis (www. Ablexis.com) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos dirigidos contra um antígeno selecionado com o uso de tecnologias como des- crito acima.

[0265] Os anticorpos humanos podem ser selecionados de uma biblioteca de apresentação em fago, onde o fago é manipulado para expressar imunoglobulinas humanas ou porções das mesmas, como Fabs, anticorpos de cadeia única (scFv) ou regiões variáveis de anti- corpo não emparelhadas ou emparelhadas (Knappik et a/., (2000) J Mol Biol 296:57-86; Krebs et al., (2001) J Immunol Meth 254:67-84; Vaughan et a/., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314; Sheets et al (1998) PITAS (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter (1991) J Mol Biol 227:381; Marks et a/., (1991) J Mol Biol 222:581). Os anticor- pos da invenção podem ser isolados, por exemplo, da biblioteca de apresentação em fago expressando as regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve do anticorpo, como proteínas de fusão, com a proteína de revestimento do bacteriófago plX, como descrito em Shi et a/., (2010) J

Mol Biol 397:385-96, e na publicação de patente internacional nº WOO09/085462). As bibliotecas podem ser triadas para a ligação do fago ao TMEFF2 ou CD3 humano e/ou de cinomolgo e os clones positi- vos obtidos podem ser adicionalmente caracterizados, os Fabs são iso- lados dos lisados do clone, e expressos como IgGs de comprimento total. Tais métodos de apresentação em fago para isolar anticorpos humanos são descritos em, por exemplo: Patentes U.S. nºs. 5.223.409, 5.403.484,

5.571.698, 5.427.908, 5. 580.717, 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793;

6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081.

[0266] A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpos monoclonais podem ser realizadas com o uso de qualquer técnica adequada, como produção de proteína recombinante. Os antí- genos imunogênicos podem ser administrados a um animal na forma de proteína purificada, ou misturas de proteína incluindo células totais ou extratos de células ou tecidos, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal a partir de ácidos nucléicos que codificam o dito antígeno ou uma porção do mesmo. Geração de anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da invenção

[0267] Os anticorpos anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos da in- venção podem ser gerados por combinação dos domínios VH/VL de ligação ao TMEFF2 isolados no presente documento com quaisquer domínios VH/VL de ligação ao CD3, inclusive aqueles no presente do- cumento descritos e aqueles que estão disponíveis publicamente. Os domínios VH/VL de ligação ao CD3 exemplificadores que podem ser usados são aqueles dos anticorpos CD3B219 e CD3B376 como descrito no presente documento. Os domínios VH/VL de ligação ao TMEFF2 exemplificadores que podem ser usados são aqueles dos anticorpos TMEB675, TMEB570, TMEB674, TMEB565, TMEB762 e TMEB757. Os anticorpos anti-TMEFF2 TMEFF2/anti-CD3 biespecíficos gerados podem ser testados quanto à sua ligação ao TMEFF2 e ao CD3, e quanto às suas características funcionais desejadas, como extermínio de células que expressam TMEFF2 mediada por células T (por exem- plo, LNCaP).

[0268] Os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser gera- dos, por exemplo, com o uso de troca de braço Fab (ou troca de meta- de da molécula) entre dois anticorpos bivalentes monoespecíficos por meio da introdução de substituições na interface CH3 de cadeia pesa- da em cada metade da molécula para favorecer a formação de hetero- dímero das duas metades de moléculas do anticorpo tendo especifici- dade distinta tanto no ambiente isento de células in vitro como usando coexpressão. A reação de troca do braço Fab é o resultado de uma reação de isomerização de ponte dissulfeto e dissociação-associação de domínios CH3. As pontes dissulfetos de cadeia pesada nas regiões de dobradiça dos anticorpos monoespecíficos parentais são reduzidas. As cisteínas livres resultantes de um dos anticorpos monoespeciíficos parentais formam uma ponte de dissulfeto intercadeias-pesadas com resíduos de cisteína de uma segunda molécula de anticorpo monoes- pecífico parental, e, simultaneamente, domínios CH3 dos anticorpos parentais liberam e reformam por dissociação-associação. Os domí- nios CH3 dos braços Fab podem ser manipulados para favorecer a heterodimerização em relação à homodimerização. O produto resultan- te é um anticorpo biespecífico tendo dois braços Fab ou metades de moléculas que se ligam, cada um(a), a um epítopo diferente, isto é, um epítopo em TMEFF2 e um epítopo em CD3. Por exemplo, os anticor- pos biespecíficos da invenção podem ser gerados com o uso da Tec- nologia DuoBodyO descrita na publicação de patente internacional nº WOZ2011/131746. A mutação F405L em uma cadeia pesada e a muta- ção K409R na outra cadeia pesada podem ser usadas no caso de an- ticorpos IgG1. Para anticorpos I9G2, uma IgG2 de tipo selvagem e um anticorpo I9gG2 com as substituições de F405L e R409K podem ser usadas. Para anticorpos IgG4, uma IgG4 de tipo selvagem e um anti- corpo IgG4 com as substituições de F405L e R409K podem ser usa- das. Para gerar anticorpos biespecíficos, o primeiro anticorpo bivalente monoespecífico e o segundo anticorpo bivalente monoespecífico são manipulados para terem a mutação precedentemente mencionada na região Fc, os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sejam submetidas à isomerização da ligação de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As condições de incubação param ser idealmente restauradas para não redutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2- mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), gluta- tiona, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercaptoe- tanol. Por exemplo, a incubação durante pelo menos 90 min, a uma temperatura de pelo menos 20 “C na presença de 25 mM de 2-MEA ou na presença de pelo menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.

[0269] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico é um isótipo IIG1 e compreende uma substituição F405L em uma primeira cadeia pesada (HC1) e uma substituição K409R em uma segunda cadeia pesada (HC2) quando comparado à IgG1 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 84.

[0270] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- TMEFF2/anti-CD3 é um isótipo IgG4 e compreende uma substituição de F405L/R409K na HC2, quando comparado à IgG4 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 85.

[0271] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- TMEFF2/anti-CD3 é um isótipo IgG4 e compreende as substituições de S228P, F234A e L235A na HC1 e as substituições de SS228P, F234A, L235A, F405L e R409K na HC2, quando comparado à IgG4 de tipo selvagem da SEQ ID NO: 85. SEQ ID NO: 84 IgG1 de tipo selvagem

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 85 IgG4 de tipo selvagem

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO 103: I9G1 F405L

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

PGK SEQ ID NO: 109: I9G1 K409R

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

PGK SEQ ID NO: 104 I9gG4 F405L/R409K

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG K

[0272] Anticorpos biespecíficos podem também ser gerados com o uso de designs como o "Knob-in-Hole" ("Protuberância-em-Cavidade", Genentech), "CrossMAbs" (Roche) e os anticorpos eletrostaticamente complementares ("electrostatically-matched antibodies", Chugai, Am- gen, NovoNordisk, Oncomed), o "LUZ-Y" (Genentech), o "Strand Ex- change Engineered Domain body" (SEEDbody, "anticorpo com interdi- gitação de segmentos de fitas-B de domínios CH3 de IgG e IgA huma- nas") (EMD Serono), e o "Biclonic" (Merus).

[0273] Na estratégia "knob-in-hole" ("protuberância-em-cavidade") (consulte, por exemplo, a publicação internacional nº WO 2006/028936) os aminoácidos selecionados que formam a interface dos domínios CH3 na IgG humana podem ser mutados em posições que afetam as inte- rações do domínio CH3 para promover a formação de heterodímero. Um aminoácido com uma cadeia lateral (orifício) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um pri- meiro antígeno e um aminoácido com uma cadeia lateral grande (bo-

tão) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno. Após a coexpressão dos dois anticorpos, um heterodímero é formado como resultado da intera- ção preferencial da cadeia pesada com uma "hole" (cavidade) com a cadeia pesada com uma "knob" (protuberância). Pares de substituição de CH3 exemplificadores que formam uma "knob" (protuberância) e uma "hole" (cavidade) são (expressos como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pesada): T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S e T366W/T366S L368A Y407V.

[0274] A tecnologia CrossMAbs, em adição ao uso da estratégia "knob-in-hole" ("protuberância-em-cavidade") para promover a troca de braço Fab utiliza as trocas de domínios CH1/CL em um meio-braço para assegurar o correto emparelhamento das cadeias leves do anti- corpo biespecífico resultante (consulte, por exemplo, a patente US nº

8.242.247).

[0275] Outras estratégias de entrecruzamento ("cross-over") po- dem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção pela troca de domínios variáveis ou constantes, ou de ambos os domínios, entre a cadeia pesada e a cadeia leve ou den- tro da cadeia pesada nos anticorpos biespecíficos, em um braço ou em ambos os braços. Estas trocas incluem por exemplo VH-CH1 com VL- CL, VH com VL, CH3 com CL e CH3 com CH1 como descrito nas pu- blicações de patente internacional nº —WO2009/080254, WOZ2009/080251, WO2009/018386 e WO2009/080252.

[0276] Podem ser utilizadas outras estratégias, como favorecimen- to da heterodimerização da cadeia pesada com o uso de interações eletrostáticas pela substituição de resíduos positivamente carregados em uma superfície CH3 e de resíduos negativamente carregados em uma segunda superfície CH3, como descrito na publicação de patente US nº US2010/0015133; publicação de patente US nº US2009/ 0182127; publicação de patente US nº US2010/028637, ou publicação de patente US nº US2011/0123532. Em outras estratégias, a hetero- dimerização pode ser favorecida pelas seguintes substituições (ex- pressas como posições modificadas no primeiro domínio CH3 da primei- ra posição da cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pesada): L351Y F405A Y407V/T394W, T3661 K392M T394W/F405A Y407V, T366L K392M T394W/F405A Y407V, L351Y Y407A/T366A K409F, L351Y Y407A/T366V KA409F, Y407A/T366A K409F, ou T350V L351Y F405A Y407V/T350V T366L K392L T394W como descrito na publicação de patente US nº US2012/0149876 ou publicação de patente US nº US2013/0195849.

[0277] A tecnologia SEEDbody pode ser utilizada para gerar anti- corpos biespecíficos da invenção. SEEDbodies têm, em seus domínios constantes, resíduos de IgG selecionados substituídos por resíduos de IgA para favorecer a heterodimerização como descrito no pedido de patente US nº 20070287170.

[0278] As mutações são tipicamente realizadas ao nível de DNA em uma molécula como o domínio constante do anticorpo com o uso de métodos-padrão. Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

[0279] A invenção fornece também polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos anti-TMEFF2 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção. A invenção fornece também poli- nucleotídeos isolados que codificam os anticorpos anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecíficos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mes- mos da invenção. Os polinucleotídeos isolados capazes de codificar os segmentos do domínio variável no presente documento fornecidos po- dem ser incluídos nos mesmos vetores ou em vetores diferentes para produzir anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno. O polinucleo- tídeo pode ser um ácido desoxirribonucleico complementar (cCDNA) e pode ser de otimizado por códon para expressão em hospedeiro ade- quado. A otimização de códon é uma tecnologia bem conhecida.

[0280] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos no presente documento descritos (e os peptídeos que codificam) incluem uma se- quência líder. Qualquer sequência líder conhecida da técnica pode ser usada. A sequência líder pode incluir, um sítio de restrição ou um sítio de início de tradução.

[0281] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica a VH do anticorpo da invenção, a VL do anticorpo da inven- ção, a cadeia pesada do anticorpo da invenção ou a cadeia leve do anticorpo da invenção.

[0282] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VH das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 87 ou 89.

[0283] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a VL das SEQ ID NOs: 28, 29, 30, 31, 88 ou 90.

[0284] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica a HC1, a LC1, a HC2 ou a LC2 dos anticorpos anti- TMEFF2/anti-CD3 da invenção.

[0285] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que codifica a HC1 das SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 91 ou 93.

[0286] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica a LC1 das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 92 ou 94.

[0287] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica a HC2 das SEQ ID NOs: 76 ou 78.

[0288] A invenção fornece também um polinucleotídeo isolado que codifica a LC2 das SEQ ID Nos: 77 ou 79.

[0289] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 ou 102.

[0290] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 105, 106, 80, 81, 107, 108, 82 e 83.

[0291] As sequências de polinucleotídeos que codificam a VH ou a VL ou um fragmento de ligação ao antígeno das mesmas dos anticor- pos da invenção, ou a cadeia pesada e a cadeia leve dos anticorpos da invenção, podem ser funcionalmente ligadas a um ou mais elemen- tos reguladores, como um promotor ou um intensificador, que permi- tem a expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira intencionada. O polinucleotídeo pode ser um cDNA.

[0292] A invenção também fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo da invenção. Tais vetores podem ser vetores plasmidi- ais, vetores virais, vetores para expressão de baculovírus, vetores de transposon ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução do polinucleotídeo da invenção em um dado organismo ou anteceden- te genético por quaisquer meios. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve dos anticor- pos da invenção, opcionalmente ligados a regiões constantes, são in- seridos em vetores de expressão. As cadeias pesadas e/ou leves po- dem ser clonadas no mesmo vetor de expressão ou em um vetor dife- rente. Os segmentos de DNA que codificam cadeias de imunoglobulina podem ser operacionalmente ligados a sequências de controle nos ve- tores de expressão que asseguram a expressão de polipeptídeos de imunoglobulina. Essas sequências de controle incluem sequências de sinalização, promotores (por exemplo, promotores associados natu- ralmente ou heterólogos), elementos de acentuador e sequência de terminação da transcrição e são escolhidas por serem compatíveis com a células hospedeira escolhida para expressar o anticorpo. De-

pois que o vetor for incorporado no hospedeiro adequado, o hospedei- ro é mantido sob condições adequadas para expressão de alto nível das proteínas codificadas pelos polinucleotídeos incorporados.

[0293] Os vetores de expressão recombinantes que estão no es- copo da descrição incluem fragmentos de ácido nucleico sintético ou derivado de cDNA que codificam ao menos uma proteína recombinan- te, como uma VH, uma VL, uma HC ou uma LC, que podem ser funci- onalmente ligados aos elementos reguladores adequados. Tais ele- mentos reguladores podem incluir um promotor de transcrição, se- quências que codificam os sítios de ligação ribossomal de MRNA ade- quados e sequências que controlam a terminação da transcrição e da tradução. Os vetores de expressão, especialmente os vetores de ex- pressão de mamíferos, podem também incluir um ou mais elementos não traduzidos, como uma origem de replicação, um promotor e enhancer adequados ligados ao gene a ser expresso, outras sequên- cias não transcritas flanqueadoras 5' ou 3', sequências não traduzidas 5' ou 3' (como sítios de ligação ao ribomossoma necessários), um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores de splicing ou se- quências de término de transcrição. Uma origem de replicação que confere a capacidade de replicar em um hospedeiro pode também ser incorporada.

[0294] As sequências de controle transcricional e de tradução nos vetores de expressão a serem usadas na transformação de células de vertebrados podem ser fornecidas por fontes virais. Vetores exemplifi- cadores podem ser construídos, como descrito por Okayama e Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).

[0295] Em algumas modalidades, a sequência de codificação do anticorpo, ou do fragmento de ligação ao antígeno, é colocada sob controle de um promotor constitutivo potente, como os promotores dos seguintes genes: hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), adeno-

sina desaminase, piruvato quinase, beta-actina, miosina humana, he- moglobina humana, creatina muscular humana e outros. Além disso, muitos promotores virais funcionam constitutivamente em células eu- carióticas, e são adequados para uso com as modalidades descritas. Esses promotores virais incluem, mas não se limitam a, o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), os promotores precoces e tardios de SV40, o promotor do vírus do tumor mamário do camundon- go (MMTV), as repetições terminais longas (LTRs) do vírus da leuce- mia de Moloney, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus Eps- tein-Barr (EBV), vírus do sarcoma de Rous (RSV) e outros tipos de re- trovírus, e o promotor da timidina quinase do vírus da herpes simples. Em uma modalidade, a sequência codificadora do anticorpo anti- TMEFF?2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é colocada sob o controle de um promotor induzível, como o promotor da meta- lotioneína, o promotor induzível por tetraciclina, o promotor induzível por doxiciclina, promotores que contêm um ou mais elementos de res- posta estimulada por interferon (ISRE), como a proteína quinase R, 2',5'-o0ligoadenilato sintetases, genes Mx, ADAR!1, e similares.

[0296] Os vetores no presente documento descritos podem conter um ou mais sítios de entrada ribossomais internos (IRES). A inclusão de uma sequência de IRES nos vetores de fusão pode ser benéfica para a expressão aumentada de algumas proteínas. Em algumas mo- dalidades, o sistema de vetores inclui um ou mais sítios de poliadenila- ção (por exemplo, SV40), que podem ser a montante ou a jusante de qualquer das sequências de ácidos nucleicos precedentemente men- cionadas. Os componentes do vetor podem ser continuamente ligados ou dispostos de modo que forneça espaçamento ótimo para a expres- são dos produtos gênicos (isto é, pela introdução de nucleotídeos es- paçadores entre os ORFs) ou posicionados de um outro modo. Ele- mentos reguladores, como o motivo IRES, também podem ser dispos-

tos para fornecer espaçamento ótimo para a expressão.

[0297] Os vetores podem compreender marcador de seleção, que são bem conhecidos da técnica. Os marcadores de seleção incluem marcadores de seleção positiva e negativa, por exemplo, genes de re- sistência a antibióticos (por exemplo, um gene de resistência à neomi- cina, um gene de resistência à higromicina, um gene de resistência à canamicina, um gene de resistência à tetraciclina, um gene de resis- tência à penicilina), genes da glutamina sintase, HSV-TK, derivados de HSV-TK para seleção por ganciclovir ou gene da purina nucleosídeo fosforilase bacteriana para seleção por 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um marcador de seleção ou o sítio de clonagem podem estar a montante ou a jusante de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de interesse ou sítio de clonagem.

[0298] Vetores exemplificadores que podem ser usados são bacte- rianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pnNH8a, pNH16a, pnH18a, pnH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) e peE12.4 (Lonza).

[0299] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 25 e/ou a VL da SEQ ID NO: 28.

[0300] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 39 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 42.

[0301] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 26 e/ou a VL da SEQ ID NO: 29.

[0302] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-

otídeo da SEQ ID NO: 40 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 43.

[0303] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 27 e/ou a VL da SEQ ID NO: 30.

[0304] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 41 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 44.

[0305] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 26 e/ou a VL da SEQ ID NO: 31.

[0306] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 40 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 45.

[0307] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 87 e/ou a VL da SEQ ID NO: 88.

[0308] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 95 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 96.

[0309] Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinu- cleotídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 89 e/ou a VL da SEQ ID NO: 920.

[0310] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 99 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 100.

[0311] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 66 e/ou a VL da SEQ ID NO:

67.

[0312] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 105 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 106.

[0313] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 74 e/ou a VL da SEQ ID NO:

75.

[0314] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-

otídeo da SEQ ID NO: 107 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 108.

[0315] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 32 e/ou a LC da SEQ ID NO:

35.

[0316] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 46 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 49.

[0317] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 33 e/ou a LC da SEQ ID NO:

36.

[0318] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 47 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 50.

[0319] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 34 e/ou a LC da SEQ ID NO:

37.

[0320] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 48 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 51.

[0321] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 33 e/ou a LC da SEQ ID NO:

38.

[0322] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 47 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 52.

[0323] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 91 e/ou a VL da SEQ ID NO:

92.

[0324] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 97 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 98.

[0325] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a VH da SEQ ID NO: 93 e/ou a VL da SEQ ID NO:

94.

[0326] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle-

otídeo da SEQ ID NO: 101 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 102.

[0327] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 76 e/ou a LC da SEQ ID NO:

77.

[0328] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 80 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 81.

[0329] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo que codifica a HC da SEQ ID NO: 78 e/ou a LC da SEQ ID NO:

79.

[0330] Em algumas modalidades, o vetor compreende o polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 82 e/ou o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 83.

[0331] Os vetores no presente documento descritos podem ser usados para transformar várias células com os genes que codificam os anticorpos, ou os fragmentos de ligação a antígeno, descritos. Por exemplo, os vetores podem ser usados para gerar as células produto- ras de anticorpos anti-TMEFF2 ou fragmentos de ligação ao antígeno. Dessa forma, a invenção fornece também uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção.

[0332] Técnicas para a introdução de genes estranhos nas células são conhecidas e podem ser usadas para construir as células recom- binantes da invenção.

[0333] O termo "célula hospedeira" se refere a uma célula na qual um vetor foi introduzido. Entende-se que o termo célula hospedeira se refere não apenas à célula do específica em questão, mas à progênie desta célula, e também a uma linhagem celular estável gerada da célu- la do específica em questão. Uma vez que certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser idêntica à célula progenitora, mas ainda assim ser incluída no escopo do termo "células hospedeira" para uso na presente invenção.

[0334] Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetais ou células de arquea. Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, e outras Enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas, são exem- plos de células hospedeiras procarióticas. Outros micróbios, como le- veduras, também são úteis para a expressão. Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) e Pichia são exemplos de células hospedeiras de levedura adequadas. As células eucarióticas exemplificadoras po- dem ser de origem de mamífero, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de mamífero incluem linhagens celula- res imortalizadas, como linhagens celulares de hibridoma ou mieloma, como linhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA CRL-1581), NSO (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC nº 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL- 1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas derivadas de células de ovário de hamster chinesa (CHO, "Chinese Hamster Ovary") como CHOK1SV (Lonza Biologics, Wal- kersville, MD), Potelligento CHOK2SV (Lonza), CHO-K1 (ATCC CRL- 61) ou DG44.

[0335] As células transformadas com os vetores de expressão no presente documento descritos podem ser selecionadas, ou pode ser feita uma triagem para expressão recombinante dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação a antígeno no presente documento descritos. Células recombinantes positivas são expandidas e são selecionados os subclones que exibem um fenótipo desejado, como expressão de alto nível, propriedades de crescimento melhoradas ou a capacidade de produzir proteínas com características bioquímicas desejadas, por exemplo, devido à modificação na proteína ou às modificações altera-

das pós-tradução. Esses fenótipos podem ser devidos às propriedades inerentes de um dado subclone ou a uma mutação. As mutações po- dem ser afetadas através do uso de produtos químicos, luz de com- primento de onda UV, radiação, vírus, mutagênese de inserção, inibi- ção do reparo de mau pareamento do DNA ou uma combinação des- ses métodos.

[0336] A invenção também fornece um método de produção de um anticorpo da invenção, que compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção em condições nas quais o anticorpo é expresso, e a recu- peração do anticorpo produzido pela célula hospedeira. Os métodos de produção de anticorpos e de purificação dos mesmos são bem co- nhecidos na técnica. Depois de sintetizados (quimicamente ou por re- combinação), os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias individuais leves e/ou pesadas, ou outros fragmentos de anticorpo, como VH e/ou VL, podem ser purificados de acordo com procedimentos convencio- nais, incluindo precipitação por sulfato de amônio, colunas de afinida- de, cromatografia em coluna, purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), eletroforese em gel e similares (consulte, em geral, Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)). Um anticorpo em questão pode ser substancialmente puro, por exemplo, com ao menos cerca de 80% a 85% de pureza, com ao menos cerca de 85% a 90% de pureza, com ao menos cerca de 90% a 95% de pu- reza, Ou com ao menos cerca de 98% a 99%, ou mais, de pureza, por exemplo, isento de contaminantes, como resíduos celulares, macromo- léculas, etc. diferentes do anticorpo em questão.

[0337] As sequências de polinucleotídeos da invenção podem ser incorporadas nos vetores com o uso de métodos-padrão de biologia molecular. A transformação na célula hospedeira, cultura, expressão e purificação do anticorpo são feitos usando métodos bem conhecidos.

[0338] A invenção fornece também um método de produção do anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, que compreende: incorporar do primeiro polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo e o segundo polinucleotídeo que codifica a VL do anticorpo em um vetor de expressão; transformar uma célula hospedeira com o vetor de expres- são; cultivar a célula hospedeira em um meio de cultura sob condições em que a VL e VH do anticorpo são expressas e formam o anticorpo; e recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira ou meio de cultura. Composições farmacêuticas/Administração

[0339] A invenção fornece também uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo da invenção e um veículo farmaceutica- mente aceitável. Para uso terapêutico, os anticorpos da invenção po- dem ser preparados na forma de composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do anticorpo como um ingrediente ativo em um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual o anticorpo da invenção é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, solução salina a 0,4% e glicina a 0,3% podem ser usadas. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. Elas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farma- ceuticamente aceitáveis como exigido para aproximá-las das condi- ções fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e agentes corantes, etc. À concentração dos anticorpos da invenção em tal formulação farmacêu- tica pode variar, de menos de cerca de 0,5%, usualmente até ao me- nos cerca de 1%, até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e pode ser selecionada principalmente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de admi- nistração selecionado. Veículos adequados e formulações adequadas, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" páginas 691 a 1092, consulte especialmente as pági- nas 958 a 989.

[0340] O modo de administração dos anticorpos da invenção pode ser qualquer rota adequada como a administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, por via intrave- nosa ou subcutânea, transmucosa, (oral, intranasal, intravaginal, retal) ou outros meios considerados pelo especialista na técnica, como bem conhecido na técnica.

[0341] Os anticorpos da invenção podem também ser administra- dos profilaticamente para reduzir o risco de desenvolver uma doença como câncer.

[0342] Dessa forma, uma composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular pode ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e entre cerca de 1 ng a cerca 100 mg/kg, por exemplo, de cerca de 50 ng a cerca de 30 mg/kg ou, com mais prefe- rência, de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg/kg, do anticorpo da inven- ção. Métodos de uso de anticorpos anti-TMEFF2 e anticorpos anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecíficos

[0343] A invenção fornece também um método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para tratar o cân- cer positivo para TMEFF2.

[0344] A invenção fornece também um método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para tratar o câncer positivo para TMEFF?2.

[0345] Múltiplos genes foram conectados ao desenvolvimento do câncer de próstata. Uma das proteínas envolvidas no desenvolvimento e no avanço do câncer de próstata e, dessa forma, sendo um alvo promissor para novas terapias anticâncer de próstata, é a proteína transmembranar com domínio similar a EGF e dois domínios similares a folistatina (TMEFF2). TMEFF2 é uma proteína transmembranar tipo | composta de dois domínios similares a folistatina (FS), um domínio similar a EGF (TM) e cauda citoplasmática curta. A expressão mais alta da proteína TMEFF?2 foi detectada em dois órgãos: cérebro e prós- tata (Liang et al. 2000; Horie et a/. 2000). A expressão elevada de TMEFF?2 foi também encontrada em linhagens celulares de câncer de próstata e amostras clínicas (Glynne-Jones et al. 2001; Gery et al. 2002; Afar et al. 2004), indicando que TMEFF2 desempenha um papel significativo no avanço do câncer de próstata. A expressão do gene Tmeff2 está sob o controle do receptor de androgênio. Um grande nú- mero de pacientes com câncer dependente de androgênio apresentou altos níveis de MRNA de TMEFF2.

[0346] Dessa forma, os anticorpos anti-TMEFF2 podem ter o po- tencial para se tornar instrumentos importantes para o diagnóstico,

prognóstico ou tratamento de câncer de próstata.

[0347] O termo "câncer" destina-se a incluir todos os tipos de cres- cimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, inde- pendentemente do tipo de histopatologia ou estágio de invasividade.

Cânceres exemplificadores positivos para TMEFF incluem câncer de próstata.

[0348] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é adeno- carcinoma.

[0349] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é um cân- cer de próstata metastático. Em algumas modalidades, o câncer de próstata apresentou metástase no reto, nos nódulos linfáticos ou nos ossos, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0350] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é câncer de próstata recidivado ou refratário.

[0351] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é câncer de próstata resistente à castração.

[0352] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é sensível à terapia de privação androgênica.

[0353] Em algumas modalidades, o câncer de próstata é insensí- vel à terapia de privação androgênica.

[0354] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso na terapia.

[0355] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF2.

[0356] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no tratamento de câncer de próstata positivo para TMEFF2.

[0357] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para fabricação de um medicamento para tratamento de câncer positivo para TMEFF?2.

[0358] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 32, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 35, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

[0359] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2,

uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 32, uma LC1 da SEQ ID NO: 35, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0360] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0361] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/

anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0362] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0363] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0364] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2,

uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0365] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0366] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/

anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0367] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0368] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

[0369] A invenção fornece também um anticorpo anti-TMEFF2/ anti-CD3 biespecífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF?2, como câncer de próstata, sendo que o anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF?2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR?2,

uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1I, a LCDR2Qe a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente; o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

[0370] Os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um segundo agente terapêutico.

[0371] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é cirurgia, quimioterapia, terapia de privação androgênica ou radiação, ou qualquer combinação das mesmas. Kits

[0372] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 ou o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico da invenção. O kit pode ser usado para usos terapêuticos ou como kits de diagnóstico. O kit pode ser usado para detectar a presença de TMEFF2, CD3, ou TMEFF2 e CD3 em uma amostra.

[0373] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo da invenção e reagentes para detectar o anticorpo. O kit pode incluir um ou mais outros elementos incluindo: instruções de uso; outros reagen- tes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico, ou um agente útil para quelação, ou para acoplar de outro modo, um anticorpo a um marcador ou a um agente terapêutico, ou uma composição radioprote- tora; dispositivos ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; carreadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositi-

vos ou outros materiais para administração a um indivíduo.

[0374] Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo da invenção em um recipiente e instruções para uso do kit.

[0375] Em algumas modalidades, o anticorpo no kit está marcado.

[0376] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 25e€ a VL da SEQ ID NO: 28.

[0377] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29.

[0378] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30.

[0379] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31.

[0380] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88.

[0381] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2 que compreende a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90.

[0382] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0383] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei-

ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0384] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0385] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0386] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0387] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0388] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei-

ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0389] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0390] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0391] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0392] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei- ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0393] A invenção fornece também um Kkit que compreende o anti- corpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primei-

ro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3, sendo que o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compre- ende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75. Métodos de detecção de TMEFF2 ou CD3

[0394] A invenção fornece também um método de detecção de TMEFF2 em uma amostra, que compreende obter a amostra, colocar a amostra em contato com o anticorpo anti-TMEFF2 da invenção, e de- tectar o anticorpo ligado ao TMEFF2 na amostra.

[0395] A invenção fornece também um método de detecção de TMEFF2 e CD3 em uma amostra, que compreende obter a amostra, colocar a amostra em contato com o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico que compreende um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um segundo domínio que se liga ao CD3 da invenção, e detectar o anticorpo ligado ao TMEFF2 e ao CD3 na amostra.

[0396] Em algumas modalidades, a amostra pode ser derivada de urina, sangue, soro, plasma, saliva, ascite, células circulantes, células de tumor circulantes, células que não estão associadas a tecidos (isto é, células livres), tecidos (isto é, tecido de tumor cirurgicamente remo- vido, biópsias, incluindo aspiração por agulha fina), preparações histo- lógicas e similares.

[0397] Os anticorpos da invenção no presente documento descri- tos ligados a TMEFF2 ou TMEFF2 e CD3 podem ser detectados com o uso de métodos conhecidos. Métodos exemplificadores incluem mar- cação direta dos anticorpos com o uso de marcadores fluorescentes ou quimioluminescentes, ou radiomarcadores, ou fixação aos anticor- pos da invenção de uma porção que é prontamente detectável, como biotina, enzimas ou etiquetas de epítopo. Marcadores e porções exemplificadores são rutênio, 111In-DOTA, 111ln-ácido dietilenotria- minapenta-acético (DTPA), peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina e beta-galactosidase, poli-histidina (etiqueta HIS), corantes de acridina, corantes de cianina, corantes de fluorona, corantes de oxazina, coran- tes de fenantridina, corantes de rodamina e corantes Alexa FluorO.

[0398] Os anticorpos da invenção podem ser usados em uma vari- edade de ensaios para detectar TMEFF2 ou TMEFF2 e CD3 na amos- tra. Ensaios exemplificadores são análise por transferência de Western (Western blot), radioimunoensaio, ressonância de plasmon de superfí- cie, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, imunoen- saio de eletroquimioluminescência (ECL), imuno-histoquímica, separa- ção de células ativadas por fluorescência (FACS) ou ensaio ELISA.

[0399] A presente invenção será agora descrita com relação aos seguintes exemplos específicos não limitadores. Exemplo 1: Geração de antígeno

[0400] O domínio extracelular humano (ECD) de TMEFF?2 foi pro- duzido com base em uma sequência com número de acesso Q9UIK5 no UniProt. O construto de ECD foi projetado com sequências de eti- queta His (His-tag) 6X e de etiqueta Avi (Avi-tag) na C-terminal (cons- truto TMEW1: SEQ ID NO: 6). Um construto contendo os domínios FS2 e EGF (aminoácidos 151 a 320 foi projetado como uma fusão de albumina sérica humana (HSA) com sequências de etiqueta His (His- tag) 6X e de etiqueta Avi (Avi-tag) (construto TMEW7; SEQ ID NO: 7). Um construto contendo o domínio proximal à membrana de TMEFF2 (resíduos 230 a 320) foi projetado com uma etiqueta His (His-tag) 6x (construto TMEW19; SEQ ID NO: 8) ou fusionado a uma Fc de I19G1 de rato com uma etiqueta His (His-tag) (construto, TMEWZ20; SEQ ID NO: 9). Os resíduos 230 a 320 de TMEFF2 contêm o domínio EGF que abrange a resíduos de 261 a 301 de TMEFF2. Os construtos de expressão de ECD de TMEFF2 humano foram temporariamente trans- fectados em células derivadas de HEK293, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific) com o uso de ExpiFectamine de acordo com o proto-

colo do fabricante.

As células foram incubadas 5 dias a 37 ºC com 8% de CO, em um agitador orbital antes da colheita.

As células expressas foram removidas por centrifugação e as proteínas TMEFF2 solúveis com etiquetas his (his-tags) foram purificadas a partir do meio com o uso de cromatografia de afinidade com metal imobilizado com o uso de resina Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) seguida de cromato- grafia de exclusão por tamanho (SEC) (GE Healthcare) em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco pH 7,2 (1x DPBS) As se- quências de aminoácidos dos antígenos gerados são mostradas na Tabela 3.

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Exemplo 2. Geração de anticorpos anti-TMEFF2 Geração de anticorpo com o uso de ratos transgênicos que expressam loci de imunoglobulina humana (OmniRatO)

[0401] O OmniRat& contém um locus de IgH quimérica de ra- to/humano (compreendendo 22 Vus humanos, todos os segmentos D e JH humanos na configuração natural ligados ao locus Cr de rato) jun- tamente com os loci de Igl. completamente humana (12 VkKs ligados a JK-CK e 16 VAs ligados a JA-CA). (consulte, por exemplo, Osborn, et al. (2013) J Immunol 190(4): 1481 a 1490). Consequentemente, os ratos apresentam expressão reduzida de imunoglobulina de rato, e em res- posta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanos introduzidos experimentam mudança de classe e mutação somática para gerarem anticorpos monoclonais IgG quiméricos humanos/de rato de alta afinidade com regiões variáveis completamente humanas. À preparação e o uso de OmniRatO, e as modificações genômicas reali- zadas nesses ratos, são descritas na publicação WO 14/093908.

[0402] OmniRats foram imunizados com o construto de TMEFF2 humano, FS2-EGF-Tev-HSA(C34S)-His-Avitag (TMEW7, SEQ ID NO: 7) e estimulados com o construto spTMEFF2 (230-320)G3S-IgG1Fc de rato (TMEW20, SEQ ID NO: 9). Após um regime de imunização de 89 dias, os nódulos linfáticos dos ratos foram colhidos e usados para ge- rar hibridomas e os sobrenadantes de hibridoma foram triados quanto à ligação à proteína TMEFF2-FL-ECD-His-Avitag (TMEW1) humana por ELISA e/ou SPARCL (Spatial Proximity Analyte Reagent Capture Luminescence). Vários sobrenadantes foram selecionados para tria- gem secundária por ELISA e SPARCL de ligação ao ECD de TMEFF, FS2-EGF, ou somente domínio EGF de TMEFF2. Com base nos resul- tados de triagem, vários clones de hibridoma foram sequenciados, ex- pressos e caracterizados quanto à funcionalidade.

Geração de Anticorpo a partir de Bibliotecas de Apresentação em Fa- go

[0403] Fabs que se ligam a TMEFF2 foram selecionados com o uso de métodos convencionais a partir de dois conjuntos de bibliotecas de apresentação em fago de novo plX, como descrito em Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 e WO2009/085462). Em resumo, dois con- juntos de bibliotecas, chamados de V3.0 e V5.0, foram gerados por diversificação de armações humanas onde os genes VH da linhagem germinativa IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 foram recom- binados com o minigene IGHJ-4 humano através do laço H3 (minigene IGHJ-6 também foi usado em V5.0), e os genes VLkappa da linhagem germinativa humana O12 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) e B3 (IGKV4-1*01) foram recombinados com o minige- ne IGKJ-1 para montar os domínios completos VH e VL. As posições nas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve ao redor das alças H1, H2, L1, L2 e L3 em contato frequente com antígenos de pro- teína e peptídeo foram escolhidas para diversificação. A diversidade de sequências nas posições selecionadas foi limitada a resíduos ocor- rendo em cada posição das famílias de genes da linhagem germinativa IGHV ou IGLV dos respectivos genes IGHV ou IGLV. A diversidade no laço H3 foi gerada utilizando laços sintéticos de tamanho curto a médio de comprimentos de 7 a 14 aminoácidos para bibliotecas V3.0, e com- primentos de 6 a 19 aminoácidos para bibliotecas V5.0. A distribuição do aminoácido na H3 foi projetada para imitar a variação observada de aminoácidos em anticorpos humanos. Os arcabouços usados para ge- rar as bibliotecas foram denominados de acordo com sua origem gêni- ca da linhagem germinativa da VH e VL humana. Para ambos os con- juntos V3.0 e V5.0, cada uma das três bibliotecas de cadeia pesada foi combinada com as quatro cadeias leves de linhagem germinativa ou bibliotecas de cadeia leve de linhagem germinativa para gerar 12 com-

binações únicas de VH:VL para cada conjunto de bibliotecas que são usadas para experimentos de seleção. Clonagem de Região V

[0404] O RNA total de lisados celulares de hibridoma de fago fo- ram purificados com o uso do kit RNeasy 96 (Qiagen) seguindo o pro- tocolo do fabricante. O RNA resultante foi quantificado com o uso de Drop Sense e armazenado a -80 ºC ou usado para síntese de cDONA com o uso do sistema de síntese de primeira fita SuperScript Ill por RT-PCR (Invitrogen). A síntese de primeira fita de cDNA foi realizada com o uso de primers específicos para gene anelados às regiões cons- tantes das cadeias pesadas kappa e lambda, respectivamente. A mis- tura de reação de RT-PCR compreendida de até 3 ug de RNA purifi- cado, primer específico para gene, mistura dNTP, tampão de reação, mM de MgCl2, DTT, RNaseOUT'Y (40 U/ul, Invitrogen) e SuperS- cript'“ Ill RT (200 U/ul, Invitrogen Cat. nº 18080-051) foi incubada a 50 ºC por 50 minutos e 85 ºC por 5 minutos. O cDNA de fita simples re- sultante foi armazenado a -20 ºC, ou usado diretamente para amplifi- cação por PCR. A reação de PCR foi executada com o uso de polime- rase Platinum Pfx (Invitrogen). Os fragmentos de região v foram ampli- ficados por primers forward e reverso que se anelam às sequências líder e regiões constantes das cadeias pesadas, kappa e lambda, res- pectivamente, com o uso de condições de PCR otimizadas. Os frag- mentos de PCR resultantes foram sequenciados, as sequências de aminoácidos das regiões v recuperadas foram otimizadas por códon e clonadas no vetor de expressão à base de pUnder carregando a regi- ão constante de IgG4 com as mutações S228P, F234A e L235A (isóti- po IgG4PAA). Transfecção e purificação em pequena escala de Expi293

[0405] Os anticorpos selecionados, identificados a partir das cam- panhas de imunização ou apresentação em fago, foram clonados e expressos como IgG1PAA e purificados através de pequena escala de 2 ml. As células Expi293'"“ (ThermoFisher Scientific) foram semeadas em densidade de 1,25 x 10º a 2,25 x 10 * células viáveis/ml em meio de expressão Expi293'Y e cultivadas em frascos de agitação de 125 mL a 2L a 37ºC, 7% de CO 2. As células foram subcultivadas quando a densidade atingiu o crescimento de fase logarítmica em 3 x 10º a 5x 1086 células viáveis/ml com uma viabilidade de 98 a 99%.

[0406] No dia da transfecção, a densidade de células viáveis e a porcentagem de viabilidade celular foram determinadas. As células foram transfectadas a uma densidade de 3 x 10º células viáveis/ml se- guindo o protocolo de transfecção do fabricante (ThermoFisher de pu- blicação número MANOO007814). A cultura foi colhida no dia 6 após a transfecção por centrifugação a 850xG por 15 minutos antes da purifi- cação. Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes cla- rificados com o uso de resina mAb Select Sure (GE Healthcare) e dia- lisados em PBS. As concentrações de proteína foram determinadas por medição AZ280 no filtrado com o uso de um instrumento DropSense (Trinean). Exemplo 3. Caracterização dos anticorpos anti-TMEFF2 Anticorpos anti-TMEFF2 se ligam a TMEFF2 com um grau muito alto de afinidade

[0407] A ligação de anticorpos anti-TMEFF2 IgG4PAA seleciona- dos ao ECD de TMEFF2 (TMEW1: TMEFF2-FL ECD-His-Avitag) e/ou à região proximal à membrana (TMEW 19: spoTMEFF2(230 a 320)G3S- H6) foi avaliada com o uso de Proteon (TMEB674, TMEB675, TMEB 565 eTMEB570) ou Biacore SPR (TMEB762 e TMEB757). Os parâme- tros cinéticos de ligação dos anticorpos selecionados são mostrados na Tabela 4. Descobriu-se que anticorpos anti-TMEFF2 se ligam tanto ao ECD de TMEFF2 como à região proximal à membrana de TMEFF2 com afinidades picomolares.

Tabela 4. iAnticorpo — lAntígeno Domínio delka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

A AAA mTEÇEÇO mem rms mes fr ProteOn SPR

[0408] A ligação de mAbs anti-TMEFF2 ao ECD e à região proxi- mal à membrana de TMEFF2 humana foi medida por ProteOn SPR (Bio Rad). Os mAbs purificados (diluídos até uma concentração final de 1 ug/ml em PBST) foram usados como ligantes no ensaio e foram imobilizados através da captura de Fc para anti-lgG Fc humano de ca- bra (GAH). Para acoplamento de amina do GAH IgG Fc, uma mistura 1:1 de EDC (40 mM) e NHS (10 mM) foi preparada imediatamente an- tes da injeção para ativar a superfície do chip na orientação vertical. O anticorpo GAH-Fc (a 30 pg/ml) em tampão de acetato (pH 5,0) foi, en- tão, fluído sobre a superfície por 300 segundos a 30 ul/min na orienta- ção vertical. Quaisquer grupos carboxila reativos restantes na superfí- cie foram subsequentemente desativados mediante a injeção de eta- nolamina 1 M (pH 8,5) na mesma orientação. Os anticorpos foram usados a uma concentração de 1 ug/ml para imobilização. Os anticor- pos foram fluídos sobre a superfície na direção horizontal. O ECD de

TMEFF?2 ou a região proximal à membrana em série de diluições de 3 vezes de 5 concentrações (concentração mais alta na faixa de 100 a 600 nM) foi fluído como analito na orientação vertical para se ligar às moléculas capturadas. Uma amostra em tampão foi também injetada no 6º canal na direção vertical para monitorar qualquer desvio no sinal de linha de base. As fases de associação e dissociação para todas as concentrações foram monitoradas ao longo de 3 minutos e 30 (ou 15) minutos respectivamente, a uma taxa de fluxo de 100 uL/minuto. A su- perfície de ligação foi regenerada para o próximo ciclo de interação com o uso de um pulso de 18 segundos de 0,8% de ácido fosfórico para remover o antígeno ligado. Os dados brutos foram processados subtraindo-se dois conjuntos de dados de referência dos dados de resposta: 1) os sinais de inter-spot para corrigir para as interações não específicas entre o antígeno e a superfície vazia do chip; 2) Os sinais de canal vazio (onde apenas PBST foi fluído sobre o chip) para corrigir desvio de linha de base não específicos.

Biacore 8K SPR

[0409] A ligação de mAbs anti-TMEFF2 ao ECD de TMEFF2 hu- mano foi medida por Biacore 8K SPR. O formato do ensaio foi o de capturar os mAbs com o uso de uma superfície de anti-Fc humano de alta densidade, então injetando titulação de concentração de TMEFF2 humano com o uso de um método cinético de ciclo único. Anti-Fc IgG humano de cabra (Jackson Immunoresearch, Cat. nº 109-005-098) foi diretamente imobilizado através de acoplamento de amina a 30 pg/ml em tampão de acetato 10 mM, pH 4,5 nas células de fluxo 1 e 2, no CMB5 Sensor Chip (GE) com uma taxa de fluxo de 30 uL/min em tam- pão HBSP (GE). Os mAbs foram capturados na superfície de anti-Fc IgG humano a 0,5 pg/ml (aproximadamente 200 a 300 RU) na célula de fluxo 2. O tampão de corrida foi, então, alterado para HBSP + 100 ug/ml de BSA. O ECD de TMEFF2 na concentração de 30 nM em série de diluições de 3 vezes foi injetado a partir de baixa para alta concen- tração com o uso do método cinético de ciclo único. A taxa de dissoci- ação foi monitorada 30 minutos após a última injeção ou concentração mais alta e, então, a superfície foi regenerada com o uso de ácido fos- fórico 0,8% (Bio Rad). Uma passagem em branco (blank) de tampão, capturando os mesmos mAbs e usando as mesmas condições de pas- sagem de amostra também foi concluída. Os dados brutos foram pro- cessados subtraindo-se dois conjuntos de dados de referência dos da- dos de resposta: 1) célula de fluxo de referência 1 subtraído da célula de fluxo de amostra 2, e 2) passagem em branco (blank) de tampão da passagem experimental. Os dados processados em todas as concen- trações para cada mAb foram globalmente ajustados como um modelo de ligação de Langmuir simples 1:1 para extrair estimativas das cons- tantes cinéticas (kon, koff) e de afinidade (KD).

Estabilidade térmica de anticorpos anti-TMEFF2

[0410] TMEB675 mostrou um perfil de estabilidade térmica mais baixo do que o usual por CVD (calorimetria de varredura diferencial) com início de desdobramento em Tm = 52 ºC e a primeira (Tm1) tran- sição térmica (Tm1) = 60,4 ºC. Um exame mais detalhado da sequên- cia de TMEB675 (vide Exemplo 4) mostrou a presença de hipermuta- ções somáticas (SHM) dentro da região de estrutura de cadeia leve e pesada. Várias variantes remodificadas foram subclonadas, expressas, purificadas e os perfis definidos por CVD. Os mAbs resultantes TMEB762 e TMEFB757 mostraram perfil de estabilidade térmica dese- jável (Tm1 = 69,4 ºC e Tm1 = 69,7 ºC, respectivamente). Em compa- ração com TMEB675, o TMEB762 teve as seguintes modificações de aminoácidos na cadeia pesada: R14P, P20L e H81Q, enquanto TMEFB757 teve as seguintes modificações de aminoácido na cadeia pesada: R14P e P20L. Em comparação com TMEB675, o TMEB762 teve as seguintes modificações de aminoácidos na cadeia leve: AID e

A91P, enquanto TMEFB757 tinha a modificação de A91P na cadeia leve. A numeração do resíduo está de acordo com Kabat. Os parâme- tros cinéticos de ligação de TMEB675, TMEB762 ao ECD de TMEFF2 são mostrados na Tabela 4. Exemplo 4. Caracterização estrutural de anticorpos anti-TMEFF2

[0411] As sequências de cDNA e as traduções de aminoácidos dos anticorpos foram obtidas com o uso de técnicas padrões. Após a determinação da sequência de polipeptídeos, alguns cDNAs de anti- corpo que codificam as regiões variáveis ou anticorpos de comprimen- to total foram otimizados por códon usando métodos padrão para au- mentar a expressão.

[0412] A Tabela 5 mostra as sequências de aminoácidos de HCDR1 e de HCDR?2 de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0413] A Tabela 6 mostra as sequências de aminoácidos de HCDRS3 de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0414] A Tabela 7 mostra as sequências de aminoácidos de LCDR1 e de LCDR?2 de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0415] A Tabela 8 mostra as sequências de aminoácidos de LCDR3 de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0416] A Tabela 9 mostra as sequências de aminoácidos de VH e de VL de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0417] A Tabela 10 mostra as SEQ ID NOs: de cadeias pesada e leve de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0418] A Tabela 11 mostra as sequências de aminoácidos de ca- deia pesada de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0419] A Tabela 12 mostra as sequências de aminoácidos de ca- deia leve de anticorpos anti-TMEFF2 selecionados.

[0420] A Tabela 13 mostra as SEQ ID NOs: de polinucleotídeos que codificam várias cadeias de anticorpos anti-TMEFF2.

Tabela 5. HCDR1 1SEQ ID NO: ID NO: Tabela 6. Tabela 7. [1SEQ ID NO: |LCDR2 Tabela 8. mer foot e mes fone e fe wW .. no Zz = co o o = co ko EE BE BS? BE B5z 28E o

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SEQ ID NO: 39 (cDNA de VH de TMEB675)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGAGAGG AGGAAGCCTGAGACCCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC SEQ ID NO: 40 (cDNA de VH de TMEB570, TMEB565)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAG CTCCTATTACATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCECT GGAATGGATGGGTGGCATTATCCCAATCAGTGGGCGTGCTAATTAT GCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCA CCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATA CCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGACGGCTACAGTAGTGGACGTA GCACAACATACGCATTTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC

CGTGTCGAGT SEQ ID NO: 41 (cDNA de VH de TMEB674)

GAAGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTCCT GGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTC AGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGC CTGGAGTGGGTGAGCGTGATCAGCGGCGGAGGCAGCTTTACCAGC TACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAACAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCCTTCTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCC

CATGACTGCTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC SEQ ID NO: 42 (cDNA de VL de TMEB675)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACGCCCTGACATTCEGGCGGCGGCACCAAGGTGGA

GATCAAG SEQ ID NO: 43 (cDNA de VL de TMEB570)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCG GGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTTC CACATACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCC GCGCCTGCTGATTTACGGTGCCTCCTATOEGCGCGACCGGCATTCC GGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCO ATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGC AGTACGGTCACAGCCCGATTACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGA

AATCAAA SEQ ID NO: 44 (cCDNA de VL de TMEB674)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG GAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCOTGCA GGACTACAACTACAGCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA

GATCAGG SEQ ID NO: 45 (cDNA de VL de TMEB565)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCG GGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTGC CACCTATTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCC GCGCCTGCTGATTTACGGTGCATCCTCCCGTGCGACCGGCATTCC GGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCO ATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGC AGTACGGCTATAACCCAATTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGA

AATCAAA SEQ ID NO: 46 (cDNA de HC de TMEB675)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGAGAGG AGGAAGCCTGAGACCCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTC CACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCcoTtTGGCGCCCTGCTCCAGGAG

CACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCAC CATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCOTGT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACGTGCGTGGTGGTEGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGG TCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCOTTCTTCCTCTACAGCOA GGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAA

GAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 47 (cDNA de VH de TMEB570, TMEB565)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAG CTCCTATTACATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCECT GGAATGGATGGGTGGCATTATCCCAATCAGTGGGCGTGCTAATTAT GCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCA CCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATA CCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGACGGCTACAGTAGTGGACGTA

GCACAACATACGCATTTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC CGTGTCGAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCeTGGC

GCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCOGGCTGTCC TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATG GTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGA CCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTEGGTEGGACGTGAGCCA GGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAG CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCT CCCGTCCTCCATOEGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCOCT TCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGG AGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA

CCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 48 (cCDNA de HC de TMEB674)

GAAGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTCCT GGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTC AGCAGCTACAGCATGAGCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGC CTGGAGTGGGTGAGCGTGATCAGCGGCGGAGGCAGCTTTACCAGC TACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAACAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCCGAG GACACCGCCTTCTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCC

CATGACTGCTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCT TCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCooTGGCOGCCCTGCTCCAGG

AGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCC

ACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCT GTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCoGGACCOCCOT

GAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGA GGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGT GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCOGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAG

AAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 49 (cDNA de LC de TMEB675)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACGCCCTGACATTCEGGCGGCGGCACCAAGGTGGA GATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTOCCOGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG

GGAGAGTGT SEQ ID NO: 50 (cDNA de LC de TMEB570)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCG GGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTTC CACATACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCC GCGCCTGCTGATTTACGGTGCCTCCTATOEGCGCGACCGGCATTCC GGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCO ATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGC AGTACGGTCACAGCCCGATTACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGA AATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG

GGAGAGTGT SEQ ID NO: 51 (cDNA de LC de TMEB674)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG GAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCOTGCA GGACTACAACTACAGCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA GATCAGGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG

GGAGAGTGT SEQ ID NO: 52 (cDNA de LC de TMEB565)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCG GGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTGC CACCTATTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCC GCGCCTGCTGATTTACGGTGCATCCTCCCGTGCGACCGGCATTCC GGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCO ATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGC AGTACGGCTATAACCCAATTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGA AATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG

GGAGAGTGT SEQ ID NO: 95 (cDNA de VH de TMEB762)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTEGCAGCCCGG AGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC SEQ ID NO: 96 (cDNA de VL de TMEB762)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA

GATCAAG SEQ ID NO: 97 (cDNA de HC de TMEB762)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTEGCAGCCCGG AGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTC CACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCcoTtTGGCGCCCTGCTCCAGGAG

CACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCAC CATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCOTGT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACGTGCGTGGTGGTEGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGG TCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCOTTCTTCCTCTACAGCOA GGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA

SEQ ID NO: 98 (cDNA de LC de TMEB762)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA GATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTOCCOGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG

GGAGAGTGTTAG SEQ ID NO: 99 (cDNA de VH de TMEB757)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTEGCAGCCCGG AGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGC SEQ ID NO: 100 (cCDNA de VL de TMEB757)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACCCCCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA

GATCAAG SEQ ID NO: 101 (cDNA de HC de TMEB757)

GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTEGCAGCCCGG AGGAAGCCTGAGACTCAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAG CAGCTACAGCATGAGCTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCAAAGGACT GGAGTGGGTGAGCGTGATTAGCGGCAGCGGCGGCTTCACCGATTA CGCCEGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAATAG CAAGAACACCCTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGA CACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGATGCCCCTGAACAGCCCTCA

CGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCTTC CACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCcoTtTGGCGCCCTGCTCCAGGAG

CACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCAC CATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCOTGT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACGTGCGTGGTGGTEGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGG TCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCA GGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAA

GAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 102 (cDNA de LC de TMEB757)

GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGGCATCAG AAACGACCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAA GCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGAGTGCCTAG CAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCAT CAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCA GGACTACAACTACCCCCTGACATTCEGGCGGCGGCACCAAGGTGGA GATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTOCCOGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCT GAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAG

[0421] As estruturas para os anticorpos anti-TMEFF2 selecionados são mostradas na Tabela 14.

Tabela 14. estrutura de VH de VL

SEQ ID NO: 53 (estrutura de VH3 3-23)

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCAKWGOGTLVTVSS SEQ ID NO: 54 (estrutura de VH1 1-69)

QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE WMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY

YCAR SEQ ID NO: 55 (estrutura de VKI L11)

AIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLL

IYAASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYP SEQ ID NO: 56 (estrutura de VKIII A27)

EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI

YGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP Exemplo 5. Mapeamento de epítopos de anticorpos anti-TMEFF2

[0422] O mapeamento de epítopos de TMEB570 e TMEB675 foi feito com o uso de troca de H/D. TMEW1 (SEQ ID NO: 6) foi usado como fonte de TMEFF2 nesses ensaios.

[0423] Foram desnaturados 10 ug de GITR humano em 133 uL de tampão de controle (fosfato 50 mM, cloreto de sódio 100 mM em pH 7,4) pela adição de 130 uL de cloridrato de guanidina 4 M, tampão TCEP 0,85 M (pH final de 2,5) e incubação da mistura durante 3 min a 10ºC. A mistura foi, então, submetida a digestão na coluna de pepsi- na/protease XIll com o uso de uma coluna de pepsina/protease XIII recheada no local (p/p, 1:1) (2,1 x 30 mm). Os peptídeos resultantes foram analisados com o uso de um sistema UPLC-MS compreendido de uma UPLC de Acquidade de Águas acoplado a um espectrômetro de massa híbrido Quadrupolo-Orbitrap Q Exactive'" (Thermo). Os peptídeos foram separados em uma coluna C8 de 50 mm x 1 mm com um gradiente de 16,5 minutos de 2 a 34% de solvente B (0,2% de áci-

do fórmico em acetonitrila). O solvente A foi 0,2% de ácido fórmico em água. A válvula de injeção e a coluna de pepsina/protease XIII, e seus tubos de conexão relacionados, foram mantidos dentro de uma caixa de resfriamento mantida a 10 ºC. A segunda válvula de comutação, a coluna C8 e os seus respectivos tubos de conexão de aço inoxidável relacionados estavam dentro de outra caixa de circulação resfriada mantida a -6 ºC. A identificação de peptídeo foi feita através de busca de dados de MS/MS, com Mascot, em comparação com a sequência de TMEW 1. A tolerância de massa para os íons de precursor e produto foi de 7 ppm e 0,02 Da, respectivamente.

[0424] 10 ul de TMEW!1 (5 ug) ou 10 ul de TMEW1 e uma mistu- ra de TMEB570 ou TMEB675 (5 ug:15 ug) foram incubados com 120 uL de tampão de marcação de óxido deutério (fosfato de sódio 50 mM, cloreto de sódio 100 mM em pH 7,4) durante O s, 30 s, 360 s, 3600 s ou 14400 s em 10º). A troca de hidrogênio/deutério (H/D) troca em ca- da ponto de tempo foi realizada em duplicata. A troca de hidrogê- nio/deutério foi bruscamente arrefecida pela adição de 130 uL de clori- drato de guanidina 4 M e tampão TCEP 0,85 M (o pH final foi 2,5). Posteriormente, as amostras arrefecidas foram submetidas à digestão com pepsina/protease em coluna e à análise por LC-MS como descrito acima.. Os espectros de massa foram registrados apenas no modo MS.

[0425] Os dados de MS brutos foram processados com o uso de HDX WorkBench, software para a análise de dados de MS de troca de H/D (Pascal et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23 (9), 1512- 1521). Os níveis de deutério são calculados com o uso da diferença média de massa entre o peptídeo deuterado e sua forma nativa (t0O). Cerca de 97 a 99% da proteína pôde ser mapeada a peptídeos especí- ficos. As curvas de acúmulo de deutério mostraram diferenças signifi- cativas nos coeficientes angulares, ao longo do tempo de troca dos peptídeos.

[0426] Epítopo de TMEB570 TMEW1 mostrou uma redução mo- desta na absorção de deutério nos resíduos 235 a 249 (a numeração de resíduos de acordo com a SEQ ID NO: 2), por exemplo, os resíduos HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) na região proximal à mem- brana foram protegidos da troca de H/D mediante ligação a TMEB570.

[0427] Epítopo de TMEB675 TMEW1 mostrou uma redução mo- desta na absorção de deutério nos resíduos 235 a 268 (a numeração de resíduos de acordo com a SEQ ID NO: 2), por exemplo, os resíduos DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58) na região proximal à membrana foram protegidos da troca de H/D mediante ligação a TMEB675.

[0428] Os resíduos do epítopo de TMEB570, TMEFF2 abrangeram assim HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) e os resíduos do epí- topo de TMEB675 abrangercam DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58). Ambos os anticorpos se ligaram a TMEFF2 dentro da região proximal à membrana. Exemplo 6. Geração de anticorpos anti-CD3

[0429] O anticorpo anti-CD3 CD3B219 foi descrito em US9850310.

[0430] Anticorpos anti-CD3 adicionais foram gerados por imuniza- ção de OmniRats (OMT'Y) - Os sobrenadantes de hibridoma obtidos foram triados quanto à ligação aos linfócitos T CD3* humanos e de ci- nomolgo, os clones foram isolados e sequenciados, e em alguns casos adicionalmente manipulados. Os anticorpos anti-CD3 foram clonados como vários isótipos incluindo IgG4 silenciosa-efetora com as+ muta- ções S228P, F234A e L235A ou como IgG1 com as mutações L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S e P331S. Dois anticorpos anti- CD3 gerados foram denominados CD3B376 e CD3B450.

[0431] A afinidade de ligação in vitro de CD3B376 e CD3B450 a células T humanas foi determinada por citometria de fluxo após cruzar com braço alvo específico para antígeno. Foi feito um estudo prelimi- nar em células T humanas para determinar a constante de ligação de saturação de uma molécula traçadora anti-CD3 (KdT). A concentração fixa do traçador ([1]) foi então usada em um ensaio de ligação por competição com concentrações tituladas dos mAbs de teste. O valor de IC so (concentração na qual 50% de inibição é alcançada) da molé- cula de teste foi usado para determinar a afinidade de ligação (K 4) com o uso da seguinte fórmula: Ka = IC50/(1+([T]/KaKT)). Cinco doado- res humanos foram usados para determinar a constante de ligação de saturação (KJaT) do traçador, um anti-CD3 AlexaFluor488 SP34-2 co- mercialmente disponível (Bioscience nº 557705) (dados não mostra- dos).

Determinação da constante de ligação de saturação do traçador (KaT)

[0432] Métodos: Células pan-T humanas foram criogenicamente armazenadas em tanques de nitrogênio até serem usadas. As células T foram descongeladas, lavadas com PBS, ressuspensas em tampão de coloração de FACS, contadas (com viabilidade anotada), e ressus- pensas a 0,5 x 1086 células/ml. O corante Far Red Live/Dead (Life Technologies, AKA Invitrogen nº L34974) (50 ul de DMSO em um frasco) foi adicionada em 1 ul por 1 x 10º células; e bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec nº 130-059-901) (1 mL de uma diluição 1:20 por 0,5 x 108 células) foi adicionado às células por 10 minutos cada. As células foram plaqueadas a 50.000 células/poço e lavadas. Concen- trações crescentes do anti-CD3 AlexaFluor488 SP-34 foram adiciona- das às células T durante 2 horas a 4ºC. As células foram lavadas para remover anticorpo não ligado, fixadas durante 15 minutos, lavadas e ressuspensas em tampão de coloração de FACS contendo EDTA 1 mM.

[0433] O citômetro de fluxo Intellicyte iQue foi usado para medir a ligação. As células foram selecionadas para população de células T,

seguido de singlets de células, seguido de células vivas (FL4). A média geométrica de coloração (FL1) foi determinada para cada poço.

[0434] Os valores de intensidade de fluorescência média captura- dos foram plotados como função da concentração de moléculas de anticorpo e analisados com o uso do software Prism em uma análise de ligação em um único sítio (ligação total). O software calcula o valor do Ka correspondente que descreve a ligação da molécula de anticor- po a um receptor (o CD3 em células pan-T humanas) que segue a lei da ação das massas. A fórmula é a seguinte: Y = (Bmax < X) / (Ka + X); onde: Bmax é a ligação máxima; K q é a concentração de ligante ne- cessária para atingir metade da ligação máxima.

[0435] Resultados: Os valores de K «a foram derivados para cada doador, e o valor médio obtido. A constante de ligação de saturação (KaT) para células T humanas foi derivada para ser 5,6 + 1,0 nM (n = 4) e foi usada na fórmula precedentemente mencionada para determi- nar afinidades de ligação Ka. Determinação da afinidade de ligação de mAbs anti-CD3 por ensaio de competição

[0436] Estudos de ligação por competição foram realizados com o uso de CD3B376 e CD3B450. Células pan-T humanas foram usadas para determinar a afinidade de ligação dos mAbs. O traçador usado foi o anti-CD3 AlexaFluor488 SP-34 comercialmente disponível (BioSci- ence nº 557705) e a constante de ligação de saturação para este tra- çador é descrita acima.

[0437] As células T foram criogenicamente armazenadas em tan- ques de nitrogênio até serem usadas. As células T foram descongela- das, lavadas com PBS, ressuspensas em tampão de coloração de FACS, contadas com viabilidade anotada, e ressuspensas a 0,5 x 10º células/ml. O corante Far Red Live/Dead (Life Technologies, AKA Invi- trogen nº L34974) (50 ul de DMSO em um frasco) foi adicionada em 1 ul por 1 x 106 células; e bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec nº 130- 059-901) (1 mL de uma diluição 1:20 por 0,5 x 10º células) foi adicio- nado às células por 10 minutos cada. As células foram plaqueadas a

50.000 células/poço e lavadas.

[0438] Os mAbs (e controle de isótipo), foram serialmente diluídos 1:2 a partir de uma concentração inicial de 1000 ou 200 pg/ml (2X), e uma concentração fixa do traçador (5 ug/ml; 2X) foi misturada em con- junto para render concentrações de 1X. Portanto, a concentração final (1X) do traçador foi de 2,5 ug/ml = 16,6 nM. A mistura foi adicionada às células T durante 2 horas a 4 ºC. As células foram, então, lavadas para remover anticorpos não ligados, fixadas por 15 minutos, lavadas e ressuspensas em tampão de coloração de FACS contendo EDTA a 1 mM.

[0439] O citômetro de fluxo Intellicyte iQue foi usado para medir a ligação. As células foram selecionadas para população de células T, seguido de singlets de células, seguido de células vivas (FL4). A média geométrica de coloração (FL1) foi determinada para cada poço. Os valores de intensidade de fluorescência média capturados foram plota- dos como função do log da concentração de moléculas de anticorpos (convertido para nM) e analisados com o uso de software Prism em uma sigmoide de dose-resposta (coeficiente angular variável) a partir da qual os valores de ECS0/IC50 (em nM) são derivados. A afinidade de ligação (Ka) foi derivada com o uso da seguinte fórmula: Ka = IC50/(1+([T]/KaT)). Onde: K a é a afinidade do competidor (molécula não marcada); IC50 em nM do composto de teste; [T] é a concentra- ção do traçador (16,6 nM); Ka T é a Ka do traçador determinada por ligação de saturação (5,6 nM para humano).

[0440] O sítio de ligação de CD3B376 foi mais forte do que o de CD3B450 em ambas as formas, bivalente e monovalente.

Tabela 15. posa arcos eso ot Construto monovalente CD3B376

[0441] As sequências de aminoácidos de CDR, VH e VL de CD3B219, CD3B376 e CD3B450 são mostradas na Tabela 16. Tabela 16. lAnticorpo [Região Sequência de aminoácidos ISEQ ID] NO: cD3B219 HCDR1 TYAMN Bo | HCDR2 RIRSKYNNYATYYAASVKG HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY LICDR1 RSSTGAVTTSNYAN LCDR2 IGTNKRAP LCDR3 IALWYSNLWV IVH (CD3B219VH) [|EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN

WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGR

FTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNF |GNSYVSWFAYWGOQGTLVTVSS VL (CD3B219VL) [QATVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA |67

NWVQQOKPGAQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLL IGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG

TKLTVL cD3B376 |HCDR1 NNNAAWS Be | HCDR2 RTYYRSKWLYDYAVSVKS Be HCDR3 evsssFDY LICDR1 TGTSSNIGTYKFVS LCDR2 EVSKRPS LCDR3 IVSYAGSGTLL VH (CcD3H219) — JAVOLAQASGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAA |74

WSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKS RITVNPDTSRNQFTLOLNSVTPEDTALYYCARGYSS

ISFDYWGQGTLVTVSS VL (CD3L150) — JASALTQPASVSGSPGOSITISCTGTSSNIGTYKFVS |75

WYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSG NTASLTISGLOAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGT

KLTVL cD3B450 |HCDR1 NNNAAWS Be | HCDR2 RTYYRSKWLYDYAVSVKS Be

IVH (CD3H231) QVALQQASGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAA |59

WSWIRQOSPSRGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKS RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGYSS

ISFDYWGQGTLVTVSS IVL (CD3L197) IQSALTQPASVSGSPGOQSITISCTGTSSNIGTYKFVS 111

WYQQHPGKAPKVMIYEVSKRPSGVSNRFSGSKSG NTASLTISGLOAEDEADYYCVSYAGSGTLLFGGGTK|

LTVL SEQ ID NO: 76 HC de CD3B219; (IgG4 S228P, F234A, L235A, F405L e R409K)

EVQOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTED TAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDK

SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 77 LC de CD3B219

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAP RGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCAL WYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 78 HC de CD3B376 (IgG4 S228P, F234A, L235A, F405L e R409K)

QVALAQASGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRG LEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPED TALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQE

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 79 LC de CD3B376

QSALTQPASVSGSPGOSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPK VLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQOAEDQADYHCVSYA GSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

[0442] A Tabela 17 mostra as SEQ ID NOs: de polinucleotídeos que codificam cadeias de anticorpo anti-CD3 Tabela 17 |cDNA de VH |cDNA de VL |cDNA de HC IcDNA de LC e fo SEQ ID NO: 105 cDNA de VH de CD3B219

GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGG CGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAA CACCTACGCCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGCC TGGAATGGGTGGCCCGGATCAGAAGCAAGTACAACAATTACGCCA CCTACTACGCCGCCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGG GACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAA ACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGGCAACTT CGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCA CCCTCGTGACCGTGTCATCT

SEQ ID NO: 106 cDNA de VL de CD3B219

CAGACCGTCGTGACCCAGGAACCTAGCCTGACCGTGTCTCCTGG CGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGA CCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCAGGCCAG GCTCCCAGAGGACTGATCGGCGGCACCAACAAGAGAGCCCCTGG CACCCCTGCCAGATTCAGCGGATCTCTGCTGGGAGGAAAGGCCG CCCTGACACTGTCTGGCGTGCAGCCTGAAGATGAGGCCGAGTAC TACTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTEGTTCGGCGGAGGÇ

CACCAAGCTGACAGTGCTG SEQ ID NO: 80 cDNA de HC de CD3B219

GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGG CGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAA CACCTACGCCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGCC TGGAATGGGTGGCCCGGATCAGAAGCAAGTACAACAATTACGCCA CCTACTACGCCGCCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGG GACGACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAA ACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGGCAACTT CGGCAACAGCTATGTGTCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCA CCCTCGTGACCGTGTCATCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCOGTCOT TCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC GCCCTGGGCTEGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACC TGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAA CTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCEGAGAAAAC

CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATCECcCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC

CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCOGACGGCTCCTTCCTCCOTCTACAGCA AGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAG

AAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 81 cDNA de LC de CD3B219

CAGACCGTCGTGACCCAGGAACCTAGCCTGACCGTGTCTCCTGG CGGCACCGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGA CCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAGCAGAAGCCAGGCCAG GCTCCCAGAGGACTGATCGGCGGCACCAACAAGAGAGCCCCTGG CACCCCTGCCAGATTCAGCGGATCTCTGCTGGGAGGAAAGGCCG CCCTGACACTGTCTGGCGTGCAGCCTGAAGATGAGGCCGAGTAC TACTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCTGTGGGTEGTTCGGCGGAGGÇ CACCAAGCTGACAGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTG TCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGG CCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGA CAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGT GGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGG CCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCAC AGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGA

GAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA SEQ ID NO: 107 cDNA de VH de CD3B376

CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCTAGACTCGTGCGGCCTTCCE CAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCATCTCCGGCGACTCCOGTGTTCA ACAACAACGCCGCCTGGTCCTGGATCCGGCAGAGCCCTTCTAGAG GCCTGGAATGGCTGGGCCGGACCTACTACCGGTCCAAGTGGCTGT ACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCGTGAACCCTG ACACCTCCCGGAACCAGTTCACCCTGCAGCTGAACTCCGTGACCOCC TGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGGCTACTCCTCCTCC

TTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCOT SEQ ID NO: 108 cDNA de VL de CD3B376

AGTCTGCTCTGACCCAGCCOTGCCTCCGTGTCTGGCTCTCCCGGC CAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCOGGC ACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGCC CCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCGST GTCCTCCAGATTETCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCOT GACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACT GTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGEC

ACCAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO: 82 cDNA de HC de CD3B376

CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCTAGACTCGTGCGGCCTTC CCAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCATCTCOGGCGACTCCGTGETT CAACAACAACGCCGCCTGGTCCTGGATCCGGCAGAGCCCTTCTA GAGGCCTGGAATGGCTGGGCCGGACCTACTACCGGTCCAAGTGG CTGTACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCGTGAA CCCTGACACCTCCCGGAACCAGTTCACCCTGCAGCTGAACTCCGT GACCCCTGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGAGGCTACT

CCTCCTCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCOGTGE TCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCOGTCTTCCCCoTGGCGCCC

TGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCET GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACT CAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACCTGCAACGTAGATCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATA TGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGG66

GACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCA TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTEGGTGGACGTGÇ AGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT TCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCO AGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCGTCCTCCATOEGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCOCA GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCCTCCTCTACAGCAAGCTAACCGTGGACAA GAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGT

CTCTGGGTAAA SEQ ID NO: 83 cDNA de LC de CD3B376

CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCEGTGTCTGGCTCTCCCGGÇ CCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCTCCAACATCOGG CACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGACAAGGC CCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTGTCCAAGCGGCCCTCTGGCG TGTCCTCCAGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCC TGACCATCAGCGGACTGCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCAC TGTGTGTCCTACGCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGÇ CACCAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTG TCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGG CCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGA CAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGT GGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGG CCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCAC AGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGA

GAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA Exemplo 7. Geração de anticorpos biespecíficos para TMEFF2 x CD3

[0443] Os anticorpos anti-TMEFF2 e anti-cCD3 monoespecíficos selecionados foram expressos como IgG4/K. Foram feitas as substitui- ções de F405L e R409K (numeração EU) em anticorpos anti-CD3, en- quanto os anticorpos anti-TMEFF2 tinham IgG4 de tipo selvagem. Em adição às substituições de posição 405 e 409, os mAbs IgG4 foram modificados para ter substituição de S228P, F234A e L235A.

[0444] Os anticorpos monoespeciíficos foram expressos e purifica- dos com métodos convencionais usando uma coluna de Proteína À (coluna HiTrap MAbSelect SuRe). Após a eluição, os agrupamentos foram dialisados em D-PBS pH 7,2.

[0445] Anticorpos biespecíficos para TMEFF2 x CD3 foram gera- dos por combinação de um mAb monoespecífico para TMEFF2 e um mAb monoespecífico para CD3 na troca de braço de Fab in vitro (como descrito na publicação de patente internacional nº WO2011/131746. Resumidamente, a cerca de 1 a 20 mg/ml a uma razão molar de 1:1 de cada anticorpo em PBS, pH 7-7,4 e 75 mM de 2-mercaptoetanolamina (2-MEA) foram misturados e incubados a 25 a 37ºC durante 2 a 6 ho- ras, seguido de remoção de 2-MEA através de diálise, diafiltração, fil- tração de fluxo tangencial e/ou filtração de células centrifugadas com o uso de métodos convencionais.

[0446] Os anticorpos biespecíficos foram adicionalmente purifica- dos após a troca de braço Fab in vitro com o uso de cromatografia de interação hidrofóbica para minimizar os anticorpos anti-TMEFF2 e anti- CD3 parentais residuais com o uso de métodos convencionais.

[0447] A Tabela 18 e a Tabela 19 mostram os anticorpos biespe- cíficos gerados.

Tabela 18. Parental (braçoHCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDRI |LCDR2 |CDR3 IAnticorpo para —TMEFF2, biespecífico |braço para CD3) Tabela 19. lAnticorpo — bi-Parental (braço para TMEFF2/ bra-VH VL Hc LC específico ço para CD3) Exemplo 8. Caracterização de anticorpos TMEFF2 x CD3 biespecíficos Análise de pureza por ultracentrifugação analítica (UCA)

[0448] A ultracentrifugação analítica (UCA) permite a determina- ção do tamanho, formato, estado de agregação e da interação reversí- vel de macromoléculas em solução. A velocidade de sedimentação (SV) é uma técnica de UCA que permite que um gradiente de concen-

tração de uma macromolécula se mova para o raio externo do suporte de amostra (célula) como a centrífuga gira. Isto permite a determina- ção do coeficiente de sedimentação que é um fator do tamanho e for- mato de uma molécula, e é exclusivo para cada molécula. O instru- mento de UCA Beckman Optima foi usado para este propósito. As amostras foram carregadas em células de centrífuga equipadas com arranjos de Beckman de 1,2 cm (classificado para 50K rpm) e janela de quartzo. As células são montadas e torqueadas a 130 libras. As cé- lulas a serem centrifugadas foram colocadas em um rotor An-50 (8 ori- fícios) ou um An-60 (4 orifícios) e colocadas na câmara de UCA. A temperatura da UCA foi equilibrada em 20,5ºC por pelo menos uma hora com o rotor na câmara antes de iniciar o teste. Os processos fo- ram executados a 40 k rpm para amostra de mAb com contagem de varredura (250 varreduras), frequência de coleta de varredura (90 se- gundos), resolução de dados (10 um), comprimento de onda de 280 nm. Os dados foram analisados com o uso do software de ajuste direto de limite SEDANAL. A pureza do anticorpo biespecífico TMCB150 e de seus mAbs parentais foi medida. TMCB150 mostrou 97,1% de monô- meros, 2,8% de dímeros e sem agregação, como determinado pelo critério aceitável de UCA para material de pesquisa temporariamente expressos para caracterização biofísica adicional. TMEB762 mostrou 95,5% de monômeros, 4,5% de dímeros e sem agregação, enquanto CD3B376 mostrou 97,7% de monômeros e 2,2% de dímeros sem agregação. Os níveis de agregados > 5% de um mínimo de moléculas purificadas em duas etapas poderiam ter um impacto significativo na atividade biológica, solubilidade, estabilidade e vida útil.

Estabilidade conformacional de anti-TMEFF2/CD3 biespecífico por CVD

[0449] O desdobramento térmico de TMCB150 foi determinado por CVD (calorimetria de varredura diferencial) que mostrou um início do desdobramento em Tm = 52,6ºC, a primeira transição térmica (Tm1)

em 61,8 ºC, a segunda transição térmica (Tm2) em 67,6 ºC e a tercei- ra transição térmica (Tm3) em 75,5 ºC. Com base no perfil de transi- ção térmica dos anticorpos parentais (anti- TMEFF2, TMEB762 e anti- CD3, CD3B376), como avaliado por CVD antes, a Tm1 de TMCB150 corresponde ao desdobramento de Fab de CD3B376 e a Tm3 de TMCB150 corresponde ao desdobramento de Fab de TMEB762. Estabilidade no soro

[0450] O ensaio de estabilidade no soro foi desenvolvido para ava- liar as propriedades dos candidatos líder para ligação não específica ou fora do alvo aos componentes do soro humano. Isso pode ser pre- ditivo de propriedades farmacocinéticas e de biodistribuição insatisfató- rias. A ligação e a estabilidade de TMCB150 são avaliadas tanto em tampão como em soro humano com o uso de um método de cromato- grafia à base de fluorescência. O anticorpo biespecífico é marcado com conjugado de Alexa Fluor 488 (kit Invitrogen de acordo com as instruções do fabricante), incubado em tampão Hepes e soro humano (Sigma, cat. nº H4522) a 4 ºC e 37 ºC durante 2 dias e, então, analisa- do por SEC-HPLC com o uso do sistema HPLC Agilent equipado com detector de fluorescência. A porcentagem de agregado é calculada por meio da integração da área sob a curva de cada pico. TMCB150 mos- trou 2,4% de agregação em tampão Hepes no instante zero e 2,0% e 1,3% de agregação após dois dias a 4 ºC e 37 ºC, respectivamente. No soro humano, TMCB150 mostrou 1,7% de agregação no instante zero e 1,1% de agregação após dois dias tanto a 1,1 ºC como 37,4 ºC. Ligação não específica

[0451] A ligação específica da molécula líder às superfícies não relacionadas é determinada por tecnologia de biossensor (Biacore 8K). O anticorpo é passado sobre superfícies de SPR revestidas com prote- ínas não relacionadas. Se o anticorpo apresentar ligação significativa a estas superfícies irrelevantes, é predito como tendo propriedades insa-

tisfatórias in vivo e apresenta desafios de fabricação. A molécula líder é testada na concentração final de 1 UM. As superfícies irrelevantes incluem proteína negativamente carregada (inibidor de tripsina de so- ja), proteína positivamente carregada (lisozima e B-defensina), proteí- na hidrofóbica (Rh-integrina a4b7), IgG humana, proteína pegajosa (Rh-CD19). São usados controles adequados neste experimento. A líder é colocada sobre duas superfícies, uma está em branco (blank) e a outra tem uma molécula imobilizada diretamente. A unidade de resposta (RU) é determinada subtraindo a RU em branco da RU da superfície de teste. A RU de TMCB150 e dos mAbs parentais são mostradas abaixo na tabela. Uma unidade de resposta > 100 prediz altos riscos para liga- ção não específica às superfícies carregadas/hidrofóbicas/IgG, o que criaria desafios durante a fabricação e traduziria em propriedades PK insatisfatórias. Nenhum dos anticorpos mostra ligação não específica a superfícies irrelevantes, predizendo baixo risco ou nenhum risco para fabricação e comportamento in vivo. Tabela 20. [ou ST Jessensnas oo ramana Jusosima prriniegrina s4o7 rreoro | poem 5 e o peer as pr is Ro pg pg Estabilidade em alta concentração

[0452] Muitos anticorpos monoclonais são formulados em alta concentração (>100 mg/ml) para reduzir o volume de injeção e facilitar a administração subcutânea. Além disso, todos os anticorpos mono- clonais são expostos a concentrações temporariamente altas (> 50 mg/ml) durante o processo de purificação. A estabilidade em alta con- centração é portanto um atributo de qualidade de importância crítica para estas moléculas. A concentração é realizada com o uso de dispo- sitivos de ultrafiltração centrífuga com membranas PMC de 30k Da Fo- ram inicialmente diluídos 5,1 a 5,3 mg de cada proteína para a mesma concentração inicial e centrifugadas a 4000xg em intervalos de 15 mi- nutos. No final de cada etapa de centrifugação de 15 minutos, os con- centradores são removidos da centrífuga e uma estimativa visual do volume restante de amostra é registrado. A concentração é medida pelo instrumento SoloVPE. As amostras concentradas foram incuba- das a 4ºC e 40ºC durante 2 semanas e alíquotas foram extraídas em intervalos temporizados para verificar a integridade por SEC analítica. TMCB150 e os mAbs parentais (CD3B376 e TMEB762) se concentra- ram normalmente. A concentração final de TMCB150 foi de 99,4 mg/ml e a dos mAbs parentais foi de 52,2 mg/ml (TMEB762) e 52,6 mg/ml (CD3B376). A concentração permaneceu a mesma durante 2 semanas em 4ºC e 40ºC sugerindo que as moléculas têm boas propriedades intrínsecas sem potencial para agregação ou adsorção aos tubos ep- pendorf. A % na amostra (A: Agregado; M: Monômero F Fragmento) como medido por meio da integração do pico de SEC é fornecida abai- xo na tabela. Em alta concentração, as moléculas são intactas com 4 a 5% de agregados e < 0,3% de fragmentos após armazenamento du- rante 2 semanas a 40 ºC prevendo boa vida útil. Tabela 21.

EEE REA E EO pes be br bo a e o ss perez bs 5 br so nm ss ppa sp 5 E) Determinação de afinidade de anticorpo anti-TMEFF2/CD3 biespeciífi- co por ensaio de exclusão cinética (KinExA)

[0453] Um instrumento KinExA 3200 (Sapidyne Instruments, Inc.) foi usado para medir a afinidade de equilíbrio da solução, K o, do mAb biespecífico TMCB150 e seu mAb TMEB762 parental TMEFF2 biva- lente ao domínio extracelular (ECD) de TMEFF2 humano. As diluições seriais de domínio extracelular (ECD) de TMEFF2 humano foram pre-

paradas com uma concentração constante de mAb anti-TMEFF2 em HEPES 10 mM, NaCL 150 mM, tensoativo P20 0,05%, pH 7,4, BSA 0,1% e NaN3 0,02%. As misturas de reação foram incubadas à tempe- ratura ambiente até que a interações de ligação atingissem o equilí- brio. A duração da incubação foi determinada com o uso de simulação de software KinExA. As microesferas foram preparadas por imobiliza- ção covalente direta do ECD de TMEFF2 por acoplamento de amina em microesferas pré-ativadas compostas de copolímero de bis- acrilamida/azolactona (Pierce Biotechnology, Inc.). Depois da incuba- ção as amostras foram medidas no instrumento KinExA para avaliar os anticorpos livres na mistura por passagem da mistura através das mi- croesferas modificadas de TMEFF2, e pela detecção dos anticorpos capturados com o uso de um anticorpo secundário marcado fluores- centemente. Os dados foram ajustados com um modelo de ligação 1:1 usando o software KinExA Pro. Tabela 22. amostra demablc pt — casi BM Medição de afinidade de ligação de anticorpo anti-TMEFF2/CD3 bies- pecífico ao peptídeo CD3e N-terminal

[0454] As constantes cinéticas foram medidas por SPR executada com o uso do Biacore 8K (GE Healthcare) e superfícies de biossensor anti-Fc humano. Os anticorpos anti-imunoglobulina humana foram co- valentemente acoplados à superfície de um chip sensor CM4 (GE Healthcare). Os anticorpos de interesse foram capturados no chip de sensor de imunoglobulina humana, seguido da injeção de peptídeo CD3e N terminal em várias concentrações em solução salina tampo- nada HEPES contendo 0,05% de tensoativo P20 (Tween'Y 20) e 100 ug/ml de BSA. A superfície foi regenerada com injeções de 2 pulsos de uL de ácido fosfórico 0,8% a 100 uL/minuto. Os dados registrados são a diferença no sinal SPR entre a célula de fluxo contendo do anti- corpo capturado e uma célula de referência sem o anticorpo captura- do. Contribuições instrumentais adicionais ao sinal foram removidas pela subtração dos dados da injeção de branco do sinal subtraído de referência. Os dados foram analisados por ajuste das fases de associ- ação e dissociação em todas as concentrações (ajuste global) com um modelo de ligação de 1:1 usando o software Biaevaluation (Biacore, Inc.). Os dados são relatados como média + IC (intervalo de confiança) 95% que é calculado por valor t para 95% IC * desvio padrão/raiz quadrada do número de réplicas.

Tabela 23.

Amostra de Média Média Média IC 95%, Ko Exemplo 9. Anticorpos biespecíficos para TMEFF2 x CD3 são eficazes no extermínio de células de câncer de próstata mediado por células T. Extermínio de células de câncer de próstata in vitro mediado por célu- las T.

[0455] Anticorpos biespecíficos para MEFF2 x CD3 selecionados foram avaliados quanto à sua capacidade para mediar o extermínio de células de câncer de próstata mediado por células T.

[0456] O extermínio mediado por células T dos anticorpos biespe- cíficos para TMEFF2 x CD3 foi medido com o uso de um ensaio de citotoxicidade de caspase que mede indiretamente a morte celular através de clivagem de um substrato fluorescente por caspase ativa 3/7. A clivagem do substrato resulta em um corante de DNA fluores- cente, com fluorescência restrita ao núcleo celular. São feitas medi- ções repetidas de fluorescência em cada poço durante todo o curso do ensaio, com o uso de uma objetiva de 10X motorizada, capaz de ima- gear os poços nas mesmas coordenadas. Populações de células alvo são identificadas com base em restrições de tamanho definidas e/ou através do uso de um marcador secundário.

[0457] As células pan-T CD3 * congeladas (Biological Specialty Corporation, Colmar, PA) foram isoladas por seleção negativa de doa- dores saudáveis normais. Células de câncer de próstata que expres- sam TMEFF2 (LNCaP-AR) foram cultivadas em RPMI 1640 com 10% de HI SFB + suplementos (Life Technologies). Células T e células alvo foram combinadas em uma razão de efetora para alvo (E:T) de 3:1 em RPM! sem vermelho de fenol + SFB 10% e suplementos (Life Techno- logies), sem reagentes de seleção, e 0,6 ul de reagente de caspase NucvView (Essen Bioscience) foi adicionado a cada ml de células, como as orientações do fabricante. Um volume total de 0,1 mL de células foi adicionado aos poços adequados de uma placa de fundo plano de 96 poços transparente (BD Falcon). Os anticorpos biespecíficos para TMEFF2 x CD3 foram preparados em concentração final 2X em RPMI sem vermelho de fenol, preparado como indicado acima, e 0,1 ml de compostos foram adicionados a cada poço. Após 30 minutos de incu- bação à temperatura ambiente para minimizar a agregação celular na borda dos poços, as placas foram transferidas para o instrumento Zo- om Incucyte (Essen Bioscience), mantidas a 37 ºC, 5% de CO».

[0458] Foram designadas definições de processamento no |In- cucyte para cada linhagem de células testada, como as orientações do fabricante. Foram tomadas medições foram a cada seis horas, até que um platô no sinal da caspase fosse observado, e as medições foram seguidas de três ou mais diminuições sucessivas a partir do sinal ná- ximo no(s) poço(s) contendo a concentração mais alta do(s) compos- to(s) de teste.

[0459] Após o ensaio estar completo, cada placa foi analisada com o uso da definição de processamento adequada. Os dados fluorescen- tes em bruto foram exportados do software Incucyte Zoom, e colados no GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). A ativida- de de caspase 3/7 foi determinada pelo cálculo da área sob a curva (AUC - "area under the curve") para cada poço no GraphPad. Os valo- res da AUC foram plotados como função do Log10 de nM do compos- to. A EC50 para cada curva de dose, em nanomolares (nM), foi relata- da após análise de regressão não linear (ajuste de 4 parâmetros, mí- nimos quadrados ordinários). Cada ensaio continha um mínimo de três réplicas biológicas, e cada linhagem celular foi testada com o uso de células T de cinco doadores saudáveis. Os dados foram adicionalmen- te analisados por estatística não clínica com o uso de um modelo de regressão não linear.

[0460] A Figura 3 mostra a morte de células LnCaP ao longo do tempo como medido pelo aumento da atividade de caspase 3/7 de an- ticorpos CD3 biespecíficos para TMEFF2 x CD3 selecionados. Anticorpos biespecíficos para TMEFF2 x CD3 são eficazes em mode- los de tumor de câncer de próstata in vivo.

[0461] Anticorpos biespecíficos selecionados foram testados em um modelo de câncer de próstata LnCaP ex vivo em camundongos machos NSG. Para o estudo, 10º células LnCaP em Cultrex 50% em 0,2 mL/animal foram administradas por injeção subcutânea no flanco direito no Dia 0. Os animais foram selecionados aleatoriamente quan- do os tumores atingiram um volume de cerca de 100 a 150 mm? e fo- ram injetadas por via intraperitoneal 20º células T/camundongo no Dia

15. Foram dez animais em cada grupo. O tratamento com os anticor- pos começou de 1 a 3 dias após as injeções de células T. Os anticor- pos foram administrados por via intraperitoneal duas vezes por sema- na. Antes da dosagem, todos os animais receberam IVIG + Fc Block. O volume tumoral e o peso corporal foi avaliado duas vezes por sema-

na até que os tumores atingissem aproximadamente 1200 mmº?. Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 24. O anticorpo para CD3 x Nulo (Nul/) foi usado como um controle negativo nestes ensaios, tendo braço de ligação CD3B219 CD3 e um braço nulo que se liga a HIV gp120.

Tabela 24.

E mess ccossaTa sra po veste quenTS consta meto po vestes ronsBTA psmers — |

[0462] A Tabela 25 mostra a porcentagem de inibição do cresci- mento tumoral no Dia 38 por cada grupo após o implante tumoral.

[0463] A Figura 4 mostra a redução no volume médio do tumor ao longo do tempo após o implante tumoral. A Figura 5A mostra a redu- ção no volume médio do tumor de cada camundongo tratado com 0,5 mg/kg de TMCB93. A Figura 5B mostra a redução no volume médio do tumor de cada camundongo tratado com 0,5 mg/kg de TMCB132. Tabela 25.

ENTOTOOS NIE ERA

[0464] A eficácia de TMEB762 x CD3B376 (TMCB150) foi avaliada também em xenoenxertos de LNCaP estabelecidos em camundongos machos NOD.Cg-Prkdc*º* I2rgTmIWiVSZJ (NSG) humanizados com 20€6 células T. Os animais foram agrupados aleatoriamente em gru- pos de 10 animais cada, por volume médio do tumor, no Dia 13 após a implantação do tumor. TMEB762 x CD3B376 em 0,5, 0,1 e 0,05 mg/kg ou anticorpo de controle nulo x CD3B376 a 0,5 mg/kg foram dosados por via intraperitoneal duas vezes por semana durante 5 semanas. No Dia 35 após a implantação do tumor, quando pelo menos oito animais permaneceram por grupo, foi calculada a inibição do crescimento tu- moral (% ICT), como determinado pelo volume tumoral. A inibição do crescimento tumoral estatisticamente significativa foi observada com TMEB762 x CD3B376 a 0,5 e 0,1 mg/kg, mas não a 0,05 mg/kg, em comparação com o controle nulo x CD3 (Figura 6). TMEB762 x CDB376 a 0,5, 0,1 e 0,05 mg/kg induziu a inibição de crescimento tu- moral em 110%, 88% e 25%, respectivamente, em comparação com os controles tratados com nulo x CD3. O tratamento com TMEB762 x CDB376 resultou em sete e três respostas completas a 0,5 e 0,1 mg/kg, respectivamente. Os tumores subcutâneos de LNCaP foram medidos por paquímetro duas vezes por semana e os resultados apre- sentados como volume médio do tumor (mm 3) + EPM (> 8 camundon- gos restantes por grupo).

Ativação de células T em resposta à administração de TMCB132

[0465] A ativação de células T em células de câncer de próstata

LnCaP foi medida por citometria de fluxo, especificamente por avalia- ção da positividade para CD25 de células T CD3+/CD8+ em 6 doado- res saudáveis normais separados (9642, 9672, 9762, 9772, 9832, 9852), 72 horas após o tratamento com TMCB132 (Figura 7). A ativa- ção de células pan-T CD3+ adicionadas em uma razão de efetora:alvo foi observada em resposta à administração de TMCB132 em células de câncer de próstata LnCaP. Citotoxicidade mediada por células T de TMCB132 in vitro.

[0466] O ensaio de citotoxicidade mediada por células T de TMCB132 foi usado para avaliar o potencial de citotoxicidade de TMCB132 in vitro, com o uso de imageamento por lapso de tempo ao vivo na plataforma Incucyte. TMCB132 foi testado em linhagem celular LnCaP positiva para TMEFF2, na presença de células T CD3+ huma- nas isoladas de doadores saudáveis em uma razão de efetora:alvo (Effector: Target) (razão E:T) de 3:1. A morte celular por apoptose foi monitorada mediante a medição do sinal de fluorescência para a cas- pase ativa 3/7 ao longo de um período de tempo de 96 horas. TMCB132 promoveu uma redução dose-dependente de células LnCaP viáveis com o aumento do tempo. O aumento dose-dependente na ati- vidade de caspase 3/7 ou no sinal de fluorescência indicaram morte celular em células LnCaP na presença das células T (Figura 8). Os dados sugerem que TMCB132 é eficaz na indução de morte mediada por células T nas células tumorais LnCaP. Eficácia de TMCB132 em xenoenxerto de próstata humano SC estabe- lecido em camundongos humanizados com células T.

[0467] A eficácia antitumoral de TMCB132 foi avaliada em xeno- enxertos de LNCaP de próstata humano subcutâneo (SC) estabelecido em camundongos machos NOD.Cg-Prkde*** 112rg TM WiVSzZJ (NSG, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) humanizados com 20€º células T. NSG machos. Os animais foram agrupados aleatoriamente em gru-

pos de 10 animais cada, por volume médio do tumor, no Dia 13 após a implantação do tumor.

TMCB132 em 0,5, 0,1 e 0,05 mg/kg ou anticor- po de controle nulo x CD3B376 a 0,5 mg/kg foram dosados por via in- traperitoneal duas vezes por semana durante 4 semanas.

No Dia 45 após a implantação do tumor, quando pelo menos sete animais per- maneceram por grupo, foi calculada a inibição do crescimento tumoral (% ICT), como determinado pelo volume tumoral.

A inibição do cresci- mento tumoral estatisticamente significativa foi observada com a TMCB132 a 0,5 e 0,1 mg/kg e 0,05 mg/kg, em comparação com o con- trole nulo x CD3 (Figura 9, p < 0,0001). TMCB132 a 0,5, 0,1 e 0,05 mg/kg induziu a inibição de crescimento tumoral em 102%, 109% e 47%, respectivamente, em comparação com os controles tratados com nulo x CD3. O tratamento com TMCB132 resultou em três, duas e uma resposta completa a 0,5, 0,1 e 0,05 mg/kg, respectivamente.

Claims (79)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, caracterizado por se ligar a uma região proximal à membrana da SEQ ID NO: 110 de TMEFF?2.

2. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado por o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo competir pela ligação à região proximal à membrana de TMEFF2 com um anticorpo de referência que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28; ou b) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29; c) a VH da SEQ ID NO.: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30; d) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31; e) a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88; ou f) a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

3. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizado por o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar nos resíduos HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) ou DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58) à região proximal à membrana de TMEFF2.

4. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado por compreender uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR?2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de ca- deia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3 das a) SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente;

b) SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente; ou e) SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente.

5. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizado por o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar à região proximal à membrana de TMEFF2 com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kp) de cer- ca de 0,4 x 10º M ou menor, em que a Kp é medida com o uso de res- sonância plasmônica de superfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à temperatura ambiente.

6. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizado por o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo se ligar à região proximal à membrana de TMEFF2 com a K »- entre cerca de 0,1 x 10º e cerca de 0,4 x 10º M.

7. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6, caracterizado por o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma estrutura de região variável de cadeia pesada (VH) derivada de VH3 3-23 (SEQ ID NO: 53) ou VH1 1-69 (SEQ ID NO: 54).

8. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizado por compreender uma estrutura de região variável de cadeia leve (VL) derivada de VKI L11 (SEQ ID NO: 55) ou VKIIII A27 (SEQ ID NO: 56).

9. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga-

ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, caracte- rizado por compreender a estrutura de VH e a estrutura de VL deriva- das de a) VH3 3-23 da SEQ ID NO: 53 e VKI L11 da SEQ ID NO: 55, respectivamente; b) VH1 1-69 da SEQ ID NO: 54 e VKIII A27 da SEQ ID NO: 56, respectivamente; ou c) VH1 1-69 da SEQ ID NO: 54 e VKI L11 da SEQ ID NO: 55, respectivamente.

10. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado por compreender: a) a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28; b) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29; c) a VH da SEQ ID NO.: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30; d) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31; e) a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88; ou f) a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

11. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo ser um isotipo I1gG1, Ig9G2, IgG3 ou IgG4.

12. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 11, carac- terizado por compreender: a) uma cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 32 e uma ca- deia leve (LC) da SEQ ID NO: 35; b) a HC da SEQ ID NO: 33 e a LC da SEQ ID NO: 36; c) a HC da SEQ ID NO.: 34 e a LC da SEQ ID NO: 37; d) a HC da SEQ ID NO: 33 e a LC da SEQ ID NO: 38;

e) a HC da SEQ ID NO: 91 e a LC da SEQ ID NO: 92; ou f) a HC da SEQ ID NO: 93 e a LC da SEQ ID NO: 94.

13. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 25 e uma VL da SEQ ID NO: 28; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 32 e uma LC da SEQ ID NO: 35.

14. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 36.

15. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 34 e uma LC da SEQ ID NO: 37.

16. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22,

respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 33 e uma LC da SEQ ID NO: 38.

17. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 91 e uma LC da SEQ ID NO: 92.

18. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou um fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: a) uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente; b) uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90; e/ou c) uma HC da SEQ ID NO: 93 e uma LC da SEQ ID NO: 94.

19. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo multiespecífico.

20. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo biespecífico.

21. Anticorpo anti-TMEFF?2 isolado, de acordo com a reivin- dicação 19 ou 20, caracterizado por o anticorpo se ligar ao CD3, opci- onalmente CD3 épsilon.

22. Composição farmacêutica, caracterizada por compre-

ender o anticorpo anti-TMEFF2 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a21 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. Anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou o fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 20, caracterizado por ser conjugado a uma ou mais molé- culas heterólogas.

24. Polinucleotídeo isolado, caracterizado por: a) codificar o anticorpo anti-TMEFF2 ou o fragmento de |i- gação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 18; b) codificar a VH do anticorpo anti-TMEFF2 das SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 87 ou 89 e/ou a VL das SEQ ID NOs: 28, 29, 30, 31, 88 ou 90.

d) compreender uma sequência de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 ou 102.

25. Vetor, caracterizado por compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24.

26. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o ve- tor como definido na reivindicação 25.

27. Método de produção do anticorpo anti-TMEFF2 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qual- quer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 26 em con- dições nas quais o anticorpo é expresso, e recuperar o anticorpo pro- duzido pela célula hospedeira.

28. Método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeutica-

mente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2 isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou da composição farmacêutica como definida na reivindicação 22, para tratar o câncer positivo para TMEFF2.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do por o câncer positivo para TMEFF2 ser um câncer de próstata.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do por o câncer de próstata ser um câncer de próstata recidivado, re- fratário, maligno ou resistente à castração, ou qualquer combinação dos mesmos.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 30, caracterizado por o anticorpo anti-TMEFF2 ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo ser administrado em combi- nação com um segundo agente terapêutico.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do por o segundo agente terapêutico ser cirurgia, quimioterapia, tera- pia de privação androgênica ou radiação, ou qualquer combinação das mesmas.

33. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado por se ligar ao anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 18.

34) Kit, caracterizado por compreender o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 18.

35. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3.

36. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a rei- vindicação 35, sendo o anticorpo caracterizado por se ligar à região proximal à membrana da SEQ ID NO: 110 de TMEFF?2.

37. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a rei- vindicação 35 ou 36, sendo o anticorpo caracterizado por competir pe- la ligação à região proximal à membrana de TMEFF2 com um anticor- po de referência que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28; ou b) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29; c) a VH da SEQ ID NO.: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30; d) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31; e) a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88; ou f) a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 920.

38. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 37, sendo o anticorpo caracterizado por se ligar nos resíduos HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 57) ou DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 58) à região proximal à mem- brana de TMEFF2.

39. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 38, sendo o anticorpo caracterizado por se ligar à região proximal à membrana de TMEFF2 com uma cons- tante de dissociação de equilíbrio (Kp) de cerca de 0,4 x 10º M ou me- nor, em que a Kp é medida com o uso de ressonância plasmônica de superfície em tampão acetato em pH 4,5 a 5,0 à temperatura ambien- te.

40. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a rei- vindicação 39, sendo o anticorpo caracterizado por se ligar à região proximal à membrana de TMEFF2 humano com a K p entre cerca de 0,1 x 10º e cerca de 0,4 x 10 º M.

41. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizado por o primeiro do- mínio compreender uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: a) SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente; ou e) SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente.

42. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a rei- vindicação 41, caracterizado por o segundo domínio compreender a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 de a) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respectivamente; ou b) SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivamente.

43. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 42, caracterizado por o primeiro do- mínio compreender: a) a VH da SEQ ID NO: 25 e a VL da SEQ ID NO: 28; b) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 29; c) a VH da SEQ ID NO.: 27 e a VL da SEQ ID NO: 30; d) a VH da SEQ ID NO.: 26 e a VL da SEQ ID NO: 31 e) a VH da SEQ ID NO: 87 e a VL da SEQ ID NO: 88; ou f) a VH da SEQ ID NO: 89 e a VL da SEQ ID NO: 90.

44. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 43, caracterizado por o segundo domínio compreender: a) a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; ou b) a VH da SEQ ID NO.: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75.

45. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 32, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 35, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 76 e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 77.

46. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das

SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: e uma VL da SEQ ID NO: 28, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 32, uma LC1 da SEQ ID NO: 35, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

47. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

48. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 19, 21 e 23, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 29, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 36, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

49. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da

SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

50. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 14, 17, 18, 20 e 24, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VL da SEQ ID NO: 30, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 34, uma LC1 da SEQ ID NO: 37, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

51. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO:

26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

52. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 13, 16, 18, 20 e 22, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 26 e uma VL da SEQ ID NO: 31, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 33, uma LC1 da SEQ ID NO: 38, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

53. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

54. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 87 e uma VL da SEQ ID NO: 88, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 91, uma LC1 da SEQ ID NO: 92, uma HC2 da SEQ ID NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

55. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se-

gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64 e 65, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 66 e a VL da SEQ ID NO: 67; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID NO: 76 e uma LC2 da SEQ ID NO: 77.

56. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um primeiro domínio que se liga ao TMEFF2 e um se- gundo domínio que se liga ao CD3, sendo que: a) o primeiro domínio compreende uma HCDR1, uma HCDR2, uma HCDR3, uma LCDR1, uma LCDR2 e uma LCDR3 das SEQ ID NOs: 10, 12, 15, 18, 20 e 86, respectivamente, e o segundo domínio compreende a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3, a LCDR1, a LCDR?2 e a LCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respecti- vamente; b) o primeiro domínio compreende uma VH da SEQ ID NO: 89 e uma VL da SEQ ID NO: 90, e o segundo domínio compreende a VH da SEQ ID NO: 74 e a VL da SEQ ID NO: 75; e/ou c) o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HC1 da SEQ ID NO: 93, uma LC1 da SEQ ID NO: 94, uma HC2 da SEQ ID

NO: 78 e uma LC2 da SEQ ID NO: 79.

57. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 56, sendo o anticorpo caracterizado por ser um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

58. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 57, caracterizado por o anticorpo compreender alanina na posição 234, alanina na posição 235 ou ala- nina na posição 234 e alanina na posição 235 na HC1, na HC2, ou na HC1 e na HC2, em que a numeração de resíduos está de acordo com o Índice EU.

59. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 35 a 58, sendo o anticorpo caracterizado por compreender prolina na posição 228 na HC1 e na HC2, em que a numeração de resíduos está de acordo com o índice EU.

60. Anticorpo anti-TMEFF2 x CD3 biespecífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 59, sendo o anticorpo caracterizado por compreender fenilalanina na posição 405 e arginina na posição 409 na HC1, e leucina na posição 405 e lisina na posição 409 na HC?2.

61. Composição farmacêutica, caracterizada por compre- ender o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 60 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

62) Polinucleotídeo, caracterizado por: a) codificar o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 45 a 56 ou b) que compreende uma sequência de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 80, 81, 82, 83, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 e 102.

63) Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 62.

64) Célula hospedeira caracterizada por compreender o ve- tor como definido na reivindicação 63.

65. Método de produção de um anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender fazer a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 64 em condições nas quais o anticorpo é expresso, recuperar e purificar o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo produ- zido pela célula hospedeira.

66. Método de produção do anticorpo anti-TMEFF2/anti- CD3 biespecífico, ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 45 a 56, caracteri- zado por compreender: a) combinar um anticorpo monoespeciífico bivalente para TMEFF?2 tendo duas HC1 idênticas e duas LC1 idênticas, e um anti- corpo monoespeciífico bivalente para CD3 tendo duas HC2 idênticas e duas LC2 idênticas em uma mistura com razão molar de cerca de 1:1; b) introduzir um agente redutor na mistura; c) incubar a mistura de cerca de noventa minutos a cerca de seis horas; d) remover o agente redutor; e e) purificar o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende a HC1, a LC1, a HC2 e a LO2.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracteriza-

do por o agente redutor ser 2-mercaptoetanolamina (2-MEA).

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do por a 2-MEA estar presente em uma concentração de cerca de 25 mM a cerca de 75 mM.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 66 a 68, caracterizado por a etapa de incubação ser executada a uma temperatura de cerca de 25ºC a cerca de 37ºC.

70. Método de tratamento de um câncer positivo para TMEFF2 em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeutica- mente eficaz do anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico, ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qual- quer uma das reivindicações 45 a 60, ou da composição farmacêutica como definida na reivindicação 61, para tratar o câncer positivo para TMEFF?2.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteriza- do por o câncer positivo para TMEFF2 ser um câncer de próstata.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do por o câncer de próstata ser um câncer de próstata recidivado, re- fratário, maligno ou resistente à castração, ou qualquer combinação dos mesmos.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 70 a 72, caracterizado por o anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 bi- específico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ser admi- nistrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do por o segundo agente terapêutico ser cirurgia, quimioterapia, tera- pia de privação androgênica ou radiação, ou qualquer combinação das mesmas.

75. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado por se ligar ao anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico, ou ao fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 45 a 56.

76) Kit, caracterizado por compreender o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 45 a 56.

77. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico isolado, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 56, caracterizado por se desti- nar ao uso em terapia.

78. Anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespeciífico isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 45 a 56, caracterizado por se destinar ao uso no tratamento de câncer positivo para TMEFF2.

79. Uso, do anticorpo anti-TMEFF2/anti-CD3 biespecífico isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 45 a 60, caracterizado por se destinar à fabricação de um medicamento para tratamento de cân- cer positivo para TMEFF2.