JP2024026260A - カリクレイン関連ペプチダーゼ2抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により
本明細書に組み込まれている配列表を含む。上記ASCIIコピーは、2020年6月2
3日に作成され、名称はJBI6125USNP1_SL.txtであり、サイズは76
4,265バイトである。
本発明は、カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを
含むhK2タンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それをコードしているポリヌクレオ
チド、ベクター、宿主細胞、それを作製及び使用する方法を提供する。
前立腺癌は、診断頻度が2番目に高い癌であり、男性における癌の死因の6位であり、
世界中の男性の全ての新たな癌症例の14%(903,500)及び全ての癌死亡の6%
(258,400)を占める。前立腺癌の診断から死亡までの過程は、疾患の程度、ホル
モン状態、及び検出可能な転移の有無:限局性疾患、放射線療法又は手術後に検出可能な
転移なく前立腺特異的抗原(PSA)のレベルが上昇していること、並びに非去勢病期又
は去勢病期における臨床的転移に基づいて、一連の臨床段階として最善に分類される。手
術、放射線照射、又はこれら両方の併用は、限局性疾患の患者にとって治癒的なものにな
り得るが、これらの患者のうちのかなりの割合は、PSAレベルの上昇をエビデンスとす
る再発性疾患を有し、これは、特に高リスク群における転移の発生、すなわち、疾患の終
末期への移行につながる場合がある。
SAの低下、腫瘍が増殖しない安定期、続いて、PSAの上昇、及び去勢抵抗性疾患とし
ての再成長である。長年にわたり、ADTは、転移性前立腺癌の患者のための標準治療で
あった。
に駆動されて前立腺組織及び前立腺癌に特異的に発現するトリプシン様酵素である。hK
2は、膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)によって活性化され、前立腺の
管に分泌され、そこで、射精液中の細胞外マトリクスであるセメノゲリンを切断して精子
の運動性を増強するカスケードを開始させる。hK2発現は、前立腺及び前立腺癌組織に
限定されるが、最近、ステロイドホルモンによりAR経路が適切に活性化された後の乳癌
株及び一次患者サンプルでhK2が検出可能であることが証明された(米国特許出願公開
第2018/0326102号)。PSAと同様に、肥大又は悪性形質転換時に前立腺の
高度に構造化された組織化が損なわれた場合に、触媒的に不活性なhK2の血液への逆行
性放出が生じる。
本開示は、カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを
含む単離タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、
単離タンパク質を提供する:
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号137のVHのHCD
R1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号138のVLのLCDR1、LCD
R2、及びLCDR3;又は配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHC
DR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号16
5のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号166のVHのHC
DR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号167のVLのLCDR1、LC
DR2、及びLCDR3;又は配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びH
CDR3、並びに配列番号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又
は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号2
05のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
メインであって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号75の重鎖可変領
域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)を含む、単離抗原結合ドメインを提
供する。
ドメインを提供する。
ンを含む単離多重特異性タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが
、以下を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する:配列番号137の重鎖可変領域(
VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列
番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR2、
及びLCDR3;又は配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3
、並びに配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番
号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163のV
LのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号164のVHのHCDR1
、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号165のVLのLCDR1、LCDR2
、及びLCDR3;又は配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR
3、並びに配列番号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列
番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号169の
VLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号204のVHのHCDR
1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号205のVLのLCDR1、LCDR
2、及びLCDR3。特定の実施形態では、本開示は、カリクレイン関連ペプチダーゼ2
(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、当該
hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162の重鎖可変領域(VH)の重鎖相
補性決定領域(HCDR)1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163の軽
鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3
を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
ンを含む単離多重特異性タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが
、配列番号75の重鎖可変領域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)を含む
、単離多重特異性タンパク質を提供する。
インを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
ンを含む、単離キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
ンを含む単離キメラ抗原受容体(CAR)であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離キメラ抗原受容体(CAR)を提供する:配列番号137の重
鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCDR2、及びHCDR3
、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、
LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及
びHCDR3、並びに配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3
;又は配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号164のVH
のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号165のVLのLCDR1
、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、
及びHCDR3、並びに配列番号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR
3;又は配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列
番号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号204のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号205のVLのLCDR
1、LCDR2、及びLCDR3。特定の実施形態では、本開示は、カリクレイン関連ペ
プチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離キメラ抗原受容体(CA
R)であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162の重鎖可変領
域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCDR2、及びHCDR3、並びに
配列番号163の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR
2、及びLCDR3を含む、単離キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
ンを含む単離キメラ抗原受容体(CAR)であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメ
インが、配列番号75の重鎖可変領域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)
を含む、単離キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
ど)に結合する第2の抗原結合ドメインを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、単
離抗hK2/抗CD3タンパク質である、単離多重特異性タンパク質を提供する。
ゲートを提供する。
む、免疫コンジュゲートを提供する。
パク質を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
免疫コンジュゲートを提供する。
提供する。
む、医薬組成物を提供する。
パク質を含む、医薬組成物を提供する。
医薬組成物を提供する。
離ポリヌクレオチドを提供する。
ードしている、単離ポリヌクレオチドを提供する。
パク質をコードしている、単離ポリヌクレオチドを提供する。
している、単離ポリヌクレオチドを提供する。
。
K2に結合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパ
ク質、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質、当該hK2
に結合する抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開
示の医薬組成物を、当該hK2発現癌を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要
としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
に結合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質
、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質、当該hK2に結
合する抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の
医薬組成物を、当該hK2発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって当該対
象に投与することを含む、方法を提供する。
合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、当
該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質、当該hK2に結合す
る抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬
組成物を、それを必要としている対象に投与して、当該対象におけるhK2発現癌の定着
を予防することを含む、方法を提供する。
を治療する方法であって、hK2に結合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗
原結合ドメインを含むタンパク質、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特
異性タンパク質、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免
疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与して、
当該非癌性状態を治療することを含む、方法を提供する。
に結合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質
、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質、当該hK2に結
合する抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の
医薬組成物を、当該前立腺癌を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としてい
る対象に投与することを含む、方法を提供する。
合する抗原結合ドメイン、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、当
該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質、当該hK2に結合す
る抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬
組成物を、当該乳癌を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている対象に
投与することを含む、方法を提供する。
コンジュゲートを当該対象に投与することと、当該免疫コンジュゲートのhK2への結合
を検出し、それによって、前立腺癌又は乳癌を検出することと、を含む、方法を提供する
。
メインを含むタンパク質、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タン
パク質、当該hK2に結合する抗原結合ドメインを含むCAR-T、本開示の免疫コンジ
ュゲート、又は本開示の医薬組成物を含む、キットを提供する。
イプ抗体を提供する。
メインと、少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイ
ンと、を含む、キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
るであろう。TM:膜貫通。
開示される方法は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳
細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される方法は、
本明細書に記載及び/又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使
用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記
載の方法に限定することを意図しないことを理解されたい。
かもその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。
ストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「A、
B、又はC」として提示される実施形態のリストは、実施形態「A」、「B」、「C」、
「A又はB」、「A又はC」、「B又はC」、又は「A、B、又はC」を含むと解釈され
るべきである。
及び「the」は、特にその内容が明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。
したがって、例えば、「細胞(a cell)」という言及には、2つ又は3つ以上の細胞の組
み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
ly of)」、及び「からなる(consisting of)」は、特許用語において全般的に受け入れ
られている意味を含意することを意図しており、すなわち、(i)「備える/含む(comp
rising)」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は
非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものでは
なく、(ii)「からなる(consisting of)」は、特許請求の範囲において特定されて
いない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに(iii)「から本質的になる
」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴
(複数可)に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。句「備え
る/含む(comprising)」(又はその同等語)に関して記載される実施形態はまた、実施
形態として、「からなる」及び「から本質的になる」に関して独立して記載されるものを
提供する。
とを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事
項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は
明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に
従う1つの標準偏差又は5%までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味す
る。
ーの発現、サイトカイン産生、又は標的細胞の増殖若しくは細胞傷害性の媒介をもたらす
、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化さ
れ得る。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制
することができ、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能
をもたらす。「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナル
と組み合わせて、T細胞及び/若しくはNK細胞の増殖並びに/又は鍵となる分子のアッ
プレギュレーション若しくはダウンレギュレーションを引き起こすシグナルを指す。
る構造化コアを含有する一本鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカ
フォールドの完全性を損なうことなく導入される多様性を許容するため、可変ドメインは
、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
エフェクター細胞で発現するFcガンマ受容体(FcγR)を介して、抗体でコーティン
グされた標的細胞の、ナチュラルキラー細胞(NK)、単球、マクロファージ、及び好中
球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存する細胞死を誘導する機
序を指す。
貪食細胞による取り込みによって抗体でコーティングされた標的細胞を排除する機序を指
す。
合することができる任意の分子(例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質
、糖脂質、核酸、これらの一部、又はこれらの組み合わせ)を指す。例示的な免疫応答と
しては、抗体産生、及びT細胞、B細胞、又はNK細胞などの免疫細胞の活性化が挙げら
れる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分、生物、タン
パク質/抗原のサブユニット、殺傷若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体
サンプルからの遺伝子によって発現し得る、当該サンプルから合成され得る、又は当該サ
ンプルから精製され得る。
指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝
的に操作されたポリペプチドであってよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの
一部、例えば、VH、VL、VH及びVL、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd及
びFv断片、1つのVHドメイン又は1つのVLドメインからなるドメイン抗体(dAb
)、サメ可変IgNARドメイン、ラクダ化VHドメイン、VHHドメイン、FR3-C
DR3-FR4部分などの抗体のCDRを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニッ
ト、HCDR1、HCDR2、及び/又はHCDR3、並びにLCDR1、LCDR2、
及び/又はLCDR3、抗原に結合するオルタナティブスカフォールド、並びに抗原結合
断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片(VH及びVLなど)は、
合成リンカーを介して互いに連結して、VH及びVLドメインが別々の一本鎖により発現
された場合にVH/VLドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン
、例えば一本鎖Fv(single chain Fv、scFv)又はダイアボディを形成することが
できる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二
重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性
であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又はオルタナティブスカフォールドに
コンジュゲートされてもよい。
体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性など
の多重特異性抗体、二量体、四量体、若しくは多量体の抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体
、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変さ
れた構造を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によ
り相互接続された、2本の重鎖(heavy chain、HC)及び2本の軽鎖(light chain、L
C)、並びにこれらの多量体(例えばIgM)から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域
(heavy chain variable region、VH)、並びに重鎖定常領域(ドメインCH1、ヒン
ジ、CH2、及びCH3からなる)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(light ch
ain variable region、VL)及び軽鎖定常領域(constant region、CL)から構成され
る。VH領域及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)が散在しており相補性決定領
域(CDR)と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各VH及びVLは、アミノ末
端からカルボキシ末端に向かって以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、F
R3、CDR3、及びFR4で配置された、3つのCDR及び4つのFRセグメントで構
成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、5つの主要な
クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMに割り当てられ得る。I
gA及びIgGは、アイソタイプのIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3
及びIgG4として更に細分類される。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメ
インのアミノ酸配列に基づいて、2つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ(κ)及
びラムダ(λ)のうちの一方に割り当てることができる。
異的に結合する分子(抗体など)を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒ
ト若しくはサル、例えば、カニクイザル(Macaca cynomolgus、cyno)若しくはチン
パンジー(Pan troglodytes)などの他の種由来の同じ抗原(ホモログ)に対して交差反
応性を有し得るか、又は2つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得
る。
抗体」、「抗hK2/抗CD3タンパク質」などは、hk2及びCD3に結合し、そして
、hK2に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメイン及びCD3に特異的に結合す
る少なくとも1つの結合ドメインを含む抗体を指す。hK2及びCD3に特異的に結合す
るドメインは、典型的にはVH/VL対である。二重特異性抗hk2×CD3抗体は、h
k2又はCD3のいずれかへの結合に関して一価であってよい。
範な群を指す。制御されていない細胞分裂及び成長は、隣接組織を浸潤する悪性腫瘍の形
成をもたらし、リンパ系又は血流を介して身体の遠位部分にも転移し得る。「癌」又は「
癌組織」は、腫瘍を含み得る。
ンパク質において一緒にみられることのない組み合わせで、細胞外標的結合ドメイン、膜
貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞表面受容体として定義される
。これには、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが天然では単一の受容体タ
ンパク質において一緒にみられることのない受容体が含まれる。CARは、主に、T細胞
及びナチュラルキラー(NK)細胞などのリンパ球での使用が意図される。
タードメインが補体成分C1qに結合して活性化し、次に、補体カスケードを活性化して
標的細胞の死を引き起こす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細
胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせ得、白血球への補体受容体(例えば、CR3)
の結合によって、CDCを容易にする。
DR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)が存在し、VLには3つのCDR(LCD
R1、LCDR2、LCDR3)が存在する。CDRは、以下のものなどの様々な描写を
用いて定義することができる:Kabat(Wu et al.(1970)J Exp
Med 132:211-50;Kabat et al.,Sequences o
f Proteins of Immunological Interest,5th
Ed.Public Health Service,National Insti
tutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Choth
ia(Chothia et al.(1987)J Mol Biol 196:90
1-17),IMGT(Lefranc et al.(2003)Dev Comp
Immunol 27:55-77)、及びAbM(Martin and Thorn
ton J Bmol Biol 263:800-15,1996)。様々な記述と可
変領域の付番との対応が記載されている(例えば、Lefranc et al.(20
03)Dev Comp Immunol 27:55-77;Honegger an
d Pluckthun,J Mol Biol(2001)309:657-70;I
nternational ImMunoGeneTics(IMGT)データベース;
ウェブリソース、http://www_imgt_orgを参照のこと)。UCL B
usiness PLCによるabYsisなどの利用可能なプログラムを使用して、C
DRを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「CDR」、「HCDR1
」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及び「LCD
R3」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したKabat、Chothia
、IMGT、又はAbMの方法のいずれかにより定義されるCDRを含む。
T細胞上で発現し、2本又は4本の受容体鎖:CD3イプシロン、CD3デルタ、CD3
ゼータ、及びCD3ガンマの会合から形成されたホモ二量体又はヘテロ二量体からなる抗
原を指す。ヒトCD3イプシロンは、配列番号442のアミノ酸配列を含む。本明細書に
おけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種
由来のものであると明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、
又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図する。したがって、「CD3」は
、非ヒト種、例えば、「マウスCD3」「サルCD3」などからのものとして指定されな
い限り、ヒトCD3を意味する。
CD3抗体」は、CD3-イプシロン細胞外ドメイン(ECD)(配列番号443)に特
異的に結合する抗体を含む、CD3-イプシロンポリペプチド(配列番号442)に特異
的に結合する抗体を指す。CD3-εは、CD3-γ、-δ、及び-ζ、並びにT細胞受
容体α/β及びγ/δヘテロダイマーと一緒に、T細胞受容体-CD3複合体を形成する
。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路を認識する抗原結合において重要な
役割を果たす。CD3複合体はシグナル伝達を媒介し、T細胞の活性化及び増殖をもたら
す。CD3は、免疫応答に必要である。
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVS
ISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDE
DHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVC
ENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKA
KPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLY
SGLNQRRI
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQH
NDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPR
GSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
概して、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、より少ない応答を
媒介する(すなわち、下流効果)試験分子の能力を指す。例示的な応答は、T細胞拡大、
T細胞活性化、又はT細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容
体への結合、増強されたFcγへの結合、又は増強されたADCC、CDC及び/若しく
はADCPなどの増強されたFcエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照(又
はビヒクル)との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約1.1、1.2、1.
5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、若しくは30倍以上、例えば
、500、600、700、800、900、若しくは1000倍以上(1を上回る全て
の整数及びその間の小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8等を含む)の減少
等、測定された応答の減少であってよい。
れた状態に移行させる方法を指す。
RNA、tRNA及びmRNA)又は規定の配列のアミノ酸のいずれかを有する、生物学
的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子を合成するためのテンプレートとして機能
する、遺伝子、cDNA、又はmRNAなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの
特定の配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞
又は他の生物系において、遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳がタンパク質を生成
する場合、その遺伝子、cDNA、又はRNAは、タンパク質をコードする。ヌクレオチ
ド配列がmRNA配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はcDNAの転写のテンプレー
トとして使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又は他
の産物をコードするとして言及され得る。
、概して、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、より多い応答を
媒介する(すなわち、下流効果)試験分子の能力を指す。例示的な応答は、T細胞拡大、
T細胞活性化、又はT細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容
体への結合、増強されたFcγへの結合、又は増強されたADCC、CDC及び/若しく
はADCPなどの増強されたFcエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照(又
はビヒクル)との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約1.1、1.2、1.
5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、若しくは30倍以上、例えば
、500、600、700、800、900、若しくは1000倍以上(1を上回る全て
の整数及びその間の小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8等を含む)の増加
等、測定された応答の増加であってよい。
的には、化学的に活性な(極性、非極性又は疎水性など)部分の表面集団、例えばアミノ
酸又は多糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピ
トープは、高次構造的空間単位を形成する連続的な及び/又は不連続なアミノ酸で構成さ
れ得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分からのアミノ酸が、タン
パク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」
は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
指す。発現産物、例えば、タンパク質は、このように、細胞によって又はインビトロで発
現し、そして、細胞内、細胞外、又は膜貫通タンパク質であってよい。
ドされているポリペプチドの翻訳を導くために生体系又は再構成された生体系において利
用することができるベクターを指す。
d et al.,Nature 341:544 546(1989))。
る抗体断片を指す。
によって接続された2つのFab断片を含む抗体断片を指す。
ンで構成される抗体断片を指す。Fv断片は、Fab(CH1及びCL)領域の定常領域
を欠いている。Fv断片におけるVH及びVLは、非共有結合性相互作用によって一緒に
保持される。
プチドのうちの1つを指す。例えば、二量体IgG FCのFCポリペプチドは、IgG
CH2及びIgG CH3定常ドメイン配列を含む)。
、HC)及び2本の軽鎖(light chain、LC)、並びにこれらの多量体(例えば、Ig
M)で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン(VH)及び重鎖定常ドメインで構成さ
れ、重鎖定常ドメインは、サブドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3で構成される
。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)で構成される。V
H及びVLは、フレームワーク領域(framework region、FR)に散在している相補性決
定領域(complementarity determining region、CDR)と称される超可変性の領域に更
に区分され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順
序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4で配置された
、3つのCDR及び4つのFRセグメントで構成される。
子、DNA又はRNA配列を導入し、その結果、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を
発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされてい
るタンパク質又は酵素を生成することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クロ
ーニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロ
モーター、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機構によって使用される他の配列などのキメ
ラ抗原受容体をコードしているポリヌクレオチドに動作可能に連結された調節配列又は制
御配列を含んでいてよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有さない非機能的配列を含ん
でいてよい。導入されたDNA又はRNAを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に
操作されている」。宿主細胞に導入されたDNA又はRNAは、宿主細胞と同じ属若しく
は種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
ヌクレオチド又は2つ以上のポリペプチドを指す。
天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
然には存在しないポリペプチドを指す。
ー(例えば、発現ベクター)である。
化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト
抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列
に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成
された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来す
る」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディス
プレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を
保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」
は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違
い、フレームワーク若しくはCDRへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、
又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違
いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成さ
れた免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配
列が少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%又は99%同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばKnappik
et al.,(2000)J Mol Biol 296:57-86に記載される
ヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えば
Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397:385-96及び
国際公開第2009/085462号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グ
ロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成HCDR3を含有し得る。少なくとも1つ
のCDRが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
レームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレーム
ワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン
又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。
内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成す
ることにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情
報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャに応答することによりエフ
ェクターとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR
含有細胞(例えば、CAR-T細胞)の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成
する。
離及び/又は精製された分子(例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド)の均質
な集団に加えて、少なくとも1つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単
離された」とは、他の細胞材料及び/又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より
高い純度、例えば80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%、99%、又は100%の純度まで単離された分子を包含する。
リクレイン2、又はHK2とも呼ばれる既知のタンパク質を指す。hK2は、プレプロタ
ンパク質として生成され、タンパク質分解中に切断されて活性プロテアーゼを生成する。
全てのhK2アイソフォーム及びバリアントが、「hK2」に包含される。様々なアイソ
フォームのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_005542.1
、NP_001002231.1、及びNP_001243009から検索可能である。
配列番号62における完全長ヒトhK2のアミノ酸配列を示す。配列は、シグナルペプチ
ド(残基1~18)及びプロペプチド領域(残基19~24)を含む。
MWDLVLSIALSVGCTGAVPLIQSRIVGGWECEKHSQPWQ
VAVYSHGWAHCGGVLVHPQWV
LTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHP
LYNMSLLKHQSLRPDEDSSHD
LMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGS
IEPEEFLRPRSLQCVSLHLLS
NDMCARAYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVC
NGVLQGITSWGPEPCALPEKP
AVYTKVVHYRKWIKDTIAANP
い又はより少ない応答を媒介する(すなわち、下流効果)試験分子の増強された又は減少
した能力のいずれかを指す。
成する個別の抗体が、抗体重鎖からのC末端リジンの除去などの可能な周知の変更、ある
いはアミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化、又はアスパラギン若しくはグ
ルタミンアミド分解などの翻訳後修飾を除いて同一である)から得られた抗体を指す。モ
ノクローナル抗体は、典型的には、1つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノ
クローナル抗体は、2つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、
抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であ
ってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であ
ってよい。
ープに特異的に結合する抗体などの分子を意味する。多重特異性分子は、他の関連抗原、
例えば、ヒト若しくはサル、例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis、cyno)
若しくはチンパンジー(Pan troglodytes)などの他の種由来の同じ抗原(ホモログ)に
対して交差反応性を有し得るか、又は2つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトー
プに結合し得る。
される。NK細胞は、CD16+CD56+及び/又はCD57+TCR-表現型を有す
る分化リンパ球を指す。NK細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」M
HC/HLA抗原を発現できない細胞に結合し、殺傷する能力、腫瘍細胞又はNK活性化
受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害
するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連
結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモーター、エンハンサーエレメント、オー
プンリーディングフレーム、5’及び3’UTR、並びにターミネーター配列は、核酸分
子(例えば、RNA)の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生(
すなわち、オープンリーディングフレームの発現)をもたらす。動作可能に連結されたペ
プチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図
された機能を付与するペプチドを指す。
の区域又は領域を指す。パラトープは、高次構造的空間単位を形成する連続的及び/又は
不連続なアミノ酸で構成され得る。所与の抗体のパラトープは、様々な実験及び計算方法
を使用して、様々なレベルで詳細に定義及び特性評価することができる。実験方法は、水
素/重水素交換質量分析(HX-MS)を含む。パラトープは、用いられるマッピング方
法に応じて異なって定義される。
せを指す。
指す。
外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、バッファ、安定剤
、又は防腐剤である。
学的作用によって共有結合しているヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。cDNAが、
ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子であり得
る。
象における障害の発生を防ぐことを意味する。
また、それぞれ転写を増強又は抑制するエンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み
得る。
合によって連結された少なくとも2つのアミノ酸残基でそれぞれが構成される1つ以上の
ポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若し
くは異なる2つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。50個未満のア
ミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種
融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミト
イル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化
、ADP-リボシル化、ペグ化、若しくはビオチン化などの翻訳後修飾によって修飾され
たタンパク質であってよい。タンパク質は、組み換え発現し得る。
クレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
ランス作用性遺伝要素を指す。
再開することを指す。
に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
体断片及び重鎖可変領域(VH)を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タンパク質
であって、VL及びVHが、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポ
リペプチドとして発現することができる、融合タンパク質を指す。特に指定しない限り、
本明細書で使用するとき、scFvは、VL及びVH可変領域をいずれの順序で有してい
てもよく、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、scFvは、VL-リン
カー-VHを含んでいてもよく、又はVH-リンカー-VLを含んでいてもよい。
軽鎖可変領域(VL)及び2つの重鎖可変領域(VH)を含む融合タンパク質であって、
2つのVL及び2つのVH領域が、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一
本鎖ポリペプチドとして発現することができる、融合タンパク質を指す。ペプチドリンカ
ーによって融合された2つのVL領域及び2つのVH領域は、二価分子VLA-リンカー
-VHA-リンカー-VLB-リンカー-VHBを形成して、2つの異なる抗原又はエピ
トープに同時に結合することができる2つの結合部位を形成する。
」とは、タンパク質性分子が、抗原又は当該抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親
和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約1×
10-7M以下、例えば約5×10-8M以下、約1×10-8M以下、約1×10-9
M以下、約1×10-10M以下、約1×10-11M以下、又は約1×10-12M以
下の平衡解離定数(KD)で抗原又は当該抗原内のエピトープに結合し、典型的には、当
該KDは、非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合についてのKDよりも少
なくとも100倍小さい。本明細書に記載の前立腺ネオ抗原の文脈において、「特異的結
合」とは、タンパク質性分子が、前立腺ネオ抗原がそのバリアントである野生型タンパク
質に検出可能には結合することなく、前立腺ネオ抗原に結合することを指す。
椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、
ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。用語「対象」及び「患者」は、本明
細書で互換的に使用することができる。
る。T細胞は、胸腺細胞、ナイーブTリンパ球、メモリT細胞、未成熟Tリンパ球、成熟
Tリンパ球、静止Tリンパ球、又は活性化Tリンパ球を含む。T細胞は、Tヘルパー(T
h)細胞、例えば、Tヘルパー1(Th1)又はTヘルパー2(Th2)細胞であってよ
い。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)、CD4+T細胞、細胞傷害
性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(TIL;CD8+T
細胞)、CD4+CD8+T細胞、又はT細胞の任意の他のサブセットであってもよい。
また、「NKT細胞」も含まれ、これは、半不変αβT細胞受容体を発現するだけでなく
、NK1.1などの通常NK細胞に関連する様々な分子マーカーも発現するT細胞の特殊
な集団を指す。NKT細胞としては、NK1.1+及びNK1.1-、並びにCD4+、
CD4-、CD8+、及びCD8細胞が挙げられる。NKT細胞のTCRは、MHC I
様分子CD Idによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。NK
T細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、
保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマ-デルタT細胞(γδT細
胞)」も含まれ、これは、その表面上に異なるTCRを有するT細胞の小さなサブセット
である特殊な集団を指し、α-及びβ-TCR鎖と命名された2本の糖タンパク質鎖でT
CRが構成されるT細胞の大部分とは異なり、γδT細胞におけるTCRは、γ鎖及びδ
鎖で構成される。γδT細胞は、免疫監視及び免疫制御において役割を果たすことができ
、そして、IL-17の重要な供給源でありかつロバストなCD8+細胞傷害性T細胞応
答を誘導することが見出された。また、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容にお
ける役割を果たすT細胞を指す「調節性T細胞」又は「Treg」も含まれる。Treg
は、典型的には、転写因子Foxp3陽性CD4+T細胞であり、また、IL-10産生
CD4+T細胞である転写因子Foxp3陰性調節性T細胞も含み得る。
及び期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療的に有効な量は、個体
の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治
療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な治療薬又は治療薬
の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、
腫瘍の成長の停止若しくは減速、及び/又は体内の他の箇所への癌細胞の転移の不在が含
まれる。
ちの1つ以上を達成することを指す:障害の重篤度及び/若しくは期間を低減する、治療
される障害に特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の
再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害について症候性であった対象における症状
の再発を制限若しくは予防する。
いて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細
胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形
質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り
込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発癌物質に曝露した後に発生し、そ
れによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換/癌は、インビトロ、インビ
ボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形
成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好
適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポ
リペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
別途明示的に記載のない限り、Kabat et al.,Sequences of
Proteins of Immunological Interest,5th E
d.Public Health Service,National Institu
tes of Health,Bethesda,MD.(1991)に記載のEUイン
デックスに従う。
07Vは、1つの免疫グロブリン定常領域におけるL351Y、F405A、及びY40
7V変異を指す。L351Y_F405A_Y407V/T394Wは、1つの多量体タ
ンパク質中に存在する、第1のIg定常領域におけるL351Y、F405A、及びY4
07V変異並びに第2のIg定常領域におけるT394W変異を指す。
ノボディを指す。VHH単一ドメイン抗体は、従来のFab領域の軽鎖及び重鎖のCH1
ドメインを欠いている。
hK2に結合する抗原結合ドメイン
本開示は、hK2に結合する抗原結合ドメイン、hK2に結合する抗原結合ドメインを
含む単一特異性及び多重特異性タンパク質(特に二重特異性タンパク質)、hK2に結合
する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)、前述のものをコードしている
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに前述のものを作製及び使用する方法を提
供する。本明細書で同定されたhK2に結合する抗原結合ドメインは、改善された熱安定
性の観点で改善された特性を示した。本明細書に開示される多重特異性タンパク質は、T
細胞媒介性細胞傷害性を媒介する、T細胞の活性化及び増殖を促進する、T細胞サイトカ
イン放出を増加させる、並びに/又は抗腫瘍効果の増加を示すのに特に有効であり得る。
含む単離タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号11
1、112、113、114、又は115に記載のhK2上のエピトープに結合する、単
離タンパク質を提供する。
2に記載のhK2上のエピトープに結合する。
14、及び115に記載のhK2上のエピトープに結合する。
体又はその抗原結合断片が、hK2の残基KVTEF(配列番号111)又はHYRKW
(配列番号112)又はSHGWAH(配列番号113)又はRHNLFEPEDTGQ
RVP(配列番号114)又はGWGSIEPEE(配列番号115)内で結合する、単
離タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本発明はまた、hK2に結合する抗原結
合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該抗原結合ドメインが、KVTEF(配列
番号111)及びHYRKW(配列番号112)の配列を有するエピトープ内でhK2に
結合する、単離タンパク質を提供する。
る。H/D交換アッセイでは、組み換え的に発現させた可溶性hK2を、抗体の存在又は
非存在下、重水素化水中で、所定の時間にわたってインキュベートすると、抗体によって
保護されていない交換可能な水素原子で重水素の組み込みが生じ、続いて、タンパク質の
プロテアーゼ消化及びLC-MSを使用するペプチド断片の分析を行う。H/D交換アッ
セイは、公知のプロトコルを使用して行うことができる。例示的なプロトコルを実施例3
に記載する。いくつかの実施形態では、クエンチングバッファ(例えば、8M尿素、1M
TCEP、pH3.0)の添加によってH/D交換混合物をクエンチした後、室温で平
衡化された固定化ペプシン/FpXIIIカラムに通す(例えば、600μL/分)。次
いで、消化性断片を逆相トラップカラムにロード(例えば、600μL/分)し、脱塩(
例えば、600μLで1分間)し、分離(例えば、C18カラムで)し、質量分析によっ
て分析する(例えば、キャピラリー温度275℃、分解能150,000、及び質量範囲
(m/z)300-1,800でLTQ(商標)Orbitrap Fusion Lu
mos質量分析計(Thermo Fisher Scientific)を用いて)。
結合ドメインが、配列番号111、112、113、114、及び115からなる群から
選択される配列を有するhK2上のエピトープに結合し、hK2に結合する抗原結合断片
が、本明細書に開示する参照抗体とhK2への結合について競合する、単離タンパク質を
提供する。いくつかの実施形態では、参照抗体は、以下を含む:
a.配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
b.配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
c.配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号165のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
d.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
e.配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
f.配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
g.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号444のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
63の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR2、及びL
CDR3を含む。
抗体の結合についての本発明の参照抗体との競合は、周知の方法を用いてインビトロでア
ッセイすることができる。例えば、非標識参照抗体の存在下におけるhK2に対する標識
抗体のhK2の膜近位領域への結合は、ELISA法によって評価してもよく、又はBi
acore分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて競合を実証してもよい。試験抗
体が参照抗体の可溶性hK2への結合を85%以上、例えば、90%以上、又は95%以
上阻害するとき、試験抗体はhK2への結合について参照抗体と競合する。
含む単離タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、
単離タンパク質を提供する:
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号137のVHのHCD
R1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号138のVLのLCDR1、LCD
R2、及びLCDR3;又は配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHC
DR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号16
5のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号166のVHのHC
DR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号167のVLのLCDR1、LC
DR2、及びLCDR3;又は配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びH
CDR3、並びに配列番号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又
は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号2
05のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。特定の実施形態では、単離タン
パク質は、カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含
み、当該hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号162のVHのHCDR1、H
CDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及
びLCDR3を含む。
K2に結合する抗原結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LC
DR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離タンパク質を提供する:
それぞれ配列番号63、65、66、67、69、71;
それぞれ配列番号63、65、66、68、70、71;
それぞれ配列番号72、73、66、67、69、71;
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181。
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、180、181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
ク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号170、1
71、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、L
CDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離タンパク質を提供する。
質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号194、19
5、172、173、174、及び175の配列番号のHCDR1、HCDR1、HCD
R3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離タンパク質を提供する。
K2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号137、162、164、166、168
、又は204のVH及び配列番号138、163、165、167、又は169のVLを
含む、単離タンパク質を提供する。
K2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質を提供する:
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;又は
配列番号204のVH及び配列番号205のVL。
ク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配
列番号163のVLを含む、単離タンパク質を提供する。
該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも80%(例
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む、単離タンパク質を提供する。
62のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
62のVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、
少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一
であるVLを含む。
Hと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一
であるVLを含む。
Hと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一
であるVLを含む。
Hと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一
であるVLを含む。
K2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号133、134、308、316、324
、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を含む
、単離タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本開示は、hK2に結合する抗原結
合ドメインを含む単離タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、
配列番号404のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。
質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号405のアミノ酸配列
を含む、単離タンパク質を提供する。
該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号404のアミノ酸配列と少なくとも8
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。
該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号405のアミノ酸配列と少なくとも8
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。
ンを含む単離タンパク質であって、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号
75の重鎖可変領域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)を含む、単離タン
パク質を提供する。配列番号75及び配列番号74は、親抗体hu11B6と比較した場
合、改善された熱安定性を示すバリアントを包含する属VH及びVLアミノ酸配列を表す
。改善された熱安定性を付与した遺伝子操作される位置は、VHにおける残基P41、I
49、M70、及びA88(配列番号5のhu11B6_VHに従う残基付番)並びにV
LにおけるS80、L82、A88、及びY91(配列番号2のhu11B6_VLに従
う残基付番)であった。
K2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号4、5、6、139、159、又は161
のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、当該hK2
に結合する抗原結合ドメインが、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むこ
とはない、単離タンパク質を提供する。
該hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質を提供する:
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
K2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、135、136、318、3
19、320、321、322、又は323のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提
供する。
る。
る。
hK2に結合する本明細書で同定されたVHドメイン及びVLドメインのいずれも、V
H-リンカー-VL又はVL-リンカー-VH配向のいずれのscFvフォーマットにも
遺伝子操作され得る。また、本明細書で同定されたVH及びVLドメインのいずれも、例
えば以下のsc(Fv)2構造を作製するために使用され得る:VH-リンカー-VL-
リンカー-VL-リンカー-VH、VH-リンカー-VL-リンカー-VH-リンカー-
VL。VH-リンカー-VH-リンカー-VL-リンカー-VL。VL-リンカー-VH
-リンカー-VH-リンカー-VL。VL-リンカー-VH-リンカー-VL-リンカー
-VH、又はVL-リンカー-VL-リンカー-VH-リンカー-VH。
ができ、得られたscFvのhK2への結合及び熱安定性は、既知の方法を使用して評価
することができる。結合は、ProteOn XPR36、Biacore3000、若
しくはKinExA機器、ELISA、又は当業者に公知の競合的結合アッセイを使用し
て評価することができる。結合は、精製されたscFv又は大腸菌上清又は発現したsc
Fvを含有する溶解細胞を使用して評価することができる。試験scFVのhK2に対す
る親和性の測定値は、異なる条件(例えば、モル浸透圧濃度、pH)下で測定した場合に
異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ(例えば、KD、Kon、Ko
ff)の測定は、典型的には、標準化条件及び標準化バッファを用いて行われる。熱安定
性は、50℃、55℃、又は60℃などの高温で、5分(min)、10分、15分、2
0分、25分、又は30分などの期間、試験scFvを加熱し、当該試験scFvのhK
2への結合を測定することによって、評価することができる。非加熱scFvサンプルと
比較したときに、hK2と同等の結合を保持しているscFvが、熱安定性であると称さ
れる。
アミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Gly、Ser Pr
o、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His及びTheである。リン
カーは、hK2への結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構
造を形成するような方法でVH及びVLを連結させるのに適切な長さを有している必要が
ある。
ーは、約10~40個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約1
0~35個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約10~30個
のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約10~25個のアミノ酸
長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約10~20個のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、約15~20個のアミノ酸長である。いくつかの
実施形態では、リンカーは6個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカー
は7個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは8個のアミノ酸長であ
る。いくつかの実施形態では、リンカーは9個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは10個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは11
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは12個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは13個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは14個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは15
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは16個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは17個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは18個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは19
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは20個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは21個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは22個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは23
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは24個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは25個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは26個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは27
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは28個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは29個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは30個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは31
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは32個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは33個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは34個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは35
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは36個のアミノ酸長である
。いくつかの実施形態では、リンカーは37個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、リンカーは38個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは39
個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは40個のアミノ酸長である
。使用され得る例示的なリンカーは、Glyリッチリンカー、Gly及びSer含有リン
カー、Gly及びAla含有リンカー、Ala及びSer含有リンカー、並びに及び他の
柔軟なリンカーである。
リンヒンジ領域、CL又はCH1の部分を含み得る。あるいは、ポリエチレングリコール
(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリ
コールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマー
を、リンカーとして利用してもよい。使用され得る例示的なリンカーを表1に示す。追加
のリンカーは、例えば、国際公開第2019/060695号に記載されている。
ンカー(L1)、及びVLを含む(VH-L1-VL)。
びVHを含む(VL-L1-VH)。
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号162のVHのHCD
R1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCD
R2、及びLCDR3;又は配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHC
DR3、並びに配列番号165のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号16
7のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は配列番号168のVHのHC
DR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号169のVLのLCDR1、LC
DR2、及びLCDR3;又は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びH
CDR3、並びに配列番号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又
は配列番号139のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
40のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
それぞれ配列番号63、65、66、67、69、71;
それぞれ配列番号63、65、66、68、70、71;
それぞれ配列番号72、73、66、67、69、71;
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181。
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、180、181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
44、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
73、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
79、180、及び181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
85、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
82、470、及び209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
44、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
44、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
73、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
79、180、181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
85、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
91、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
82、470、及び209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む。
9、及び71のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びL
CDR3を含む。
0、及び71のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びL
CDR3を含む。
9、及び71のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びL
CDR3を含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
Lを含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号138のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号165のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号167のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号169のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号205のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号160のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号140のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号140のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号140のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
63のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一であるVLを含む。
であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一であるVLを含む。
24、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を
含む。
24、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列と
少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
含む。
、2、又は3のVLを含む。
61のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、hK2
に結合する抗原結合ドメインは、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むこ
とはない。
。
。
。
含む。
含む。
。
。
含む。
含む。
。
。
。
含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
Lを含む。
Lを含む。
含む。
含む。
含む。
Lを含む。
Lを含む。
含む。
含む。
含む。
Lを含む。
Lを含む。
hK2に結合する本明細書で同定されたVHドメイン及びVLドメインのいずれも、F
ab、F(ab’)2、Fd、又はFvフォーマットに遺伝子操作することができ、それ
らのhK2への結合及び熱安定性は、本明細書に記載のアッセイを使用して評価すること
ができる。
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
63のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
65のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
67のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
69のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
又は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
びHCDR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3
を含む。
CDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
それぞれ配列番号63、65、66、67、69、71;
それぞれ配列番号63、65、66、68、70、71;
それぞれ配列番号72、73、66、67、69、71;
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、180、181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
4、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
3、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
9、180、及び181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
5、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
1、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
2、470、209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含む。
4、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
3、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
9、180、181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含む。
5、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
1、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
2、470、及び209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含む。
174、及び175、又はそれぞれ配列番号194、195、172、173、174、
及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLC
DR3を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
む。
む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくと
も99%)同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
63のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
あるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
あるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
あるVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一であるVLを含む。
あるVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号138のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号165のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号167のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号169のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%
)同一であるVH及び配列番号205のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを
含む。
1のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、Fabは
、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことはない。
む。
む。
む。
む。
む。
む。
む。
む。
む。
を含む。
を含む。
む。
む。
む。
を含む。
を含む。
む。
む。
む。
を含む。
を含む。
Fc HC(VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3)及びFab-Fc LC(VL-
CL)フォーマットに遺伝子操作され得る。特定のこのような実施形態では、Fab-F
c LCは、配列番号354と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Fab-Fc HCは、配列番号354と同一であるアミノ酸配列
を含む。
7)を含む。いくつかの実施形態では、Fab-Fc HCは、C末端リジン残基を有す
るアミノ酸配列、及び配列番号361と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、
少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一である配列を含む。
特定の実施形態では、Fab-Fc HCは、配列番号361のアミノ酸配列を含む。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも9
9%)同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Fab-Fc LCは、配
列番号221と同一であるアミノ酸配列を含む。
る特に好適な抗原結合ドメインは、配列番号354のアミノ酸配列を有するFab-Fc
HC及び配列番号221のアミノ酸配列を有するFab-Fc LCを含む。
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
63のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
65のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
67のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
69のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
又は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、180、181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
2、173、174及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、L
CDR2、及びLCDR3を含む。
8、179、180及び181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、L
CDR2、及びLCDR3を含む。
4、185、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
8、182、470、209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含む。
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
8、179、180、181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含む。
4、185、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
8、182、470、及び209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。
8のVLを含む。
3のVLを含む。
5のVLを含む。
7のVLを含む。
9のVLを含む。
5のVLを含む。
VLを含む。
又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、
Fabは、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことはない。
を含む。
を含む。
を含む。
VLを含む。
VLを含む。
を含む。
を含む。
VLを含む。
VLを含む。
を含む。
を含む。
を含む。
VLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
0のVLを含む。
0のVLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
0のVLを含む。
0のVLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
VLを含む。
0のVLを含む。
0のVLを含む。
配列番号137の重鎖可変領域(VH)の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、HCD
R2、及びHCDR3、並びに配列番号138の軽鎖可変領域(VL)の軽鎖相補性決定
領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3;又は
配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
63のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
65のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
67のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号1
69のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
又は配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
DR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、180、181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、180、及び181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、470、209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及
びLCDR3を含む。
、145、及び146のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、180、181のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及
びLCDR3を含む。
、186、及び187のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、192、及び193のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
、470、及び209のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
含む。
。
、又は3のVLを含む。
のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、Fabは、
配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことはない。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
含む。
含む。
。
。
。
含む。
含む。
。
。
。
含む。
含む。
のHC及び配列番号221のLCを含む。
のHC及び配列番号222のLCを含む。
のHC及び配列番号223のLCを含む。
のHC及び配列番号224のLCを含む。
のHC及び配列番号220のLCを含む。
と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるHC及び配列番号221と少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)
同一であるLCを含む。
と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるHC及び配列番号221のLCを含む。
のHC及び配列番号221と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも
90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるLCを含む。
と少なくとも95%同一であるHC及び配列番号221と少なくとも95%同一であるL
Cを含む。
と少なくとも99%同一であるHC及び配列番号221と少なくとも95%同一であるL
Cを含む。
と少なくとも99%同一であるHC及び配列番号221と少なくとも99%同一であるL
Cを含む。
と少なくとも95%同一であるHC及び配列番号221と少なくとも99%同一であるL
Cを含む。
C及び配列番号221のLCを含む。
hK2に結合する抗原結合ドメインのバリアントは、本開示の範囲内である。例えば、
バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか
又は有する限り、hK2に結合する抗原結合ドメインに1、2、3、4、5、6、7、8
、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、25、26、27、28、又は29個のアミノ酸置換を含んでいてよい
。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメイン
に対して約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%
、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
、又は99%であってよい。いくつかの実施形態では、多様性はフレームワーク領域に存
在する。いくつかの実施形態では、バリアントは保存的置換により生成される。
、P41、G45、I49、M70、及びA88、及びV89(配列番号5のhu11B
6_VHに従う残基付番)並びにVLにおけるD1、D9、S10、A12、V13、L
15、I21、N22、K24、K49、R58、V62、D64、S80、L82、Q
83、A84、V87、A88、Y91、Q104、及びL108(配列番号2のhu1
1B6_VLに従う残基付番)に置換を含んでいてよい。保存的置換は、任意の指定の位
置で行うことができ、得られたhK2に結合する抗原結合ドメインのバリアントを、本明
細書に記載のアッセイで所望の特性について試験する。
、本明細書に開示されるhK2に結合する抗原結合ドメインのVH及びVLとそれぞれ少
なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又
は少なくとも99%)同一であるVH及びVLを含む。
結合ドメインも提供される
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;又は
配列番号204のVH及び配列番号205のVL。
は、90%である。いくつかの実施形態では、同一性は、91%である。いくつかの実施
形態では、同一性は、91%である。いくつかの実施形態では、同一性は、92%である
。いくつかの実施形態では、同一性は、93%である。いくつかの実施形態では、同一性
は、94%である。いくつかの実施形態では、同一性は、94%である。いくつかの実施
形態では、同一性は、95%である。いくつかの実施形態では、同一性は、96%である
。いくつかの実施形態では、同一性は、97%である。いくつかの実施形態では、同一性
は、98%である。いくつかの実施形態では、同一性は、99%である。
Hと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号138のVLと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも
99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも
99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号165のVLと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも
99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号167のVLと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも
99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号444のVLと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも
99%)同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は
少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号169のVLと少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)
同一であるVLを含む。
Hと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は
少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号205のVLと少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)
同一であるVLを含む。
Hと少なくとも85%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも90%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも91%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも92%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも93%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも94%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも96%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも97%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも98%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
Hと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも85%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも90%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも91%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも92%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも93%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも94%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも96%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも97%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも98%同一であるVLを含む。
H及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一であるVLを含む。
る必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一
の位置の数の関数である(即ち、同一性%=同一の位置の数/位置の総数×100)。
0)に組み込まれているE.Meyers及びW.Millerのアルゴリズム(Com
put.Appl.Biosci 4:11-17(1988))を使用し、PAM12
0重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用して求
めることができる。更に、2つのアミノ酸又は核酸配列間の同一性パーセントは、GCG
ソフトウェアパッケージ(http_//_www_gcg_comで入手可能)のGA
Pプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム(
J.Mol.Biol.48:444-453(1970))を使用し、Blossum
62マトリクス又はPAM250マトリクス、及びギャップ重み付け16、14、12
、10、8、6、又は4、及び長さ重み付け1、2、3、4、5、又は6を使用して求め
ることもできる。
に結合する親抗原結合断片の所望の機能的特性を保持しながら、CDR領域のいずれかに
1つ又は2つの保存的置換を含む。
変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び
欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基
に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に
定義されており、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性側鎖(例
えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、非荷電極性側鎖(
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロ
シン、トリプトファン)、芳香族側鎖(例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒ
スチジン、チロシン)、脂肪族側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、セリン、スレオニン)、アミド(例えば、アスパラギン、グルタミン)、
β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び含硫黄側鎖(システイ
ン、メチオニン)を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング変異誘発につい
て以前に説明されているように(MacLennan et al.,(1988)Ac
ta Physiol Scand Suppl 643:55-67、Sasaki
et al.,(1988)Adv Biophys 35:1-24)、ポリペプチド
内のいずれの天然残基もアラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は
、既知の方法、例えばPCR突然変異誘発(米国特許第4,683,195号)により行
うことができる。あるいは、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン(NN
K)又は非ランダムコドン(例えば11個のアミノ酸(Ala、Cys、Asp、Glu
、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)をコードするDVKコド
ン)を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイ
を用いて、その特徴について試験することができる。
本開示で提供されるhK2に結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して作製
することができる。例えば、Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ法を使
用して、hK2に結合するVH/VL対を同定することができる。ハイブリドーマ法では
、マウス又は他の宿主動物、例えば、ハムスター、ラット、若しくはニワトリを、ヒト及
び/又はカニクイザルhK2で免疫し、続いて、標準的な方法を用いて骨髄腫細胞で免疫
した動物の脾臓細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。1個の不死化したハ
イブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に
対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するhK2に結合する抗原
結合ドメインを含有する抗体の生成についてスクリーニングしてよい。
ト化してもよい。ヒトアクセプタフレームワークの選別を含む例示的なヒト化技術として
は、CDRグラフト化(米国特許第5,225,539号)、SDRグラフト化(米国特
許第6,818,749号)、リサーフェシング(Padlan,(1991)Mol
Immunol 28:489-499)、特異性決定残基のリサーフェシング(米国特
許出願公開第2010/0261620号)、ヒトフレームワーク適応(米国特許第8,
748,356号)、又は超ヒト化(米国特許第7,709,226号)が挙げられる。
これらの方法では、CDRの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれら
の組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得
るヒトフレームワークに、親抗体のCDR又はCDR残基のサブセットを移植する。
22653号に記載されているものなどの技術により、変化させたフレームワーク支持残
基を組み込んで結合親和性を保持することによって(復帰変異)、又はCDRのいずれか
に多様性を導入して、例えば抗原結合ドメインの親和性を改善することによって、所望の
抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化してもよい。
ニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、hK2に結合する抗原結合断片を作
製することができ、これらは例えば、米国特許第6,150,584号、国際公開第19
99/45962号、同第2002/066630号、同第2002/43478号、同
第2002/043478号、及び同第1990/04036号に記載されている。この
ような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非
相同組み換えを使用して、導入染色体(transchromosome)を使用して、又はミニ遺伝子
を使用して、少なくとも1つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物の
ゲノムに挿入してもよい。Regeneron(http://_www_regene
ron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_
harbourantibodies_com)、Open Monoclonal T
echnology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_n
et)、KyMab(http://_www_omtinc_net)、Triann
i(http://_www.trianni_com)、及びAblexis(htt
p://_www_ablexis_com)などの企業は、上記の技術を使用して、選
択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。いくつかの実施
形態では、Ablexisマウス及びOmniRatラットを可溶性完全長KLK2タン
パク質(ヒトカリクレイン-2 6-Hisタンパク質)(配列番号454)で免疫した
。
b、一本鎖抗体(scFv)、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファ
ージが遺伝子操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる
。hK2に結合する抗原結合ドメインは、例えば、Shi et al.,(2010)
J Mol Biol 397:385-96及び国際公開第09/085462号)に
記載されているバクテリオファージpIXコートタンパク質との融合タンパク質として抗
体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離すること
ができる。ライブラリを、ヒト及び/又はカニクイザルhK2へのファージ結合について
スクリーニングしてよく、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物から
Fabを単離し、scFV又は抗原結合断片の他の構成に変換してよい。
パク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精
製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形
態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードして
いる核酸から動物の体内で新規に(de novo)形成されてもよい。
本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインは、半減期延長部分にコンジュゲートさせ
てもよい。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン
結合タンパク質及び/又はドメイン、トランスフェリン並びにその断片及び類似体、免疫
グロブリン(Ig)又はその断片、例えばFc領域である。前述の半減期延長部分のアミ
ノ酸配列は公知である。Ig又はその断片は、全てのアイソタイプ、すなわち、IgG1
、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、及びIgEを含む。
長部分としては、所望の特性のための、ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えば
、PEG5000又はPEG20,000、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例
えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン
酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン
二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン
、炭水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類)が挙げられる。これら部
分は、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインと直接融合させてよく、標準的なクロ
ーニング及び発現技術によって作製してよい。あるいは、周知の化学的カップリング方法
を用いて、組み換えで生成された本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインにその部分
を結合させてもよい。
込むか、又は遺伝子操作してシステインをhK2結合部位から離れる方向に面する残基位
置にし、周知の方法を用いてペギル基をシステインに結合させることによって、本開示の
hK2に結合する抗原結合ドメインにペギル部分をコンジュゲートさせることができる。
ュゲートされる。
Ig定常領域、Ig定常領域の断片、Fc領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブ
ミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、半減
期延長部分は、Ig定常領域である。
ンビボモデルを利用してその薬物動態特性について評価することができる。
本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインは、Ig定常領域又はIg定常領域の断片
にコンジュゲートして、Fcエフェクター機能C1q結合、補体依存性細胞傷害(CDC
)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)、貪食作用、又は細胞表
面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションを含む、抗体様特
性を付与することができる。Ig定常領域又はIg定常領域の断片はまた、本明細書で論
じられるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のhK2に結合する抗原結合
ドメインは、標準的な方法を使用して遺伝子操作して従来の完全長抗体にすることができ
る。hK2に結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載の通り、更
に遺伝子操作されてもよい。
構成される。EUインデックスに従う残基付番で、重鎖においてCH1ドメインは残基A
118~V215に及び、CH2ドメイン残基はA231~K340に及び、CH3ドメ
イン残基G341~K447に及ぶ。いくつかの例では、G341は、CH2ドメイン残
基と称される。ヒンジは、概して、E216を含み、ヒトIgG1のP230で終結する
と定義される。Ig Fc領域は、Ig定常領域の少なくともCH2及びCH3ドメイン
を含み、したがって、Ig重鎖定常領域の少なくともおよそA231からK447までの
領域を含む。
ートしたhK2に結合する抗原結合ドメインを提供する。
を含む。
メイン、及びCH3ドメインを含む。ヒンジの一部は、Igヒンジの1つ以上のアミノ酸
残基を指す。
3ドメインを含む。
g定常領域の断片のN末端にコンジュゲートされる。
g定常領域の断片のC末端にコンジュゲートされる。
2)を介してIg定常領域又はIg定常領域の断片にコンジュゲートされる。
、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、1
06、107、又は108のアミノ酸配列を含む。
抗原結合ドメインは、いくつかの既知のアッセイを使用してその機能性について評価する
ことができる。hK2への結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価することができ
る。Ig定常ドメイン又はIg定常領域の断片、例えばFc領域によって付与される変化
した特性は、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、若しくはFcRn受容体など
の受容体の可溶性形態を使用するFc受容体結合アッセイにおいて、又は例えばADCC
、CDC、若しくはADCPを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイする
ことができる。
して使用するインビトロアッセイを用いて評価することができる。細胞溶解は、溶解した
細胞からの標識(例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質)の放出
によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、標的細胞1に対し
てエフェクター細胞4の比で使用する。標的細胞はBATDAで予め標識し、エフェクタ
ー細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを2時間インキュベートし、上清に放出し
たBATDAを測定することにより、細胞溶解を測定した。0.67%Triton X
-100(Sigma Aldrich)による最大の細胞傷害に対してデータを正規化
し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのBATDAの自然放出によって最
小対照を求める。
他の標識分子を発現するように遺伝子操作された任意のhK2発現細胞を標的細胞として
使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター:標
的細胞比は、例えば4:1とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添
加し又は添加せずに、標的細胞と共に4時間インキュベートしてよい。インキュベーショ
ン後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した
抗CD11b抗体及び抗CD14抗体により識別され得、貪食作用パーセントは、標準的
な方法を用いて、CD11+及びCD14+マクロファージにおけるGFP蛍光の割合(
%)に基づいて決定され得る。
MI)に1×105細胞/ウェル(50μL/ウェル)でプレーティングし、50μLの
試験タンパク質を0~100μg/mLの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で1
5分間インキュベートし、11μLのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応物を3
7℃で45分間インキュベートすることによって測定することができる。溶解した細胞の
百分率(%)は、標準法を使用して、FACSアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色
細胞の%として検出され得る。
域又はIgG1重鎖定常領域の断片にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、
hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号110と少なくとも80%(例えば、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一で
あるアミノ酸配列を含むIgG1重鎖定常領域又はIgG1重鎖定常領域の断片(例えば
、ヒンジ-CH2-CH3を含む)にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、
IgG1重鎖定常領域は、Fcサイレンシング変異(L234A_L235A_D265
S)及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたT350V_T366L_K
392L_T394W変異を含む。いくつかの実施形態では、hK2に結合する抗原結合
ドメインは、配列番号110のアミノ酸配列を有するIgG1重鎖定常領域又はIgG1
重鎖定常領域の断片にコンジュゲートされる。
ミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含むIgG1重鎖定常領
域(例えば、CH1-ヒンジ-CH2-CH3)にコンジュゲートされる。特定の実施形
態では、hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号378のアミノ酸配列を含むI
gG1重鎖定常領域又はIgG1重鎖定常領域の断片にコンジュゲートされる。
なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又
は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含むIgG1軽鎖定常領域にコンジュゲ
ートされる。いくつかの実施形態では、hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号
447と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
95%、又は少なくとも99%)同一であるIgG1軽鎖定常領域にコンジュゲートされ
る。いくつかの実施形態では、hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号309又
は447と同一であるアミノ酸配列を含むIgG1軽鎖定常領域にコンジュゲートされる
。特定の実施形態では、hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号309と同一で
あるアミノ酸配列を含むIgG1軽鎖定常領域にコンジュゲートされる。
ノ酸配列を含むIgG1重鎖定常領域にコンジュゲートしたhK2に結合する抗原結合ド
メイン及び配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含むIgG1軽鎖定常領域にコン
ジュゲートしたhK2に結合する抗原結合ドメインを含む。
の抗原結合ドメイン、及び配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重
鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメイン、及び配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽
鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のI
g重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配列番号309と同一で
あるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを
含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメイン、及び配列番号109と同一であるアミノ
酸配列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のI
g重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配列番号309と同一で
あるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを
含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(例えば、CD3)に結合する第2の抗原結
合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配列を含む第2のIg定常領域又は
第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号378と同一
であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と
を含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号309と同一
であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片と
を含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378
と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の
断片と、(ii)配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領
域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号255のHCDR1、
配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR
1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、リンパ球抗
原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配列を含
む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378
と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の
断片と、(ii)配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領
域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(
例えば、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号255のHCD
R1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のL
CDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、リン
パ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配
列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号378と同一であるアミノ酸配列
を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号309と同一であるアミノ酸配列
を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ
酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配
列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽
鎖定常領域の断片とを含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号331のアミノ酸配列
を含む、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン、及び配列番号109と同一で
あるアミノ酸配列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ
酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配
列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽
鎖定常領域の断片とを含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(例えば、CD3)に
結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号331のアミノ酸配列を含む、リン
パ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配
列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して様々な設計の
単一特異性又は多重特異性タンパク質に遺伝子操作され得る。
パク質を提供する。
質を提供する。
る。
る。
ど)に結合する第2の抗原結合ドメインを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、
BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2Cである。
質である。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFv、(scFv)2、Fv、Fab
、F(ab’)2、Fd、dAb、又はVHHを含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fabを含む。
を含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、F(ab’)2を含む。
2を含む。
b’)2を含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、VHHを含む。
。
を含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fvを含む。
含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fdを含む。
含む。
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
インがFabを含み、リンパ球抗原(例えば、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメイ
ンがscFvを含む二重特異性である。
Vを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fabを含む。
ンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fab’を含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fvを含む。
、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、dAbを含む。
リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、VHHを含む。
、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、scFVを含む。
み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、Fdを含む。
ンカー(L1)、及びVL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L
1-VH)を含む。
、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、1
06、107、又は108のアミノ酸配列を含む。
、72、141、147、170、176、188、194、196、198、200、
206、又は216のHCDR1、配列番号64、65、73、142、148、171
、177、188、189、195、197、199、201、207、又は217のH
CDR2、配列番号66、143、172、178、184、190、208、又は21
8のHCDR3、配列番号67、68、144、173、179、182、185、又は
191のLCDR1、配列番号69、70、145、174、180、186、192、
又は470のLCDR2、及び配列番号71、146、175、181、187、193
、又は209のLCDR3を含む。
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71;
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;
それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
170、171、172、173、174、及び175、又はそれぞれ配列番号194、
195、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、任意選択で、CD3、CD3
イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、
BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2C、例えば
CD3であるリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン。
194、195、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、任意選択で、CD3、CD3
イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、
BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2C、例えば
CD3であるリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン。
7のVH及び配列番号138のVLを含む。
2のVH及び配列番号163のVLを含む。
4のVH及び配列番号165のVLを含む。
6のVH及び配列番号167のVLを含む。
8のVH及び配列番号169のVLを含む。
4のVH及び配列番号205のVLを含む。
のVH及び配列番号74のVLを含む。
のVH及び配列番号74のVLを含む。
2のVHと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも9
9%)同一であるVLを含む。
番号162のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLを含
む。
番号162のVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも8
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるVLを含
む。
2のVHと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも9
9%)同一であるVLを含み、任意選択で、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、C
D8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、B
TNL8、PD-1、CD195、又はNKG2C、例えばCD3であるリンパ球抗原に
結合する第2の抗原結合ドメイン。
2のVHと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号163のVLを含み、任意選択で
、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2
D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、又はN
KG2C、例えばCD3であるリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン。
2のVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含み、任
意選択で、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、
NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195
、又はNKG2C、例えばCD3であるリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン
。
VH及び配列番号163のVLを含む。
VH及び配列番号163のVLを含み、任意選択で、CD3、CD3イプシロン(CD3
ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD1
86、BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2C、例えばCD3であるリンパ
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン。
5、6、139、159、又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は16
0のVLを含み、ただし、Fabは、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含
むことはない。
5、又は6のVH及び配列番号1、2、又は3のVLを含み、ただし、hK2に結合する
第1の抗原結合ドメインは、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことは
ない。
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、133、134、135、136、308、316、318、319、320
、321、322、323、324、325、404、405、406、407、408
、又は409のアミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸配列を含む。
3のアミノ酸配列を含む。
4のアミノ酸配列を含む。
5のアミノ酸配列を含む。
6のアミノ酸配列を含む。
8のアミノ酸配列を含む。
6のアミノ酸配列を含む。
8のアミノ酸配列を含む。
9のアミノ酸配列を含む。
0のアミノ酸配列を含む。
1のアミノ酸配列を含む。
2のアミノ酸配列を含む。
3のアミノ酸配列を含む。
4のアミノ酸配列を含む。
5のアミノ酸配列を含む。
4のアミノ酸配列を含む。
5のアミノ酸配列を含む。
6のアミノ酸配列を含む。
7のアミノ酸配列を含む。
8のアミノ酸配列を含む。
9のアミノ酸配列を含む。
4のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
5のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
は405のアミノ酸配列を含む。本開示はまた、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合
ドメインであって、配列番号248の重鎖可変領域(VH)及び配列番号157の軽鎖可
変領域(VL)を含む、リンパ球抗原に結合する抗原結合ドメインを提供する。配列番号
248及び配列番号157は、親抗体CD3B815抗体の属VH及びVLアミノ酸配列
を表す。
DIQX1TQSPX2X3LSX4SX5GX6RVX7X8X9CRARQSIG
TAIHWYQQKX10X11X12X13PX14LLIX15YASESISGX
16PSRFSGSGSGTDFTLTIX17SX18QX19EDX20AX21Y
YCQQSX22SWPYTFGX23GTKLEIK
含む
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260
のLCDR3;又は
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261
のLCDR3。
含む
配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
号248のVHと少なくとも80%(少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
95%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも
80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なく
とも99%)同一であるVLを含む。
、配列番号248のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるVH及び配列番号251のV
Lを含む。
、配列番号248のVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例えば、少なく
とも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%同一であるV
Lを含む。
48のVH及び配列番号251のVLを含む。
含む
配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCD
R3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121
のLCDR3;又は
配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
55のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番
号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3
を含む。
170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、リンパ球抗原に結合する第2
の抗原結合ドメインは、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配
列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2
、及び配列番号261のLCDR3を含む。
194、195、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、リンパ球抗原に結合する第2
の抗原結合ドメインは、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配
列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2
、及び配列番号261のLCDR3を含む。
170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、リンパ球抗原に結合する第2
の抗原結合ドメインは、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。
194、195、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、リンパ球抗原に結合する第2
の抗原結合ドメインは、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。
H及び配列番号163のVLを含み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは
、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261
のLCDR3を含む。
VH及び配列番号163のVLを含み、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン
は、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。
メインを含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク
質を提供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1のドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、
173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183、18
4、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177、17
8、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;又は
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、6
5、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特異
性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、6
5、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特異
性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、
142、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、
142、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、
189、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1のドメインが、それぞれ配列番号170、17
1、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LC
DR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイ
ンが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離
多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、
183、184、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、
177、178、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、
189、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、
207、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LC
DR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイ
ンが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離
多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、
207、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LC
DR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイ
ンが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離
多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、
171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のド
メインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、
単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
原結合ドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性
タンパク質を提供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号139のVH及び配列番号14
0のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号139のVH及び配列番号14
0のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122の
VH及び配列番号123のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号137のVH及び配列番号13
8のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号137のVH及び配列番号13
8のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122の
VH及び配列番号123のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号168のVH及び配列番号16
9のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号16
3のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列番号44
4のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列番号16
5のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号168のVH及び配列番号16
9のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122の
VH及び配列番号123のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号204のVH及び配列番号20
5のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122の
VH及び配列番号123のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号204のVH及び配列番号20
5のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む;又は
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号16
3のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248の
VH及び配列番号251のVLを含む。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号139のVH及び
配列番号140のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号139のVH及び
配列番号140のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号122のVH及び配列番号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号137のVH及び
配列番号138のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号137のVH及び
配列番号138のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号122のVH及び配列番号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号168のVH及び
配列番号169のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び
配列番号163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号166のVH及び
配列番号444のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号164のVH及び
配列番号165のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号168のVH及び
配列番号169のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号122のVH及び配列番号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号204のVH及び
配列番号205のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号122のVH及び配列番号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号204のVH及び
配列番号205のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。
メインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び
配列番号163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列
番号248のVH及び配列番号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供す
る。
質である。いくつかの実施形態では、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、第1
の免疫グロブリン(Ig)定常領域若しくは第1のIg定常領域の断片にコンジュゲート
される、及び/又はリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインは、第2の免疫グロ
ブリン(Ig)定常領域若しくは第2のIg定常領域の断片にコンジュゲートされる。
断片は、Fc領域を含む。
断片は、CH2ドメインを含む。
断片は、CH3ドメインを含む。
断片は、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。
断片は、ヒンジの少なくとも一部、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む。
3ドメインを含む。
ドメインと第1のIg定常領域又は第1のIg定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原
に結合する第2の抗原結合ドメインと第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片
との間に、第2のリンカー(L2)を更に含む。
、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、1
06、107、又は108のアミノ酸配列を含む。
2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG1、IgG2、及びIgG3
、又はIgG4アイソタイプである。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG1アイソタイプである。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG2アイソタイプである。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG3アイソタイプである。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG4アイソタイプである。
g定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、IgG1アイソタイプである。
Ig定常領域の断片は、本明細書に記載の通り更に遺伝子操作されてもよい。
2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のFcγRへ
の結合を低減する少なくとも1つの変異を含む。
とも1つの変異は、F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L
235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L
/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L23
5A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L
235A/G236欠失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268
Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L2
35E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/
A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238
S、及びS228P/F234A/L235A/G236欠失/G237A/P238S
からなる群から選択され、残基の付番はEUインデックスに従う。特定の実施形態では、
第1のIg定常領域若しくは第1のIg定常領域の断片及び/又は第2のIg定常領域若
しくは第2のIg定常領域の断片は、以下の変異:L234A_L235A_D265S
を含む。
2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のFcγ受容
体(FcγR)への結合を増強する少なくとも1つの変異を含む。
とも1つの変異は、S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F
243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L
、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及びG236A/S
239D/I332Eからなる群から選択され、残基の付番はEUインデックスに従う。
、若しくはFcγRIII、又はこれらの任意の組み合わせである。
2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、多重特異性タンパク質の半減期を調
節する少なくとも1つの変異を含む。
変異は、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/
S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH4
35Rからなる群から選択され、残基の付番はEUインデックスに従う。
イン若しくは第1のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1つの変異
及び/又は第2のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは第2のIg定常領域の断片のC
H3ドメインにおける少なくとも1つの変異を含む。
常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1つの変異及び/又は第2のIg定常
領域のCH3ドメイン若しくは第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少な
くとも1つの変異は、T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、
T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366
S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K3
92M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、
L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366
V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y4
07V、及びT350V/T366L/K392L/T394Wからなる群から選択され
、残基の付番はEUインデックスに従う。特定の実施形態では、第1のIg定常領域若し
くは第1のIg定常領域の断片は、以下の変異を含む:T350V_T366L_K39
2L_T394W及び/又は第2のIg定常領域若しくは第2のIg定常領域の断片は、
以下の変異を含む:T350V_L351Y_F405A_Y407V。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、以下の変異を含む:
第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_L3
51Y_F405A_Y407V及び第2のIg定常領域におけるL235A_L235
A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W;又は
第1のIg定常領域におけるL235A_L235A_D265S_T350V_T3
66L_K392L_T394W及び第2のIg定常領域におけるL235A_L235
A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片は、以下の変異を含む:
第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_L3
51Y_F405A_Y407V及び第2のIg定常領域におけるL234A_L235
A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W;又は
第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_T3
66L_K392L_T394W及び第2のIg定常領域におけるL234A_L235
A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
は、配列番号378と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%
、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む。
は、配列番号309と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%
、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む。
番号109と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
109と同一であるアミノ酸配列を含む。
酸配列を含み、第1のIg軽鎖定常領域は、配列番号309と同一であるアミノ酸配列を
含み、第2のIg定常領域は、配列番号109と同一であるアミノ酸配列を含む。
の抗原結合ドメイン、及び配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重
鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメイン、及び配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽
鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のI
g重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配列番号309と同一で
あるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを
含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメイン、及び配列番号109と同一であるアミノ
酸配列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ酸配列を含む第1のI
g重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配列番号309と同一で
あるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを
含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(例えば、CD3)に結合する第2の抗原結
合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配列を含む第2のIg定常領域又は
第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号378と同一
であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と
を含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号309と同一
であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片と
を含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378
と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の
断片と、(ii)配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領
域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号255のHCDR1、
配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR
1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、リンパ球抗
原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配列を含
む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、それぞれ配列番号170、171、172、173、17
4、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及び
LCDR3を含む、hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378
と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の
断片と、(ii)配列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領
域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(
例えば、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号255のHCD
R1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のL
CDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、リン
パ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配
列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号378と同一であるアミノ酸配列
を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、配列番号309と同一であるアミノ酸配列
を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽鎖定常領域の断片とを含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ
酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配
列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽
鎖定常領域の断片とを含む。
、CD3)に結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号331のアミノ酸配列
を含む、リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン、及び配列番号109と同一で
あるアミノ酸配列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片を含む。
の抗原結合ドメインであって、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含む、
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと、(i)配列番号378と同一であるアミノ
酸配列を含む第1のIg重鎖定常領域又は第1のIg重鎖定常領域の断片と、(ii)配
列番号309と同一であるアミノ酸配列を含む第1のIg軽鎖定常領域又は第1のIg軽
鎖定常領域の断片とを含み、当該単離タンパク質は、リンパ球抗原(例えば、CD3)に
結合する第2の抗原結合ドメインであって、配列番号331のアミノ酸配列を含む、リン
パ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインと、配列番号109と同一であるアミノ酸配
列を含む第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片とを更に含む。
本開示のhK2に結合する抗原結合断片は、多重特異性抗体に遺伝子操作してもよく、
このような抗体も本発明の範囲内に包含される。
でFabアーム交換を促進するIg定常領域CH3ドメイン内の2つの単一特異性二価抗
体に置換が導入されている完全長多重特異性抗体に遺伝子操作してもよい。この方法では
、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をCH3ドメインに有するように、2つの
単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステイン
がジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において共にインキュベーシ
ョンされ、それにより、Fabアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュ
ベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、2
-メルカプトエチルアミン(2-MEA)、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリ
スリトール(DTE)、グルタチオン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(T
CEP)、L-システイン、及びβ-メルカプトエタノールであり、好ましくは、2-メ
ルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス(2-カルボキシエチル)ホス
フィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも20℃の温度で、少
なくとも25mMの2-MEAの存在下又は少なくとも0.5mMのジチオスレイトール
の存在下で、pH5~8、例えばpH7.0又はpH7.4で、少なくとも90分間のイ
ンキュベートを用いることができる。
的マッチ変異(Chugai、Amgen、NovoNordisk、Oncomed)
、鎖交換遺伝子操作ドメインボディ(SEEDbody)(EMD Serono)、D
uobody(登録商標)変異(Genmab)、及び他の非対称変異(例えば、Zym
eworks)などの技術が挙げられる。
り、小さい側鎖(ホール)を有するアミノ酸が第1のCH3領域に導入され、大きな側鎖
(ノブ)を有するアミノ酸が第2のCH3領域に導入され、第1のCH3領域と第2のC
H3領域との間に優先的な相互作用をもたらす、CH3領域の界面上の変異が含まれる。
ノブ及びホールを形成する例示的なCH3領域変異は、T366Y/F405A、T36
6W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y
407A、T366W/T394S、F405W/T394S、及びT366W/T36
6S_L368A_Y407Vである。
09/0182127号、同第2010/028637号、又は同第2011/0123
532号に記載のように、第1のCH3領域上の正に荷電した残基及び第2のCH3領域
上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進
され得る。
許出願公開第2012/0149876号又は同第2013/0195849号(Zym
eworks)に記載のL351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I
_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T39
4W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L
351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F
、又はT350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K
392L_T394Wである。
に、選択されたIgG残基をIgA残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進すること
を伴う。
2011/143545号、国際公開第2013/157954号、国際公開第2013
/096291号、及び米国特許出願公開第2018/0118849号に記載のR40
9D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_T
366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S
_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L35
1K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K
409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K
、K392D/E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E24
0K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399Kである。
63号及び米国特許出願公開第2014/0303356号に開示されており、F405
L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405
L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K
409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRS
TVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLS
TVW/K409AGRH、及びY407LWQ/K409AGRHの変異が含まれる。
性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD)(国際公開第2009/1
34776号;DVDは、VH1-リンカー-VH2-CH構造を有する重鎖と、VL1
-リンカー-VL2-CL構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意
選択である)、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメインなどの、異なる特異性を
有する2つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造(国際公開第
2012/022811号、米国特許第5,932,448号、米国特許第6,833,
441号)、一緒にコンジュゲートされた2つ又は3つ以上のドメイン抗体(dAb)、
ダイアボディ、ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、二重標的
(DT)-Ig(GSK/Domantis)、2in1抗体(Genentech)、
架橋Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Sta
r)、及びCovXボディ(CovX/Pfizer)、IgG様二重特異性(InnC
lone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)、及びBs
Ab(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)、及
びTvAb(Roche)、ScFv/Fc融合体(Academic Institu
tion)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Tru
bion、Zymogenetics/BMS)、二重親和性再標的技術(Fc-DAR
T)(MacroGenics)、及び二重(ScFv)2-Fab(National
Research Center for Antibody Medicine--
China)、二重活性又はBis-Fab(Genentech)、Dock-and
-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、二価二重特異性(Biotecn
ol)、及びFab-Fv(UCB-Celltech)が含まれる。ScFv抗体、ダ
イアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体には、二重特異性T細胞エンゲージャー(B
iTE)(Micromet)、タンデムダイアボディ(Tandab)(Affime
d)、二重親和性再標的技術(DART)(MacroGenics)、一本鎖ダイアボ
ディ(Academic)、TCR様抗体(AIT、ReceptorLogics)、
ヒト血清アルブミンScFv融合体(Merrimack)、及びCOMBODY(Ep
igen Biotech)、二重標的ナノボディ(Ablynx)、二重標的重鎖のみ
のドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。
特異性タンパク質に遺伝子操作してもよい。このような設計では、少なくとも1つの抗原
結合ドメインが、scFvの形態である。例示的な設計としては、以下が挙げられる(「
1」は、第1の抗原結合ドメインを示し、「2」は、第2の抗原結合ドメインを示し、「
3」は、第3の抗原結合ドメインを示す:
設計1:鎖A)scFv1-CH2-CH3;鎖B)VL2-CL;鎖C)VH2-C
H1-ヒンジ-CH2-CH3
設計2:鎖A)scFv1-ヒンジ-CH2-CH3;鎖B)VL2-CL;鎖C)V
H2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3
設計3:鎖A)scFv1-CH1-ヒンジ-CH2-CH3;鎖B)VL2-CL;
鎖C)VH2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3
設計4:鎖A)CH2-CH3-scFv1;鎖B)VL2-CL;鎖C)VH2-C
H1-ヒンジ-CH2-CH3
米国特許出願公開第2012/0149876号又は同第2013/0195849号
(Zymeworks)に記載のように、変異L351Y_F405A_Y407V/T
394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L
_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T36
6A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T
366A_K409F、又はT350V_L351Y_F405A_Y407V/T35
0V_T366L_K392L_T394WなどのCH3の遺伝子操作を設計1~4に組
み込んでもよい。
;鎖B)VL2-CL;鎖C)VH2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3。
ドメイン及びリンパ球抗原(CD3など)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該h
K2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号63、72、141、147、17
0、176、188、194、196、198、200、206、又は216のHCDR
1、配列番号64、65、73、142、148、171、177、188、189、1
95、197、199、201、207、又は217のHCDR2、配列番号66、14
3、172、178、184、190、208、又は218のHCDR3、配列番号67
、68、144、173、179、182、185、又は191のLCDR1、配列番号
69、70、145、174、180、186、192、又は470のLCDR2、及び
配列番号71、146、175、181、187、193、又は209のLCDR3を含
む。
単離多重特異性タンパク質は、hK2に結合する第1の結合ドメイン及びリンパ球抗原(
例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK2に結合する第1の抗原
結合ドメインは、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2
、及びLCDR3を含む:
それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
多重特異性タンパク質は、hK2に結合する第1の結合ドメイン及びリンパ球抗原(例え
ばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK2に結合する第1の抗原結合
ドメインは、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175又
はそれぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、以下を含む:
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;又は
配列番号204のVH及び配列番号205のVL。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号75のVH及び配列番号74のV
Lを含む。
単離多重特異性タンパク質は、hK2に結合する第1の結合ドメイン及びリンパ球抗原(
例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK2に結合する第1の抗原
結合ドメインは、配列番号162のVHと少なくとも80%(少なくとも85%、少なく
とも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVH及び配列番号1
63のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
イン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK
2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号162のVH及び配列番号163のV
Lと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
イン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK
2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号162のVHと少なくとも80%(少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一で
あるVH及び配列番号163のVLを含む。
イン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK
2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号162のVHと少なくとも80%(少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一で
あるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
イン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK
2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号162のVH及び配列番号163のV
Lを含む。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号4、5、6、137、139、1
59、又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、た
だし、当該hK2に結合する抗原結合ドメインは、配列番号5のVH及び配列番号2のV
Lの両方を含むことはない。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、以下を含む:
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、134、1
35、136、308、316、318、319、320、321、322、323、3
24、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を
含む。
ドメイン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該
hK2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号404又は405のアミノ酸配列
と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
イン及びリンパ球抗原(例えばCD3)に結合する第2の結合ドメインを含み、当該hK
2に結合する第1の抗原結合ドメインは、配列番号404又は405のアミノ酸配列を含
む。
イン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結合す
る第2の抗原結合ドメインは、配列番号255又は116のHCDR1、配列番号256
又は117のHCDR2、配列番号257又は118のHCDR3、又は配列番号258
又は119のLCDR1、配列番号259又は120のLCDR2、及び配列番号260
、261、又は121のLCDR3を含む。
ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインは、配列番号248のVH及び配列番号157のVLを含
む。
ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインは、以下を含む:
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260
のLCDR3;又は
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261
のLCDR3。
ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインは、以下を含む:
配列番号248のVH及び配列番号249のVL;
配列番号248のVH及び配列番号250のVL;
配列番号248のVH及び配列番号251のVL;
配列番号248のVH及び配列番号252のVL;
配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインは、配列番号248のVHと少なくとも80%(少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるV
H及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるVLを含む。
イン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結合す
る第2の抗原結合ドメインは、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。
ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインは、以下を含む:
配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCD
R3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121
のLCDR3;又は
配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
イン及びリンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインを含み、当該リンパ球抗原に結合す
る第2の抗原結合ドメインは、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR
2、配列番号257のHCDR3、又は配列番号258のLCDR1、配列番号259の
LCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む。
の結合ドメインは、配列番号326、327、328、329、330、331、332
、333、334、335、336、又は337のアミノ酸配列を含む。
合ドメインは、配列番号331のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるアミ
ノ酸配列を含む。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号255、256、275、258、259、及び260のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号358のHC2
、及び配列番号267のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号359のHC2
、及び配列番号272のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号358のHC2
、及び配列番号267のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号259のHC2
、及び配列番号272のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号358のHC2
、及び配列番号267のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1、配列番号221のLC1
、及び配列番号360のHC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183、18
4、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列番号
444のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号355のHC1、配列番号445のLC1
、及び配列番号360のHC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177、17
8、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列番号
165のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号356のHC1、配列番号222のLC1
、及び配列番号360のHC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号359のHC2
、及び配列番号272のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号359のHC2
、及び配列番号272のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号15
1のVLを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号358のHC2
、及び配列番号267のLC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び260のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1、配列番号221のLC1
、及び配列番号362のHC2を含む。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、6
7、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番
号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、14
3、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1のドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、
173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183、18
4、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177、17
8、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、19
0、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、20
8、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞ
れ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCD
R2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;又は
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、6
6、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ
配列番号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、HCDR
2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特異性タン
パク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、6
6、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ
配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR
2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特異性タン
パク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142
、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142
、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189
、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1のドメインが、それぞれ配列番号170、171、1
72、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1
、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、
それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、
HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特
異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183
、184、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177
、178、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189
、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207
、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1
、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、
それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、
HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多重特
異性タンパク質を提供する。
質である。
2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号2
06、207、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3
、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の
ドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261の
HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む
、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171
、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離多
重特異性タンパク質を提供する。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異性タンパク質を提
供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号25
1のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列番号
444のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列番号
165のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号12
3のVLを含む;
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号15
1のVLを含む;又は
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号
331のscFVを含む。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番
号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番
号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番
号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番
号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番
号251のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番
号163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号3
31のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列番
号444のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号3
31のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列番
号165のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号3
31のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番
号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番
号123のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み
、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番
号151のVLを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番
号163のVLを含み、当該リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号3
31のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、以下を含む、単離タンパク質を提供する:
配列番号351のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2;
配列番号351のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2;
配列番号352のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2;
配列番号352のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2;
配列番号353のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2;
配列番号354のHC1、配列番号221のLC1、及び配列番号360のHC2;
配列番号355のHC1、配列番号223のLC1、及び配列番号360のHC2;
配列番号356のHC1、配列番号222のLC1、及び配列番号360のHC2;
配列番号353のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2;
配列番号357のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2;
配列番号357のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2;又
は
配列番号361のHC1、配列番号221のLC1、及び配列番号362のHC2。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号351のHC1、配列番号358の
HC2、及び配列番号267のLC2を含む、単離タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号351のHC1、配列番号359の
HC2、及び配列番号272のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号352のHC1、配列番号358の
HC2、及び配列番号267のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号352のHC1、配列番号359の
HC2、及び配列番号272のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号353のHC1、配列番号358の
HC2、及び配列番号267のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC1、配列番号221の
LC1、及び配列番号360のHC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号355のHC1、配列番号223の
LC1、及び配列番号360のHC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号356のHC1、配列番号222の
LC1、及び配列番号360のHC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号353のHC1、配列番号359の
HC2、及び配列番号272のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号357のHC1、配列番号359の
HC2、及び配列番号272のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号357のHC1、配列番号358の
HC2、及び配列番号267のLC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
を含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号361のHC1、配列番号221の
LC1、及び配列番号362のHC2を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
質である。
る第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重特異
性タンパク質を提供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該CD3に結合する第2のドメインが、それぞれ
配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR
2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該CD3に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331
のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1、配列番号221のLC1
、及び配列番号360のHC2を含む。
C1及びHC2ドメイン)の両方のC末端にリジン(例えば、K477)を含む。追加の
リジンは、コンストラクトの発現を増強し得る。したがって、特定の実施形態では、単離
多重特異性タンパク質は、配列番号361のHC1、配列番号221のLC1、及び配列
番号362のHC2を含む。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、以下である、単離多重
特異性タンパク質を提供する:
当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、17
2、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、当該CD3に結合する第2のドメインが、それぞれ
配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR
2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
当該hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号
163のVLを含み、当該CD3に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331
のscFVを含む;並びに/又は
当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1、配列番号221のLC1
、及び配列番号362のHC2を含む。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも80%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも8
0%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVと少なくとも80%同一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも85%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも8
5%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVと少なくとも85%同一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも90%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも9
0%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVと少なくとも90%同一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも9
5%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVと少なくとも95%同一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも9
9%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVと少なくとも99%同一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVH及び配列番号163のVLと少なくとも95%同一であるVLを含み、当該C
D3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号331のscFVと少なくとも95%同
一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVH及び配列番号163のVLと少なくとも99%同一であるVLを含み、当該C
D3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号331のscFVと少なくとも99%同
一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLを含み、当該C
D3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号331のscFVと少なくとも95%同
一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLを含み、当該C
D3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号331のscFVと少なくとも99%同
一であるscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも95%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも9
5%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号1
62のVHと少なくとも99%同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも9
9%同一であるVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、配列番号33
1のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
る第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162
のVH及び配列番号163のVLを含み、当該CD3に結合する第2の結合ドメインが、
配列番号331のscFVを含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC
1と少なくとも80%同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも80%同
一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも80%同一であるHC2を含
む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC
1と少なくとも85%同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも85%同
一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも85%同一であるHC2を含
む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC
1と少なくとも90%同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも90%同
一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも90%同一であるHC2を含
む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC
1と少なくとも95%同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも95%同
一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも95%同一であるHC2を含
む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
合する第2のドメインを含む単離多重特異性タンパク質であって、配列番号354のHC
1と少なくとも99%同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも99%同
一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも99%同一であるHC2を含
む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
C1及びHC2ドメイン)の両方のC末端にリジン(例えば、K477)を含む。したが
って、いくつかの実施形態では、単離多重特異性タンパク質は、C末端リジンを含み、か
つ配列番号361のHC1と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも
90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるHC1と、C末端リジン
を含み、かつ配列番号362のHC2と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、
少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%)同一であるHC2とを含
む。
合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号11
1及び配列番号112の配列を有するエピトープ内の3つ以上の残基でhK2に結合する
、単離多重特異性タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、hK2に
結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該CD3に結合
する抗原結合ドメインが、配列番号341、配列番号448、及び配列番号449の配列
を有するエピトープ内の3つ以上の残基でCD3に結合する、単離多重特異性タンパク質
を提供する。
る第2のドメインを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号111及
び配列番号112の配列を有するエピトープ内でhK2に結合し、当該CD3に結合する
抗原結合ドメインが、配列番号341、配列番号448、及び配列番号449の配列を有
するエピトープ内でCD3に結合する、単離多重特異性タンパク質を提供する。
本開示のタンパク質中に存在するIg定常領域又はFc領域などのIg定常領域の断片
は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであってよい。
イプである。
イプである。
イプである。
イプである。
タイプは、結合又はFc媒介性エフェクター機能などのIg定常領域の特性に影響を与え
ないと予想される。Ig定常領域のその断片を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注
反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している(Baert et al.,
(2003)N Engl J Med 348:602-08)。Ig定常領域のその
断片を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ig定常領域の
アロタイプによって部分的に決定され得る(Stickler et al.,(201
1)Genes and Immunity 12:213-21)。Ig定常領域のア
ロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の多様性に関連する
。表2は、選択IgG1、IgG2、及びIgG4アロタイプを示す。
ある。
チダーゼによってIg定常領域から除去され得る(Cai et al.,(2011)
Biotechnol Bioeng 108:404-412)。製造中、米国特許出
願公開第20140273092号に記載のとおり、細胞外Zn2+、EDTA、又はE
DTA-Fe3+の濃度を制御することによって、CTLの除去を最高レベル未満に制御
することができる。タンパク質のCTL含有量は、既知の方法を使用して測定することが
できる。
合断片は、約10%~約90%のC末端リジン含有量を有する。いくつかの実施形態では
、C末端リジン含有量は約20%~約80%である。いくつかの実施形態では、C末端リ
ジン含有量は約40%~約70%である。いくつかの実施形態では、C末端リジン含有量
は約55%~約70%である。いくつかの実施形態では、C末端リジン含有量は約60%
である。
ドメインに対してFc領域変異を行って、ADCC、ADCP、及び/若しくはADCP
などのエフェクター機能、並びに/又は薬物動態特性を調節することができる。このこと
は、変異をFcに導入して、変異Fcの、活性化FcγRs(FcγRI、FcγRII
a、FcγRIII)、阻害性FcγRIIb、及び/又はFcRnへの結合を制御する
ことにより達成可能である。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、Ig定常領域又はIg定常領域の断片に少なくと
も1つの変異を含む。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、Fc領域に少なくとも1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の変異を含む。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、抗体のFcRnへの結合を調節するFc領域にお
ける少なくとも1つの変異を含む。
位置としては、位置250、252、253、254、256、257、307、376
、380、428、434、及び435が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われ
ることができる例示的な変異は、変異T250Q、M252Y、I253A、S254T
、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H43
3K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及びH435R
である。半減期を延長するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの変異は
、変異M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M
428L、N434A、及びT307A/E380A/N434Aである。半減期を短縮
するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの変異は、変異H435A、P
257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E
/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rである。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、M252Y/S254T/T256E変異を含む
。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、タンパク質の活性化Fcγ受容体(FcγR)へ
の結合を低減する、及び/又はC1q結合、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性
細胞媒介細胞傷害(ADCC)、若しくは貪食作用(ADCP)などのFcエフェクター
機能を低下させる、Fc領域における少なくとも1つの変異を含む。
せるために変異させることが可能なFc位置としては、位置214、233、234、2
35、236、237、238、265、267、268、270、295、297、3
09、327、328、329、330、331、及び365が挙げられる。単独で、又
は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、IgG1、IgG2、IgG3、又
はIgG4における、変異K214T、E233P、L234V、L234A、G236
の欠失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、
D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327
Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A3
30S、及びP331Sである。ADCCが低下したタンパク質をもたらす例示的な組み
合わせの変異は、IgG1におけるL234A/L235A、IgG1におけるL234
A/L235A/D265S、IgG2におけるV234A/G237A/P238S/
H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4におけるF234A/L2
35A、IgG4におけるS228P/F234A/L235A、全てのIgアイソタイ
プにおけるN297A、IgG2におけるV234A/G237A、IgG1におけるK
214T/E233P/L234V/L235A/G236欠失/A327G/P331
A/D365E/L358M、IgG2におけるH268Q/V309L/A330S/
P331S、IgG1におけるS267E/L328F、IgG1におけるL234F/
L235E/D265A、IgG1におけるL234A/L235A/G237A/P2
38S/H268A/A330S/P331S、IgG4におけるS228P/F234
A/L235A/G237A/P238S、及び、IgG4におけるS228P/F23
4A/L235A/G236欠失/G237A/P238Sの変異である。IgG2由来
の残基117~260及びIgG4由来の残基261~447を有するFcなどのハイブ
リッドIgG2/4 Fcドメインを使用してもよい。
とができる。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、K214T、E233P、L234V、L234
A、G236の欠失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、
P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297
A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L3
28F、K322、A330S、及びP331Sからなる群から選択される、少なくとも
1つの変異を含む。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、L234A/L235A/D265S変異を含む
。特定の実施形態では、hK2に結合する抗原結合ドメインを、L234A_L235A
_D265S変異を含むIgG1定常領域又はIgG1定常領域の断片にコンジュゲート
させる。
hK2に結合する抗原結合ドメインはL234A/L235A変異を含む。
hK2に結合する抗原結合ドメインは、タンパク質のFcγ受容体(FcγR)への結合
を増強する、並びに/又はC1q結合、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞
媒介細胞傷害(ADCC)、及び/若しくは貪食作用(ADCP)などのFcエフェクタ
ー機能を増強する、Fc領域における少なくとも1つの変異を含む。
増強するために変異させることが可能なFc位置としては、位置236、239、243
、256,290,292、298、300、305、312、326、330、332
、333、334、345、360、339、378、396、又は430(EUインデ
ックスに従った残基付番)が挙げられる。単独で又は組み合わせて行うことが可能な例示
的な変異は、G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292
P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E3
33A、K334A、A339T、及びP396L変異である。ADCC又はADCPが
増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、S239D/I332E、
S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243
L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V3
05I/P396L、及びG236A/S239D/I332Eである。
8、324、326、333、345、及び430が挙げられる。単独で又は組み合わせ
て行うことが可能な例示的な変異は、S267E、F1268F、S324T、K326
A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E4
30S、E430F、及びE430Tである。CDCが増加したタンパク質をもたらす例
示的な組み合わせの変異は、K326A/E333A、K326W/E333A、H26
8F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T、及びS267E
/H268F/S324Tである。
G1、IgG2、及びIgG4野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE
RKCCVECPPCPAPPVAGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQFNSTFR
VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKN
QVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE
SKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQFNSTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
を発現するように遺伝子操作された細胞にて評価することができる。例示の結合アッセイ
では、96ウェルプレート中1ウェル当たり2×105個の細胞を播種し、BSA St
ain Buffer(BD Biosciences,San Jose,USA)中
、4℃で30分間ブロックした。細胞を、氷上で、4℃で1.5時間、試験抗体と共にイ
ンキュベートする。BSA染色緩衝液で2回洗浄した後、細胞を、R-PE標識抗ヒトI
gG二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratori
es)と共に4℃で45分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で2回洗浄し、
その後、1:200希釈したDRAQ7生/死細胞染色試薬(Cell Signali
ng Technology,Danvers,USA)を含有する150μLのSta
in Buffer中に再懸濁する。染色された細胞のPE及びDRAQ7シグナルを、
それぞれB2及びB4チャンネルを使用して、Miltenyi MACSQuantフ
ローサイトメーター(Miltenyi Biotec、Auburn,USA)によっ
て検出する。生細胞をDRAQ7除外でゲーティングし、収集された少なくとも10,0
00生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを求める。解析にはFlowJoソ
フトウェア(Tree Star)を使用する。平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対
数としてデータをプロットする。非線形回帰分析を実行する。
Ig定常領域又はIg定常領域の断片にコンジュゲートしたhK2に結合する抗原結合
ドメインのADCCを媒介する能力は、Ig定常領域又はIg定常領域の断片のオリゴ糖
成分を遺伝子操作することによって増強することができる。ヒトIgG1又はIgG3は
、Asn297においてN-グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、公知の
二分岐G0、G0F、G1、G1F、G2、又はG2Fの形態である。遺伝子操作されて
いないCHO細胞によって生成され得るIg定常領域含有タンパク質は、典型的には、少
なくとも約85%のグリカンフコース含有量を有する。Ig定常領域又はIg定常領域の
断片にコンジュゲートしたhK2に結合する抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型
オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もCDC活性も変化させることなく、
改善されたFcγRIIIa結合を介してタンパク質のADCCが増強される。このよう
なタンパク質は、培養物の浸透圧の制御(Konno et al.,Cytotech
nology 64(:249-65,2012)、宿主細胞株としてのバリアントCH
O株Lec13の適用(Shields et al.,J Biol Chem 27
7:26733-26740,2002)、宿主細胞株としてのバリアントCHO株EB
66の適用(Olivier et al.,MAbs;2(4):405-415,2
010;PMID:20562582)、宿主細胞系としてのラットハイブリドーマ細胞
株YB2/0の適用(Shinkawa et al.,J Biol Chem 27
8:3466-3473,2003)、1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8
)遺伝子に対して特異的な低分子干渉RNAの導入(Mori et al.,Biot
echnol Bioeng88:901-908,2004)、又はβ-1,4-N-
アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII及びゴルジα-マンノシダーゼII若
しくは強力なアルファ-マンノシダーゼI阻害剤であるキフネンシンの共発現(Ferr
ara et al.,J Biol Chem281:5032-5036,2006
、Ferrara et al.,Biotechnol Bioeng93:851-
861,2006;Xhou et al.,Biotechnol Bioeng 9
9:652-65,2008)などの、二分岐複合型のFcオリゴ糖を有する比較的高度
に脱フコシル化された免疫グロブリンの発現を成功させることが報告されている様々な方
法を使用して得られ得る。
ートしたhK2に結合する抗原結合ドメインは、約1%~約15%、例えば、約15%、
14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%
、2%、又は1%のフコース含有量を有する二分岐グリカン構造を有する。いくつかの実
施形態では、Ig定常領域又はIg定常領域の断片にコンジュゲートしたhK2に結合す
る抗原結合ドメインは、約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、
又は20%のフコース含有量を有するグリカン構造を有する。
る。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する百分率である。これらの
糖構造は、複数の方法、例えば、1)国際公開第2008/0775462号に記載され
るような、N-グリコシダーゼF処理試料(例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ
-並びに高マンノース構造)のMALDI-TOFの使用、2)Asn297グリカンの
酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたHPLC(UPLC)及び/又は
HPLC-MS(UPLC-MS)による検出/定量化、3)第1のGlcNAc単糖類
と第2のGlcNAc単糖類との間を切断し、フコースを第1のGlcNAcに付加され
たままにさせる、Endo S又は他の酵素によるAsn297グリカンの処理を伴うか
又はこの処理なしでの、天然又は還元mAbのインタクトプロテイン分析、4)酵素消化
(例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼLys-C)によるmAbの構成ペプチド
への消化、その後のHPLC-MS(UPLC-MS)による分離、検出及び定量、5)
Asn297にPNGase Fを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、mAbタ
ンパク質からmAbオリゴ糖を分離すること、により特性決定及び定量化可能である。こ
のように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識され、分離され、グリカン構造の
細かな特性評価を可能にする様々な補足的技術、即ち、実測された質量の理論上の質量と
の比較によるマトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析、イオン交換
HPLC(GlycoSep C)によるシアル化の程度の決定、順相HPLC(Gly
coSep N)による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能
キャピラリー電気泳動-レーザー誘起蛍光(HPCE-LIF)によるオリゴ糖の分離及
び定量によって特定することが可能である。
又はIg定常領域の断片にコンジュゲートしたhK2に結合する抗原結合ドメインが、約
1%~15%のフコース含有量を有することを指す。
領域又はIg定常領域の断片にコンジュゲートしたhK2に結合する抗原結合ドメインが
、約50%超、典型的には80%超又は85%超のフコース含有量を有することを指す。
抗イディオタイプ抗体は、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインに特異的に結合
する抗体である。
ィオタイプ抗体を提供する。
ディオタイプ抗体を提供する
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL。
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
プ又はCDR)を認識する抗体である。Id抗体は、抗原をブロッキングするものであっ
ても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングIdは、サンプル中の遊離抗原結合
ドメイン(例えば、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメイン)を検出するために使用
され得る。ブロッキングしないIdを使用して、サンプル中の全抗体(遊離しているもの
、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの)を検出することが
できる。Id抗体は、抗Idが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製す
ることができる。
る抗-抗Id抗体を生成することもできる。抗-抗Idは、抗Idを誘導した元の抗原結
合ドメインとエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合ドメインのイディオタ
イプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合ドメインを発
現する他のクローンを同定することが可能である。抗Id抗体は、本明細書の他の箇所に
記載のものなどの任意の好適な技術によって変動(それにより、抗Id抗体バリアントを
産生する)、及び/又は誘導することができる。
本開示のhK2に結合する抗原結合ドメイン、hK2に結合する抗原結合ドメインを含
むタンパク質、又はhK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質(本
明細書ではhK2結合タンパク質と総称される)を、異種分子にコンジュゲートさせても
よい。hK2結合タンパク質はまた、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む
キメラ抗原受容体(CAR)も含む。
を提供する。
含む、タンパク質を提供する。
含む、多重特異性タンパク質を提供する。
含む、CARを提供する。
提供する。
む、タンパク質を提供する。
む、多重特異性タンパク質を提供する。
む、CARを提供する。
治療薬を導くために使用することができる。あるいは、内部移行してから細胞機能を改変
することを意図する治療薬にカップリングさせた本開示のhK2結合タンパク質を用いて
、hK2発現細胞を標的とすることもできる。
ルにおけるhK2の発現を評価するために使用することができる。
的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能なものに
する組成物を含む。
粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素(例えば、一般的にELISAにおいて使用される
)、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオ
ロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート(scintillates)、アビ
ジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、抗体又はその断片、ポリヒス
チジン、Ni2+、Flagタグ、mycタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ
、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステル、
及び比色基質が挙げられる。
を発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグ
ナルを発する。
ロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、3H、11C、
13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu
、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、
94mTc、99mTc、115In、1231、1241、125I、1311、21
1At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac、及び227A
cが挙げられる。
ンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバ
ルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原
子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イ
ットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、
ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム
原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原
子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、
レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウ
ム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、
セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、
ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウ
ム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウ
ム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、
アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインス
タイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はロー
レンシウム原子である。
あり得る。
ドリニウム原子であり得る。
)の原子番号を有する金属であり得る。
、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、
Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe
3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2
+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+、及びZn2+であり得る。金属
原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る
。
80RDマレイミド、又はIRDye 800CW、ルテニウムポリピリジル色素などの
任意の市販の色素が挙げられる。
yante、FITC)、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド
、CyDye(例えば、Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluors(例
えば、Alexa488、Alexa555、Alexa594、Alexa647)、
近赤外(near infrared、NIR)(700~900nm)蛍光染料、並びにカルボシア
ニン及びアミノスチリル染料である。
して使用することができる。
ク質は、造影剤として使用することができる。
異性タンパク質は、造影剤として使用することができる。
は、造影剤として使用することができる。
えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片)、
又は放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)である。
レキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、
マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、
DNA結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞傷害性又は細胞増殖
抑制作用を引き起こし得る。
活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリ
ンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォルディ(Aleurites fordii)
タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナ(Phytolaca americana)
タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・カランティア(
momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス(s
apaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマ
イシン、エノマイシン、及びトリコテセンなどの酵素活性を有する毒素である。
Y、及び186Reなどの放射性核種である。
類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンであ
る。例示的な分子は、米国特許第5,635,483号及び同第5,780,588号に
開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTPの加水分解、
並びに核及び細胞の分裂に干渉し(Woyke et al(2001)Antimic
rob Agents and Chemother.45(12):3580~358
4)、抗癌及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチ
ン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のN(アミノ)末端若しくはC(カルボキシル)末端を
介して(国際公開第02/088172号)、又は抗体内に遺伝子操作された任意のシス
テインを介して、本発明の抗体に結合することができる。
ートさせることができる。
ンパク質にコンジュゲートされる。
パク質に直接又は間接的にコンジュゲートさせることができる。好適なリンカーは、当該
技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー(N-スクシ
ミジル-ベンゾエートの誘導体、ドデカボレート)、大環状及び非環式の両キレート剤の
キレート部分、例えば、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,1
0,四酢酸(DOTA)の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の誘導体、
S-2-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7-トリアザシクロノナン-1,
4,7-三酢酸(NOTA)の誘導体、及び1,4,8,11-テトラアザシクロドデカ
ン-1,4,8,11-四酢酸(TETA)の誘導体、N-スクシンイミジル-3-(2
-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミド
エステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(
例えば、ジスクシンイミジルスベレート)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)
、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス
-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジア
ミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、及びビス-
活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)、並びに
他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
血液から除去される。
本発明はまた、hK2に結合する抗原結合ドメインを含むキットを提供する。
供する。
キットを提供する。
る。
ンパク質を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書;他の試薬、例えば、標
識、治療薬、又はキレート化若しくは別の方法のカップリングに有用な剤、標識若しくは
治療薬に対する抗体、又は放射線防護組成物;投与するために当該抗体を調製するための
デバイス又は他の材料;医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又
は他の材料を含む、1つ以上の他の構成要素を含み得る。
キットの使用説明書とを含む。
むタンパク質と、キットの使用説明書とを含む。
む多重特異性タンパク質と、キットの使用説明書とを含む。
される。
ンパク質は、標識される。
重特異性タンパク質は、標識される。
含む
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL。
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
む、hK2に結合する抗原結合ドメインを含む。
、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、134、135、
136、308、316、318、319、320、321、322、323、324、
325、404、405、406、407、408、又は409を含む、hK2に結合す
る抗原結合ドメインを含む。
本発明はまた、サンプル中のhK2を検出する方法であって、サンプルを入手すること
と、当該サンプルを本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインと接触させることと、当
該サンプル中の結合したhK2を検出することと、を含む、方法を提供する。
細胞、滑液、血中循環細胞、組織と会合していない細胞(即ち、遊離細胞)、組織(即ち
、微細な針吸引を含む、手術により切除された組織、生検)、組織学的調製物などに由来
することができる。
できる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して
抗体を直接標識すること、又は本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグな
どの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ル
テニウム、111In-DOTA、111In-ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA
)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダ
ーゼ、ポリ-ヒスチジン(HISタグ)、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染
料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びAlexafluo
r(登録商標)染料である。
様々なアッセイで使用してよい。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオ
イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光(
ECL)イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別(FACS)、又は
ELISAアッセイである。
本明細書で同定されたhK2に結合する抗原結合ドメインのいずれかを、キメラ抗原受
容体(CAR)に遺伝子操作して、hK2に結合するCARを提供することができる。本
開示は、hK2を標的とするCAR、このようなCARを含む細胞、及び本明細書に記載
のCARを使用して前立腺癌などのhK2産生癌を治療する方法を提供する。
「抗原特異的応答を誘発する」という句は、本明細書で使用するとき、CARが抗原に特
異的に結合し、免疫学的に認識することができ、その結果、CARのhK2抗原への結合
により免疫応答が誘発されることを意味する。抗原特異性及び標的細胞を認識する能力に
ついてCARを試験する方法は、当技術分野で知られている。
胞の使用に関する。キメラ抗原受容体(CAR)は、T細胞シグナル伝達ドメインに連結
された抗体(scFvなど)の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築された異種タン
パク質又はポリペプチドである。CARの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合
特性を利用して、非MHC制限的に選択された標的に向けてT細胞の特異性及び反応性を
リダイレクトする能力を挙げることができる。非MHC制限抗原認識により、CARを発
現するT細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができるため、腫瘍
逃避の主要なメカニズムを迂回する。更に、T細胞において発現される場合、CARは、
内因性T細胞受容体(T cell receptor、TCR)アルファ及びベータ鎖と有利には二量
体化しない。
に記載の刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメ
イン(本明細書では細胞質シグナル伝達ドメインとも称される)とを少なくとも含む組み
換えポリペプチドコンストラクトを提供する。CARを発現するT細胞は、本明細書では
、CAR T細胞、CAR-T細胞、又はCAR修飾T細胞と称され、これらの用語は、
本明細書において互換的に使用される。細胞は、その表面上に抗体結合ドメインを安定し
て発現するように遺伝的に改変することができ、MHC非依存性の新規抗原特異性を付与
する。
Iタンパク質の細胞内ドメインと組み合わされて単一のキメラタンパク質になるCARを
安定して発現するように、遺伝的に改変される。一実施形態では、刺激分子は、T細胞受
容体複合体に関連するゼータ鎖である。
機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成することにより定められたシグナル伝達
経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、
又はかかるメッセンジャに応答することによりエフェクターとして機能することによって
作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞(例えば、CAR-T細胞)
の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばCAR-T細胞における
免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びヘルパー活性(サイトカインの分
泌を含む)が挙げられる。
含む。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激又は抗原依存性シミ
ュレーションに関与する分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグ
ナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含む。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達
ドメインとしては、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するもの
が挙げられる。例えば、CAR-Tの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞
受容体の細胞質配列を含み、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体又は共刺激
分子からの細胞質配列を含む。
ITAMとして知られているシグナル伝達モチーフを含む。一次細胞質シグナル伝達配列
を含む例示的なITAMとしては、CD3-ゼータ、FcRγ、FcRベータ、CD3γ
、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DA
P10、及びDAP12に由来するものが挙げられる。
タ」は、GenBankアクセッション番号BAG36664.1として提供されるタン
パク質、又は非ヒト種、例えば、ネズミ、ウサギ、霊長類、マウス、げっ歯類、サル、類
人猿などからの等価な残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」又は代替的に「CD
3-ゼータ刺激ドメイン」又は「TCR-ゼータ刺激ドメイン」は、T細胞活性化に必要
な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸
残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、GenBankアクセ
ッション番号BAG36664.1の残基52~164、又はその機能的オルソログであ
る、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する等価な残基を含
む。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」又は「CD3-ゼータ刺激ドメイン」は、配列
番号28として提供される配列、又は配列番号28と少なくとも50%、少なくとも55
%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少な
くとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
8%、若しくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列である。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR
GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE
RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
よる共刺激応答(例えば、限定するものではないが、増殖)を媒介するT細胞上の同種結
合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガ
ンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、MHCクラス1分子、BTLA、
及びToll配位子受容体、並びにOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、I
CAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、及び4-1BB(CD137)が挙
げられるが、これらに限定されない。
子は、以下のタンパク質ファミリー:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパ
ク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM
タンパク質)、及び活性化NK細胞受容体で表すことができる。例示的なこのような分子
としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD
30、MyD88、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原
-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp
80、CD160、B7-H3、及びCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げら
れる。
胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的フラグメントを含み得る。
番号AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列、又は非ヒト種、例えば、マウ
ス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するTNFRスーパーファミリー
のメンバーを指し、「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBankアクセッション番
号AAA62478.2のアミノ酸残基214~255、又は非ヒト種、例えば、マウス
、げっ歯類、サル、及び類人猿などからの等価な残基として定義される。一態様では、「
4-1BB共刺激ドメイン」又は「CD137共刺激ドメイン」は、配列番号27(KR
GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
;配列番号27)、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの
等価な残基、又は配列番号27と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60
%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%の配列同一性を有する配列として提供される配列である。
メインが使用される。別の実施形態では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換によって選択
又は修飾し、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結
合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる
。一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8αヒンジドメインを含む。
くとも1つの共刺激分子に由来する1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。
一実施形態では、共刺激分子は、4-1BB(すなわち、CD137)、CD27、CD
3-ゼータ、及び/又はCD28から選択される。CD28は、T細胞共刺激において重
要なT細胞マーカーである。CD27は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメン
バーであり、共刺激免疫チェックポイント分子として機能する。4-1BBは、T細胞に
強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Tリンパ球の長期生存を増強する。CD
3-ゼータは、TCRと会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシンベースの活性化
モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs、ITAM)を含有する
。別の実施形態では、共刺激分子は、MyD88又はCD40である。
1BB、及びCD3-ゼータを含む細胞内T細胞受容体シグナル伝達ドメインと、を含む
。別の実施形態では、CARは、細胞内ヒンジドメインと、CD28、4-1BB、及び
CD3-ゼータを含む細胞内T細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含み、当該ヒンジド
メインは、CD8、CD4、又はCD28の細胞外領域の全て又は一部、抗体定常領域の
全て又は一部、FcγRIIIA受容体、IgGヒンジ、IgMヒンジ、IgAヒンジ、
IgDヒンジ、IgEヒンジ、又はIgヒンジの全て又は一部を含む。IgGヒンジは、
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、
IgD、IgE、又はこれらのキメラ由来であってよい。
下に定義する刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達
ドメイン(本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも称される)とを少なくとも
含む組み換えポリペプチドコンストラクトを提供する。
に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキ
メラ融合タンパク質を含む。一実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインと、膜
貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来
する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融
合タンパク質を含む。一実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ド
メインと、1つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも2つの機能的シグナル伝達ドメイ
ン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイ
ンと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。
むように、又は本発明のCARの状況において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと
組み合わされるように設計してよい。一実施形態では、CARの細胞質ドメインは、CD
3-ゼータのシグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、CARの細胞質ドメインと
しては、CD3-ゼータ、4-1BB、及びCD28シグナル伝達モジュール、並びにこ
れらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、本発明は、C
AR T細胞、及び養子療法のためのそれらの使用方法を提供する。
能的バリアント」とは、本明細書で使用するとき、親CARとかなりの又は著しい配列同
一性又は類似性を有するCARを指し、当該機能的バリアントは、それがバリアントであ
るCARの生物活性を保持している。機能的バリアントは、例えば、親CARと同様の程
度、同程度、又はより高い程度、標的細胞を認識する能力を保持しているCARのバリア
ントを包含する。親CARに関して、機能的バリアントは、例えば、親CARとアミノ酸
配列が少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約75%、約80%、約8
5%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約9
7%、約98%、約99%又はそれ以上同一であり得る。
のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、機能的バリアントは、少なくとも1つの非保存
的アミノ酸置換を有する親CARのアミノ酸配列を含む。この場合、非保存的アミノ酸置
換は、機能的バリアントの生物活性を妨害又は阻害することができない。非保存的アミノ
酸置換により、機能的バリアントの生物活性が親CARと比較して増加するように、機能
的バリアントの生物活性を増強させることができる。
。
、その結果、他の構成成分、例えば、他のアミノ酸が、機能的バリアントの生物活性を実
質的に変化させることはない。
、すなわち、任意の数のアミノ酸を含み得、ただし、CAR(又はその機能的部分若しく
は機能的バリアント)は、その生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主内
の疾患細胞(例えば、癌細胞)を検出する能力、又は宿主内の疾患を治療若しくは予防す
る能力などを保持している。例えば、CARは、約50~約5000個のアミノ酸長、例
えば、約50、約70、約75、約100、約125、約150、約175、約200、
約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、
約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、
約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、
約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000
個、又はそれ以上のアミノ酸長であり得る。
然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでいてもよい。かかる合成アミノ酸
は、当該技術分野において既知であり、例としては、アミノシクロヘキサンカルボン酸、
ノルロイシン、α-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-シス
テイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルア
ラニン、4-ニトロフェニルアラニン、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボ
ン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、
4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリンβ
-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキ
シルアラニン、シクロヘキシルグリシン、N’-ベンジル-N’-メチル-リジン、N’
,N’-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペ
ンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカ
ルボン酸、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-
3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、及びα-tert-ブチ
ルグリシンが挙げられる。
とができる。これらは、グリコシル化、エステル化、N-アシル化、アミド化、カルボキ
シル化、リン酸化、エステル化、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化することができ
、又は酸付加塩に変換することができる。いくつかの実施形態では、これらは、二量体化
若しくはポリマー化、又はコンジュゲートされている。
既知の方法によって得ることができる。ポリペプチド及びタンパク質をデノボ合成する好
適な方法は、参考文献、例えばChan et al.,Fmoc Solid Pha
se Peptide Synthesis,Oxford University P
ress,Oxford,United Kingdom,2000;Peptide
and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,Mar
cel Dekker,Inc.,2000;and Epitope Mapping
,ed.Westwood et al.,Oxford University Pr
ess,Oxford,United Kingdom,2001に記載されている。ま
た、CARは、標準的な組み換え方法を使用し、本明細書に記載の核酸を使用して、組み
換えにより産生され得る。更に、CAR(その機能的部分及び機能的バリアントを含む)
の一部は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物などの供給源から単離及び/又は精製することが
できる。単離及び精製の方法は、当該技術分野において既知である。あるいは、本開示の
CAR(その機能的部分及び機能的バリアントを含む)は、商業的に合成することができ
る。この点において、CAR、ポリペプチド、及びタンパク質は、合成、組み換え、単離
、及び/又は精製することができる。
供する。抗体又はその抗原結合断片は、CARの機能的部分に対して任意のレベルの親和
性又は結合活性を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ある範
囲の親和性(KD)でhK2に結合し得る。一実施形態では、当業者により実施される表
面プラズモン共鳴又はKinexa法によって求めたとき、約10-7M以下のKDで、
例えば、限定するものではないが、1~9.9(又は1、2、3、4、5、6、7、8、
若しくは9などの、その中の任意の若しくは値)×10-8M、10-9M、10-10
M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M、又はそ
の中の任意の範囲若しくは値のKDで、抗体はhK2に結合する。1つの例示的な親和性
は、1×10-8M以下である。別の例示的な親和性は、1×10-9M以下である。
該技術分野において既知であり、任意の抗体-抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノ
アッセイ(radioimmunoassay、RIA)、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセ
イ(enzyme-linked immunosorbent assay、ELISA)、免疫沈降、及び競合阻害アッ
セイなどが挙げられる。
その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(sdAb)、
scFv及びヒトキメラ抗体又はヒト化抗体などの連続するポリペプチド鎖の一部として
発現される(Harlow et al.,1999、In:Using Antibo
dies:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor Laboratory Press,N.Y.;Harlow et al.,
1989、In:Antibodies:A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor,N.Y.;Houston et al.,19
88、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;B
ird et al.,1988,Science 242:423-426)。一態様
では、本開示のCARの抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。一態様では、本開示のC
ARは、scFvを含む抗体断片を含む。
メインを含む、CARを提供し、当該細胞外抗原結合ドメインは、hK2に結合する。
hK2に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイン。
チドと、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9(CD137)成分を含む共刺激ド
メイン及びT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3z)成分を含む一次シグナル
伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むCD8aヒンジ領域、
配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン、並び
に/又は
配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン、及
び配列番号28と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ド
メインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン。
メインを含む、CARを提供し、当該細胞外抗原結合ドメインは、hK2に結合し、以下
を含む
配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
37のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
61のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
37のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号165のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
64のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
66のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
68のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号2
04のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号444のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
66のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号160のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
59のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号140のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
61のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号140のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
39のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号140のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号1
59のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号1のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号4のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号2のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号4のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号3のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号4のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号1のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号5のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号2のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号5のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号3のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号5のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号1のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号6のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;
配列番号2のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号6のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;又は
配列番号3のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号6のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該細胞外抗原結合ドメインがhK2に結合し、配列番
号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号162のV
HのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、CARを提供する。
シグナル伝達ドメインを含み、当該細胞外抗原結合ドメインがhK2に結合し、配列番号
138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号137のVH
のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3;又は配列番号140のVLのLCDR1、
LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号139のVHのHCDR1、HCDR2、
及びHCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号63、72、141、147、170、176、188、194、196、198、
200、206、又は216のHCDR1、配列番号64、65、73、142、148
、171、177、183、189、195、197、199、201、207、又は2
17のHCDR2、配列番号66、143、172、178、184、190、208、
又は218のHCDR3、配列番号67、68、144、173、179、182、18
5、又は191のLCDR1、配列番号69、70、145、174、180、186、
192、又は470のLCDR2、及び配列番号71、146、175、181、187
、193、又は209のLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号63、72、141、147、170、176、188、194、196、198、
200、206、若しくは216のHCDR1、又はその保存的置換を含む、CARを提
供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号64、65、73、142、148、171、177、183、189、195、1
97、199、201、207、若しくは217のHCDR2、又はその保存的置換を含
む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号66、143、172、178、184、190、208、若しくは218のHCD
R3、又はその保存的置換を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号67、68、144、173、179、185、若しくは191のLCDR1、又は
その保存的置換を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号69、70、145、174、180、186、192、若しくは470のLCDR
2、又はその保存的置換を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号71、146、175、181、187、193、若しくは209のLCDR3、又
はその保存的置換を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号196、197、178、179、180、及び181のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号200、201、190、191、192、193のHCDR1、HCDR
2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209のHCDR1、HC
DR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、それ
ぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71のHCDR1、HCDR2、HC
DR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、CARを提供する。
2、3、138、140、160、163、165、167、169、又は205のVL
を含む。
5、6、137、139、159、161、162、164、166、168、又は20
4のVHを含む。
2、3、138、140、160、163、165、167、169、205、又は44
4のVL、及び配列番号4、5、6、137、139、159、161、162、164
、166、168、又は204のVHを含む。
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号137のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号162のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
番号162のポリペプチドと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号162のVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号164のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号166のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号169のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号205のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号159のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号161のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号139のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号159のポリペプチドと
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号4のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号5のポリペプチドと少なくと
も50%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%
、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号6のポリペプチドと少なくと
も80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%
、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号4のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号5のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号6のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号4のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なく
とも99%同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号5のポリペプチドと少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
5%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%
同一であるアミノ酸配列を含むVLと、配列番号6のポリペプチドと少なくとも85%、
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含むVHとを含む。
含むVLと、配列番号137及び配列番号139のアミノ酸配列を含むVHとを含む細胞
外抗原結合ドメインを含む。
む。いくつかの実施形態では、scFvは、VLとVHとの間にリンカーポリペプチドを
含む。
。いくつかの実施形態では、リンカーポリぺプチドは、配列番号7と少なくとも50%、
少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくと
も75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42
、43、44、149、150、151、152、410、411、412、413、4
14、415、416、417、418、419、420、421、422、423。4
24、又は425からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
のアミノ酸配列を含むscFVである。
9のアミノ酸配列を含むscFVである。
0のアミノ酸配列を含むscFVである。
1のアミノ酸配列を含むscFVである。
2のアミノ酸配列を含むscFVである。
0のアミノ酸配列を含むscFVである。
1のアミノ酸配列を含むscFVである。
2のアミノ酸配列を含むscFVである。
3のアミノ酸配列を含むscFVである。
4のアミノ酸配列を含むscFVである。
5のアミノ酸配列を含むscFVである。
6のアミノ酸配列を含むscFVである。
7のアミノ酸配列を含むscFVである。
8のアミノ酸配列を含むscFVである。
9のアミノ酸配列を含むscFVである。
0のアミノ酸配列を含むscFVである。
1のアミノ酸配列を含むscFVである。
2のアミノ酸配列を含むscFVである。
3のアミノ酸配列を含むscFVである。
4のアミノ酸配列を含むscFVである。
5のアミノ酸配列を含むscFVである。
6又は配列番号417のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列
を含むscFVである。
は配列番号417のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むscFVである。
又は配列番号152のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少
なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配列を
含むscFVを含む、hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。
配列番号152のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むscFVを含む、hK2
に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少
なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又
は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
35、又は配列番号136のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90
%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸
配列を含む。
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくと
も99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
、又は配列番号136のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号24のアミノ酸配
列を含む。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41
、42、43、44、149、150、151、152、410、411、412、41
3、414、415、416、417、418、419、420、421、422、42
3、424,又は425からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、CARを提供す
る。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号33のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
も50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%
、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号34のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号35のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号36のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号37のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号38のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号39のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号40のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号41のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号42のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号43のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
内シグナル伝達ドメインを含み、当該hK2に結合する細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号44のアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
とも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70
%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む
。
ミリーメンバー9(CD137)成分、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3
z)成分、表面抗原分類(CD27)成分、表面抗原分類スーパーファミリーメンバー(
例えば、CD28又は誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)など)成分、及びこれらの組
み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む。
くつかの実施形態では、CD137成分は、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも8
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98、又は
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
つかの実施形態では、CD3z成分は、配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも80%
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98、又は少な
くとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号45のアミノ酸配
列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少な
くとも98、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG
CELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK
RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、CD8a-TMポリペプチドは、配列番
号26のアミノ酸配列を含む。(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC;
配列番号26)。
列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少な
くとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。
28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD
16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD
134、CD137、又はCD154の膜貫通領域を少なくとも含む。いくつかの実施形
態では、膜貫通ドメインは、ζ、η、又はFcεR1γ及び-β、MB1(Igα)、B
29又はCD3-γ、ζ、若しくはηの膜貫通ドメインを少なくとも含む。いくつかの実
施形態では、膜貫通ドメインは、合成であり、例えば、ロイシン及びバリン、フェニルア
ラニンのトリプレット、又はトリプトファンなどの主に疎水性の残基を含む。
合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、
CD8aヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、CD8a-ヒンジ領域は、配列番
号25のアミノ酸配列(TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRP
AAGGAVHTRGLDFACD;配列番号25)を含む。
なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも
70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を
含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列EPKSCDKTHTCP
PCP(配列番号126)を含むか、又はEPKSCDKTHTCPPCP(配列番号1
26)と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、
少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%のアミノ酸
配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列
EPKSCDKTHTCPPCP(配列番号127)を含むか、又はEPKSCDKTH
TCPPCP(配列番号127)と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも6
0%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、若しくは少
なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒ
ンジ領域は、配列ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRC
P)3(配列番号128)を含むか、又はELKTPLGDTTHTCPRCP(EPK
SCDTPPPCPRCP)3(配列番号128)と少なくとも50%、少なくとも55
%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少な
くとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
8%、若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの
実施形態では、ヒンジ領域は、配列ESKYGPPCPSCP(配列番号129)を含む
か、又はESKYGPPCPSCP(配列番号129)と少なくとも50%、少なくとも
55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、
少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
5、56、57、58、59、60、61、153、154、155、156、426、
427、428、429、430、431、432、433、434、435、435、
436、437、438、439、440、又は441のアミノ酸配列を含む、CARを
提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一で
あるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一
であるアミノ酸配列を含む、CARを提供する。
も90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるア
ミノ酸配列を含む、CARを提供する。
も90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるア
ミノ酸配列を含む、CARを提供する。
列と同一であるアミノ酸配列を含む。
5、又は配列番号156のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%
、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%)同一であるアミノ酸配
列を含む。
%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも
99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも
99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも
99%)同一であるアミノ酸配列を含む。
又は配列番号156のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
メイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、当該細胞外抗原結合ドメインが、配列
番号111及び配列番号112の配列を有するエピトープ内の3つ以上の残基でhK2に
結合するCARを提供する。
本開示はまた、本明細書に記載のCARをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供
する。
縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド配列を全て
含む。タンパク質又はRNAをコードしているポリヌクレオチドという句はまた、そのタ
ンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、いくつかのバリアントにおいて、発現し
たタンパク質にスプライシングされるイントロンを含有し得る程度にイントロンを含み得
る。
る。
発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは
、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞に
よって、又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、組み換え
ポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド(例えば、裸の、又はリポソームに
含有されるもの)、及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウ
イルス、及びアデノ随伴ウイルス)を含む、当該技術分野において既知の全てのベクター
が挙げられる。
施形態では、単離免疫応答性細胞は、CARで形質導入され、例えば、CARは、免疫応
答性細胞の表面上に構成的に発現される。ある特定の実施形態では、単離免疫応答性細胞
は、少なくとも1つの共刺激リガンドで更に形質導入され、免疫応答性細胞が少なくとも
1つの共刺激リガンドを発現するようにする。ある特定の実施形態では、少なくとも1つ
の共刺激リガンドは、4-1BBL、CD48、CD70、CD80、CD86、OX4
0L、TNFRSF14、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定
の実施形態では、単離免疫応答性細胞は、少なくとも1つのサイトカインで更に形質導入
され、免疫応答性細胞が少なくとも1つのサイトカインを分泌するようにする。ある特定
の実施形態では、少なくともサイトカインは、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7
、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、及びこれらの組み合
わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単離免疫応答性細胞は、Tリ
ンパ球(T細胞)、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、
制御性T細胞(Treg)、ヒト胚性幹細胞、リンパ球前駆細胞、T細胞前駆細胞、及びそれ
からリンパ球細胞が分化し得る多能性幹細胞からなる群から選択される。
細胞株(例えば、Jurkat、SupT1など)からのT細胞、又は哺乳動物から得ら
れたT細胞など、任意のT細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、T細胞は、多数
の供給源(骨髄、血液、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに
限定されない)から得ることができる。T細胞はまた、濃縮又は精製され得る。T細胞は
、ヒトT細胞であり得る。T細胞は、ヒトから単離されたT細胞であり得る。T細胞は、
任意の種類のT細胞であり得、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD8+T細胞(例
えば、細胞傷害性T細胞)、CD4+ヘルパーT細胞(例えば、Th1及びTh2細胞)
、末梢血単核球(PBMC)、末梢血白血球(PBL)、腫瘍浸潤細胞、メモリT細胞、
ナイーブT細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の発達段階のものであり得る。
T細胞は、CD8+T細胞又はCD4+T細胞であってよい。
る抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、CD8αヒンジ、及び膜貫通ドメイン、並び
にヒト4-1BB及びCD3-ゼータシグナル伝達ドメインを含むCARを含むレンチウ
イルスベクターを細胞に導入することによって生成され得る。本開示のCAR T細胞は
、インビボで複製することができ、その結果、持続的な腫瘍制御につながり得る長期持続
性が得られる。
細胞を更に提供する。本明細書で使用するとき、「宿主細胞」という用語は、組み換え発
現ベクターを含有し得る任意のタイプの細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植
物、動物、若しくは藻類、真菌であり得るか、又は、原核細胞、例えば、細菌若しくは原
生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞であり得る、すなわち、生物、例
えば、ヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞、すなわち、懸濁
物中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において既知であり、
例えば、DH5α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、C
OS細胞、HEK293細胞などが挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製す
る目的で、宿主細胞は、原核細胞、例えば、DH5α細胞であり得る。組み換えCAR、
ポリペプチド、又はタンパク質を産生する目的で、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る
。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は、任意の細胞タイプのものであり得、任意
の組織タイプに由来し得、任意の発達段階のものであり得るが、宿主細胞は末梢血リンパ
球(peripheral blood lymphocyte、PBL)であり得る。宿主細胞はT細胞であり得る
。
、少なくとも1つの他の細胞、例えば、組み換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細
胞(例えば、T細胞)、又はT細胞以外の細胞(例えば、B細胞、マクロファージ、赤血
球、好中球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など)に加えて、記載される
組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であり得る。代替的
に、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、この場合、その集団は、組み換え発現ベ
クターを含む宿主細胞を主に含む(例えば、本質的にそれらからなる)。集団はまた、細
胞のクローン集団であり得、この場合、集団の全ての細胞が組み換え発現ベクターを含む
単一の宿主細胞のクローンであり、そのため、集団の全ての細胞は組み換え発現ベクター
を含む。一実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載の組み換え発現ベクターを含む宿
主細胞を含むクローン集団である。
本発明はまた、本開示のhK2結合タンパク質のいずれかをコードしている単離ポリヌ
クレオチドを提供する。hK2結合タンパク質は、hK2に結合する抗原結合ドメイン、
hK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、hK2に結合する抗原結合ドメイ
ンを含む多重特異性タンパク質、及び本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む
キメラ抗原受容体(CAR)を含む。
リヌクレオチドを提供する。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
を提供する。
。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
る。
。
を提供する。
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;又は
配列番号6のVH及び配列番号3のVL。
レオチド及び/又は配列番号163のVLをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供
する。
18、19、20、21、22、23、133、134、135、136、308、31
6、318、319、320、321、322、323、324、325、404、40
5、406、407、408、又は409のポリペプチドをコードしている単離ポリヌク
レオチドを提供する。
8、39、40、41、42、43、44、149、150、151、152、410、
411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、
421、422.423、424、又は425のポリペプチドをコードしている単離ポリ
ヌクレオチドを提供する。
クレオチド配列は、配列番号225、226、227、228、229、230、231
、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274
、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292
、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312
、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370
、371、372、373、374、446、450、又は451のポリヌクレオチドと
少なくとも85%同一である。
クレオチド配列は、配列番号225、226、227、228、229、230、231
、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274
、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292
、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312
、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370
、371、372、373、374、446、450、又は451のポリヌクレオチドと
少なくとも90%同一である。
クレオチド配列は、配列番号225、226、227、228、229、230、231
、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274
、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292
、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312
、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370
、371、372、373、374、446、450、又は451のポリヌクレオチドと
少なくとも95%同一である。
クレオチド配列は、配列番号225、226、227、228、229、230、231
、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274
、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292
、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312
、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370
、371、372、373、374、446、450、又は451のポリヌクレオチドと
少なくとも98%同一である。
クレオチド配列は、配列番号225、226、227、228、229、230、231
、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274
、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292
、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312
、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370
、371、372、373、374、446、450、又は451のポリヌクレオチドと
少なくとも99%同一である。
232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、
242、243、244、245、246、247、263、267、271、267、
274、282、292、293、294、295、303、304、305、306,
312、316、363、364、365、367、368、369、370、371、
372、373、又は374の単離ポリヌクレオチドを提供する。
232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、
242、243、244、245、246、247、263、271、273、274、
275、276、277、278、279、280、281、282、283、292、
293、294、295、296、297、303、304、305、306、312、
316、317、363、364、365、366、367、368、369、370、
371、372、373、374、446、450、又は451の単離ポリヌクレオチド
を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号354のポリヌクレオチド配列を
コードしている単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
いる単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
いる単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
チド配列をコードしている単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
いる単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
いる単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
いる単離ポリヌクレオチド配列を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号3
61、221、及び362のポリヌクレオチド配列をコードしている単離ポリヌクレオチ
ド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
とも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少
なくとも99%、又は100%)同一である単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
ポリヌクレオチド又は本開示のhK2結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド
にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチドを含む、単離又は精製核酸を提供する。
ンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオ
チドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列(本明細
書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列)に特異的にハイブリダイズすること
を意味する。高ストリンジェンシー条件としては、正確に相補的な配列を有するポリヌク
レオチド、又は散らばったミスマッチをほんのわずか含むポリヌクレオチドを、ヌクレオ
チド配列とマッチしたいくつかの小領域(例えば、3~12塩基)を有することとなった
ランダム配列から識別する条件が挙げられる。かかる相補的な小領域は、14~17又は
それ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリ
ダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高いストリンジェンシー
条件としては、例えば、低塩及び/又は高温条件(例えば、約50~70℃の温度の約0
.02~0.1MのNaCl又は同等のものによって提供される)が挙げられる。かかる
高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖又は標的鎖との間のミ
スマッチがあったとしてもほとんど許容されず、本明細書に記載のCARのいずれかの発
現を検出するために特に好適である。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よ
りストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
現させる1つ以上の制御エレメント(例えばプロモーター又はエンハンサー)に動作可能
に連結し得る。ポリヌクレオチドは、cDNAであってもよい。プロモーターは、強い、
弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモーターであってよい。使用する
ことができる例示的なプロモーターは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ(HPRT)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ-アクチン、ヒ
トミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイル
スプロモータが、真核細胞中で恒常的に機能し、記載された実施形態での使用に適してい
る。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プ
ロモーター、SV40の初期及び後期プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス(MMTV)
プロモーター、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、エプスタイ
ンバーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、及び他のレトロウイルスの
長い末端反復配列(LTR)、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモー
ターが挙げられる。メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモータ
ー、ドキシサイクリン誘導性プロモーター、タンパク質キナーゼR2’,5’-オリゴア
デニル酸合成酵素、Mx遺伝子、ADAR1などの1つ以上のインターフェロン刺激応答
エレメント(ISRE)を含有するプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用しても
よい。
、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。このようなベクターは、プ
ラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾ
ンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝的バックグラウンドに
本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。
本開示のhK2結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、hK2結合タンパ
ク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。このよう
な調節エレメントには、転写プロモータ、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードす
る配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター
はまた、1つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された
好適なプロモーター及びエンハンサー、他の5’又は3’隣接非転写配列、5’又は3’
非翻訳配列(例えば、必須リボソーム結合部位)、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ー及びアクセプター部位、又は転写終結配列を含んでいてもよい。宿主において複製する
能力を付与する複製起点もまた組み込まれてもよい。
両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレ
オチド間結合は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
ドされている本開示のhK2結合タンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で
宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び
翻訳制御配列は、ウイルス資源により提供することができる。例示的なベクターは、Ok
ayama and Berg,3 Mol.Cell.Biol.280(1983)
に記載されたように構築されてもよい。Biol.280(1983)。
ていてもよい。IRES配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を増
強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、1つ以上のポリ
アデニル化部位(例えば、SV40)を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれ
かの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又
は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように(即ち、ORF間に「スペー
サー」ヌクレオチドを導入することにより)配置されてもよいか、又は別の方法で位置付
けられてもよい。調節エレメント、例えば、IRESモチーフはまた、発現に最適な間隔
を提供するように配置されてもよい。
核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例
えば、ColE1、SV40、2μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来
していてよい。
めに設計され得る。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために
作製され得る。
用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる
遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤(例えば、薬物)に対す
る感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至
らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、
単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、シトシンデアミナー
ゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
ーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性(例えば
、抗生物質、重金属などに対する耐性)、栄養要求性宿主における原栄養を提供するため
の補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子(例えば、ネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラ
サイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノ
ールx耐性遺伝子)、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のHSV-TK
、HSV-TK誘導体、又は6-メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ遺伝子が挙げられる(Gadi et al.,7 Gene Ther.173
8-1743(2000))。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位
は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流
にあってもよい。
174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、p
NH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,
USA);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及び
pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核生物:pWL
neo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pS
VK3、pBPV、pMSG及びpSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lo
nza)並びにpEE12.4(Lonza)である。追加のベクターは、pUCシリー
ズ(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md
.)、pBluescriptシリーズ(Stratagene,LaJolla、Ca
lif.)、pETシリーズ(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX
シリーズ(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)、及
びpEXシリーズ(Clontech,Palo Alto,Calif.)を含む。λ
GT10、λGT11、λEMBL4、及びλNM1149、λZapII(Strat
agene)などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物
発現ベクターとしては、pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3
、及びpBIN19(Clontech)が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとし
ては、pEUK-Cl、pMAM、及びpMAMneo(Clontech)が挙げられ
る。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガ
ンマレトロウイルスベクターであってよい。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
るポリヌクレオチドを含む。
レオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
クレオチドを含む。
レオチドを含む。
るポリヌクレオチドを含む。
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;又は
配列番号6のVH及び配列番号3のVL。
4、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、134、135
、136、308、316、318、319、320、321、322、323、324
、325、404、405、406、407、408、又は409のポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチドを含む。
、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、149、150、1
51、152、410、411、412、413、414、415、416、417、4
18、419、420、421、422、423。424、又は425のポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチドを含む。
るポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号221のポリペ
プチド配列をコードしているポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは
、配列番号360のポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチドを含む。いくつ
かの実施形態では、本開示は、配列番号354、221、及び360のベクター、ポリペ
プチド配列を提供する。
実施形態では、ベクターは、配列番号303のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態
では、ベクターは、配列番号373のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では
、ベクターは、配列番号367、303、及び373のポリヌクレオチド配列を含む。
るポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号221のポリペ
プチド配列をコードしているポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターは
、配列番号362のポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチドを含む。
実施形態では、ベクターは、配列番号303のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態
では、ベクターは、配列番号374のポリヌクレオチドを含む。
胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけ
でなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指す
ことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代にお
いてある特定の改変が生じることがあるため、そのような後代は親細胞と同一ではないこ
とがあるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含ま
れる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であって
もよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・スブチリス(Ba
cillus subtilis)などの桿菌、並びにサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serra
tia)、及び様々なシュードモナス属(Pseudomonas)の種などの他の腸内細菌科のもので
ある。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロ
ミセス(Saccharomyces)(例えば、S.セレビジアエ(S.cerevisiae))及びピキア(P
ichia)である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のもの
であってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株(例えばハイブリドーマ)又は
骨髄腫細胞株(例えばSP2/0(American Type Culture Co
llection(ATCC)、Manassas、VA、CRL-1581)、NS0
(European Collection of Cell Cultures(EC
ACC)、Salisbury,Wiltshire,UK、ECACC No.851
10503)、FO(ATCC CRL-1646)及びAg653(ATCC CRL
-1580)マウス細胞株)が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、U266(A
TTC CRL-TIB-196)である。他の有用な細胞株としては、CHO-K1S
V(Lonza Biologics(Walkersville,MD))、CHO-
K1(ATCC CRL-61)、又はDG44などの、チャイニーズハムスターの卵巣
(CHO)細胞に由来するものが挙げられる。
ことと、宿主細胞によって生成されたhK2結合タンパク質を回収することと、を含む、
本開示のhK2結合タンパク質の生成方法も提供する。タンパク質を作製し、それを精製
する方法は既知である。(化学的に又は組み換えによって)合成されてから、硫酸アンモ
ニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ
ー(HPLC)精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従ってhK2結合タンパク
質を精製することができる(全般的には、Scopes,Protein Purifi
cation(Springer-Verlag,N.Y.,(1982)を参照)。対
象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約80%~85%、純度が少
なくとも約85%~90%、純度が少なくとも約90%~95%、又は純度が少なくとも
約98%~99%、若しくはそれ以上であってよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質
以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてよい。
物学的方法を用いてベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体
発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
示的な修飾ヌクレオチドは、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウ
ラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5
-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ
ウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、N6-置換
アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ
メチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5″-メトキシカル
ボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル
アデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ウィブトキソシン(wybutoxosine)、シュ
ードウラシル、キューオシン、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6
-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチ
ルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチ
ルシトシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4
-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-
(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、及び2,6-ジアミノプリ
ンである。
本発明はまた、本開示のhK2結合タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、
医薬組成物を提供する。
体とを含む医薬組成物を提供する。
的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
質と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、
本発明の抗体が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このよう
なビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落
花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及
び0.3%グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まな
い。これらは、従来周知の滅菌技術(例えば、濾過)によって滅菌することができる。組
成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例え
ば、pH調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのよ
うな医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約0.5重量%未満から通常少なくとも約1重
量%まで、最大で15又は20重量%まで変動し得、また、選択される投与方法に従って
、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル
及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Rem
ington:The Science and Practice of Pharm
acy,21stEdition,Troy,D.B.ed.,Lipincott W
illiams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006
,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp6
91-1092に記載され、特にpp.958-989を参照されたい。
非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、経粘膜(経口、鼻
腔内、膣内、直腸)投与、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であ
ってよい。
的に許容される担体を含む好適な医薬組成物で提供され得る。一態様では、本開示は、記
載される1つ以上のCARを発現する有効量のリンパ球及び医薬的に許容される賦形剤を
含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、CAR発現細胞、例えば、本明細書
に記載されるような複数のCAR発現細胞を、1つ以上の医薬的又は生理学的に許容され
る担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせて含み得る。医薬的に許容される担体は、有効
成分以外の、対象に対して無毒性である医薬組成物中の成分であり得る。
とができる。医薬的に許容される担体の例は、生理学的に適合性の溶剤、分散媒体、コー
ティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり、例えば、塩、緩衝液、
抗酸化剤、糖類、水性若しくは非水性担体、防腐剤、湿潤剤、界面活性剤、若しくは乳化
剤、又はこれらの組み合わせである。医薬組成物中の医薬的に許容される担体の量は、担
体の活性並びに安定性及び/又は最小酸化などの製剤の所望の特徴に基づいて実験的に決
定することができる。用語「医薬的に許容される」とは、医薬組成物に関して本明細書で
使用するとき、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、あるいは
米国薬局方又は動物及び/若しくは又はヒトにおける使用について他の全般的に認識され
ている薬局方に列挙されていることを意味する。
本開示はまた、対象におけるhK2発現癌を治療する方法であって、治療有効量の本開
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを、当該hK2発現癌を治療するのに十分な時間
にわたって、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、当該hK2発現癌を治療す
るのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、当該hK2発現
癌を治療するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供す
る。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むCARを、当該hK2発現癌を治療するの
に十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む免疫コンジュゲートを、当該hK2発現癌
を治療するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する
。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む医薬組成物を、当該hK2発現癌を治療す
るのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
象を治療するために、CARを発現する遺伝的に改変されたT細胞を投与する方法を提供
する。
は、治療を必要とする対象から収集され、本明細書に記載され当該技術分野において既知
の方法を使用して、T細胞を活性化及び増殖して、次いで対象に注入して戻される。
明はまた、化学療法及び/又は免疫療法により対象において著しく免疫が抑制され、それ
によって対象の癌を発症するリスクを増加させる、悪性腫瘍又は自己免疫疾患を治療する
ことを含む。
方法であって、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインを当該対象に投与して当該非
癌性状態を治療することを含む、方法を提供する。
方法であって、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を当該対象
に投与して当該非癌性状態を治療することを含む、方法を提供する。
方法であって、本開示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質
を当該対象に投与して当該非癌性状態を治療することを含む、方法を提供する。
方法であって、本開示の免疫コンジュゲートを当該対象に投与して当該非癌性状態を治療
することを含む、方法を提供する。
方法であって、本開示の医薬組成物を当該対象に投与して当該非癌性状態を治療すること
を含む、方法を提供する。
方法であって、本開示のCARを当該対象に投与して当該非癌性状態を治療することを含
む、方法を提供する。
する。
成(BPH)を有する。
腺癌の非存在下で高PSAレベルを有する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを、当該hK2発現癌を予防するのに十分な時間
にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、当該hK2発現癌を予防す
るのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、当該hK2発現
癌を予防するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供す
る。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むCARを、当該hK2発現癌を予防するの
に十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む免疫コンジュゲートを、当該hK2発現癌
を予防するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する
。
示のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む医薬組成物を、当該hK2発現癌を予防す
るのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
のhK2に結合する抗原結合ドメインを、当該hK2発現腫瘍細胞の量を低減するのに十
分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を、当該hK2発現腫瘍細胞の量
を低減するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する
。
のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、当該hK2発現腫
瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法
を提供する。
のhK2に結合する抗原結合ドメインを含むCARを、当該hK2発現腫瘍細胞の量を低
減するのに十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
の免疫コンジュゲートを、当該hK2発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわた
って、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。
の医薬組成物を、当該hK2発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、当
該対象に投与することを含む、方法を提供する。
る。
前立腺癌、又はこれらの任意の組み合わせである。
の任意の組み合わせである。
結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、前立腺癌を治療するのに十分
な時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメ
インが以下を含む、方法を提供する
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;又は
配列番号6のVH及び配列番号3のVL。
結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、前立腺癌を治療するのに十分
な時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメ
インが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1
9、20、21、22、23、133、134、135、136、308、316、31
8、319、320、321、322、323、324、325、404、405、40
6、407、408、又は409のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、乳癌を治療するのに十分な時間に
わたって、当該対象に投与することを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが以
下を含む、方法を提供する
配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
配列番号161のVH及び配列番号140のVL;
配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
配列番号6のVH及び配列番号2のVL;又は
配列番号6のVH及び配列番号3のVL。
する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、乳癌を治療するのに十分な時間に
わたって、当該対象に投与することを含み、当該hK2に結合する抗原結合ドメインが、
配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20
、21、22、23、133、134、135、136、308、316、318、31
9、320、321、322、323、324、325、404、405、406、40
7、408、又は409のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
抗原に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、前立腺癌を治療するの
に十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該リンパ球抗原に結合する
抗原結合ドメインが以下を含む、方法を提供する:
配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCD
R3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121
のLCDR3;
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260
のLCDR3;又は
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261
のLCDR3。
抗原に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、前立腺癌を治療するの
に十分な時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該リンパ球抗原に結合する
抗原結合ドメインが以下を含む、方法を提供する:
配列番号122のVH及び配列番号123のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号254のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号157のVL。
に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、乳癌を治療するのに十分な
時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該リンパ球抗原に結合する抗原結合
ドメインが以下を含む、方法を提供する:
配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCD
R3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121
のLCDR3;
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260
のLCDR3;又は
配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCD
R3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261
のLCDR3。
に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を、乳癌を治療するのに十分な
時間にわたって、当該対象に投与することを含み、当該リンパ球抗原に結合する抗原結合
ドメインが以下を含む、方法を提供する:
配列番号122のVH及び配列番号123のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号254のVL;又は
配列番号248のVH及び配列番号157のVL。
CARを発現するリンパ球の量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
る1つ以上のCARを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与す
ることを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘導又は調節する。
方法は、記載される1つ以上のCARを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要と
する対象に投与することを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘
導する。別の態様では、本開示は、癌を有する対象の生存期間を増加させる方法を提供し
、本方法は、記載される1つ以上のCARを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必
要とする対象に投与することを含み、それにより、対象の生存期間が長くなる。概ね、C
ARを発現するリンパ球により、対象における癌細胞の死滅が誘導され、対象における腫
瘍/癌細胞の低減又は根絶がもたらされる。標的とすることができる転移性病変を含む癌
の非限定的なリストは、前立腺癌及び乳癌、並びにこれらの組み合わせを含む。一実施形
態では、対象において治療される癌は、前立腺癌及び乳癌である。
の非存在下での高PSAレベルなどの、癌性状態に発達するリスクのある非癌性状態の治
療に適用可能である。
する細胞外抗原結合ドメインを有するCARを発現するリンパ球を、それを必要としてい
る対象に投与し、それによって、当該リンパ球が当該対象における癌細胞の死滅を誘導す
ることを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、CARのうちの少なくとも
1つは、配列番号46~61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
れる1つ以上のCARを発現するリンパ球と接触させることを含み、それにより、リンパ
球は癌細胞の死滅を誘導する。標的とすることができる転移性癌細胞を含む癌細胞の非限
定的なリストは、前立腺癌及びその組み合わせを含む。一実施形態では、癌細胞は、前立
腺癌細胞である。
量は、対象の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差
異を考慮して、医師が判断することができる。概して、本明細書に記載のT細胞を含む医
薬組成物は、約104~約1010細胞/kg(体重)、場合によっては約105~約1
06細胞/kg(体重)の投与量(これらの範囲内の全ての整数値を含む)で投与してよ
いと述べることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のT細胞を含む医薬
組成物は、約106細胞/kg(体重)の投与量で投与され得る。T細胞組成物はまた、
これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において通常に知られている注
入技術を使用することによって投与することができる(例えば、Rosenberg e
t al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
療される部位の感作の前に、そして、感作を引き起こすために十分な時間で行われるよう
に、徐放性、遅延放出、及び持続性放出送達システムを含み得る。組成物は、他の療法薬
又は療法と併用することができる。かかるシステムは、組成物の反復投与を回避すること
により、対象及び医師に対する利便性を高めることができ、本発明における特定の組成物
の実施形態に対して特に好適であり得る。
ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステ
ル、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などのポリマー基本成分
系が含まれる。前述の薬物含有ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,
075,109号に記載されている。送達系としてはまた、コレステロール、コレステロ
ールエステルなどのステロール、並びに脂肪酸又はモノ-ジ-及びトリ-グリセリドなど
の中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系、シラスティック系、ペプチド基本成分系、ヒ
ドロゲル放出系、ワックスコーティング、従来のバインダー及び賦形剤を使用した圧縮錠
剤、部分的に融合したインプラントなども挙げられる。具体例としては、(a)米国特許
第4,452,775号、同第4,667,014号、同第4,748,034号、及び
同第5,239,660号に記載されているものなど、活性組成物がマトリックス内の形
態で含有される浸食系、並びに(b)米国特許第3,854,480号及び同第3,83
2,253号に記載されているものなどの活性成分が制御された速度でポリマーから浸透
する拡散系が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ポンプベースのハードウェ
ア送達システムが使用され得、そのうちのいくつかは埋め込み用に適合されている。
レーシスを実施し)、本開示によるT細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖したT細
胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回
実行することができる。特定の態様では、T細胞は、10cc~400ccの採血から活
性化され得る。特定の態様では、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、
60cc、70cc、80cc、90cc、又は100ccの採血から活性化される。
(エアロゾル吸入、注射、注入、経口摂取、輸血、埋め込み、又は移植を含む)によって
実施することができる。例えば、本明細書に記載されるCAR-T細胞及び組成物は、経
動脈、皮内、皮下、腫瘍内、髄内、節内、筋肉内経路で、静脈内(i.v.)注射によっ
て、又は腹腔内経路で患者に投与され得る。一態様では、本開示の組成物は、i.v.注
射によって投与される。一態様では、本開示の組成物は、皮内注射又は皮下注射によって
対象に投与される。T細胞の組成物は、例えば、腫瘍、リンパ節、組織、器官、又は感染
部位に直接注射することができる。
、hK2)特異的CARを発現する免疫応答性細胞は、1人の対象から得ることができ、
同じ対象又は異なる適合性対象に投与することができる。本開示の末梢血由来T細胞、又
は拡大T細胞(例えば、インビボ、エクスビボ、又はインビトロ由来)は、例えば、静脈
内注射、局所注射、全身注射、カテーテル投与、又は非経口投与を介して投与することが
できる。
細胞、例えば、T細胞を選択及び/又は単離するために、白血球をエクスビボで収集、濃
縮、又は枯渇させる。これらの単離されたT細胞は、当該技術分野において既知の方法に
よって増殖させることができ、本開示の1つ以上のCARコンストラクトが導入され得る
ように処理され、それによってCAR-T細胞を作製することができる。それを必要とす
る対象は、その後、高用量化学療法による標準的な治療と、それに続く末梢血幹細胞移植
を受ける場合がある。特定の態様では、移植後又は移植と同時に、対象は、増殖したCA
R-T細胞の注入を受ける。一態様では、増殖した細胞は、手術の前又は後に投与される
。
くとも部分的に阻止するために十分な量である(「治療有効量」)。対象に投与される上
記治療の投与量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化す
る。ヒト投与のための投与量の増減は、当該技術分野において概ね受け入れられている慣
行に従って実行することができる。
び骨髄中で長期間にわたって高レベルで持続するhK2特異的記憶細胞を得ることができ
る。いくつかの例では、対象に注入された本発明のCAR T細胞は、進行した化学療法
抵抗性癌を有する対象において、インビボで癌細胞、例えば、前立腺癌細胞を排除するこ
とができる。
対象(例えば、ヒト)に、本開示のCAR-T細胞を初回投与し、CAR-T細胞を1回
以上後続投与し、当該1回以上の後続投与は、前回の投与の15日未満後、例えば、14
、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、又は2日後に投与される。一
実施形態では、CAR-T細胞を対象(例えば、ヒト)に1週間に2回以上投与する、例
えば、CAR-T細胞を1週間に2、3、又は4回投与する。一実施形態では、対象に、
CAR-T細胞を1週間に2回以上投与し(例えば、1週間に2、3又は4回投与)(本
明細書ではサイクルとも称される)、その後、CAR-T細胞投与がない週が続き、続い
て、CAR-T細胞を1回以上追加投与する(例えば、CAR-T細胞を1週間に2回以
上投与)。別の実施形態では、対象に、CAR-T細胞を2サイクル以上で投与し、各サ
イクル間の時間は、10、9、8、7、6、5、4、又は3日未満である。一実施形態で
は、CAR-T細胞は、1週間に3回の投与のために、1日おきに投与される。一実施形
態では、CAR-T細胞は、少なくとも2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週
間、8週間、又はそれ以上の週にわたって投与される。
週間、1ヶ月、5週間、6週間、7週間、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、又
はそれ以上後に繰り返され得る。また、治療過程を繰り返すことも、長期にわたる投与と
して可能である。繰り返し投与は、同一用量であっても異なる用量であってもよい。
によって、本発明の方法で投与することができる。
クターを使用して生成される。かかるウイルスベクターで生成されたCAR-T細胞は、
安定したCAR発現を概して有する。
、12、13、14、15日間、CARベクターを一過性に発現する。CARの一過性発
現は、RNA CARベクターの送達によって行われ得る。一実施形態では、CAR R
NAは、エレクトロポレーションによってT細胞に形質導入される。
CAR抗体応答を生成するリスクが高い場合、CAR T注入の中断は、10~14日を
超えて続けないことが必要である。
本開示のhK2結合タンパク質は、少なくとも1つの追加の療法と併用投与してもよい
。
ゲン枯渇療法、若しくは放射線、又はこれらの任意の組み合わせである。
として起こるため、投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時」又は「
同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、1つの治療の送達は、もう1つの
治療の送達が開始される前に終了する。いずれの場合もいくつかの実施形態では、併用投
与することにより、治療がより効果的になる。例えば、第2の治療はより効果的であり、
例えば、同等の効果が、第2の治療を少なくして見られ、又は第2の治療が、第1の治療
なく第2の治療が施される場合に見られるよりも、症状を大幅に軽減し、又は第1の治療
と同様の状況が見られる。いくつかの実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他
のパラメータの軽減が、他の治療なしで送達される1つの治療で観察される軽減よりも大
きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相
加的であるか、又は相加的を超えるものであり得る。送達は、送達された第1の治療の効
果が、第2の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
ー刺激因子、並びにインターフェロンを含むがこれらに限定されない、因子などの他の治
療薬は、CAR-T細胞などのhK2結合タンパク質の前、後、又は同時に(一斉に)投
与してよい。
加の治療剤は、同時に、同じ若しくは別個の組成物で、又は逐次投与してよい。逐次投与
の場合、本明細書に記載のCAR発現細胞などのhK2結合タンパク質を最初に投与し、
2番目に追加の剤を投与してもよく、又は投与の順序を逆にしてもよい。
、治療レジメンにおいて手術、放射線、化学療法、免疫抑制剤、抗体、又は他の免疫破壊
剤と組み合わせて使用してよい。別の実施形態では、本明細書に記載のCAR発現細胞な
どのhK2結合タンパク質は、抗アンドロゲン治療と組み合わせて使用してもよい。一実
施形態では、対象に、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤を投与することができる。例
えば、一実施形態では、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。
本発明の二重特異性hk2/CD3抗体の実施形態を以下に提供する。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球
抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、275、258、
259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ドメインは、配
列番号136のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインは、配列番
号248のVH及び配列番号251のVLを含む。実施形態によれば、単離抗hK2/抗
CD3タンパク質は、配列番号351のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号
267のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球
抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号116、117、118、119、
120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、
及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ドメインは、配
列番号136のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインは、配列番
号122のVH及び配列番号123のVLを含む。実施形態によれば、単離抗hK2/抗
CD3タンパク質は、配列番号351のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号
272のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、25
7、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号134のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメイ
ンは、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号352のHC1、配列番号358のHC2、
及び配列番号267のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号116、117、11
8、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号134のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメイ
ンは、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号352のHC1、配列番号359のHC2、
及び配列番号272のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、25
7、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号325のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメイ
ンは、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号353のHC1、配列番号358のHC2、
及び配列番号267のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1のドメイ
ンは、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、257、
258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ドメイ
ンは、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含み、リンパ球抗原に結合する
第2の結合ドメインは、配列番号331のscFVを含む。実施形態によれば、単離抗h
K2/抗CD3タンパク質は、配列番号354のHC1、配列番号221のLC1、及び
配列番号360のHC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、25
7、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号166のVH及び配列番号444のVLを含み、リンパ球抗原に結合
する第2の結合ドメインは、配列番号331のscFVを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号355のHC1、配列番号223のLC1、
及び配列番号360のHC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、25
7、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号164のVH及び配列番号165のVLを含み、リンパ球抗原に結合
する第2の結合ドメインは、配列番号331のscFVを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号356のHC1、配列番号222のLC1、
及び配列番号360のHC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号116、117、11
8、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号325のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメイ
ンは、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号353のHC1、配列番号359のHC2、
及び配列番号272のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号116、117、118、
119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ドメイ
ンは、配列番号316のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインは
、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む。実施形態によれば、単離抗h
K2/抗CD3タンパク質は、配列番号357のHC1、配列番号359のHC2、及び
配列番号272のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該
リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、257、
258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LC
DR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ドメイ
ンは、配列番号316のscFVを含み、リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインは
、配列番号248のVH及び配列番号151のVLを含む。実施形態によれば、単離抗h
K2/抗CD3タンパク質は、配列番号357のHC1、配列番号358のHC2、及び
配列番号267のLC2を含む。
実施形態によれば、単離抗hk2/抗CD3タンパク質は、hK2に結合する第1のド
メイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、当該hK2に結合する第1の結合ド
メインは、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のH
CDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
当該リンパ球抗原に結合する第2のドメインは、それぞれ配列番号255、256、25
7、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含む。実施形態によれば、hK2に結合する第1の結合ド
メインは、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含み、リンパ球抗原に結合
する第2の結合ドメインは、配列番号331のscFVを含む。実施形態によれば、単離
抗hK2/抗CD3タンパク質は、配列番号361のHC1、配列番号221のLC1、
及び配列番号362のHC2を含む。
する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を限定する
ものではない。
本開示はまた、以下の番号付きの実施形態を提供する。
1.カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単
離タンパク質であって、当該抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、1
72、173、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1
、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離タンパク質。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
9%、又は100%)同一であるVHを含む、実施形態1に記載の単離タンパク質。
態2に記載の単離タンパク質。
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
9%、又は100%)同一であるVLを含む、実施形態1~3のいずれか1つに記載の単
離タンパク質。
態4に記載の単離タンパク質。
れか1つに記載の単離タンパク質。
Ig)、Igの断片、Ig定常領域、又はIg定常領域の断片である、実施形態1~6の
いずれか1つに記載の単離タンパク質。
(FcγR)への結合を低減する少なくとも1つの変異を含み、任意選択で、当該タンパ
ク質のFcγRへの結合を低減する変異が、L234A_L235A_D265Sである
、実施形態7に記載の単離タンパク質。
当該Ig定常領域のCH3ドメインにおける変異が、T350V_T366L_K392
L_T394Wである、実施形態7又は8に記載の単離タンパク質。
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態7~9のいずれか1つに記載の
単離タンパク質。
記載の単離タンパク質。
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態7~11のいずれか1つに記載
の単離タンパク質。
に記載の単離タンパク質。
0%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHCを含む、実
施形態1~13のいずれか1つに記載の単離タンパク質。
0%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるLCを含む、実
施形態1~15のいずれか1つに記載の単離タンパク質。
ンパク質。
載の単離タンパク質。
記載の多重特異性タンパク質。
ク質。
多重特異性タンパク質。
I2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8
、PD-1、CD195、又はNKG2Cである、実施形態20~23のいずれか1つに
記載の多重特異性タンパク質。
ンパク質。
の多重特異性タンパク質:
a.配列番号116の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号117のHCD
R2、配列番号118のHCDR3、配列番号119の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
号157のVLを含む、実施形態25に記載の多重特異性タンパク質。
の多重特異性タンパク質:
a.配列番号255の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号256のHCD
R2、配列番号257のHCDR3、配列番号258の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
61のLCDR3;又は
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1
、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、実施形態25
のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質。
も80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も99%、又は100%)同一であるVHを含む、実施形態29に記載の多重特異性タン
パク質。
施形態30に記載の多重特異性タンパク質。
も80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も99%、又は100%)同一であるVLを含む、実施形態29~31のいずれか1つに
記載の多重特異性タンパク質。
施形態32に記載の多重特異性タンパク質。
33のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質。
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%
)同一である、実施形態34に記載の多重特異性タンパク質。
特異性タンパク質。
ュゲートされ、当該半減期延長部分が、免疫グロブリン(Ig)、Igの断片、Ig定常
領域、又はIg定常領域の断片である、実施形態25~36のいずれか1つに記載の多重
特異性タンパク質。
体(FcγR)への結合を低減する少なくとも1つの変異を含み、任意選択で、当該タン
パク質のFcγRへの結合を低減する変異が、L234A_L235A_D265Sであ
る、実施形態37に記載の多重特異性タンパク質。
を含み、任意選択で、当該Ig定常領域のCH3ドメインにおける変異が、T350V_
L351Y_F405A_Y407Vである、実施形態37又は38に記載の多重特異性
タンパク質。
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は
100%)同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態37~39のいずれか1つに記載の
多重特異性タンパク質。
載の多重特異性タンパク質。
、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一である
アミノ酸配列を含む、実施形態25~41のいずれか1つに記載の多重特異性タンパク質
。
ク質。
エピトープ内のCD3に結合する、実施形態25~43のいずれか1つに記載の多重特異
性タンパク質。
、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCD
R1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該リンパ球抗原に結合する第2のドメイン
が、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。
も80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も99%、又は100%)同一であるVHを含む、実施形態45に記載の単離抗hK2/
抗CD3タンパク質。
施形態46に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
も80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も99%、又は100%)同一であるVLを含む、実施形態45~47のいずれか1つに
記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
施形態48に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも99%、又は100%)同一であるscFVを含む、実施形態45~49の
いずれか1つに記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
を含む、実施形態50に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるHC1を含む、実施形態45~51のいずれか1つに記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
2に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるLC1を含む、実施形態45~53のいずれか1つに記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
4に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるHC2を含む、実施形態45~55のいずれか1つに記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
6に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
、K477)を含む、実施形態52~57のいずれか1つに記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるHC1を含む、実施形態58に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。
9に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるHC2を含む、実施形態58~60のいずれか1つに記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
1に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
親m11B6抗体のヒト化からの抗体作製。
親マウス抗HK2抗体、m11B6は、Vaisanenら(Clinical Ch
emistry 50:9,1607-1617(2004))に記載されている。ヒト
化11B6(本明細書ではhu11B6と称する)は、米国特許第9,345,782号
及び同第10,100,125号において作製及び記載されている。
する追加の抗HK2抗体を作製した。モデリングを使用してhu11B6の熱安定性を改
善するために場合により変更されることができるhu11B6フレームワークにおける残
基の位置を同定した。同定された位置は、VHにおける残基P41、I49、M70、及
びA88、並びにVLにおけるS80、L82、A88、及びY91であった(残基付番
は、配列番号5のhu11B6_VH及び配列番号2のhu11B6_VLのアミノ酸配
列に従った)。
B6VH又はVLである、VH-リンカー-VL配向で、バイナリコンビナトリアルsc
Fvライブラリを作製した。GGSEGKSSGSGSESKSTGGS(配列番号7)
のリンカー配列を使用して、VH/VL領域をコンジュゲートさせた。遺伝子操作された
scFvを大腸菌(E.coli)で発現させ、上清中の生成されたscFvを、ELI
SAによってヒトhK2への結合について試験し、hu11B6の結合と比較した。hu
11B6と同等の結合を示す任意の新たなバリアントを集約し、55℃、60℃、及び6
5℃で10分間、上清をインキュベートした後にヒトhK2への結合について更に試験し
た。55℃、60℃、及び65℃でインキュベートした後にhu11B6への同等の結合
を保持しており、熱安定性が改善していた分子を両配向(VH-リンカー-VL;VL-
リンカー-VH)でマトリクス化し、更なる特性評価のために哺乳類scFvに変換した
。マトリックス化したscFvもCARコンストラクトに組み込み、実施例11に更に記
載する通り更に特性評価した。
15;7(4):778-91)によって概説されているアプローチに従って、広範囲に
及ぶ生殖系列の多様性で実施し、増強された熱安定性についてバリアントを慎重にスクリ
ーニングした。配列保存に基づいて、ヒト重鎖生殖系列IGHV4-30及び軽鎖生殖系
列IGKV3D-11を、フレームワーク適合について選択した。体細胞超変異部位及び
マウス/ヒト生殖細胞系列の多様性の選択セットを含む残基を用いて、バイナリscFv
ライブラリを構築した。バリアントをクローニングし、上記の通り大腸菌で発現させた。
増強された熱安定性について、シングルポイントELISAにおいて異なる温度で上清を
スクリーニングした。マウス/ヒトキメラ11B6 scFVを親対照として使用した。
マウス11B6と同様の結合活性及び67℃のTm値を維持していたクローンKL2B3
59を、追加のプロファイリングのためにscFv-Fc及びCAR-Tに変換した。S
PRによって測定されたKL2B359のhK2への親和性(KD)は、約0.7~1n
Mであった。このキャンペーンからHCF3-LCD6、HCG5-LCB7、KL2B
357、KL2B358、及びKL2B360も得られ、機能性について更に特性評価し
た。
登録商標))及びトランスジェニックラット(OmniRat(登録商標))を使用した
抗体作製。
OmniRat(登録商標)は、キメラヒト/ラットIgH座(ラットCH座に連結さ
れた天然構成の22のヒトVH、全てのヒトD及びJHセグメントを含む)を完全なヒト
IgL座(Jκ-Cκに連結された12のVκ及びJλ-Cλに連結された16のVλ)
と共に含有する。(例えば、Osborn,et al.(2013)J Immuno
l 190(4):1481-1490を参照されたい)。したがって、ラットは、ラッ
ト免疫グロブリンの低減した発現を呈し、導入されたヒト重
鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、免疫化に応答して、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて
、完全ヒト可変領域を有する高親和性キメラヒト/ラットIgGモノクローナル抗体を生
成した。OmniRat(登録商標)の調製及び使用、並びにこのようなラットが有して
いるゲノム改変は、国際公開第14/093908号に記載されている。
可変ドメイン、キメラヒト/マウスヒンジ領域、及びマウスFc領域を有する抗体を生成
する。Ablexisカッパマウス及びラムダマウス系統は、以下に記載されるように、
その重鎖がヒト又はマウスのいずれであるかによって区別される。カッパマウスによって
生成される抗体は、マウスVH、DH及びJHエキソン及びマウスVκ、Jκ、及びCκ
エキソンに由来する配列を欠いている。内因性マウスIgλは、カッパマウスにおいて活
性である。ヒトIgκ鎖は、約90~95%のナイーブレパートリーを含み、マウスIg
λ鎖は、この系統において約5~10%のナイーブレパートリーを含む。ラムダマウスに
よって生成される抗体は、マウスVH、DH及びJHエキソン及びマウスVλ、Jλ、及
びCλエキソンに由来する配列を欠いている。内因性マウスIgλは、ラムダマウスにお
いて活性である。ヒトIgλ鎖は、約40%のナイーブレパートリーを含み、マウスIg
κ鎖は、約60%のナイーブレパートリーを含む。Ablexis(登録商標)の調製及
び使用、並びにこのようなマウスが保有しているゲノム改変は、国際公開第11/123
708号に記載されている。
ヒトカリクレイン-2 6-Hisタンパク質)で免疫した。
VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVH
PQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSF
PHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVV
KVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSL
HYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGI
TSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHH
H(配列番号454)
コホートごとに融合を行った。細胞を合わせ、CD138発現について選別した。可溶性
hK2抗原を使用してハイスループット小型化MSDフォーマットで、ハイブリドーマス
クリーニングを実施した。約>300個のサンプルがhK2バインダーであると同定され
た。Biacore 8K SPRによる単一サイクル速度論法によって、>300個の
抗hKLK2上清サンプルのヒトKLK2タンパク質への結合を測定した。更に、上清サ
ンプルをヒトKLK3タンパク質への結合についても同様に試験した。並行して、上清を
、フローサイトメトリーによって、KLK2発現細胞株VCap及び陰性細胞株DU14
5への結合についても試験した。選択された細胞バインダーを、上記の通り、VH-VL
及びVL/VHの両配向におけるscFv変換及び熱安定性試験に進めた。Ablexi
sマウス免疫キャンペーンから、KL2B413、KL2B30、KL2B53、及びK
L2B242が得られた。OmniRat免疫キャンペーンから、KL2B467及びK
L2B494が得られた。
マット、mAbフォーマット、VH-リンカーVL配向のscFvフォーマット、又はV
L-リンカー-VH配向のscFvフォーマットで発現させ、以下に記載の通り更に分析
した。上記配列番号7のリンカー配列を使用して、VH/VL領域をコンジュゲートさせ
た。
細胞内アッセイにおいて最も高い性能を示した抗体可変ドメイン及びscFv抗体断片
の配列を本明細書に提供する。可変ドメインは、fabフォーマット、VH-リンカーV
L配向のscFvフォーマット、又はVL-リンカー-VH配向のscFvフォーマット
で発現させた。
表3は、選択された抗hK2抗体のVH及びVLのアミノ酸配列を示す。表4は、選択
された抗hK2選択抗体のKabat HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を示す
。表5は、選択された抗hK2抗体のKabat LCDR1、LCDR2、及びLCD
R3を示す。表6は、選択された抗hK2抗体のAbM HCDR1、HCDR2、及び
HCDR3を示す。表7は、抗hK2のAbM LCDR1、LCDR2、及びLCDR
3を示す。表8は、選択されたhK2抗体の可変ドメイン配列及び配列番号をまとめる。
表9は、VH及びVL領域のタンパク質及びDNAの配列番号を示す。
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAA
CCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCA
ACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCA
GTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCA
TACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTA
GGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTT
TCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACA
TATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCT
GGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGC
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAG
CCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAA
ACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACA
ACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGC
TATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCA
GAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTC
ATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTT
TATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTT
GGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAG
CCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCA
ACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCA
GTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAGC
TACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCC
GCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAG
CCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTG
TACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCT
GGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAG
CCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCA
ACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCA
GTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAGC
TACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCC
GCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAG
CCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTG
TACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCT
GGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAG
CCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCA
ACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCA
GTTCCCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCC
TACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCC
GGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTG
TACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTT
GGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAG
CCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCA
ACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCA
GCCACCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCC
TACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCC
GGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTG
TACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTT
GGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAG
CCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCA
ACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCA
GTTCCCTGGCAAGCGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCC
TACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCC
GGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTG
TACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTT
GGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
GAGGTGCAACTTGTGGAGAGCGGCGGAGGTCTGGTCCAA
CCCGGAGGAAGTCTCCGTCTCTCCTGTGCTGCTAGTGGCT
TCACTTTCAGCTCATATTGGATGACATGGGTGAGACAAGC
CCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTAGCTAACATTAAACAG
GACGGCTCCGAACGGTACTATGTTGATTCTGTGAAGGGAC
GGTTCACTATATCCAGGGATAATGCAAAAAATTCACTCTA
TCTTCAAATGAACTCACTCAGAGCAGAGGACACTGCCGTG
TATTATTGCGCCAGGGATCAAAATTATGACATACTGACCG
GTCATTATGGAATGGATGTTTGGGGCCAGGGAACAACCGT
TACCGTCTCAAGT
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG
CCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTG
GCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCC
CCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTAC
AGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAG
TCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCT
GAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTAT
TACTGTGCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCA
ACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCAC
GGTCACCGTCTCCTCA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG
CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATAT
GATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCC
GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTG
TATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACT
ATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCAC
CGTCTCTTCA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG
CCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTG
GCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCC
CGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTC
AGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAG
TCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCT
GAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATAT
TATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCG
ACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG
CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATAT
GATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCC
GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTG
TATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGG
CCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTC
TTCA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG
CCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGT
AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCC
GGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTA
TATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTC
TTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAAT
GGTCACCGTCTCCTCA
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTA
TCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTG
AAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTA
TCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATAT
GCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTT
CCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCA
ACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAA
CAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTA
AACTTGAGATCAAA
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTG
TCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTG
AATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTA
TCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATAT
GCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTA
GTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAG
TAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAA
CAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAA
AGTTGGAAATCAAA
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTG
AGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCG
AGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTA
CCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTAC
GCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCA
GCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCCA
GAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCTCCGTGTACTTCTGCCAG
CAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCA
AGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTG
AGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCG
AGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTA
CCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTAC
GCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCA
GCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAG
CAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCAG
CAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCA
AGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCTCTGGCTGTG
TCTCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCCG
AGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTA
CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTAC
GCCGCCTCCAACGTGGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTTT
CCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG
CTCTCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGTCAG
CAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAA
AGGTGGAAATCAAG
)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTG
TCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCG
AGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTA
CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAGACTGCTGATCTAC
GCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCT
CCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTC
CTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAG
CAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAA
AGGTGGAAATCAAG
GAAATCGTACTGACCCAGTCCCCTTCTTTCTTGAGTGCA
TCAGTTGGGGATAGAGTGACCATTACTTGTAGAGCATCTC
AAGGTATTTCTTCATACTTGTCTTGGTATCAACAAAAACC
TGGCAAGGCACCCAAACTCTTGATCTACGCCACCTCTACA
TTGCAAAGTGGGGTTCCTTCTAGGTTTTCAGGCTCCGGCT
CTGGTACCGAGTTCACCCTCACTATAAGCAGTCTCCAACC
TGAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAGCAGCTTAATTCT
TATCCCCGAACCTTTGGTCAAGGAACTAAGGTCGAGATCA
AA
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCA
TCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTC
AGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACC
AGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACT
TTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGAT
CTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCC
TGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGT
TACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCA
AA
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCA
TCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTC
AGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC
AGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACT
TTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGAT
CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC
TGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGT
GCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTA
AA
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCC
CCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAAT
TGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG
CCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCT
GGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGT
ATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCC
CCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACA
TTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGG
CCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGG
GGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGT
AGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCA
CCGTCCTA
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCC
CCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACA
TTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGG
CCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGG
GGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGT
AGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCG
TCCTA
図1は、mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B3
59、KL2B360、HCF3、及びHCG5のVHドメインの配列アラインメントを
示す。図2は、mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2
B359、KL2B360、LDC6、及びLCB7のVLドメインの配列アラインメン
トを示す。配列番号75及び配列番号74のコンセンサスアミノ酸配列を、それぞれVH
及びVLドメインについて決定した。HCDR及びLCDR残基には下線を付す。
はFである、X4は、G若しくはRである、X5は、I若しくはMである、X6は、I若
しくはMである、X7は、A若しくはPである、又はX8は、V若しくはAである。
X4は、A又はSであり、X5は、V又はLであり、X6は、L又はPであり、X7は、
I又はLであり、X8は、N又はSであり、X9は、R又はKであり、X10は、K又は
Rであり、X11は、V又はRであり、X12は、V又はIであり、X13は、V又はI
であり、X14は、Q又はSであり、X15は、L又はVであり、X16は、Q又はEで
あり、X17は、P又はAであり、X18は、F又はVであり、X19は、A又はSであ
り、X20は、Y又はFであり、X21は、Q又はGであり、X22は、L又はVである
。
hK2特異的VH/VL領域を、VH-CH1-ヒンジCH2-CH3及びVL-CL
として遺伝子操作し、IgG2若しくはIgG4として発現させたか、又はVH-リンカ
ー-VL若しくはVL-リンカー-VH配向のいずれかのscFvとして遺伝子操作した
。scFvに使用したリンカーは、上記配列番号7のリンカーであった。scFVを使用
して、実施例7に記載の通り二重特異性抗体を作製した、又は実施例11に記載の通りC
ARを作製した。
表11は、mAbにおける選択された抗hK2抗体のLCのアミノ酸配列を示す。表12
は、mAbフォーマットの選択された抗hK2抗体のHC及びLCのDNA配列番号をま
とめる。表13は、VH-リンカー-VL又はVL-リンカー-VH配向の選択されたs
cFvのアミノ酸配列を示す。
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAA
CCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCA
ACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCA
GTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCA
TACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTA
GGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTT
TCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACA
TATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCT
GGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGCGCCAAAAC
AACAGCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGA
GATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCA
AGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTC
TGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTC
CTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTG
TAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAA
TGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAA
ATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCAT
GCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGT
CTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATC
TCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGA
GCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAA
CAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGA
GAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCC
CCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAA
ATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAG
AGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCAC
AGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAA
GAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATG
CCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAA
CAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTC
TGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAA
AAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAG
TGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAG
CTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAG
CCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAA
ACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACA
ACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGC
TATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCA
GAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTC
ATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTT
TATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTT
GGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCAGCCTCCAC
CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG
AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA
AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC
AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC
CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA
CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTG
CAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG
AAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC
CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT
CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA
GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA
CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG
GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA
CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA
GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG
AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC
AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAA
GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT
CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC
CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC
CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC
AAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG
TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG
CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG
CCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTG
GCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCC
CCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTAC
AGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAG
TCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCT
GAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTAT
TACTGTGCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCA
ACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCAC
GGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTC
TTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCA
CAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG
CTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAAT
ATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGC
CGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAG
GACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCG
TGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTT
CAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG
ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTG
TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA
CGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTC
CCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC
AGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCA
GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG
GTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG
AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC
TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC
AGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATG
TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCA
CTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG
CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATAT
GATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCC
GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTG
TATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACT
ATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCAC
CGTCTCTTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCC
CTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCG
CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT
GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG
CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT
CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGC
AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTC
CCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGG
ACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACT
CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGG
TGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG
GTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCA
GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAA
GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCC
TCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC
GAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGA
GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA
GGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA
ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT
GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTA
ACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG
CCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTG
GCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCC
CGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTC
AGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAG
TCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCT
GAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATAT
TATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCG
ACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC
TTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGC
TCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG
GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG
GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG
TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTA
CACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG
GACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCAC
CATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTT
CCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCC
CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC
AGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG
CAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG
TCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG
CAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAA
ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGG
TGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAA
CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA
CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAG
AGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCT
CTCCCTGTCTCTGGGTAAA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG
CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATAT
GATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCC
GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTG
TATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGG
CCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTC
TTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG
GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT
GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC
TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA
GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA
GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAA
CTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGG
GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA
CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA
AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGG
TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG
CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC
CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA
GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA
GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC
CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG
CTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCT
TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA
CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAG
CCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGT
AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCC
GGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA
TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTA
TATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTC
TTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAAT
GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC
TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA
CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG
CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT
CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC
TGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA
AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG
TCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT
AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA
GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGC
AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG
GGTAAA
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTA
TCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTG
AAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTA
TCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATAT
GCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTT
CCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCA
ACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAA
CAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTA
AACTTGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCGACTGTGTC
CATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGT
GCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAG
ACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACA
AAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAA
GACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCA
AGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGC
CACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTC
AACAGGAATGAGTGT
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTG
TCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTG
AATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTA
TCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATAT
GCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTA
GTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAG
TAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAA
CAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAA
AGTTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT
CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT
GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG
AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATC
GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG
GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA
AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT
CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTC
AACAGGGGAGAGTGT
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCA
TCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTC
AGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACC
AGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACT
TTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGAT
CTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCC
TGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGT
TACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCA
AACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCA
TCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTC
AGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC
AGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACT
TTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGAT
CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC
TGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGT
GCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTA
AACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCC
CCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAAT
TGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG
CCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCT
GGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGT
ATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG
GTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCC
CTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTG
TGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGG
CCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGA
GACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCG
GCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGT
CCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAG
CACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCC
CCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACA
TTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGG
CCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGG
GGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGT
AGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCA
CCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCT
GTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCC
ACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCG
TGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGC
GGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAAC
AAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGC
AGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCA
TGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAA
TGTTCA
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCC
CCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACA
TTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGG
CCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGG
CCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTG
GGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGG
GGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGT
AGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCG
TCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTT
CCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACA
CTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGA
CAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGG
AGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAG
TACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGT
GGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGA
AGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGT
TCA
抗hK2抗体の親和性及び熱安定性。
可溶性hK2に対する選択されたhK2抗体の親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR
)によって測定した。SPRは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することに
よって、2つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。
抗体を、抗Fc抗体でコーティングされたセンサチップ上に捕捉し、続いて、様々な濃度
並びに指定の会合及び解離時間で可溶性hK2を注入した。解離後、表面を適切な溶液で
再生して、次の相互作用の準備を行った。センサグラムを1:1ラングミュアモデルに適
合させることによって、速度情報(オンレート及びオフレート定数)を抽出した。結合親
和性(KD)を、速度定数(koff/kon)の比として報告する。選択されたhK2
抗体のKD値を、表14に列挙する。
性を求めた。NanoDSFを使用して、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中0.5m
g/mLの濃度の分子のTmを測定した。サンプルを384ウェルサンプルプレートから
24ウェルキャピラリーにロードすることによって、測定を行った。各サンプルにつき、
デュープリケートで測定を行った。熱走査は、1.0℃/分の速度で20℃から95℃ま
でに及ぶ。固有のトリプトファン及びチロシンの蛍光を330nm及び350nmの発光
波長でモニタリングし、F350/F330nm比を温度に対してプロットして、アンフ
ォールディング曲線を作成した。測定されたTm値を、表14に列挙する。
oDSFによって測定したとき67℃の熱安定性(Tm)を有しており、約34nMのヒ
トhK2に対する結合親和性(KD)を有していた。再ヒト化キャンペーンについて得ら
れ、そして、マウス11B6と同様の結合親和性を維持していたクローンKL2B359
を、追加のプロファイリングのためにscFv-Fc及びCAR-Tに変換した。KL2
B359 scFvは、67℃のTm及び約0.7~1nMのhK2に対する結合親和性
(KD)を示す。KL2B30、KL2B242、KL2B53、KL2B467、及び
KL2B494 Fabは、0.5nM未満の結合親和性及び70℃を超えるTm値を示
した。
水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)によって、選択された抗hK2抗体及び抗
hK2/CD3二重特異性抗体のエピトープ及びパラトープを求めた。ヒトKLK2抗原
を、エピトープ及びパラトープマッピング実験に使用した。
体又は抗hK2/CD3二重特異性抗体の有り及び無しでインキュベートした。水素-重
水素交換(HDX)混合物を、8M尿素、1M TCEP、pH3.0の添加によって異
なる時点でクエンチした。クエンチしたサンプルを、室温でバッファA(H2O中1%ア
セトニトリル、0.1%FA)で平衡化した固定化ペプシン/FpXIIIカラムに60
0μL/分で通した。消化性断片を、バッファAを用いて600μL/分で逆相トラップ
カラムにロードし、1分間脱塩した(600μLのバッファA)。脱塩された断片を、2
0分かけて100μL/分で8%→35%バッファB(95%アセトニトリル、5%H2
O、0.0025%TFA)の線形勾配を有するC18カラムによって分離し、質量分析
によって分析した。275℃のキャピラリー温度、分解能150,000、及び質量範囲
(m/z)300~1,800で、LTQ(商標)Orbitrap Fusion L
umos質量分析計(Thermo Fisher Scientific)を使用して
質量分析を実行した。BioPharma Finder3.0(Thermo Fis
her Scientific)を、HDX実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同
定に使用した。HDExaminerバージョン2.5(Sierra Analyti
cs,Modesto,CA)を使用して、HDX実験についてのMS生データファイル
から質量中心値を抽出した。
B413、及びKL2B53を溶解性hK2タンパク質と共にインキュベートした結果、
異なるパターンの水素交換及び全体的な保護が得られた。保護されたセグメントをhK2
抗原の配列にマッピングして、結合エピトープを可視化した(図3)。KL2B494、
KL2B467、及びKL2B30は、(i)残基174~178(配列番号111、K
VTEF)(例えば、配列番号111の残基のうちの少なくとも3つ、すなわち、174
~176におけるKVT残基に結合したKL2B494、KL2B467、及びKL2B
30)並びに(ii)残基230~234(配列番号112、HYRKW)(例えば、配
列番号112の残基のうちの少なくとも3つ、すなわち、230~232におけるHYR
残基に結合したKL2B494、KL2B467、及びKL2B30)の共通配列に結合
した。また、KL2B413は、図3に示す通り、配列番号111の全ての残基及び配列
番号112のKW残基に結合した。本発明の実施形態は、hK2に結合する抗原結合ドメ
インを含む単離タンパク質であって、当該抗原結合ドメインが配列番号111及び配列番
号112の配列を有するエピトープ内でhK2に結合し、例えば、当該抗原結合ドメイン
が、配列番号111の全ての残基、又は少なくとも4つの残基、又は少なくとも3つの残
基に結合し、配列番号112の全ての残基、又は少なくとも4つの残基、又は少なくとも
3つの残基に結合する、単離タンパク質を提供する。
GWAH)、60~75(配列番号114、RHNLFEPEDTGQRVP)、及び1
38~147(配列番号115、GWGSIEPEE)からなる配列に結合した。
2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413、又はKL2B53)は、
配列番号111、112、113、114、及び115からなる群から選択される1つ以
上のアミノ酸配列を含むhK2の不連続エピトープ(すなわち、その残基が配列中に離れ
て配置されているエピトープ)に特異的に結合するhk2特異的抗原結合ドメインを含む
。
に抗hK2/CD3二重特異性抗体KLCB113及びKLCB80のパラトープを、H
DExaminer残基プロットからの重水素取り込みにおける有意差に基づいて同定し
た。KL2BB494は、そのうちの2つがKL2B494重鎖可変ドメインに位置し(
GFTFSH(配列番号)455)及びTAVYYCAKPHIVMVTAL(配列番号
456))、1つのパラトープ領域が軽鎖可変ドメイン内に位置する(YDDSDRPS
GIPER(配列番号457))3つのパラトープ領域を含む。KL2B467は、その
うちの2つがKL2B467重鎖可変ドメインに位置し(FTFSY(配列番号)458
)及びGSYWAFDY(配列番号459))、1つのパラトープ領域が軽鎖可変ドメイ
ン内に位置する(DNSD(配列番号460))3つのパラトープ領域を含む。Hu11
B6は、重鎖に位置する1つのエピトープ領域(GNSITSDYA(配列番号461)
)を含む。KL2B413は、重鎖可変ドメイン(GFTF(配列番号462)及びAR
DQNYDIL(配列番号463))に位置する2つのパラトープ領域を含む。二重特異
性KLCB80のKL2B30は、重鎖に位置するパラトープ領域(アミノ酸残基TIF
及びVTPNF(配列番号464)を含む)及び軽鎖に位置するパラトープ領域(YAA
STLQSG(配列番号465))を含む。二重特異性KLCB113のKL2B53は
、重鎖に位置する1つのパラトープ領域(アミノ酸残基ESGWSHY(配列番号466
)を含む)を含む。図38A~38Fは、これらの抗hK2抗体及び抗hK2/CD3二
重特異性抗体の結合パラトープを示す(下線付き配列はCDR領域を示し、ハイライトさ
れた配列はパラトープ領域を示す)。
免疫
抗CD3抗体CD3B376の作製は、米国特許出願公開第20200048349号
に記載されている。
生成した。13頭のカッパマウス及び12頭のラムダマウスを含むAblexisマウス
をTRCW5で免疫した(配列番号338)。TRCW5は、Kim et al,JM
B(2000)302(4):899-916によって報告されている通り、26アミノ
酸リンカーによってCD3εの細胞外領域に融合しているCD3δの細胞外領域で構成さ
れる。このポリペプチドは、そのC末端に、部位特異的ビオチン化に使用されるC末端A
viタグを有するヒトIgG1 Fcドメインを有していた(Fairhead & H
owarth,Methods Mol Biol(2015);1266:171-1
84)。
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDL
GKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMGSADDAKK
DAAKKDDAKKDDAKKDGSDGNEEMGGITQTPYKVSISGTT
VILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSL
KEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVSPPSPA
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGKGGGLNDIFEAQKIEWHE
皮内注射を含む8部位に広げて50μgのTRCW5及び50μgのCD40 mAbを
投与することによって、マウスをハイブリドーマ融合のためにブーストした。最終的なブ
ーストについては、マウスに、4.74×107細胞/mLで、CD3εを含むT細胞受
容体複合体を内因的に発現するT細胞株であるJurkat細胞を20μL注射した((
Schneider et al(1977)Int.J.Cancer,19(5):
621-6)。
をカウントし、FO骨髄腫細胞(ATCC(CRL-1646))と1:1の比で合わせ
、抗体スクリーニングの前に37℃で10日間インキュベートした。次いで、製造業者の
説明書に従って、プレート上に非特異的に固定化されたTRCW5を使用するTRCW5
への結合についてのELISAによって(ELISA、Thermoカタログ番号340
22)、又はビオチン化TRCW5(SPARCL ELISA、Lumigen)への
ストレプトアビジンのコンジュゲーションによって、ハイブリドーマ融合細胞からの上清
をアッセイした。4℃で一晩0.5ug/mLのTRCW5及び0.5ug/mLのHV
EM-Fc(R&Dカタログ番号365-HV)でプレートをコーティングすることによ
って、ELISAアッセイを実施した。4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中
0.4%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を添加することによって、プレートを
ブロッキングした。0.02%(v/v)Tween 20を補充した1×PBSでプレ
ートを洗浄した。各ウェルに対し、50uLのハイブリドーマ上清を適用し、室温で1時
間インキュベートした。ブロッキングバッファで1:10,000希釈した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(Jacksonカタログ番号115-036-071)にコンジュゲー
トしたヤギ抗マウスIgG Fcを添加し、続いて室温で30分間インキュベートするこ
とによって、結合した抗体を検出した。3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(
TMB)基質バッファ(Thermoカタログ番号34022)を25uL/ウェルで添
加し、暗所で10分間インキュベートした。25uL/ウェルの4M H2SO4を添加
することによって反応を停止させた。BioTek(登録商標)Epoch2マイクロプ
レートリーダーを使用して、450nmで発光を読み取った。バックグラウンドよりも少
なくとも3倍高いシグナルを有するヒットを選択した。
PARCL ELISAから194、70ヒットは両方のアッセイで同定された)が得ら
れた。これら426個の初期ヒットのうち、49個のELISA、及び32個のSPAR
CL ELISAヒットを確認した。陽性バインダーに対応するハイブリドーマ融合物を
再度供給し、フローサイトメトリーを使用して、Jurkat細胞に結合する能力につい
て試験した。結果は、平均蛍光指数(MFI、表4を参照されたい)に基づいて、クロー
ン003_F12、クローン036_E10、及びクローン065_D03を含む3つの
抗体が、CD3を内因的に発現するJurkat細胞に対して著しい結合を示すことを示
唆した。クローン003_F12及び036_E10(ヒトカッパマウスから)は、EL
ISAによってヒトカッパ軽鎖について陽性であることが確認されたが、クローン065
_D03(ヒトラムダマウスから)は、ヒトラムダについて陰性であった。次いで、これ
ら3つのクローンの可変遺伝子を配列決定した。
いてスクリーニングした。簡潔に述べると、初代ヒト及びカニクイザル汎T細胞をフロー
染色バッファ中に1×106細胞/mLで再懸濁させ、細胞を50,000細胞/ウェル
でプレーティングした。各ウェルに、50uLのハイブリドーマ上清を添加し、混合物を
氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、200μLの染色バッファ
を添加し、300×Gで5分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。Ale
xa-647にコンジュゲートした抗マウスIgGを、50μLの総体積で染色バッファ
中2μg/mLで添加し、氷上で30分間インキュベートした。150μLの染色バッフ
ァを添加し、300×Gで5分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。細胞
を、1:1,000希釈したSytox green dead cell stain
を含有するランニングバッファ30μLに再懸濁させ、iQue Screenerで実
験した。細胞をFCS対SCSでゲーティングして、残屑を除去した。シングレットをS
CS-A対SCS-Hでゲーティングし、シングレット集団から、Sytox gree
nによる低-陰性についてBL1チャネルを用いて生細胞を選択した。RL1(Alex
a-647)幾何平均により試験物質を陰性対照と比較することによって、CD3結合を
評価した。このアッセイでは、クローン065_D03が、最も高い細胞結合シグナルを
示した(図4A及び図4B)。
B815と呼ばれる抗体を得た(配列は、表16に示す)。Jurkat細胞への結合に
ついてCD3B815を再度スクリーニングしたところ、Jurkat細胞への陽性結合
を示した。
CD3B815のv領域の軽鎖(LC)を、scFvフォーマットでヒト化した。簡潔
に述べると、CD3B815からのLCをヒトIGKV1-39*01-IGKJ2*0
1生殖細胞系にグラフトし、ヒトからマウスへの復帰変異について2つの位置(Y49K
及びL78V)を同定した。この結果、Y49K、L78Vのいずれか、又はY49K及
びL78Vの両方を有するバリアントが得られた。CD3B815からのLCはまた、9
2~93位における脱アミド化のリスクを提示するNSモチーフを含んでいた。したがっ
て、生成されたいくつかのバリアントもN92Gを含んでいた。これらのバリアント及び
関連する変異を表17に記載する。
選択された抗CD3抗体のVH及びVLのDNA配列を示す。表20は、Kabat記述
における選択された抗CD3抗体のKabat HCDR1、HCDR2、及びHCDR
3のアミノ酸配列を示す。表21は、Kabat記述における選択された抗CD3抗体の
Kabat LCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を示す。表22は
、選択されたCD3抗体のCDR、VH、及びVL配列をまとめる。図6は、CD3B8
15、CD3W244、CD3W245、CD3W246、及びCD3W247のVL領
域のアラインメントを示す。
図6は、CD3B815、CD3W244、CD3W245、CD3W246、及びC
D3W247のVL領域のアラインメントを示す。HCDR及びLCDR残基には下線を
付す。配列番号157のコンセンサスアミノ酸配列をVL領域について決定した。
はSである、X4は、V若しくはAである、X5は、P若しくはVである、X6は、E若
しくはDである、X7は、S若しくはTである、X8は、F若しくはIである、X9は、
S若しくはTである、X10は、T若しくはPである、X11は、N若しくはGである、
X12は、G若しくはKである、X13は、S若しくはAである、X14は、R若しくは
Kである、X15は、K若しくはYである、X16は、I若しくはVである、X17は、
N若しくはSである、X18は、V若しくはLである、X19は、S若しくはPである、
X20は、I若しくはFである、X21は、D若しくはTである、X22は、N若しくは
Gである、又はX23は、G若しくはQである。
大腸菌で発現させるために、リンカーGTEGKSSGSGSESKST(配列番号1
08)を用いてVH-リンカー-VL配向のscFVとして、抗CD3分子の可変領域を
フォーマット化し、次いで、組み換えCD3(ホモ二量体CD3εγ-Fc、CD3W1
47、配列番号339)への結合、T細胞への結合、及び熱安定性についてスクリーニン
グした。
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQ
HNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYP
RGSKPEDANFYLYLRARVGSADDAKKDAAKKDDAKKDDAK
KDGSQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKD
GKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQ
VYYRMGSGSLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD
VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE
PQVYTFPPSQEEMTKNQVSLRCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTKPVLDSDGSFRLESRLTVDKSRWQEGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSGGHHHHHH
列を有するpADL(商標)-22cベクターにクローニングした。大腸菌細胞をプラス
ミドで形質転換し、100μg/mLのカルベニシリンを補充した2×YT微生物成長培
地において37℃で一晩成長させた。1mMのIPTGを添加することによってタンパク
質発現を誘導し、培養物を一晩成長させた。発現後、2,200×gで5分間遠心分離す
ることによって細胞をペレット化し、上清を収集し、ELISAによってビオチン化CD
3W147への結合について直接試験した。
チン化CD3W147(配列番号339)を2倍希釈で0.039μg/mL~2.5μ
g/mLの範囲の濃度でプレート上に固定化し、続いて、室温で45分間インキュベート
した。結合したscFvを、ニワトリ抗HA-西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して検
出し、次いで、化学発光基質で検出した。CD3B815に由来する全ての試験したsc
Fv分子がCD3εに結合した(図5)。
子を試験した。簡潔に述べると、ヒトT細胞を解凍し、1×10^6細胞/mLでフロー
染色バッファに再懸濁させ、50,000細胞/ウェルでプレーティングした。陽性対照
であるCD3W36は、¥scFv-LHとしてフォーマット化された抗CD3抗体SP
34で構成されており、呼吸器合胞体ウイルスからのF-糖タンパク質を標的とするsc
Fvである陰性対照B23を比較のために使用した。大腸菌上清を150μL/ウェルで
添加し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを染色バッ
ファで洗浄し、染色バッファ中のAlexa-647にコンジュゲートした抗His抗体
で検出した。インキュベーション後、200μLのIntelliCytランニングバッ
ファを混合物に添加し、細胞を1:1,000 Sytox Green dead c
ell stainを含有するランニングバッファ30μL中に再懸濁させ、iQue
Screenerで分析した。上記の通り、ゲーティング及び分析を行った。CD3B8
15に由来する全てのscFv分子が、T細胞結合と一致する平均蛍光指数を示した(表
25)。
水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)によって、CD3上のエピトープを決定し
た。そのCD3ε上のエピトープは結晶構造(PDB ID 1SY6)から知られてい
たので、抗体クローンOKT3をHDX実験の対照として使用した(Kjer-Niel
sen,L.et al.;Proc Natl Acad Sci U S A 10
1,7675-7680)。
リンカー領域と融合したCD3εγで構成された10μMのCD3W220(配列番号3
40)10μLを、1.2モル過剰のリガンドの有り又は無しで、30μLのH2O又は
重水素化バッファ(20mMのMES、pH6.4、95%D2O中150mMのNaC
l、又は20mMのTris、pH8.4、95%D2O中150mMのNaCl)と混
合することによって、オンエクスチェンジ反応を開始させた。反応混合物を15、50、
150、500、又は1,500秒間1.2℃でインキュベートした。オンエクスチェン
ジした溶液を、冷却した40μLの8M尿素、1M TCEP、pH3.0を添加するこ
とによってクエンチし、直ちに分析した。
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQ
HNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYP
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VYYRMGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYL
QQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG
DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPN
LPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYA
PELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKA
SSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV
SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI
SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE
SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAK
TYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQN
CELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG
KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSD
RVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHA
DICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDF
AAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHH
HHHHHH
chnologies,Morrisville,NC)を用いて、HDX-MSサンプ
ル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼXIII型(アスペ
ルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)由来のプロテアーゼ、IXXI型)/ペプシ
ンカラム(w/w、1:1、2.1×30mm)(NovaBioAssay Inc.
,Woburn,MA)、トラップ、ACQUITY UPLC BEH C18 Va
nGuard Pre-column(2.1×5mm)(Waters,Milfor
d,MA)、分析用、Accucore C18(2.1×100mm)(Thermo
Fisher Scientific,Waltham,MA)、及びLCポンプ、V
H-P10-A(Thermo Fisher Scientific)であった。ロー
ディングポンプ(プロテアーゼカラムからトラップカラムに)を、99%の水、1%のア
セトニトリル、0.1%のギ酸で600μL/分に設定した。勾配ポンプ(トラップカラ
ムから分析カラムへ)は、100μL/分において20分間で0.1%ギ酸水溶液中8%
→28%のアセトニトリルに設定した。
(m/z)300~1,800で、LTQ(商標)Orbitrap Fusion L
umos質量分析計(Thermo Fisher Scientific)を使用して
質量分析を実行した。
Fisher Scientific)を、HDX実験の前に非重水素化サンプルのペプ
チド同定に使用した。HDExaminer2.5(Sierra Analytics
,Modesto,CA)を使用して、HDX実験についてのMS生データファイルから
質量中心値を抽出した。
。全ての交換時点(1.2℃でpH6.4又はpH8.4)を、pH7.4及び23℃に
おける等価時点に変換した(例えば、1.2℃、pH6.4で15秒は、23℃、pH7
.4で0.15秒と等価である)、表23)。
あるKLCB91を組み換えCD3ε(配列番号340)と共にインキュベートした結果
、異なるパターンの全体的な保護及び抗原の特定のセグメントにおける保護度が得られた
。KLCB91及びOKT3はいずれも、高次構造非同一エピトープを示す非連続セグメ
ント(図7)を保護していた。保護されたセグメントをCD3εの結晶構造(PDB 1
SY6)にマッピングして、3次元で結合エピトープを可視化した。
致して、OKT3のエピトープは、CD3ε(配列番号340及び図7)の残基29~3
7、79~84、及び87~89に及ぶペプチドからなることが見出された。CD3W2
45は、OKT3と部分的に重複するエピトープに結合し、CD3ε配列番号340のア
ミノ酸残基29~37(PQYPGSEIL、配列番号341)、55~63(GSDE
DHLSL、配列番号448)、及び79~84(PRGSKP、配列番号449)を含
んでいた(図7)。
実施例1~3で作製された抗hK2抗体のVH/VL領域及び実施例4の抗CD3抗体
のVH/VL領域を、二重特異性フォーマットに遺伝子操作し、IgG1として発現させ
た。
CD3 VH/VL領域を、配列番号7のリンカーを使用してVH-リンカー-VL又
はVL-リンカー-VH配向のいずれかのscFvとして遺伝子操作した(表1)。sc
Fvフォーマットの抗CD3分子のアミノ酸配列を、表26に示す。CD3に結合するV
H-リンカー-VL又はVL-リンカー-VHのscFv分子を、Fcサイレンシング変
異(L234A/L235A/D265S)及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように
設計されたT350V/L351Y/F405A/Y407V変異を含むscFv-ヒン
ジ-CH2-CH3フォーマットに更に遺伝子操作した。配列番号109のポリペプチド
を定常ドメインヒンジ-CH2-CH3として使用した。scFv-ヒンジ-CH2-C
H3フォーマット(scFV-Fv)における抗CD3分子のアミノ酸配列を、表27に
示す。scFvフォーマット及びscFv-ヒンジ-CH2-CH3フォーマット(sc
FV-Fv)における抗CD3分子のDNA配列番号を、表28に示す。
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
AGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC
GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
GGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACC
GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
CAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACG
CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
GTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGA
GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAGATCAAG
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACT
ACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGA
CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
CGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTT
GGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC
CGTGAGCAGC
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
AGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC
GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
GGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACC
GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
CAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACG
CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
CTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGA
GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAGATCAAG
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACT
ACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGA
CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
CGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTT
GGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC
CGTGAGCAGC
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
AGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC
GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
GGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACC
GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
CAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACG
CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
GTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGA
GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAGATCAAG
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
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TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACT
ACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGA
CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
CGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTT
GGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC
CGTGAGCAGC
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
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GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
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GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
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TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
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AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
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CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
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GGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC
CGTGAGCAGC
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TCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGC
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GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGATCTGA
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GGCGGAAGCGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCC
TGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAG
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AGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAAC
AAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAG
TCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGAT
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TGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
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AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAACTGGTGGAG
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TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAA
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TGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACT
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GGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
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GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
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GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
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GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
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GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
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CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
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GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
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CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
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GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
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CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
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CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
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GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
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AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
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AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
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AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
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TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
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CGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
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CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
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GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
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CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
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CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
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CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
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GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
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GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
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CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
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CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
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GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
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TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
CAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACG
CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
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GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
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CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
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GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
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AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACT
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CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
CGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTT
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CGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
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CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
AGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC
GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
GGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACC
GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
CAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACG
CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
GTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGA
GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
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TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
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AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
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AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC
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TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
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AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
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CGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
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CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
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GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
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GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGATCTGA
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GGCGGAAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCC
TGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCG
TGCCCGCCAGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAG
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CCAGCGAGAGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGG
CAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGC
CTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGA
GCGGCAGCTGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCT
GGAGATCAAGGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
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CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAG
AGCGGTGGCGGTCTGGTGAAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCC
TGAGCTGTGCCGCCAGCGGTTTCACCTTCAGCCGCTACAA
CATGAACTGGGTGCGCCAAGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGGTGAGCAGCATCAGCACCAGCAGCAACTACATCTACT
ACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCTTCAGCCGCGA
CAACGCCAAGAACAGCCTGGACCTGCAGATGAGCGGTCTG
CGCGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCACCCGCGGTT
GGGGCCCATTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGAC
CGTGAGCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAG
CCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACT
AGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCC
GATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGA
TCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATT
TATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGG
GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGATCTGA
GGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGAAAGCAAGTCCACC
GGCGGAAGCGACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCC
TGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAG
GGCCAGACAGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAG
CAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATG
CTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGG
CAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGT
GTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAA
GTGGGAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCT
GGAAATAAAAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTG
AGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGAC
AGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAAC
AAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAG
TCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGAT
CAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTC
TGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGC
TGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
AAGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAACTGGTGGAG
TCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAA
CATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG
TGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACT
ACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGA
CAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTG
AGAGCCGAGGACACGGCTATTTATTACTGTACGAGAGGCT
GGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
CD3特異的VH及びVL領域を、それぞれVH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3及
びVL-CLフォーマットに遺伝子操作し、IgG1として発現させた。Fcサイレンシ
ング変異L234A/L235A/D265S及び選択的ヘテロ二量体化を促進するよう
に設計されたCH3変異T350V/L351Y/F405A/Y407Vを含む配列番
号158のポリペプチドを使用して、CD3特異的VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH
3を作製した(表29)。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK
配列番号309又は447のポリペプチドを使用して、CD3特異的VL-VCを作製
した(表30)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW
KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3及びVL-CLフォーマットにおける抗CD3
分子のDNA配列の配列番号を表31に示す。
、CD3W248 HC cDNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGTGGCGGTCTGGTGAAG
CCAGGTGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGTGCCGCCAGCGGTT
TCACCTTCAGCCGCTACAACATGAACTGGGTGCGCCAAGC
CCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCACC
AGCAGCAACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC
GCTTCACCTTCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGGA
CCTGCAGATGAGCGGTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCATC
TACTACTGCACCCGCGGTTGGGGCCCATTCGACTACTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACCAA
GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC
ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG
CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA
CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA
CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA
GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCAC
CGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTT
CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC
CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCC
ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG
CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG
TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG
CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA
ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG
TGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA
CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC
AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA
CGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAG
TCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT
CTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
AGCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACCTGTCGTGCCCGCC
AGAGCATCGGCACCGCCATCCACTGGTACCAGCAGAAGCC
AGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCGAG
AGCATCAGCGGTGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCC
AGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGGCAGC
TGGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCA
AGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGGCATCCTGTCTGTG
AGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGAC
AGAGCATTGGCACAGCCATACACTGGTATCAGCAAAGAAC
AAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAG
TCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGCGGCAGTGGAT
CAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACAGTGTGGAGTC
TGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTGGGAGC
TGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
AACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC
ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTAC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA
GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG
AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG
CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAG
TGT
実施例2に記載の通り配列番号7のリンカー(表1)を使用してVH-リンカー-VL
又はVL-リンカー-VH配向のいずれかのscFVとして遺伝子操作されたhK2 V
H/VL領域を、Fcサイレンシング変異(L234A/L235A/D265S)及び
選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたT350V/T366L/K392L
/T394W変異を含むscFv-ヒンジ-CH2-CH3フォーマットに更に遺伝子操
作し、IgG1として発現させた。配列番号110のポリペプチドを定常ドメインヒンジ
-CH2-CH3として使用した。
_ZWB)
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYVLPPSREEMTKNQVSLLCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
分子のアミノ酸配列を、表32に示す。
hK2特異的VH及びVL領域を、それぞれVH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3及
びVL-CLフォーマットで遺伝子操作した。Fcサイレンシング変異L234A/L2
35A/D265S及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたCH3変異T
350V/T366L/K392L/T394Wを含む配列番号378のポリペプチドを
使用して、KLK2特異的VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3)を作製した。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRE
EMTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK
配列番号309又は447のポリペプチドを使用して、hK2特異的VL-VCを作製
した。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVT
VAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW
KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
hK2 Fab-Fc HCのアミノ酸配列配列を表33に示す。
Fabとして遺伝子操作されたCD3B376及びCD3W245、並びに上記の通り
両方の配向でscFvとして遺伝子操作されたKL2B359、KL2B413、KL2
B467、及びKL2B494のhK2 VH/VLを発現させて、二重特異性抗体を生
成し、フォーマットscFv-ヒンジ-CH2-CH3のhK2結合アーム並びに重鎖:
VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3及び軽鎖:VL-CLのフォーマットのCD3結
合アームを有するhK2/CD3二重特異性抗体を得た。あるいは、LH-リンカー-V
H配向でscFVとして遺伝子操作された抗CD3抗体CD3W245のVH/VL領域
、並びに上記の通りFabとして遺伝子操作された抗hK2抗体KL2B30、KL2B
242、及びKL2B53のVH/VL領域を発現させて、重鎖VH-CH1-ヒンジ-
CH2-CH3及び軽鎖VL-CLのフォーマットのhK2結合アーム並びにフォーマッ
トscFv-ヒンジ-CH2-CH3のCD3結合アームを有するhK2/CD3二重特
異性抗体を得た。抗scFvを作製するために使用したリンカーは、配列番号7のリンカ
ーである。
操作し、T350V_T366L_K392L_T394W CH3変異を上記の通り他
の重鎖に遺伝子操作した。加えて、HK2結合アーム及びCD3結合アームの両方を、上
記の通りFcエフェクターサイレンシング変異L234A_L235A_D265Sを含
有するように遺伝子操作した。
、潜在的な製造可能性の問題を防ぐために、Ser(C33S)に変異した1つの遊離C
ys残基を含有していた。
製した。実施例8及び9に記載の通り、二重特異性抗体を、そのhK2及びCD3への結
合、並びにそのインビトロ及びインビボ細胞傷害性について特性評価した。表34は、選
択された抗hKL2/CD3二重特異性抗体のCDR配列番号を示す。表35は、選択さ
れた抗hKL2/CD3二重特異性抗体のVH、VL、及びscFvの配列番号を示す。
表36は、選択された抗hKL2/CD3二重特異性抗体のHC1、HC2、LC1、及
びLC2の配列番号を示す。HC1及びLC1は、hKL2結合アームの重鎖及び軽鎖を
指す。あるいは、HC1は、hKl2結合アームのscFv-ヒンジ-CH2-CH3を
指す場合もある。HC2及びLC2は、CD3結合アームの重鎖及び軽鎖を指す。あるい
は、HC2は、CD3結合アームのscFv-ヒンジ-CH2-CH3を指す場合もある
。表37 HC1、LC1、HC2、及びLC2のアミノ酸配列。表37 HC1、LC
1、HC2、及びLC2のcDNA配列。
GAGATTGTTCTCACCCAATCCCCAGCTACTCTCTCTCTT
TCACCCGGTGAGCGGGCAACCCTCTCCTGTAGAGCCAGCG
AGAGCGTGGAGTATTTTGGCACATCCCTGATGCACTGGTA
TCAGCAAAAACCAGGACAACCCCCCAGACTCCTCATATAT
GCCGCCTCAAATGTCGAGAGTGGGATACCTGCACGGTTTT
CAGGAAGCGGCAGCGGTACTGACTTCACATTGACTATATC
CTCTGTAGAGCCAGAGGATTTTGCAGTCTACTTCTGCCAG
CAAACTAGGAAGGTTCCATATACTTTTGGGGGCGGTACAA
AAGTTGAGATAAAGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGG
CAGCGGCAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAAGTA
CAGCTCCAGGAGTCAGGACCTGGGCTCGTCAAACCATCTC
AGACATTGTCCCTGACATGCACAGTTTCCGGCAACAGTAT
TACTTCCGACTATGCTTGGAATTGGATCAGGCAATTCCCA
GGAAAGCGGCTCGAGTGGATAGGTTATATTTCTTACTCTG
GATCTACTACCTACAATCCCAGTTTGAAGTCTCGCGTGAC
AATTAGCCGGGACACATCAAAAAATCAATTCTCACTTAAA
CTTAGTTCTGTAACCGCTGCCGATACAGCCGTGTACTACT
GCGCCACTGGTTATTATTATGGAAGCGGATTTTGGGGGCA
AGGAACTTTGGTGACCGTCTCTTCCGAGCCCAAATCTAGC
GACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAG
CAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC
CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA
TGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA
AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC
CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC
CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC
TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCAT
CCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTG
CCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCT
GGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGG
AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
GAGGTACAACTTGTCGAAAGTGGCGGTGGAGTCGTCCAG
CCTGGGCGATCACTTCGCCTCTCCTGTGTAGCCTCTGGTT
TCACTTTCTCATCTTACGACATACACTGGGTCCGCCAGGC
ACCTGGTAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCCATCATTAGTTAC
GATGGCTCCAAAAAAGATTACACCGATAGCGTAAAGGGCA
GATTTACCATTTCCAGGGATAATTCAAAGAACACCCTGTA
TCTGCAAATGGACAGCCTCCGCGTCGAAGACTCTGCAGTT
TATAGCTGTGCCAGGGAGTCAGGCTGGTCCCATTATTACT
ATTATGGTATGGACGTTTGGGGCCAGGGAACCATGGTCAC
TGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC
CTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG
CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT
GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG
CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT
CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC
AACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTG
ACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGC
AGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC
AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT
GCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAA
GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC
GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT
GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC
CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATC
CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT
GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTG
GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC
AGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGA
ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
CAGAGCGTACTTACCCAGCCTCCCAGCGTGTCTGTAGCC
CCAGGACAGACAGCCAGTATTACATGCGGTGGTGACAATA
TAGGTTCCAAATCCGTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCAGG
GCAAGCTCCCGTGCTCGTGGTATATGATAATTCCGACCGC
CCTTCCGGCATTCCCGAACGGTTTAGTGGTTCAAATTCAG
GCACCACAGCAACTCTGACCATAAGCAGAGTCGAAGCTGG
AGACGAAGCCGACTACTACTGTCAGGTATGGGACTCTAGT
AGTGACCACCCTGTCGTCTTCGGTGGGGGAACCAAAGTGA
CCGTTCTGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGG
CAGCGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTCCAGCTC
GTAGAAAGTGGGGGCGGCGTAGTTCAGCCAGGCAGGAGTC
TCCGGCTGAGTTGTGCAGCCAGCGGCTTTACTTTTTCCTA
CTATGGAATGCACTGGGTACGTCAGGCACCCGGCAAAGGT
TTGGAGTGGGTCGCATTCATTTCTTATGATGGATCAAATA
AGTATTATGCCGATAGTGTAAAGGGCAGATTTACAATAAG
TCGAGACAACTCAAAGAACACTCTCTACCTCCAAATGAAT
AGTCTTCGGGCAGAGGATACTGCAGTGTACTATTGTGCTC
ATCTTCCTTATTCCGGTTCTTACTGGGCATTCGATTATTG
GGGGCAAGGGACACAAGTTACCGTGTCTAGCGAGCCCAAA
TCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCAC
CTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG
GTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTG
AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA
TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGC
ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG
ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA
CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCT
GCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACC
TCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT
CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAG
CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC
TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC
GGGT
AGCAGCGAATTGACCCAACCACCTTCCGTCAGCGTCGCA
CCAGGGCAAACCGCCCGCATCACATGCGGTGGGAACAATA
TAGGAAGCAAATCTGTCCACTGGTACCAGCAAAAACCAGG
ACAAGCCCCTGTTCTGGTCGTCTATGATGACAGCGACAGA
CCAAGTGGTATTCCCGAGAGATTCTCCGGTAGCAACTCTG
GAAATACAGCTACTTTGACCATCTCCAGAGTTGAGGCTGG
TGACGAGGCAGATTACTATTGCCAGGTCTGGGACAGCTCC
AGCGACCACGTCGTATTCGGTGGCGGGACCAAGCTGACTG
TGCTGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAG
CGAGAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCCAGGTGCAGTTGGTA
GAGTCAGGAGGGGGCCTCGTTCAACCTGGTGGCAGCCTCC
GTTTGTCTTGTGCTGCCAGTGGATTTACTTTCAGTCACTA
CGCAATGAGCTGGGTGAGACAAGCACCTGGCAAGGGCCTT
GAGTGGGTCTCCACTATCGGCGGTTCAGGGGGGAGCACTT
ACTACGCTGACTCTGTAAAAGGTCGCTTTACTATATCTAG
AGATAACTCTAAAAACACACTCTACTTGCAGATGAACAGC
CTGCGAGCCGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAAGC
CTCATATTGTAATGGTCACTGCCCTCTTGTATGATGGCAT
GGATGTTTGGGGCCAAGGGACAATGGTGACAGTCTCAAGC
GAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGT
GCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCT
CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG
ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT
GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG
TACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT
ACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA
GGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGC
GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA
ACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG
CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCT
AGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC
ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC
CCTGTCTCCGGGT
CAGGTTCAACTTCAAGAATCCGGGCCAGGTCTGGTCAAG
CCTTCAGAGACTTTGTCCCTTACTTGCACAGTGAGCGGTG
GCTCTATCTCAAGTTACTACTGGTCATGGATACGGCAGCC
CCCAGGAAAGGGGCTTGAGTGGATTGGGTACATTTATTAC
TCAGGGTCAACAAACTACAATCCCTCCCTCAAATCCCGAG
TGACAATTAGTGTCGATACATCTAAAAACCAGTTTTCCCT
GAAATTGAGCTCAGTCACCGCAGCTGATACTGCAGTCTAT
TATTGTGCTGGCACAACAATCTTCGGGGTAGTAACTCCAA
ACTTCTACTACGGGATGGACGTGTGGGGGCAAGGAACAAC
CGTAACAGTAAGTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC
TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA
CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG
CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT
CTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACC
TGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA
AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG
TCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT
AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
CTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCT
CACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGC
AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG
GGT
GATATTCAAATGACCCAGTCACCATCATTCCTGTCCGCC
TCAGTGGGAGATCGCGTCACTATTACTTGTCGTGCTAGCC
AGGGGATATCATCATATTTGGCTTGGTATCAACAAAAGCC
AGGAAAGGCCCCAAAATTCCTTATATATGCAGCTAGTACA
CTCCAGAGTGGTGTTCCTAGCCGGTTCTCTGGCAGCGGCT
CAGGGACCGAGTTCACCCTGACAATCTCCAGCTTGCAGCC
CGAAGACTTTGCAACCTACTATTGCCAGCAACTGAACTCC
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AACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACC
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TGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGC
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AGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACG
AGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGG
CCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAG
TGT
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GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC
AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC
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GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATC
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AGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGA
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GATATTGTAATGACTCAGTCACCCTCTTCACTGAGTGCA
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GCCCCCTATACTTTTGGACAGGGCACACGCCTTGAGATTA
AACGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACC
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TGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGC
AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCA
AGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACG
AGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGG
CCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAG
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GGTCAATTTCATCTTACTACTGGAGTTGGCTTCGTCAGCC
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GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG
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GCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA
CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG
CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG
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GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC
ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACGTGCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT
GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGCTGTGCCTGGTCAAAGGC
TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG
GGCAGCCGGAGAACAACTACCTCACCTGGCCTCCCGTGCT
GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC
GTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
AGTTATGAGCTGACTCAACCACCCAGTGTCAGCGTATCC
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TGGGAGAAAATTACGCCTCCTGGTACCAACAGAAGCCTGG
ACAAAGTCCTGTCCTCGTTATTTATCAAGATTCTAAACGT
CCCTCTGGGATCCCCGAACGATTCTCCGGCTCTAACTCTG
GGAATACCGCTACCTTGACAATAAGTGGTACACAGGCACT
TGATGAAGCTGATTATTACTGCCAGGCATGGGATAACAGC
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GTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCC
CTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTG
TGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGG
CCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGA
GACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCG
GCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGT
CCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAG
CACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAG
CCTTCCGAGACACTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCTGGCG
GCTCCATCTCCTCCTACTACTGGTCCTGGATCAGACAGCC
TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACTAC
TCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAG
TGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCT
GAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTAC
TATTGTGCTGGCACCACCATCTTCGGCGTGGTCACCCCTA
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TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA
CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
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GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
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CTTGTGACAAAACTCACACTTGTCCACCGTGCCCAGCACC
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TCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT
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CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAAC
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CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACGTGCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG
CTGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACCT
CACCTGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGC
AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCG
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TGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAG
AGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTA
GTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACC
AGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCA
TGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCA
AGGGCGGCTCCGAGGGCAAGAGCAGCGGCAGCGGCAGCGA
GAGCAAGAGCACCGGCGGCAGCGAGGTGCAACTGGTGGAG
TCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATAA
CATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG
TGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACT
ACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGA
CAACGCCAAGAACTCACTGGATCTGCAAATGAGCGGCCTG
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GGGGGCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCAGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACA
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
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GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCCGCC
TCTGTGGGCGACAGAGTGACCATTACCTGCCGGGCCAGAC
AGTCTATCGGCACCGCTATCCACTGGTATCAGCAGAAGCC
TGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAG
TCCATCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCTCTGGAT
CTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCC
TGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTCCGGCTCT
TGGCCTTACACCTTTGGTCAGGGCACCAAGCTGGAAATCA
AGGGCGGATCTGAGGGAAAGTCCAGCGGCTCCGGCAGCGA
AAGCAAGTCCACCGGCGGAAGCGAGGTGCAGCTGGTTGAA
TCTGGCGGAGGACTGGTTAAGCCTGGCGGCTCTCTGAGAC
TGTCTTGTGCTGCTTCTGGCTTCACCTTCAGCCGGTACAA
CATGAACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAA
TGGGTGTCCTCCATCTCCACCTCCAGCAACTACATCTACT
ACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCTTCTCCAGAGA
CAACGCCAAGAACTCCCTGGACCTGCAGATGTCTGGCCTG
AGAGCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCACCAGAGGCT
GGGGACCCTTCGATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTGTCATCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACT
TGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAG
CCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT
TCACCTTCAGTAGATATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGC
TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACT
AGTAGTAATTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCC
GATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGGA
TCTGCAAATGAGCGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTATT
TATTACTGTACGAGAGGCTGGGGGCCTTTTGACTACTGGG
GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA
GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC
ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG
CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA
CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA
CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA
GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCAC
CGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTT
CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC
CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCC
ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG
CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG
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CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA
ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG
TGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA
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AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA
CGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAG
TCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA
TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT
CTCCCTGTCTCCGGGT
GACATACAAATGACACAATCACCCTCTTCTCTTTCTGCA
AGCGTTGGCGACCGTGTCACTATCACTTGTCGAGCCCGCC
AGTCCATAGGTACTGCCATTCACTGGTATCAACAGAAGCC
TGGCAAGGCTCCCAAACTCCTGATTAAGTATGCCAGCGAG
AGCATTTCCGGCGTACCTTCAAGATTTTCCGGCTCCGGTA
GTGGGACAGATTTCACTCTCACTATATCTAGCCTCCAACC
AGAAGATTTCGCCACTTACTACTGTCAACAATCAGGTTCA
TGGCCTTACACTTTCGGCCAGGGGACAAAATTGGAGATCA
AGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACC
TTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTG
TGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGC
AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCA
AGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTAC
AGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACG
AGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGG
CCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAG
TGT
CAGGTGCAGCTCCAACAGAGTGGTCCCAGACTCGTGAGA
CCCTCTCAAACACTCAGTTTGACTTGTGCCATCTCAGGCG
ATTCAGTTTTCAACAACAATGCAGCTTGGAGCTGGATTAG
GCAGTCACCTAGTCGCGGTCTTGAATGGCTTGGGCGTACA
TACTATCGCTCTAAATGGTTGTATGATTACGCTGTGTCCG
TGAAGAGCCGAATCACCGTAAACCCTGATACCTCCAGGAA
TCAGTTCACATTGCAACTGAATAGTGTGACTCCCGAGGAT
ACTGCACTCTATTATTGTGCCCGAGGATATAGCAGTAGCT
TCGACTATTGGGGACAAGGGACACTCGTTACCGTTAGTTC
AGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC
TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT
GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC
GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC
CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA
GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC
CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG
GTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC
ACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGG
ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC
CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG
TGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG
GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA
GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA
GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC
CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC
GAGAACCACAGGTGTACGTGTACCCCCCATCCCGGGAGGA
GATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA
GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA
ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT
GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCGCCCTCGTGAGCAAGCTC
ACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
CAGTCTGCTCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCT
CCCGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCTCCT
CCAACATCGGCACCTACAAGTTCGTGTCCTGGTATCAGCA
GCACCCCGACAAGGCCCCCAAAGTGCTGCTGTACGAGGTG
TCCAAGCGGCCCTCTGGCGTGTCCTCCAGATTCTCCGGCT
CCAAGTCTGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACT
GCAGGCTGAGGACCAGGCCGACTACCACTGTGTGTCCTAC
GCTGGCTCTGGCACCCTGCTGTTTGGCGGAGGCACCAAGC
TGACCGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCAC
TCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAG
GCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAG
CCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAA
GGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAAC
AACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTG
AGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCAC
GCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA
GAATGTTCA
選択されたhK2×CD3二重特異性抗体の親和性
hK2又はヒトCD3に対する選択されたhK2×CD3二重特異性抗体の親和性を、
表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。SPRは、複合体の形成及び解離時の
質量の変化を測定することによって、2つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験す
るための無標識技術である。抗体を、抗Fc抗体でコーティングされたセンサチップ上に
捕捉し、続いて、様々な濃度並びに指定の会合及び解離時間で可溶性hK2又は可溶性組
み換えヒトCD3を注入した。解離後、表面を適切な溶液で再生して、次の相互作用の準
備を行った。センサグラムを1:1ラングミュアモデルに適合させることによって、速度
情報(オンレート及びオフレート定数)を抽出した。結合親和性(KD)を、速度定数(
koff/kon)の比として報告する。選択されたhK2/CD3二重特異性抗体のK
D値を、表39に列挙する。
自動プロメテウス機器を使用してNanoDSF法によって、二重特異性抗体サンプル
の熱安定性を求めた。測定は、サンプルを384ウェルサンプルプレートから24ウェル
キャピラリーにロードすることによって行った。各サンプルにつき、デュープリケートで
測定を行った。Prometheus NanoDSFユーザインターフェース(Mel
ting Scanタブ)を使用して、実施のための実験パラメータを設定した。サンプ
ルの熱走査は、1.0℃/分の速度で20℃から95℃までに及ぶ。二重UV技術は、3
30nm及び350nmの発光波長で固有のトリプトファン及びチロシンの蛍光をモニタ
リングし、この比(F350nm/F330nm)を温度に対してプロットして、アンフ
ォールディング曲線を作成する。NanoDSFは、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4
)中0.5mg/mLの濃度で全ての分子のTmを測定するために使用される。測定され
たTm値を、表40に列挙する。
ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、Ab候補が自己相互作用する傾
向を測定した。自己相互作用する傾向は、通常、乏しいAb溶解度に置き換わり、下流の
Ab製造における課題となる。このアッセイでは、金ナノ粒子(AuNP)をヤギ抗ヒト
IgG(H+L)捕捉抗体でコーティングし、その後、ポリクローナルヤギIgGの存在
下で候補Abと共にインキュベートする。自己会合する任意の候補Abは、AuNPを近
接させ、その結果、最大吸光度波長(λmax)とも呼ばれるナノ粒子のプラズモン波長
(λp)のシフトが生じる。各候補Abについてのシフト(Δλmax)の大きさは、そ
の自己会合の強度を示す。自己会合能を示さない、ないし高い自己会合能を示す適切な対
照抗体を、このアッセイで使用する。このアッセイで試験した全ての分子は、自己会合の
リスクを示さなかった、ないしは低いリスクしか示さなかった。
hK2×CD3二重特異性抗体のインビトロ細胞傷害性
Incucyteプラットフォームにおけるライブタイムラプスイメージングを使用し
て、T-細胞媒介細胞傷害性アッセイによって、作製した二重特異性抗体の細胞傷害能を
ンビトロで測定した。3:1のエフェクター:標的比(E:T比)で健常ドナーから単離
された汎ヒトCD3+T細胞の存在下で、hK2陽性細胞株VCaP細胞において、二重
特異性抗体を試験した。標的VCaP細胞によって安定的に発現される色素からの蛍光シ
グナルを測定することによって、アポトーシスによる細胞死をモニタリングした。
CD3二重特異性抗体を、96時間にわたって0~100nMで投与した。3:1のエフ
ェクター対標的(ET)比を使用した。図8Aは、標的細胞死を定量するための、リアル
タイムでincuCyteイメージングシステムによって測定されたKL2B×CD3二
重特異性分子のインビトロ標的細胞傷害性を示す。標的細胞は、標的細胞死を定量化する
ためにリアルタイムでIncuCyteイメージングシステムによって測定された赤色核
色素を安定的に発現していた。VCaP細胞のリアルタイム速度殺傷曲線のAUCに基づ
いて、全腫瘍細胞溶解をグラフ化した(図8A)。図8Bは、標的細胞死からのアポトー
シスシグナルを測定するための、蛍光カスパーゼ3/7試薬によって測定されたKL2B
×CD3二重特異性分子のインビトロ標的細胞傷害性を示す。緑色蛍光カスパーゼ3/7
試薬を使用して、標的細胞死からのアポトーシスシグナルを測定した。リアルタイムカス
パーゼ3/7活性曲線のAUCに基づいて、総カスパーゼ3/7活性をグラフ化した(図
8B)。データは、二重特異性hK2/CD3抗体が、時間の増加と共に生存可能なVC
aP細胞が用量依存的に減少するのを促進し、したがって、VCaP腫瘍細胞のT細胞媒
介死を誘導することを示す。したがって、二重特異性hK2×CD3抗体は、T細胞の活
性化を媒介するのに有効であり、用量依存的なKLK2+腫瘍細胞の殺傷を示す。
hK2×CD3二重特異性抗体を、T細胞の活性化及び増殖を促進する能力について試
験した。正常なドナー汎T細胞をCFSE(5uM)で標識し、KLK2(+)VCap
細胞と共培養した。KLK2×CD3二重特異性抗体を、96時間にわたって0~100
nMで投与した。3:1のエフェクター対標的(ET)比を使用した。96時間コインキ
ュベートした後、細胞を収集し、CD25、live/dead Dyeで染色した。F
lowjoソフトウェアを備えるFortessaフローサイトメーターでフローサイト
メトリー分析を行った。CTV色素希釈及び活性化マーカーCD25の頻度を求めた。異
なる用量におけるCD25陽性細胞の頻度を使用して、インビトロT活性化をグラフ化し
た(図9A)。0nM処理群を使用して増殖ゲートを決定した。増殖ゲートに入る細胞の
頻度を使用して、インビトロT細胞増殖をグラフ化した(図9B)。データから、様々な
KLK2×CD3二重特異性抗体によるT細胞の用量依存的活性化及び増殖が確認される
。
T細胞サイトカイン放出に対する抗hK2×CD3抗体の効果をインビトロで測定した
。上記のインビトロ細胞傷害性実験から上清サンプルを収集した。様々な用量のhK2×
CD3二重特異性抗体でIFN-及びTNF-α濃度を定量するために13-plexサ
イトカインLuminexアッセイを実行した。図10A及び図10Bは、用量依存的に
KLK2×CD3二重特異性抗体によって誘発された、活性化されたT細胞による機能的
サイトカインの放出を示す。
hK2×CD3抗体の有効性。
この試験の目的は、ヒト前立腺腫瘍VCaP皮下マウス異種移植モデルにおいてKLK
2×CD3二重特異性のインビボ有効性を評価することである。ヒト前立腺腫瘍VCaP
皮下マウス異種移植モデルにおいて、KLK2×CD3二重特異性抗体のインビボ有効性
を評価した。得られたSCヒト前立腺VCaP異種移植片において、KLK2×CD3分
子の抗腫瘍有効性を評価した。無傷の雄NSGマウスを使用して、ヒト腫瘍及びヒトT細
胞を移植するための好適な宿主を提供した。ヒト前立腺細胞株VCaPは、Americ
an Type Culture Collection(ATCC)から入手した。指
数関数的成長中にVCaP細胞を収集し、マウスの右側腹部に、0.2mLの体積に1×
107個の細胞を皮下注射した。各動物につき、20e6個のヒトT細胞を腹腔内注射し
た。3つの用量レベルを5倍漸増で評価した:0.2mg/kg、1mg/kg、及び5
mg/kg(図39A)。二重特異性抗体を週2回腹腔内投与した。最初の腹腔内投与の
6時間後に眼の血液をサンプリングし、Luminexベースのアッセイを使用して機能
的サイトカインレベルを測定した(図39B)。腫瘍体積及び体重の測定値を、全ての試
験を通して週2回収集した。デルタ腫瘍成長阻害パーセント(ΔTGI)は、ΔTGI%
=([(TVc-TVc0)-(TVt-TVt0)]/(TVc-TVc0))×10
0(式中、「TVc」は、所与の対照群の平均腫瘍量であり、「TVc0」は、所与の対
照群の平均初期腫瘍量であり、「TVt」は、処理群の平均腫瘍量であり、「TVt0」
は、処理群の平均初期腫瘍量である)として計算される、処理群及び対照群の平均腫瘍量
の差として定義した。TGI%は、([TVc-TVt]/TVc)×100と定義した
。
、すなわち、KLCB80は、1mg/kgで周辺腫瘍成長阻害を示し、5mg/kgで
強固な抗腫瘍効果を示した。最初の投与の6時間後におけるサイトカイン評価は、活性K
LCB80の上記バックグラウンド機能的サイトカイン放出を示し、これはインビボにお
ける有効性と一致する。
hK2 11B6 scFv CARの構築及び発現
hK2標的化抗体11B6に由来するscFvを含むhK2 CARコンストラクト(
CAR13:HL_HCヒト化_LCヒト化_20AA及びCAR15:LH_LCヒト
化_HCヒト化_20AA)を、図11に示すように構築した。Dynabeads H
uman T-Expander CD3/CD28で刺激したT細胞をエレクトロポレ
ーションに供し、次いで、OPTI-MEM(Invitrogen)で3回洗浄し、5
0×106/mLの最終濃度でOPTI-MEMに再懸濁させた。続いて、0.1mLの
細胞(5E6)を、RNAをコードしているIVT CAR10μgと混合し、エレクト
ロポレーションした。エレクトロポレーション後、T細胞を6ウェルプレートに移し、直
ちに37℃のインキュベーターに戻した。初代ヒトT細胞に、mRNAなし(モック)、
又はhK2 scFv CAR若しくは無関係の対照CARのいずれかを発現するmRN
A10μgをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの24時間後、2μ
g/mLのビオチン化Lタンパク質及びストレプトアビジンコンジュゲートしたPE(図
12、上図)、又はビオチン化hK2(1μg/mL)及びストレプトアビジンコンジュ
ゲートしたPE(図12、下図)で染色した後に、フローサイトメトリーによってCAR
表面発現を測定した。
集した。200μL/ウェルのマイクロタイタープレート用FACSバッファを使用して
、細胞をFACSバッファで2回洗浄し、上清を廃棄した。全てのウェルを、タンパク質
Lを含有する染色バッファ(Genscript、カタログ番号M000971:500
;2ug/mL)100μLで染色し、光から保護しながら、4℃で少なくとも30分間
インキュベートした。150μL/ウェルのマイクロタイタープレート用FACSバッフ
ァを使用して、FACSバッファを2回添加することによって細胞を洗浄した。室温で4
分間、400×gで遠心分離を行った。次いで、上清を廃棄した。全てのウェルを100
μLのストレプトアビジン-R-フィコエリトリン(SA-PE、1:250)及びLi
ve/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain色
素(1:1000)で染色し、光から保護しながら4℃で少なくとも30分間インキュベ
ートした。次いで、細胞のフローサイトメトリー分析の準備を整えた。
Rの両方で観察されたが(それぞれ41.4%及び66.3%)、mRNAエレクトロポ
レーションを伴わないT細胞である対照T細胞ではバックグラウンド染色(約5.5%)
しかみられなかった。図12の下図に示されるように、初代ヒトT細胞におけるCAR発
現は、J&J内部ビオチン標識組み換えKLK2タンパク質(ビオチン-Hk2タンパク
質、ロット:20188010、CBISID:KL2W12.CB.003、2.4m
g/mL、1mMベンズアミジン)、続いてSA-PEを介しても検出することができた
。図示されるように、T細胞は、フローサイトメトリーによって測定したとき、KLK2
LH CAR(82.7%)を効率的に発現したが、mRNAエレクトロポレーション
を伴わないT細胞である対照T細胞又は未開示の対照CAR(非KLK2特異的)ではバ
ックグラウンド染色(約1.73%又は1.19%)しかみられなかった。結果は、代表
的なドナーT細胞について示されており、複数のドナーで再現可能であった(少なくとも
n=3)。
フローサイトメーターを使用したCellTrace Violet(CTV、The
rmoFisherScientific)ベースの細胞傷害性アッセイのために共培養
を行って、11B6 CAR-T細胞の細胞傷害性について試験した。
れた/所望のE:Tに必要な濃度で再懸濁させた。T細胞を100μL/ウェルのアッセ
イで添加した(2×106細胞/mL、100μLを10:1のE:T比、すなわち2E
4個の標的細胞あたり2E5T個の細胞でプレーティング)。10:1のE:T濃度のス
トックを作製し、完全T細胞培地(Optimizerw/CTS、5%ヒト血清、1%
GlutaMax)で0.3125:1になるように2倍連続希釈を行った。96ウェ
ルの丸底組織培養処理プレートを使用して、T細胞をトリプリケートでプレーティングし
た(100uL/ウェル)。
バイアルに添加した。この原液を、5μMの染色溶液にするために20mLのPBS(3
7℃に加温)で希釈した。10E6個の腫瘍細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、4E6
/mL(2.5mL)に再懸濁させた。等体積(2.5mL)のCTV染色溶液を添加し
た。細胞を37℃のインキュベーター内で20分間インキュベートした。40mLのPR
MI+20%FBSを細胞に添加して、任意の非結合色素を吸収させた。細胞を5分時間
インキュベートした。細胞を400×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、予熱し
ておいたRPMI+10%FBS培地に再懸濁させた。その間に、T細胞を上記の所望の
E/T比で播種した。腫瘍細胞株Vcap(KLK2+)及びDU145(KLK2-)
を再度カウントし、次いで、細胞をデュープリケートで2E5/mL及び100uLに再
懸濁させた。平底96ウェルプレートにおいて、細胞を、標識された腫瘍細胞株とコイン
キュベートした。
共培養後、全ての細胞をU底96ウェルプレートに移し、洗浄した。20時間の共培養後
、全ての細胞を平底96ウェルプレートから回収し、U底96ウェルプレートに移し、次
いで、洗浄した。30μLの0.25%トリプシンを全てのウェルに添加し、37℃のイ
ンキュベーターで5分間インキュベートした。5分後、全ての腫瘍細胞をU底96ウェル
プレートに回収した。細胞を、400×gで5分間、2回遠心分離及び洗浄した。次いで
、細胞ペレットを、希釈した(1:1000)LIVE/DEAD(商標)Fixabl
e Near-IR染色色素(100μL)に再懸濁させた。細胞を4℃で30分間イン
キュベートし、400×gで5分間細胞を遠心分離することによって、2回FACSバッ
ファで洗浄した。洗浄後、100μLのBD Cytofix(商標)固定バッファ(5
0uLのFACSバッファ+50uLの固定バッファ)を使用して、全ての細胞を10分
間固定した。細胞を、400×gで5分間、1回遠心分離及び洗浄した。細胞ペレットを
FACSバッファに再懸濁させた。染色されたサンプルを、インキュベーション期間の終
了後にマルチカラーフローサイトメトリーによって分析した。
特異的死%=Near IR%+CTV+(死)細胞-自然Near IR%+CTV
+/(100%-自然Near IR%+CTV+(死)細胞)×100%。
陰性DU145細胞)をCell Trace Violet(CTV)蛍光色素で標識
し、次いで、hK2 CAR-T細胞と共培養した。モックT細胞が、陰性エフェクター
対照として機能した。細胞を、図13に示すように、0.3125:1~10:1の範囲
のエフェクター対標的細胞(E/T)比で20時間共培養した。殺傷パーセントは、CA
R-T細胞なしで培養された生存標的細胞の数に対する、共培養物中に残存する生存(生
存能色素陰性)標的(CTV陽性)細胞の絶対数の比として測定した。図示されるように
、10:1~0.3125:1のE/T比で、hK2 CAR LH T細胞は、hK2
(+)ヒト前立腺癌細胞株VCap細胞を特異的かつ効率的に溶解した(図13、上図)
が、K2(-)DU145細胞(図13、下図)は溶解せず、一方、モック又はhK2
HL CARであるT細胞ではバックグラウンド細胞傷害性しかみられなかった。
リアルタイム細胞分析システムとしてのxCELLigenceを用いて、リアルタイム
細胞傷害性についても試験した。
nces)の各ウェルに添加し、バックグラウンドインピーダンスを測定し、細胞指数と
して表した。次いで、接着標的細胞VCap及びDU145を解離させ、100μLの体
積で、5E4(VCap)、5E3(DU145)細胞/Eプレートのウェルの密度で播
種し、電極表面上に受動的に接着させた。播種後、Eプレートを層流フード内において周
囲温度で30分間保持し、次いで、細胞培養インキュベーター内のRTCA MP機器に
移した。実験期間(96時間)全体にわたって15分間隔でデータ記録を直ちに開始した
。
から50μLの培地を除去し、エフェクターCAR-T細胞を50μLの体積で、様々な
エフェクター対標的(E:T)比で添加した。hK2 CAR-T及び未開示の対照CA
R(非hK2特異的)T細胞を再懸濁させた。次いで、96ウェルプレートにおいてデュ
ープリケートで2倍希釈を行った(5:1~0.156:1のE/T比)。標的+モック
エフェクター対照(RNAエレクトロポレーションT細胞なし)も標的細胞に添加した。
2時間、モック、10μgのmRNAエレクトロポレーション(トランスフェクションの
24時間後)hK2 11B6 CAR LH、又は対照CAR-T細胞と共にインキュ
ベートした。VCap及びDU145についての正規化された細胞指数(CI)プロット
を、それぞれ図14及び図15に示す。単独で播種された場合、標的細胞はプレートに接
着し、増殖して、CIの読み出しを増加させる。T細胞を標的細胞に添加すると、hK2
CAR及び対照CAR-T細胞は、5:1~0.156:1のE/T比において、hK
2(+)VCaP細胞の細胞溶解、及びその後のCIの進行的減少を媒介した。
細胞傷害性T細胞によって産生されたIFN-γは、腫瘍の免疫監視作用を発揮させ、
これにより、増殖を直接阻害し、インビボ及びインビトロにおいて一部の悪性腫瘍のアポ
トーシスを誘導することができる。hK2 CAR-T細胞がhK2(+)腫瘍細胞によ
って認識され、活性化され得るかどうかを判定するために、実施例3に記載の通り、xC
ELLigenceベースの殺傷アッセイから上清を回収した。約70時間の共培養後、
上清を回収し、ELISAキット(ヒトIFN-γELISA MAX(商標)Delu
xe、BioLegend、カタログ番号430106)と共に提供された指示書に従っ
て、ELISAによってアッセイした。
LH及び対照CAR-T細胞は、hK2発現VCap細胞との共培養中にE:T比依存的
にIFN-γを分泌したが、hK2-陰性DU145細胞との共培養中には分泌しなかっ
た。未開示の対照CARは、抗原発現レベルがhK2よりもはるかに高いことから、はる
かに多量のIFN-γを分泌した。デュープリケートの培養物からの平均IFN-γ濃度
±SD(pg/mL)を記録した。
実施例1に記載の通り、scFvとしてクローニングされた11B6の外部ドメインは
、高温(55℃)で結合を保持しなかったので、追加のキャンペーンを開始して、親11
B6から新たなヒト化抗体を生成させた。
R1~CAR12、CAR14、CAR16)。熱安定化scFvを含有するCARコン
ストラクトの説明及び配列番号を表13に提供する。説明における名称(HCG5、LC
D6、HCF3、LCB7)は、実施例1で同定されたVH鎖又はVL鎖を指し、20A
Aは、scFv中のVH/VL対間の20アミノ酸長のリンカーを指す。CARにおける
scFvをVH-L-VL又はVL-L-VH配向のいずれかでクローニングした。
込み、更に特性評価した。表41は、作製されたCARコンストラクト及びその配列番号
を示す。使用したシグナル配列は、MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(配列番号
24)である。
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商標)NFAT細胞(JNL)を介したその抗原依存性活性化を評価した。活性化T細胞
(NFAT)の核因子は、最初に免疫細胞の調節因子として同定された転写因子のファミ
リーである。T細胞が活性化されると、カルシウムが流入し、NFATのN末端でセリン
リッチな核局在化シグナルを脱リン酸化するカルシニューリンが活性化され、NFATが
核内移行する。理論に束縛されることを望むものではないが、scFvクラスタリングに
よるトニックシグナル伝達は、JNLレポーター細胞株においてNFATプロモーターに
よって駆動されるホタルルシフェラーゼによって後で検出することができる。
になるように再懸濁させた。500μLのJNL細胞及びレンチウイルスウイルスをMO
I3で添加し、上下にピペッティングすることによって混合した。混合物を37℃のイン
キュベーターで24時間インキュベートした。500μLのJNL培地を各ウェルに添加
し、37℃のインキュベーターで培養を続けた。4日目に細胞をT25フラスコに移した
。5~6日目に、形質導入の検証を行った。150μLの細胞を収集して、使用した特定
のCARに適切な検出試薬(例えば、CARを検出するためのビオチン-hK2タンパク
質)を介してCAR発現を調べた。凍結又はアッセイにおいて使用するのに十分な細胞が
得られるまで、JNL細胞を5×105/mLで維持した。
いて評価した。シグナル伝達応答性NFATプロモーターによって駆動されるルシフェラ
ーゼ遺伝子を含有するJurkat細胞に、様々なhK2CARコンストラクトを形質導
入した。このアッセイは、以下のように行った。2:1のエフェクター対標的比で、標的
細胞株との共培養を行った。JNL細胞をスピンダウンして、培地中の任意の分泌された
ルシフェラーゼを除去し、次いで、JNL細胞を4×105/mLで新鮮培地に再懸濁さ
せた。細胞を収集した。次いで、抗原陽性及び抗原陰性の標的細胞株の両方を2E5/m
Lで調製した。100μLのJNLを100μLの標的細胞に添加した。JNLのみの対
照については、標的細胞の代わりに100μLの培地を添加した。陽性対照の場合、JN
L細胞のみ又はCARJNL細胞を1×細胞刺激カクテルに添加し、37℃のインキュベ
ーター内で24時間インキュベートした。150μLの上清を96ウェルプレートに収集
し、遠心分離して細胞を除去した。100μLの上清をプレートからソリッドボトム黒色
プレートに移した。次いで、100μLのQuanti-luc lucia検出試薬を
添加した。Envisionマルチプレートリーダーで読み取る前に、混合物を室温で5
分間インキュベートした。
トレプトアビジンコンジュゲートしたPEによって判定し、結果を図17に示す。形質導
入されたJNL細胞におけるCAR発現は、選択されたクローンの全てについて確認され
、細胞の60~75%が異なるクローン及び親11B6 CARにわたって検出可能な発
現を示した。指定のCARクローンを含有するJNL細胞及び非形質導入JNL細胞(U
TD)を標的細胞株(VCap又はDU145細胞)と共培養し、発光強度としてルシフ
ェラーゼ活性を測定した。発光強度が抗原発現細胞の存在下でUTD細胞のレベルを1.
5倍上回った場合、クローンは活性であるとみなした。
て、JNL細胞においてルシフェラーゼが発現した(図18)。指定のCARクローンを
含有するJNL細胞及びJNL細胞(非形質導入、以後「UTD」)を標的細胞株(VC
ap又はDU145細胞)と共培養し、発光強度としてルシフェラーゼ活性を測定した。
発光強度が抗原発現細胞の存在下でUTD細胞のレベルを1.5倍上回った場合、クロー
ンは活性であるとみなした。10個のクローン全て並びに親11B6 CAR HL及び
LHについて、抗原依存性活性化はみられなかった。
熱安定化11B6 CAR T細胞の機能を評価するために、レンチウイルス形質導入
を使用して、熱安定化11B6及び親scFvが形質導入されたCAR-T細胞を作製し
た。感染多重度(MOI)3で、初代ヒトT細胞に熱安定化11B6及び親scFv C
ARレンチウイルスを形質導入した。形質導入の14日後に、ビオチン化hK2(1μg
/mL)、続いて、ストレプトアビジンコンジュゲートしたPEによってCAR発現を判
定した。
-X(商標)293T細胞を、丸底のCorning(商標)BioCoat(商標)コ
ラーゲンIでコーティングされた培養皿に播種し、DMEM+10%FBS培地を使用し
て37℃で一晩インキュベートした。
下を調製した。培養培地を21mLの293T成長培地で置き換えた。リポフェクタミン
2000を室温で希釈し、OptiMEMを平衡化した。希釈したリポフェクタミン20
00を、混合プラスミドに滴下し、十分に混合した。混合物を室温で25分間インキュベ
ートした。トランスフェクション混合物をLenti-X293T細胞に滴下し、プレー
トを穏やかに旋回させて混合した。混合物を37℃のインキュベーター内でインキュベー
トした。トランスフェクションの24時間後及び48時間後にレンチウイルスを収集した
。上記試薬を表42にまとめる。
45μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過する前に過剰な293T細胞が辺りを
浮遊している場合、500×gで10分間遠心分離した。上清を滅菌容器に移し、1/3
の体積のLenti-X濃縮物(Clontech、カタログ番号631232)と合わ
せ、穏やかに反転させることによって混合した。混合物を4℃のインキュベーター内でイ
ンキュベートした。サンプルを、1,500×gで45分間、4℃で遠心分離したところ
、遠心分離後に白色ペレットが見えた。ペレットを乱すことなく上清を慎重に除去した。
1,500×gで短時間遠心分離した後、残留上清をピペットで除去した。冷T細胞成長
を使用して、ペレットを元の体積の1/10に穏やかに再懸濁させた。ウイルスを200
μLに分注し、直ちに-80℃で保存した。
させた。1ウェルあたり100μL、20,000個/mLのSupT1細胞を、平坦な
96ウェルプレートに播種した。次いで、ウイルス力価測定を96ウェル丸底プレートで
行った)。100μLの培地をプレートの全てのウェルに添加した。ウイルスのアリコー
トを、手で-80℃の冷凍庫から解凍した。アリコートを上下にピペッティングして十分
に混合し、50μLのウイルスを最初のウェルに添加し、続いて、十分に混合した。50
μLのウイルスを次のウェルにピペッティングして入れることによって、連続1:3希釈
を行った。次いで、50μLの培地を、一次Abのみ、二次Abのみ、及び非形質導入対
照に添加した。各50μLを力価測定プレートからアッセイプレート内の100μLのS
upT1細胞にマルチチャネルピペットで移し、37℃で一晩インキュベートした。10
0μLの予熱した培地を各サンプルに添加し、更に2日間インキュベートした。フローサ
イトメトリーによって形質導入効率を求めた。サンプルを丸底96ウェルプレートに移し
、1400RPMで3分間回転させた。上清を素早く廃棄し、続いてブロッティングして
、フード内の過剰な培地を除去した。150μLのFACSバッファで洗浄を繰り返した
。次いで、CARコンストラクトに適切な染色プロトコルを行った。フローサイトメトリ
ー分析の前に、150μLのFACSバッファにサンプルを再懸濁させた。
複数コピーの統合を除外するために、20%に最も近い形質導入の力価が使用される。
を水浴中で解凍し、9mLの予熱されたT細胞培地(TCM CTS OpTmizer
T Cell Expansion SFM+5%ヒト血清+IL-2 100IU/
mL)を含有する15mLのコニカルチューブに滴下した。クライオバイアルを1mLの
培地で洗浄して最大数を回収し、室温で8分間300×gで回転させた。ペレットを新鮮
な10mLのTCMに再懸濁させ、カウントし、1mLあたり1E6細胞になるように再
懸濁させた。24ウェルプレートに、1ウェル当たり5E5個の細胞を添加した。総体積
が1ウェルあたり1mLになるように、1ウェルあたり1.5×106個のCD3/CD
28ビーズを500μLの体積に添加した。活性化の24時間後、ウイルスを室温で解凍
した。ウイルスを感染多重度(MOI)3で添加し、穏やかに旋回させて混合し、インキ
ュベーターでプレートに戻した。(レンチウイルス機能力価は、SupT1力価アッセイ
で以前に求めた。)ウイルスが添加されていない非形質導入(UTD)のために1つのウ
ェルを確保した。
降にペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。3~5日目に、2mLの細胞につき4
mLのTCMを添加し、T25組織培養処理フラスコに移した。フラスコをインキュベー
ター内に水平に配置した(3日目)。T細胞培養のために等体積のTCMを添加した(4
日目)。5~14日目に、細胞を1日おきに確認し、生存率、サイズ、及び総細胞数を記
録した。1mLあたり100万個の細胞になるように細胞密度を調整した。理想的な収集
時間はドナー依存性であり、細胞サイズ及び拡大の倍率によって決定される。全般的に、
100~200倍の拡大で、MOXIフローセルカウンターに基づいて、細胞サイズが8
μm未満であったときに細胞を冷凍した。
した。100μLのT細胞を、100μLのFACSバッファの入った96ウェルプレー
トの対応するウェルに収集し、混合し、室温で3分間、1300RPMで回転させた。細
胞を200μLのFACSバッファに再懸濁させ、4℃で遠心分離を繰り返した。
Sバッファで希釈)に再懸濁させ、氷上で30分間インキュベートした。100μLのF
ACSバッファを添加し、4℃でスピン洗浄した。更に200μLのFACSバッファを
添加した後、スピン洗浄を繰り返した。二次抗体SA-PE(1:250)を含有するマ
スター溶液100μLで染色し、live dead fixable stain(1
:500)、αCD3、αCD4、及びαCD8抗体を氷上で30分間施した。100μ
LのFACSバッファを添加し、4℃でスピン洗浄し、廃棄し、4℃でスピン洗浄する前
に200μLのFACSバッファに再懸濁させた。フローサイトメトリーによって分析す
る前に、サンプルを100μLのFACSバッファに再懸濁させた。
00×gで10分間、室温で遠心分離した。50mLのコニカルチューブに適合するよう
に、培養物をより少ない体積の培地に再懸濁させた。チューブを4℃で10分間マグネッ
トに入れ、「脱ビーズ」した。細胞をチューブから穏やかに移してビーズ/マグネットの
摂動を最小化し、正確な体積を記録した。カウントを繰り返した。遠心分離を300×g
で10分間行い、上清を廃棄した。冷却容器内のCS-10 CryoStor(登録商
標)細胞冷凍保存培地中で細胞を冷凍した。直ちに容器を-80℃に24~48時間移し
た後、液体窒素中で永続的に保存した。結果を図27に示し、形質導入T細胞の表面上の
hK2 CAR発現を確認する。分析した10個の熱安定化クローン及び親11B6 H
L及びLHの各々によって検出されたhK2 CAR+T細胞の百分率(陽性%)の要約
を図に提供する。CAR17(KL2B413_HL)、CAR18(KL2B413_
LH)、CAR19(KL2B359_HL)、及びCAR20(HK2B359_LH
)の表面発現の結果を図27に示す。図示されるように、異なるクローンは、17.9%
~42.7%の範囲の異なるCAR発現レベルを有する。CAR陽性CD3+T細胞の百
分率は、CAR17については56.0%、CAR18については51.2%、CAR1
9については45.1%、CAR20については59.9%、そして、非形質導入細胞(
図中UTD)については0.065%であった。全てのCAR T+細胞を、後続の機能
アッセイのために等価なCAR+T細胞に対して正規化した。
scFv CAR-T細胞を、抗原依存性細胞傷害性についてリアルタイムIncuC
yte腫瘍殺傷アッセイで評価した。熱安定化hK2 CAR-T細胞及び親11B6
CAR-T細胞を、CAR発現データに基づいて計算した1:1又は0.5:1のエフェ
クター:標的比で88時間、VCaP細胞(図20)又はPC3細胞(図21)とコイン
キュベートした。CAR17、CAR18、CAR19、及びCAR20を形質導入した
CAR-T細胞を、T細胞上のCAR発現に基づいて計算した1:1又は0.5:1のエ
フェクター対標的(ET)比で96時間、hK2陽性VCaP細胞及びhK2陰性DU1
45細胞とコインキュベートした。CAR17、CAR18、CAR19、及びCAR2
0を形質導入したCAR-T細胞の経時的な腫瘍細胞成長阻害パーセントを、VCap細
胞については図30に、DU145細胞については図31に示す。標的細胞は、リアルタ
イムでIncuCyteイメージングシステムによって測定された赤色核色素を安定的に
発現していた。腫瘍細胞成長阻害(%)=(初期生存標的細胞数-現時点の生存標的細胞
数)/初期生存細胞数×100(%)。試験したCAR-T細胞は、約100%のTGI
を達成したが、非形質導入対照は、いかなるTGIも示さなかった。hK2陰性DU14
5細胞中の試験したCAR-T細胞では、TGIは観察されなかった。
1:1のE/T比でVCaP細胞と共にhK2 CAR-T細胞を一晩(およそ20時
間)共培養したものから上清を回収し、13-plex Milliplexヒト高感度
T細胞キット(HSTCMAG28SPMX13)を使用して分析した。hK2 CAR
改変T細胞は、hK2発現VCap細胞との共培養中にはサイトカインを分泌したが、非
形質導入T細胞(UTD)では最少であった。hK2 CAR-T細胞によるサイトカイ
ン放出の結果を図22に示す。
T細胞を一晩(およそ20時間)共培養したものから上清を回収した。hK2 CAR-
T細胞は、hK2発現VCap細胞との共培養中にはIFN-γを分泌したが、hK2-
陰性DU145細胞との共培養中には分泌しなかった。CD3/28ビーズで刺激したT
細胞及びT細胞のみをそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。hK2 CAR-
T細胞によるIFN-γ放出を図23に示す。デュープリケートの培養からの平均IFN
-γ濃度±SD(pg/mL)を示す。異なる熱安定化CAR-T細胞は、hK2(+)
VCap細胞と共培養したとき、異なる量のIFN-γを生成した。
hK2 CAR-T細胞を増殖アッセイで評価した。T細胞増殖は、インビボ免疫機能
の重要なインビトロパラメータである。熱安定化11B6 CAR T細胞の機能を更に
評価するために、熱安定化11B6及び親scFv CAR-T細胞をCTVで標識して
、T細胞増殖を評価した。
let(CTV、5μM)で標識し、hK2(+)VCap及びhK2(-)DU145
細胞と共培養した。共培養の5日後、細胞を収集し、CD3、CD25、NearIR
live/dead Dye、及びhK2CARに染色した。Flowjoソフトウェア
を備えるFortessaフローサイトメーターでフローサイトメトリー分析を行った。
リンパ球を生CD3によって同定し、CTV色素希釈及び活性化マーカーCD25を有す
るCAR-T細胞の頻度を求めた。図示されるように、hK2 CAR+T細胞をゲーテ
ィングすることにより、hK2(+)Vcap細胞は、全てのCARコンストラクトで遺
伝子操作されたT細胞の増殖(図33)及び活性化マーカーCD25のアップレギュレー
ション(図34)を促進したが、hK2(-)DU145細胞は促進しなかった。CD3
/28ビーズで刺激したT細胞及びT細胞のみをそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使
用した。任意の刺激なしのT細胞のみは増殖せず、CD3/28ビーズで刺激されたT細
胞は等価な増殖パターンを示した。図35に示されるように、hK2 CAR-T細胞は
、VCap細胞と5日間共培養した後に、CD3/28ビーズ陽性対照よりもロバストに
増殖した。様々なCARコンストラクトで遺伝子操作されたT細胞は、異なる増殖活性を
有し、異なるCAR-T細胞数を示した。CAR-T細胞数は、3つの技術的複製物から
の平均絶対細胞数+/-SEMに基づいていた。
で2回洗浄し、腫瘍細胞の増殖をブロックするために、37℃のインキュベーターにおい
て1.5時間、100ug/mLのマイトマイシンC(MMC)を含有するPBS中10
E6/mLで再懸濁させた。20μLのDMSOをCTV染色溶液のバイアルに添加した
。5μLの溶液を、5mL(1:1000)のPBS(37℃に加温)で希釈して、5μ
Mの染色溶液を提供した。2E6個のT細胞をカウントし、回収し、PBSで2回洗浄し
、4E6/mL(0.5mL)で再懸濁させた。等体積(0.5mL)のCTV染色溶液
を添加した。細胞を37℃で20分間インキュベートした。次いで、4mLのPRMI+
20%FBSを細胞に添加して、任意の非結合色素を吸収させた。細胞を5分間インキュ
ベートし、400×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、予熱しておいたRPMI
+10%FBS培地に再懸濁させた。T細胞をカウントし、1E5個の細胞(100uL
)を96ウェル平底プレートに播種した。
を回収し、1.5時間後にカウントし、次いで、1E6/mLで再懸濁させた。1E5個
の細胞(100μL)を96ウェルプレート内でT細胞と共培養した。T細胞のみ、及び
3:1の比のCD3/28ビーズ対細胞を添加したT細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性
対照として使用した。
×gで5分間2回洗浄し、次いで、96ウェルU底プレートにおいてhK2CAR、CD
3、CD8、及びCD25、live/dead(Near-IR)で染色した。洗浄後
、全ての細胞を100μLのBD Cytofix(商標)固定バッファ(50uLのF
ACSバッファ+50uLの固定バッファ)を使用して10分間固定した。染色されたサ
ンプルを、インキュベーション期間の終了後にマルチカラーフローサイトメトリーによっ
て分析した。
たT細胞の右端ピーク(CTV明)、及び集団の残りを捕捉するためのCTV希釈ゲート
を包含するように、CTV未希釈ゲートを設定した。これを全てのサンプルに適用した。
R-T細胞の特性評価。
CAR-T細胞の活性化は、抗原依存性である
生成されたCAR-T細胞を、実施例5に記載の通り、抗原依存性活性についてJNL
レポーターアッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、シグナル伝達応答性NFATプ
ロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含有するJurkat細胞(JN
L細胞と呼ばれる)に、CAR17(KL2B413_HL)、CAR18(KL2B4
13_LH)、CAR19(KL2B359_HL)、又はCAR20(KL2B359
_LH)コンストラクトを形質導入した。ビオチン化hK2、続いて、ストレプトアビジ
ンコンジュゲートしたPEによって、各CARの発現を判定した。選択されたクローンに
ついて、形質導入されたJNL細胞におけるCAR発現が確認され、図28に示す通り、
細胞の46~50%がKL2B359ベースのCARを発現し、細胞の73.7~96%
がKL2B413ベースのCARを発現していた。各CARを発現するJNL細胞のパー
セントは以下の通りであった。CAR17(KL2B413_HL):73.7%。CA
R18(KL2B413_LH):93.6%、CAR19(KL2B359_HL):
46%、CAR20(KL2B359_LH):50.8%。
合によって、JNL細胞におけるルシフェラーゼが発現する。その目的のために、試験C
ARコンストラクトを形質導入したJNL細胞又は非形質導入NJL細胞(UTD)を、
標的細胞株(VCap、LNCaP/hK2(hK2を組み換え発現するLNCaP細胞
)、LNCaP、C4-2B、22Rv1、又はDU145細胞)と共培養し、ルシフェ
ラーゼ活性を発光強度として測定した。発光強度が抗原発現細胞の存在下でUTD細胞の
レベルを1.5倍上回った場合、コンストラクトは活性であるとみなした。試験したCA
Rコンストラクトについては、抗原依存性活性化はみられなかった。図29は、図に示さ
れるCAR-T細胞の試験標的細胞への結合から生じたRLU(相対光単位)を示す。
CAR17、CAR18、CAR19、及びCAR20を形質導入したCAR-T細胞
を、T細胞上のCAR発現に基づいて計算した1:1又は0.5:1のエフェクター対標
的(ET)比で96時間、hK2陽性VCaP細胞及びhK2陰性DU145細胞とコイ
ンキュベートした(実施例11)。標的細胞は、リアルタイムでIncuCyteイメー
ジングシステムによって測定された赤色核色素を安定的に発現していた。経時的な腫瘍細
胞成長阻害パーセントを、VCap細胞については図30に、DU145細胞については
図31に示す。腫瘍細胞成長阻害(%)=(初期生存標的細胞数-現時点の生存標的細胞
数)/初期生存細胞数×100(%)。試験したCAR-T細胞は、約100%のTGI
を達成したが、非形質導入対照は、いかなるTGIも示さなかった。hK2陰性DU14
5細胞中の試験したCAR-T細胞では、TGIは観察されなかった。
細胞傷害性T細胞によって産生されたIFN-γは、腫瘍の免疫監視作用を発揮させる
のに非常に重要であり、これにより、増殖を直接阻害し、インビボ及びインビトロにおい
て一部の悪性腫瘍のアポトーシスを誘導することができる。hK2 CAR改変ヒトT細
胞がhK2陽性腫瘍細胞によって認識及び活性化され得るかどうかを判定するために、指
定のCARクローンを形質導入した初代T細胞及び対照非形質導入T細胞(UTD)を標
的細胞株(LNCaP/hK2、LNCaP、C4-2B、22Rv1、又はDU145
細胞)と共培養し、IFN-γ濃度測定のために上清を回収した。図32に示されるよう
に、hK2 CAR細胞を形質導入したCAR-T細胞は、hK2を組み換え発現するL
NCap細胞(LNCap/hK2)細胞との共培養中にIFN-γを分泌し、また、非
常に低いhK2発現C4-2B及びLNCap細胞との共培養中にも分泌したが、hK2
-陰性DU145細胞では分泌しなかった。デュープリケートの培養からの平均IFN-
γ濃度±SD(pg/mL)を図に示す。
する
主に、標的腫瘍細胞を殺傷する溶解顆粒の免疫分泌を通して、CD8+Tリンパ球及び
ナチュラルキラー(NK)細胞などの細胞傷害性リンパ球によって、腫瘍細胞を認識及び
殺傷することができる。このプロセスは、顆粒膜と免疫エフェクター細胞の細胞質膜との
融合を伴い、その結果、典型的にはCD107aなどの溶解顆粒を取り囲む脂質二重層に
存在するリソソーム関連タンパク質の表面曝露が生じる。したがって、CD107aの膜
発現は、免疫細胞活性化及び細胞傷害性脱顆粒のマーカーを構成する。
レートにおいて1ウェルあたり0.1mLで等数のエフェクター細胞と共培養した。対照
ウェルは、T細胞のみを含有していた。1μL/サンプルのモネンシン(BD Bios
ciences)に加えて抗CD107a(1ウェルあたり5μL)を添加し、37℃で
4時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、hK2 CAR、CD3、及び
CD8の発現について染色し、フローサイトメーターBD Fortessaで分析した
。
は、hK2陽性Vcap細胞との共培養において明らかであったが、hK2陰性DU14
5との共培養は効果を有していなかった。腫瘍細胞刺激なしのCAR-T細胞のみ及びU
TD対照では、バックグラウンド染色(<2%)しかみられなかった。イオノマイシン(
eBioscience(商標)細胞刺激カクテル;500×)と組み合わせたフォルボ
ール12-ミリステート13-アセテート(PMA)は、この4時間細胞培養モデルにお
けるCD107a細胞表面発現の一貫した誘導因子であり、これを陽性対照として使用し
た。結果を代表的なドナーT細胞について示し、この結果は、複数のドナーで再現可能で
あった。
CAR-T細胞を、実施例9に記載のT細胞増殖アッセイプロトコルを使用してその増
殖について評価した。hK2 CAR-T及び非形質導入(UTD)T細胞をCellT
race Violet(CTV;5μM)で標識し、hK2陽性VCap及びhK2陰
性DU145細胞と共培養した。共培養の5日後、細胞を収集し、CD3、CD25、N
earIR live/dead Dye、及びhK2CARで染色した。Flowjo
ソフトウェアを備えるFortessaフローサイトメーターでフローサイトメトリー分
析を行った。リンパ球を生CD3によって同定し、CTV色素希釈及び活性化マーカーC
D25を有するCAR-T細胞の頻度を求めた。CD3+T細胞でゲーティングすること
により、hK2陽性Vcap細胞は、図34及び35に示すように各試験したCAR-T
細胞の増殖を、そして、図36及び37に示すように活性化マーカーCD25のアップレ
ギュレーションを促進したが、hK2陰性DU145細胞は促進しなかった。任意の刺激
なしのT細胞のみは増殖せず、CD3/28ビーズで刺激されたT細胞は等価な増殖パタ
ーンを示した。hK2 CAR+T細胞は、VCap細胞と5日間共培養した後に、CD
3/28ビーズ陽性対照よりもロバストに増殖した。異なる試験したCAR-T細胞は、
異なる増殖活性を有し、異なるCAR-T細胞数を示した。増殖しているT細胞及びCD
25を発現しているT細胞の百分率は、デュープリケートからの平均絶対細胞数+/-S
EMに基づいていた。
hK2に結合する抗体又は抗原結合ドメインを、In-111、Zr-89、又はLu
-177 Ac-225などの様々な放射性金属で標識し、雄NOD.Cg-Prkdc
scid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,The Jackson Lab
oratory,Bar Harbor,ME)又はBalb-c若しくはSHO Nu
deマウスにおいて、LNCaP、VCaP、又はC4-2Bを含む得られた皮下(SC
)ヒト前立腺モデルで、インビボ腫瘍体内分布又は腫瘍有効性を評価する。hK2に結合
する抗体若しくは抗原結合ドメイン又はアイソタイプ対照抗体の様々な用量を、異なる量
の放射活性(10~1000nCi)で標識し、腫瘍取り込み又は有効性を測定する。
hK2に結合する抗体又は抗原結合ドメインを、In-111、Zr-89、又はLu-177 Ac-225などの様々な放射性金属で標識し、雄NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)又はBalb-c若しくはSHO Nudeマウスにおいて、LNCaP、VCaP、又はC4-2Bを含む得られた皮下(SC)ヒト前立腺モデルで、インビボ腫瘍体内分布又は腫瘍有効性を評価する。hK2に結合する抗体若しくは抗原結合ドメイン又はアイソタイプ対照抗体の様々な用量を、異なる量の放射活性(10~1000nCi)で標識し、腫瘍取り込み又は有効性を測定する。
以下の態様を包含し得る。
[1] カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、114、及び115からなる群から選択される配列を有するhK2上のエピトープに結合する、単離タンパク質。
[2] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、KVTEF(配列番号111)及びHYRKW(配列番号112)の配列を有するエピトープ内のhK2に結合する、上記[1]に記載の単離タンパク質。
[3] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、hK2への結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、以下を含む、上記[1]に記載の単離タンパク質:
a.配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
b.配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
c.配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号165のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
d.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
e.配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
f.配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
g.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号444のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。
[4] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、hK2への結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[3]に記載の単離タンパク質。
[5] 以下のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[1]~[4]に記載の単離タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、180、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
l.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
[6] それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[5]に記載の単離タンパク質。
[7] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFv、(scFv) 2 、Fv、Fab、F(ab’) 2 、Fd、dAb、又はVHHである、上記[1]~[6]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[8] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、Fabである、上記[7]に記載の単離タンパク質。
[9] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、VHHである、上記[7]に記載の単離タンパク質。
[10] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、上記[7]に記載の単離タンパク質。
[11] 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及びVL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、上記[10]に記載の単離タンパク質。
[12] 前記L1が、以下を含む、上記[11]に記載の単離タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、又は
d.約10~20個のアミノ酸。
[13] 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は108のアミノ酸配列を含む、上記[12]に記載の単離タンパク質。
[14] 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記[13]に記載の単離タンパク質。
[15] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号137、162、164、166、168、又は204のVH及び配列番号138、163、165、167、169、又は205のVLを含む、上記[1]~[14]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[16] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[15]に記載の単離タンパク質:
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;又は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;又は
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;又は
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;又は
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;又は
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。
[17] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含む、上記[15]に記載の単離タンパク質。
[18] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号133、134、308、316、324、325、404、405、406、407、408、及び409からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[1]~[17]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[19] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号404又は405のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[1]~[17]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[20] カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号75の重鎖可変領域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)を含む、単離タンパク質。
[21] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号4、5、6、139、159、又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことはない、上記[20]に記載の単離タンパク質。
[22] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[21]に記載の単離タンパク質:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
[23] 以下のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[20]~[22]のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
b.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
c.それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71;
d.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;又は
e.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;又は
f.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71。
[24] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFv、(scFv) 2 、Fv、Fab、F(ab’) 2 、Fd、dAb、又はVHHである、上記[21]に記載の単離タンパク質。
[25] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、Fabである、上記[24]に記載の単離タンパク質。
[26] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、VHHである、上記[24]に記載の単離タンパク質。
[27] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、上記[24]に記載の単離タンパク質。
[28] 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及びVL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、上記[27]に記載の単離タンパク質。
[29] 前記L1が、以下を含む、上記[28]に記載の単離タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、
d.又は約10~20個のアミノ酸。
[30] 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は108のアミノ酸配列を含む、上記[29]に記載の単離タンパク質。
[31] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、135、136、318、319、320、321、322、又は323のアミノ酸配列を含む、上記[21]~[30]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[32] 単一特異性タンパク質である、上記[1]~[31]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[33] 多重特異性タンパク質である、上記[1]~[31]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[34] 前記多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、上記[33]に記載の単離タンパク質。
[35] 前記多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、上記[33]に記載の単離タンパク質。
[36] リンパ球上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、上記[34]又は[35]に記載の多重特異性タンパク質。
[37] 前記リンパ球が、T細胞である、上記[36]に記載の多重特異性タンパク質。
[38] 前記T細胞が、CD8 + T細胞である、上記[37]に記載の多重特異性タンパク質。
[39] 前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞である、上記[38]に記載の多重特異性タンパク質。
[40] 前記リンパ球上の抗原が、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2Cである、上記[36]のいずれか一項に記載の多重特異性タンパク質。
[41] 前記リンパ球上の抗原が、CD3εである、上記[40]に記載の多重特異性タンパク質。
[42] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[41]に記載の多重特異性タンパク質:
a.配列番号116の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCDR3、配列番号119の軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
[43] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号157のVLを含む、上記[41]に記載の多重特異性タンパク質。
[44] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[43]に記載の多重特異性タンパク質:
a.配列番号255の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258の軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3;又は
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
[45] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、上記[43]に記載の多重特異性タンパク質。
[46] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含む、上記[43]又は[45]に記載の多重特異性タンパク質。
[47] 前記hK2に結合する結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[41]~[46]のいずれか一項に記載の多重特異性タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;
l.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209;
m.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
n.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
o.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;
p.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;
q.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
r.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
s.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
t.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
u.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
v.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
w.配列番号166のVH及び配列番号444のVL;
x.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
y.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
z.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
aa.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;又は
bb.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
[48] 前記hK2に結合する結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[47]に記載の多重特異性タンパク質。
[49] 前記CD3に結合する結合ドメインが、以下を含む、上記[41]~[48]のいずれか一項に記載の多重特異性タンパク質
a.配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCDR3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
c.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
i.配列番号248のVH及び配列番号254のVL;又は
j.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
[50] 半減期延長部分にコンジュゲートしている、上記[1]~[49]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[51] 前記半減期延長部分が、免疫グロブリン(Ig)、前記Igの断片、Ig定常領域、前記Ig定常領域の断片、Fc領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである、上記[50]に記載の単離タンパク質。
[52] 前記Ig定常領域の断片が、Fc領域を含む、上記[51]に記載の単離タンパク質。
[53] 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメインを含む、上記[52]に記載の単離タンパク質。
[54] 前記Ig定常領域の断片が、CH3ドメインを含む、上記[52]に記載の単離タンパク質。
[55] 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、上記[52]に記載の単離タンパク質。
[56] 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、上記[55]に記載の単離タンパク質。
[57] 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、上記[56]に記載の単離タンパク質。
[58] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片のN末端にコンジュゲートされる、上記[50]~[57]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[59] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片のC末端にコンジュゲートされる、上記[50]~[57]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[60] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、第2のリンカー(L2)を介して前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片にコンジュゲートされる、上記[50]~[57]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[61] 前記L2が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は108のアミノ酸配列を含む、上記[60]に記載の単離タンパク質。
[62] 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4アイソタイプである、上記[51]~[61]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[63] 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、IgG1である、上記[62]に記載の単離タンパク質。
[64] 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質のFcγ受容体(FcγR)への結合を低減する少なくとも1つの変異を含む、上記[51]~[63]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[65] 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記少なくとも1つの変異が、F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236欠失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及びS228P/F234A/L235A/G236欠失/G237A/P238Sからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[64]に記載の単離タンパク質。
[66] 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記変異が、L234A_L235A_D265Sである、上記[65]に記載の単離タンパク質。
[67] 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質の前記FcγRへの結合を増強する少なくとも1つの変異を含む、上記[51]~[66]に記載の単離タンパク質。
[68] 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を増強する前記少なくとも1つの変異が、S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及びG236A/S239D/I332Eからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[67]に記載の単離タンパク質。
[69] 前記FcγRが、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、若しくはFcγRIII、又はこれらの任意の組み合わせである、上記[64]~[68]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[70] 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質の半減期を調節する少なくとも1つの変異を含む、上記[51]~[63]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[71] 前記タンパク質の半減期を調節する少なくとも1つの変異が、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[70]に記載の単離タンパク質。
[72] 前記Ig定常領域のCH3ドメインに少なくとも1つの変異を含む、上記[51]~[63]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[73] 前記Ig定常領域の前記CH3ドメインにおける前記少なくとも1つの変異が、T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V、及びT350V/T366L/K392L/T394Wからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[72]に記載の単離タンパク質。
[74] 前記Ig定常領域の前記CH3ドメインにおける前記変異が、T350V_T366L_K392L_T394W又はT350V_L351Y_F405A_Y407Vである、上記[73]に記載の単離タンパク質。
[75] 前記IgG定常領域が、配列番号109、110、158、又は378を含む、上記[73]又は[74]に記載の単離タンパク質。
[76] 前記IgG定常領域が、配列番号109又は378を含む、上記[75]に記載の単離タンパク質。
[77] 以下を含む、上記[1]~[18]又は[50]~[76]のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.配列番号210の重鎖(HC)及び配列番号221の軽鎖(LC);
b.配列番号211のHC及び配列番号222のLC;
c.配列番号212のHC及び配列番号223のLC;
d.配列番号213のHC及び配列番号224のLC;又は
e.配列番号219のHC及び配列番号220のLC。
[78] 配列番号354と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC及び配列番号221と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるLCを含む、上記[1]~[76]のいずれかに記載の単離タンパク質。
[79] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;並びに/又は
c.配列番号210のHC及び配列番号221のLC。
[80] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;並びに/又は
c.配列番号354のHC及び配列番号221のLC。
[81] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;並びに/又は
c.配列番号211のHC及び配列番号222のLC。
[82] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;並びに/又は
c.配列番号212のHC及び配列番号223のLC。
[83] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;並びに/又は
c.配列番号213のHC及び配列番号224のLC。
[84] hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又は
b.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;並びに/又は
c.配列番号219のHC及び配列番号220のLC。
[85] キメラ抗原受容体(CAR)である、上記[79]~[84]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[86] CD3εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質である、上記[79]~[84]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[87] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[86]に記載の多重特異性タンパク質:
a.配列番号116の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCDR3、配列番号119の軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
[88] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号157のVLを含む、上記[86]又は[87]に記載の多重特異性タンパク質。
[89] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[86]又は[87]に記載の多重特異性タンパク質:
a.配列番号255の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258の軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3;又は
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
[90] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、上記[86]に記載の多重特異性タンパク質。
[91] 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含む、上記[86]又は[90]に記載の多重特異性タンパク質。
[92] キメラ抗原受容体(CAR)である、上記[1]~[32]のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
[93] 前記CARが、以下を含む、上記[92]に記載の単離タンパク質
a.上記[1]~[32]のいずれか一項に記載のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
b.膜貫通ドメインと、
c.少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイン。
[94] 前記CARが、CD8aヒンジ領域を更に含む、上記[92]又は[93]に記載の単離タンパク質。
[95] 以下である、上記[92]~[94]のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;
b.前記膜貫通ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;並びに/又は
c.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む。
[96] hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインを含む、単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[97] 前記リンパ球抗原が、T細胞抗原である、上記[96]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[98] 前記T細胞抗原が、CD8 + T細胞抗原である、上記[97]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[99] 前記リンパ球抗原が、NK細胞抗原である、上記[98]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[100] 前記リンパ球抗原が、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、又はNKG2Cである、上記[96]~[99]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[101] 前記リンパ球抗原が、CD3εである、上記[100]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[102] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、scFv、(scFv) 2 、Fv、Fab、F(ab’) 2 、Fd、dAb、又はVHHを含む、上記[96]~[100]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[103] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、Fabを含む、上記[102]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[104] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、VHHを含む、上記[102]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[105] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、scFVを含む、上記[102]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[106] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインがFabを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインがscFVを含む、上記[102]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[107] 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及びVL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、上記[105]又は[106]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[108] 前記L1が、以下を含む、上記[107]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、又は
d.約10~20個のアミノ酸。
[109] 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は108のアミノ酸配列を含む、上記[108]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[110] 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記[109]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[111] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、114、又は115に記載のhK2上のエピトープに特異的に結合する、上記[96]~[110]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[112] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111及び112に記載のhK2上のエピトープに特異的に結合する、上記[111]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[113] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、114、及び115からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含むhK2の不連続エピトープに特異的に結合する、上記[111]又は[112]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[114] 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、又は449に記載のCD3ε上のエピトープに特異的に結合する、上記[96]~[113]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[115] 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、及び449からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含むCD3ε上の不連続エピトープに特異的に結合する、上記[114]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[116] 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、及び449に記載のCD3ε上のエピトープに特異的に結合する、上記[115]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[117] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号63、72、141、147、170、176、188、194、196、198、200、206、又は216のHCDR1、配列番号64、65、73、142、148、171、177、189、195、197、199、201、207、又は217のHCDR2、配列番号66、143、172、178、184、190、208、又は218のHCDR3、配列番号67、68、144、173、179、182、185、又は191のLCDR1、配列番号69、70、145、174、180、186、192、又は470のLCDR2、及び配列番号71、146、175、181、187、193、又は209のLCDR3を含む、上記[96]~[116]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[118] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[117]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
l.それぞれ配列番号216、217、218、181、470、及び209。
[119] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[118]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[120] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[118]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質:
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。
[121] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含む、上記[117]~[119]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[122] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号75のVH及び配列番号74のVLを含む、上記[96]~[115]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[123] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号4、5、6、137、139、159、又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方を含むことはない、上記[122]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[124] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[123]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
[125] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、134、135、136、308、316、318、319、320、321、322、323、324、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を含む、上記[124]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[126] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号404又は405のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[124]に記載の単離タンパク質。
[127] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号255又は116のHCDR1、配列番号256又は117のHCDR2、配列番号257又は118のHCDR3、配列番号258又は119のLCDR1、配列番号259又は120のLCDR2、及び配列番号260、261、又は121のLCDR3を含む、上記[96]~[125]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[128] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、上記[126]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[129] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号157のVLを含む、上記[126]又は[127]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[130] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[128]又は[129]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3;
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。
[131] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含む、上記[129]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[132] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[96]~[126]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のHCDR3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。
[133] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号328、329、330、331、332、333、334、335、336、又は337のアミノ酸配列を含む、上記[132]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[134] 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[96]~[132]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[135] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、第1の免疫グロブリン(Ig)定常領域若しくは第1のIg定常領域の断片にコンジュゲートされる、及び/又は前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、第2の免疫グロブリン(Ig)定常領域若しくは第2のIg定常領域の断片にコンジュゲートされる、上記[96]~[134]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[136] 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片との間、及び前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインと前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片との間に、第2のリンカー(L2)を更に含む、上記[135]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[137] 前記L2が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は108のアミノ酸配列を含む、上記[136]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[138] 前記Ig定常領域の断片が、Fc領域を含む、上記[137]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[139] 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメインを含む、上記[138]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[140] 前記Ig定常領域の断片が、CH3ドメインを含む、上記[139]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[141] 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、上記[140]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[142] 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、上記[141]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[143] 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、上記[142]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[144] 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、IgG1、IgG2、及びIgG3、又はIgG4アイソタイプである、上記[138]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[145] 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片及び前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、IgG1である、上記[144]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[146] 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、前記多重特異性タンパク質のFcγRへの結合を低減する少なくとも1つの変異を含む、上記[145]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[147] 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記少なくとも1つの変異が、F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236欠失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及びS228P/F234A/L235A/G236欠失/G237A/P238Sからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[146]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[148] 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する変異が、L234A_L235A_D265Sである、上記[147]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[149] 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、前記多重特異性タンパク質のFcγ受容体(FcγR)への結合を増強する少なくとも1つの変異を含む、上記[144]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[150] 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を増強する前記少なくとも1つの変異が、S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、及びG236A/S239D/I332Eからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[149]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[151] 前記FcγRが、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、若しくはFcγRIII、又はこれらの任意の組み合わせである、上記[146]~[150]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[152] 前記第1のIg定常領域又は第1のIg定常領域の断片、及び第2のIg定常領域又は第2のIg定常領域の断片が、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも1つの変異を含む、上記[144]に記載の単離多重特異性タンパク質。
[153] 前記多重特異性タンパク質の前記半減期を調節する前記少なくとも1つの変異が、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[152]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[154] 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第1のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1つの変異及び/又は前記第2のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1つの変異を含む、上記[152]又は[153]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[155] 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第1のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける前記少なくとも1つの変異及び/又は前記第2のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1つの変異が、T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V、及びT350V/T366L/K392L/T394Wからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、上記[154]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[156] 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは第1のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける前記変異及び前記2のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける前記変異が、それぞれ、T350V_T366L_K392L_T394W又はT350V_L351Y_F405A_Y407Vである、上記[155]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[157] 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片及び前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、以下の変異を含む、上記[135]~[156]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V及び前記第2のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W;又は
b.前記第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W及び前記第2のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。
[158] 前記第1のIg定常領域が、配列番号110又は配列番号378を有する、上記[157]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[159] 前記第2のIg定常領域が、配列番号109及び配列番号158を有する、上記[157]又は[158]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[160] 前記第1のIg定常領域が、配列番号378と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含み、前記第2のIg定常領域が、配列番号109と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[135]~[157]のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[161] 前記単離タンパク質が、配列番号309と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を更に含む、上記[160]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[162] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2を含む。
[163] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2を含む。
[164] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2を含む。
[165] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2を含む。
[166] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2を含む。
[167] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1、配列番号221のLC1、及び配列番号360のHC2を含む。
[168] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号331のscFVと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC2を含む。
[169] 前記単離多重特異性タンパク質が、HC1及びHC2のC末端にリジン(例えば、K477)を含み、前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC1及び配列番号362のHC2と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC2を含む、上記[167]又は[168]に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。
[170] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列番号444のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号355のHC1、配列番号445のLC1、及び配列番号360のHC2を含む。
[171] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列番号165のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号356のHC1、配列番号222のLC1、及び配列番号360のHC2を含む。
[172] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2を含む。
[173] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号359のHC2、及び配列番号272のLC2を含む。
[174] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号151のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号358のHC2、及び配列番号267のLC2を含む。
[175] hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下である、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列番号163のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1、配列番号221のLC1、及び配列番号362のHC2を含む。
[176] 治療剤又は造影剤にコンジュゲートした上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
[177] 上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[178] 上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードしている、ポリヌクレオチド。
[179] ポリヌクレオチドであって、
a.上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、263、271、274、282、292、293、294、295、303、304、305、306、312、317、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[180] ポリヌクレオチドであって、
a.上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一である単離タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、446、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[181] 上記[179]又は[180]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[182] 上記[181]に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[183] 上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質を生成する方法であって、前記タンパク質が発現する条件で上記[182]に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記タンパク質を回収することと、を含む、方法。
[184] 治療剤又は造影剤にコンジュゲートした上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
[185] 上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[186] ポリヌクレオチドであって、
a.上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、263、271、274、282、292、293、294、295、303、304、305、306、312、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[187] ポリヌクレオチドであって、
a.上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一である単離タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、263、271、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、292、293、294、295、296、297、303、304、305、306、312、316、317、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、446、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[188] 上記[186]又は[187]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[189] 上記[188]に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[190] 上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質を生成する方法であって、前記多重特異性タンパク質が発現する条件で上記[189]に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記多重特異性タンパク質を回収することと、を含む、方法。
[191] 対象におけるhK2発現癌を治療する方法であって、治療有効量の上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質、上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質、上記[176]若しくは[184]に記載の免疫コンジュゲート、又は上記[177]若しくは[185]に記載の医薬組成物を、前記hK2発現癌を治療するのに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。
[192] 対象におけるhK2発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質、上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質、上記[176]若しくは184]に記載の免疫コンジュゲート、又は上記[177]若しくは[185]に記載の医薬組成物を、前記hK2発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。
[193] 対象におけるhK2発現癌の定着を予防する方法であって、上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質、上記[95]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質、上記[176]若しくは[184]に記載の免疫コンジュゲート、又は上記[177]若しくは[185]に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、前記対象における前記hK2発現癌の定着を予防することを含む、方法。
[194] hK2発現癌を発症するリスクを有する対象における非癌性状態を治療する方法であって、上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質、上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、上記[176]若しくは[184]に記載の免疫コンジュゲート、又は上記[177]若しくは[185]に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、前記非癌性状態を治療することを含む、方法。
[195] 前記hK2発現癌が、前立腺癌又は乳癌である、上記[191]~[194]のいずれか一項に記載の方法。
[196] 前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性の前立腺癌、又はこれらの任意の組み合わせである、上記[195]に記載の方法。
[197] 前記乳癌が、アンドロゲン受容体(AR)陽性乳癌、再発性、難治性、若しくは悪性の乳癌、又はこれらの任意の組み合わせである、上記[195]に記載の方法。
[198] 前記非癌性状態が、前立腺肥大、良性前立腺過形成(BPH)、又は診断された前立腺癌の非存在下において高い前立腺特異的抗原(PSA)レベルを有する状態である、上記[195]に記載の方法。
[199] 前記単離タンパク質又は前記単離多重特異性タンパク質が、第2の治療剤と組み合わせて投与される、上記[191]~[198]のいずれか一項に記載の方法。
[200] 前記第2の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン枯渇療法、若しくは放射線、又はこれらの任意の組み合わせである、上記[199]に記載の方法。
[201] 対象における前立腺癌又は乳癌の存在を検出する方法であって、上記[176]又は[184]に記載の免疫コンジュゲートを、前立腺癌又は乳癌を有する疑いがある対象に投与することと、前記免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによって前立腺癌又は乳癌の存在を検出することと、を含む、方法。
[202] 上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質、上記[96]~[175]のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質、上記[176]若しくは[184]に記載の免疫コンジュゲート、又は上記[177]若しくは[185]に記載の医薬組成物を含むキット。
[203] 上記[1]~[95]のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
[204] 以下を含む、キメラ抗原受容体(CAR):
a.hK2に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
b.膜貫通ドメインと、
c.少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイン。
[205] CD8aヒンジ領域を更に含む、上記[204]に記載のCAR。
[206] 以下である、上記[204]又は[205]に記載のCAR
a.前記膜貫通ドメインが、CD8a膜貫通領域(CD8A-TM)ポリペプチドを含み;
b.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9(CD137)成分を含む共刺激ドメイン及びT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3z)成分を含む一次シグナル伝達ドメインを含む。
[207] 以下である、上記[204]又は[206]に記載のCAR
a.前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;
b.前記膜貫通ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む;並びに/又は
c.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む。
[208] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号63、72、141、147、170、176、188、194、196、198、200、206、又は216のHCDR1、配列番号64、65、73、142、148、171、177、183、189、195、197、199、201、207、又は217のHCDR2、配列番号66、143、172、178、184、190、208、又は218のHCDR3、配列番号67、68、144、173、179、182、185、又は191のLCDR1、配列番号69、70、145、174、180、186、192、又は470のLCDR2、及び配列番号71、146、175、181、187、193、又は209のLCDR3を含む、上記[204]~[207]のいずれか一項に記載のCAR。
[209] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、上記[204]~[208]のいずれか一項に記載のCAR
a.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
b.それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71;
c.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
d.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
e.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
f.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
g.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
h.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
i.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、又は209;
j.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;
k.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;
l.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
m.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
n.それぞれ配列番号196、197、178、179、180、及び181;
o.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
p.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
q.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。
[210] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、上記[204]~[209]のいずれか一項に記載のCAR。
[211] 上記[204]~[209]のいずれか一項に記載のCARであって、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む;又は配列番号140のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号139のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、CAR。
[212] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[204]~[211]のいずれか一項に記載のCAR
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。
[213] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号75のVH及び配列番号74のVLを含む、上記[204]~[212]のいずれか一項に記載のCAR。
[214] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号138又は配列番号140のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVL及び配列番号137又は配列番号139のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む、上記[204]~[211]のいずれか一項に記載のCAR。
[215] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号1、2、3、140、若しくは160のVL及び/又は配列番号4、5、6、139、159、若しくは161のVHを含む、上記[213]に記載のCAR。
[216] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、上記[215]に記載のCAR:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。
[217] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、上記[204]~[216]のいずれか一項に記載のCAR。
[218] 前記scFvが、VLとVHとの間に第1のリンカー(L1)を含む、上記[217]に記載のCAR。
[219] 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記[218]に記載のCAR。
[220] 前記scFVが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、134、135、136、308、316、318、319、320、321、322、323、324、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を含む、上記[219]に記載のCAR。
[221] 前記scFVが、配列番号404又は配列番号405のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[219]に記載のCAR。
[222] 前記scFvが、配列番号133、配列番号134、配列番号135、又は配列番号136のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[219]に記載のCAR。
[223] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、シグナルポリペプチドを更に含む、上記[217]~[222]のいずれか一項に記載のCAR。
[224] 前記シグナルポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を含む、上記[223]に記載のCAR。
[225] 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9(CD137)成分、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3z)成分、表面抗原分類(CD27)成分、表面抗原分類スーパーファミリーメンバー成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む、上記[204]~[224]のいずれか一項に記載のCAR。
[226] 前記CD137成分が、配列番号27のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[225]のいずれか一項に記載のCAR。
[227] 前記CD3z成分が、配列番号28のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[226]のいずれか一項に記載のCAR。
[228] 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号45のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[227]のいずれか一項に記載のCAR。
[229] 前記CD8a-TMポリペプチドが、配列番号26のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[228]のいずれか一項に記載のCAR。
[230] 前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[229]のいずれか一項に記載のCAR。
[231] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、149、150、151、152、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、又は425のアミノ酸配列を含む、上記[223]~[230]のいずれか一項に記載のCAR。
[232] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号416又は配列番号417のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[223]~[230]のいずれかに記載のCAR。
[233] 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号149、配列番号150、配列番号151、又は配列番号152のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[223]~[230]のいずれかに記載のCAR。
[234] 配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、153、154、155、156、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、435、436、437、438、439、440、又は441のアミノ酸配列を含む、上記[204]~[233]のいずれか一項に記載のCAR。
[235] 配列番号432又は配列番号433のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[204]~[233]のいずれか一項に記載のCAR。
[236] 配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、上記[204]~[233]のいずれか一項に記載のCAR。
[237] 上記[204]~[236]のいずれか一項に記載のCARを発現する、単離リンパ球。
[238] 前記リンパ球が、Tリンパ球である、上記[237]に記載の単離リンパ球。
[239] 前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞である、上記[238]に記載の単離リンパ球。
[240] 上記[204]~[236]のいずれか一項に記載のCARをコードしている、単離ポリヌクレオチド。
[241] 上記[240]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[242] 上記[240]に記載のポリヌクレオチド又は上記[241]に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[243] 上記[237]~[239]のいずれか一項に記載のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
[244] hK2発現癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の上記[237]~[239]のいずれか一項に記載のリンパ球を、それを必要としている対象に投与し、それによって、前記リンパ球が、前記対象における前記hK2発現癌の殺傷を媒介することを含む、方法。
[245] 前記hK2発現癌が、前立腺癌又は乳癌である、上記[244]に記載の方法。
[246] 前記hK2発現癌が、前立腺癌である、上記[245]に記載の方法。
[247] 癌細胞の標的化殺傷の方法であって、前記癌細胞を、上記[244]~[246]のいずれか一項に記載のリンパ球と接触させ、それによって、前記リンパ球が前記癌細胞の標的化殺傷を誘導することを含む、方法。
[248] 前記癌細胞が、前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、上記[247]に記載の方法。
[249] 前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、上記[248]に記載の方法。
[250] 対象における癌の存在を検出する方法であって、
a.前記対象から得られた細胞サンプルを上記[204]~[236]のいずれか一項に記載のCARと接触させ、それによって、CAR-細胞複合体を形成することと、
b.前記CAR-細胞複合体を検出することと、ここで、前記CAR-細胞複合体の検出が、前記対象における前記癌の存在を示す、
を含む、方法。
Claims (250)
- カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離タ
ンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、114
、及び115からなる群から選択される配列を有するhK2上のエピトープに結合する、
単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、KVTEF(配列番号111)及びHYR
KW(配列番号112)の配列を有するエピトープ内のhK2に結合する、請求項1に記
載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、hK2への結合について参照抗体と競合し
、前記参照抗体が、以下を含む、請求項1に記載の単離タンパク質:
a.配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
b.配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
c.配列番号164のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号165のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
d.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号167のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
e.配列番号168のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号169のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
f.配列番号204のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号205のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3;又は
g.配列番号166のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、並びに配列番
号444のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、hK2への結合について参照抗体と競合し
、前記参照抗体が、配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3、
並びに配列番号163のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項
3に記載の単離タンパク質。 - 以下のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR
3を含む、請求項1~4に記載の単離タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、180、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
l.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。 - それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCDR1
、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項5
に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFv、(scFv)2、Fv、Fab
、F(ab’)2、Fd、dAb、又はVHHである、請求項1~6のいずれか一項に記
載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、Fabである、請求項7に記載の単離タン
パク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、VHHである、請求項7に記載の単離タン
パク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、請求項7に記載の単離タ
ンパク質。 - 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及び
VL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、請
求項10に記載の単離タンパク質。 - 前記L1が、以下を含む、請求項11に記載の単離タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、又は
d.約10~20個のアミノ酸。 - 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は1
08のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の単離タンパク質。 - 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の単離タンパク質。
- 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号137、162、164、166
、168、又は204のVH及び配列番号138、163、165、167、169、又
は205のVLを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項15に記載の単離タン
パク質:
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;又は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;又は
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;又は
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;又は
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;又は
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも80%
(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%
、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(例えば
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は1
00%)同一であるVLを含む、請求項15に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号133、134、308、316
、324、325、404、405、406、407、408、及び409からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の単離タンパク
質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号404又は405のアミノ酸配列
と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~17の
いずれか一項に記載の単離タンパク質。 - カリクレイン関連ペプチダーゼ2(hK2)に結合する抗原結合ドメインを含む単離タ
ンパク質であって、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号75の重鎖可変
領域(VH)及び配列番号74の軽鎖可変領域(VL)を含む、単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号4、5、6、139、159、又
は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含み、ただし、前
記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号5のVH及び配列番号2のVLの両方
を含むことはない、請求項20に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項21に記載の単離タン
パク質:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。 - 以下のHCDR1、HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR
3を含む、請求項20~22のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
b.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
c.それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71;
d.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;又は
e.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;又は
f.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFv、(scFv)2、Fv、Fab
、F(ab’)2、Fd、dAb、又はVHHである、請求項21に記載の単離タンパク
質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、Fabである、請求項24に記載の単離タ
ンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、VHHである、請求項24に記載の単離タ
ンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、請求項24に記載の単離
タンパク質。 - 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及び
VL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、請
求項27に記載の単離タンパク質。 - 前記L1が、以下を含む、請求項28に記載の単離タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、
d.又は約10~20個のアミノ酸。 - 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は1
08のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、135、136、3
18、319、320、321、322、又は323のアミノ酸配列を含む、請求項21
~30のいずれか一項に記載の単離タンパク質。 - 単一特異性タンパク質である、請求項1~31のいずれか一項に記載の単離タンパク質
。 - 多重特異性タンパク質である、請求項1~31のいずれか一項に記載の単離タンパク質
。 - 前記多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、請求項33に記載の単離
タンパク質。 - 前記多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、請求項33に記載の単離
タンパク質。 - リンパ球上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項34又は35に記載の多
重特異性タンパク質。 - 前記リンパ球が、T細胞である、請求項36に記載の多重特異性タンパク質。
- 前記T細胞が、CD8+T細胞である、請求項37に記載の多重特異性タンパク質。
- 前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項38に記載の多重特異
性タンパク質。 - 前記リンパ球上の抗原が、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L
4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD
-1、CD195、又はNKG2Cである、請求項36のいずれか一項に記載の多重特異
性タンパク質。 - 前記リンパ球上の抗原が、CD3εである、請求項40に記載の多重特異性タンパク質
。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項41に記載の多重特
異性タンパク質:
a.配列番号116の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号117のHCD
R2、配列番号118のHCDR3、配列番号119の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号15
7のVLを含む、請求項41に記載の多重特異性タンパク質。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項43に記載の多重特
異性タンパク質:
a.配列番号255の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号256のHCD
R2、配列番号257のHCDR3、配列番号258の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
61のLCDR3;又は
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1、配列番号
256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列
番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、請求項43に記載の
多重特異性タンパク質。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99
%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は
100%)同一であるVLを含む、請求項43又は45に記載の多重特異性タンパク質。 - 前記hK2に結合する結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR3、
LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項41~46のいずれか一項に記
載の多重特異性タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;
l.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209;
m.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
n.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
o.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;
p.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;
q.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
r.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
s.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
t.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
u.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
v.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;
w.配列番号166のVH及び配列番号444のVL;
x.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
y.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
z.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
aa.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;又は
bb.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。 - 前記hK2に結合する結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、172、1
73、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCD
R2、及びLCDR3を含む、請求項47に記載の多重特異性タンパク質。 - 前記CD3に結合する結合ドメインが、以下を含む、請求項41~48のいずれか一項
に記載の多重特異性タンパク質
a.配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のH
CDR3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号1
21のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
60のLCDR3;又は
c.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
61のLCDR3;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
i.配列番号248のVH及び配列番号254のVL;又は
j.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。 - 半減期延長部分にコンジュゲートしている、請求項1~49のいずれか一項に記載の単
離タンパク質。 - 前記半減期延長部分が、免疫グロブリン(Ig)、前記Igの断片、Ig定常領域、前
記Ig定常領域の断片、Fc領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメ
イン、又はポリエチレングリコールである、請求項50に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、Fc領域を含む、請求項51に記載の単離タンパク質。
- 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメインを含む、請求項52に記載の単離タンパク
質。 - 前記Ig定常領域の断片が、CH3ドメインを含む、請求項52に記載の単離タンパク
質。 - 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項52に
記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部、CH2ドメイン、及びCH3ド
メインを含む、請求項55に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、請
求項56に記載の単離タンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の
断片のN末端にコンジュゲートされる、請求項50~57のいずれか一項に記載の単離タ
ンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の
断片のC末端にコンジュゲートされる、請求項50~57のいずれか一項に記載の単離タ
ンパク質。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、第2のリンカー(L2)を介して前記Ig
定常領域又は前記Ig定常領域の断片にコンジュゲートされる、請求項50~57のいず
れか一項に記載の単離タンパク質。 - 前記L2が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は1
08のアミノ酸配列を含む、請求項60に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、IgG1、IgG2、IgG3、又
はIgG4アイソタイプである、請求項51~61のいずれか一項に記載の単離タンパク
質。 - 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、IgG1である、請求項62に記載
の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質のFcγ受容体(F
cγR)への結合を低減する少なくとも1つの変異を含む、請求項51~63のいずれか
一項に記載の単離タンパク質。 - 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記少なくとも1つの変異が、F2
34A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331
S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V2
34A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236欠失
/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A33
0S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L
234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S
、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及びS228P/F
234A/L235A/G236欠失/G237A/P238Sからなる群から選択され
、残基の付番がEUインデックスに従う、請求項64に記載の単離タンパク質。 - 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記変異が、L234A_L235
A_D265Sである、請求項65に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質の前記FcγRへの
結合を増強する少なくとも1つの変異を含む、請求項51~66に記載の単離タンパク質
。 - 前記タンパク質の前記FcγRへの結合を増強する前記少なくとも1つの変異が、S2
39D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/
Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292
P/Y300L/V305I/P396L、及びG236A/S239D/I332Eか
らなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、請求項67に記載の単離
タンパク質。 - 前記FcγRが、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、若しくはFcγRI
II、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項64~68のいずれか一項に記載の
単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域又は前記Ig定常領域の断片が、前記タンパク質の半減期を調節する
少なくとも1つの変異を含む、請求項51~63のいずれか一項に記載の単離タンパク質
。 - 前記タンパク質の半減期を調節する少なくとも1つの変異が、H435A、P257I
/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H43
3K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rからなる群から選択され、
残基の付番がEUインデックスに従う、請求項70に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域のCH3ドメインに少なくとも1つの変異を含む、請求項51~63
のいずれか一項に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域の前記CH3ドメインにおける前記少なくとも1つの変異が、T35
0V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T
394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V
、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F40
5A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T
366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A
/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V、及びT350V/T
366L/K392L/T394Wからなる群から選択され、残基の付番がEUインデッ
クスに従う、請求項72に記載の単離タンパク質。 - 前記Ig定常領域の前記CH3ドメインにおける前記変異が、T350V_T366L
_K392L_T394W又はT350V_L351Y_F405A_Y407Vである
、請求項73に記載の単離タンパク質。 - 前記IgG定常領域が、配列番号109、110、158、又は378を含む、請求項
73又は74に記載の単離タンパク質。 - 前記IgG定常領域が、配列番号109又は378を含む、請求項75に記載の単離タ
ンパク質。 - 以下を含む、請求項1~18又は50~76のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.配列番号210の重鎖(HC)及び配列番号221の軽鎖(LC);
b.配列番号211のHC及び配列番号222のLC;
c.配列番号212のHC及び配列番号223のLC;
d.配列番号213のHC及び配列番号224のLC;又は
e.配列番号219のHC及び配列番号220のLC。 - 配列番号354と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるHC及び配列番号22
1と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、少なくとも99%、又は100%)同一であるLCを含む、請求項1~76のいずれ
かに記載の単離タンパク質。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;並びに/又は
c.配列番号210のHC及び配列番号221のLC。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;並びに/又は
c.配列番号354のHC及び配列番号221のLC。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;並びに/又は
c.配列番号211のHC及び配列番号222のLC。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;並びに/又は
c.配列番号212のHC及び配列番号223のLC。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;並びに/又は
c.配列番号213のHC及び配列番号224のLC。 - hK2に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記抗原結合ドメ
インが、以下を含む、単離タンパク質:
a.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209のHCD
R1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;並びに/又
は
b.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;並びに/又は
c.配列番号219のHC及び配列番号220のLC。 - キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項79~84のいずれか一項に記載の単離タ
ンパク質。 - CD3εに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質である、請求項79
~84のいずれか一項に記載の単離タンパク質。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項86に記載の多重特
異性タンパク質:
a.配列番号116の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号117のHCD
R2、配列番号118のHCDR3、配列番号119の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号120のLCDR2、及び配列番号121のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号15
7のVLを含む、請求項86又は87に記載の多重特異性タンパク質。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項86又は87に記載
の多重特異性タンパク質:
a.配列番号255の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、配列番号256のHCD
R2、配列番号257のHCDR3、配列番号258の軽鎖相補性決定領域1(LCDR
1)、配列番号259のLCDR2、及び配列番号260のLCDR3;又は
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
61のLCDR3;又は
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;又は
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;又は
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;又は
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;又は
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1、配列番号
256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCDR1、配列
番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、請求項86に記載の
多重特異性タンパク質。 - 前記CD3εに結合する抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99
%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は
100%)同一であるVLを含む、請求項86又は90に記載の多重特異性タンパク質。 - キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項1~32のいずれか一項に記載の単離タン
パク質。 - 前記CARが、以下を含む、請求項92に記載の単離タンパク質
a.請求項1~32のいずれか一項に記載のhK2に結合する抗原結合ドメインを含む
細胞外ドメインと、
b.膜貫通ドメインと、
c.少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイン。 - 前記CARが、CD8aヒンジ領域を更に含む、請求項92又は93に記載の単離タン
パク質。 - 以下である、請求項92~94のいずれか一項に記載の単離タンパク質
a.前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%同一
であるアミノ酸配列を含む;
b.前記膜貫通ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であ
るアミノ酸配列を含む;並びに/又は
c.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも9
0%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号28のアミノ酸配列と
少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む。 - hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及びリンパ球抗原に結合する第2の抗原結合
ドメインを含む、単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原が、T細胞抗原である、請求項96に記載の単離抗hK2/抗CD3
タンパク質。 - 前記T細胞抗原が、CD8+T細胞抗原である、請求項97に記載の単離抗hK2/抗
CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原が、NK細胞抗原である、請求項98に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原が、CD3、CD3イプシロン(CD3ε)、CD8、KI2L4、
NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1
、CD195、又はNKG2Cである、請求項96~99のいずれか一項に記載の単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原が、CD3εである、請求項100に記載の単離抗hK2/抗CD3
タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する
第2の抗原結合ドメインが、scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab’)2
、Fd、dAb、又はVHHを含む、請求項96~100のいずれか一項に記載の単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する
第2の抗原結合ドメインが、Fabを含む、請求項102に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する
第2の抗原結合ドメインが、VHHを含む、請求項102に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメイン及び/又は前記リンパ球抗原に結合する
第2の抗原結合ドメインが、scFVを含む、請求項102に記載の単離抗hK2/抗C
D3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインがFabを含み、前記リンパ球抗原に結
合する第2の抗原結合ドメインがscFVを含む、請求項102に記載の単離抗hK2/
抗CD3タンパク質。 - 前記scFvが、N末端からC末端に向かって、VH、第1のリンカー(L1)、及び
VL(VH-L1-VL)、又はVL、L1、及びVH(VL-L1-VH)を含む、請
求項105又は106に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記L1が、以下を含む、請求項107に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.約5~50個のアミノ酸、
b.約5~40個のアミノ酸、
c.約10~30個のアミノ酸、又は
d.約10~20個のアミノ酸。 - 前記L1が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は1
08のアミノ酸配列を含む、請求項108に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項109に記載の単離抗hK2/
抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、
114、又は115に記載のhK2上のエピトープに特異的に結合する、請求項96~1
10のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111及び112に記載の
hK2上のエピトープに特異的に結合する、請求項111に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号111、112、113、
114、及び115からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含むhK2の不
連続エピトープに特異的に結合する、請求項111又は112に記載の単離抗hK2/抗
CD3タンパク質。 - 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、又は4
49に記載のCD3ε上のエピトープに特異的に結合する、請求項96~113のいずれ
か一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、及び4
49からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含むCD3ε上の不連続エピト
ープに特異的に結合する、請求項114に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記CD3εに結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号341、448、及び4
49に記載のCD3ε上のエピトープに特異的に結合する、請求項115に記載の単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号63、72、141、14
7、170、176、188、194、196、198、200、206、又は216の
HCDR1、配列番号64、65、73、142、148、171、177、189、1
95、197、199、201、207、又は217のHCDR2、配列番号66、14
3、172、178、184、190、208、又は218のHCDR3、配列番号67
、68、144、173、179、182、185、又は191のLCDR1、配列番号
69、70、145、174、180、186、192、又は470のLCDR2、及び
配列番号71、146、175、181、187、193、又は209のLCDR3を含
む、請求項96~116のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、H
CDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項117に記載の単離
抗hK2/抗CD3タンパク質
a.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
b.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
c.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
d.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
e.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
f.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、及び209;
g.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
h.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
i.それぞれ配列番号196、197、178、179、190、及び181;
j.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
k.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
l.それぞれ配列番号216、217、218、181、470、及び209。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、
172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項118に記載の単離抗hK2/抗CD3
タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項118に記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質:
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも
80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも
99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一であるVLを含む、請求項117~119のいずれか一項に記載の単
離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号75のVH及び配列番号7
4のVLを含む、請求項96~115のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タ
ンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号4、5、6、137、13
9、159、又は161のVH及び配列番号1、2、3、140、又は160のVLを含
み、ただし、前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号5のVH及び配列番号
2のVLの両方を含むことはない、請求項122に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパ
ク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項123に記載の
単離抗hK2/抗CD3タンパク質:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号161のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、133、13
4、135、136、308、316、318、319、320、321、322、32
3、324、325、404、405、406、407、408、又は409のアミノ酸
配列を含む、請求項124に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号404又は405のアミノ
酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項12
4に記載の単離タンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号255又は116の
HCDR1、配列番号256又は117のHCDR2、配列番号257又は118のHC
DR3、配列番号258又は119のLCDR1、配列番号259又は120のLCDR
2、及び配列番号260、261、又は121のLCDR3を含む、請求項96~125
のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号255のHCDR1
、配列番号256のHCDR2、配列番号257のHCDR3、配列番号258のLCD
R1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号261のLCDR3を含む、請求項1
26に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号248のVH及び配
列番号157のVLを含む、請求項126又は127に記載の単離抗hK2/抗CD3タ
ンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項128又
は129に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
60のLCDR3;
b.配列番号255のHCDR1、配列番号256のHCDR2、配列番号257のH
CDR3、配列番号258のLCDR1、配列番号259のLCDR2、及び配列番号2
61のLCDR3;
c.配列番号248のVH及び配列番号249のVL;
d.配列番号248のVH及び配列番号250のVL;
e.配列番号248のVH及び配列番号251のVL;
f.配列番号248のVH及び配列番号252のVL;
g.配列番号248のVH及び配列番号253のVL;又は
h.配列番号248のVH及び配列番号254のVL。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号248のVHと少な
くとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少な
くとも99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号251のVLと少なくとも8
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
9%、又は100%)同一であるVLを含む、請求項129に記載の単離抗hK2/抗C
D3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項96~1
26のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.配列番号116のHCDR1、配列番号117のHCDR2、配列番号118のH
CDR3、配列番号119のLCDR1、配列番号120のLCDR2、及び配列番号1
21のLCDR3;又は
b.配列番号122のVH及び配列番号123のVL。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号328、329、3
30、331、332、333、334、335、336、又は337のアミノ酸配列を
含む、請求項132に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列番号331のアミノ酸配
列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項96~1
32に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、第1の免疫グロブリン(Ig)定常
領域若しくは第1のIg定常領域の断片にコンジュゲートされる、及び/又は前記リンパ
球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、第2の免疫グロブリン(Ig)定常領域若
しくは第2のIg定常領域の断片にコンジュゲートされる、請求項96~134のいずれ
か一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインと前記第1のIg定常領域又は前記第1
のIg定常領域の断片との間、及び前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメイン
と前記第2のIg定常領域又は前記第2のIg定常領域の断片との間に、第2のリンカー
(L2)を更に含む、請求項135に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記L2が、配列番号7、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、9
8、99、100、101、102、103、104、105、106、107、又は1
08のアミノ酸配列を含む、請求項136に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、Fc領域を含む、請求項137に記載の単離抗hK2/抗
CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメインを含む、請求項138に記載の単離抗hK
2/抗CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、CH3ドメインを含む、請求項139に記載の単離抗hK
2/抗CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項140
に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部、CH2ドメイン、及びCH3ド
メインを含む、請求項141に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記Ig定常領域の断片が、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを含む、請
求項142に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常
領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、IgG1、IgG2、及びIgG3、又はI
gG4アイソタイプである、請求項138に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片及び前記第2のIg定常領
域又は前記第2のIg定常領域の断片が、IgG1である、請求項144に記載の単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常
領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、前記多重特異性タンパク質のFcγRへの結
合を低減する少なくとも1つの変異を含む、請求項145に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する前記少なくとも1つの変
異が、F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D
265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S
/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N29
7A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G
236欠失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309
L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D2
65A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/
P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及びS2
28P/F234A/L235A/G236欠失/G237A/P238Sからなる群か
ら選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、請求項146に記載の単離抗hK2
/抗CD3タンパク質。 - 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を低減する変異が、L234A_L
235A_D265Sである、請求項147に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
。 - 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片、及び前記第2のIg定常
領域又は前記第2のIg定常領域の断片が、前記多重特異性タンパク質のFcγ受容体(
FcγR)への結合を増強する少なくとも1つの変異を含む、請求項144に記載の単離
抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記多重特異性タンパク質の前記FcγRへの結合を増強する前記少なくとも1つの変
異が、S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R
292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L
/R292P/Y300L/V305I/P396L、及びG236A/S239D/I
332Eからなる群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、請求項149
に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記FcγRが、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、若しくはFcγRI
II、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項146~150のいずれか一項に記
載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域又は第1のIg定常領域の断片、及び第2のIg定常領域又は
第2のIg定常領域の断片が、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも1つ
の変異を含む、請求項144に記載の単離多重特異性タンパク質。 - 前記多重特異性タンパク質の前記半減期を調節する前記少なくとも1つの変異が、H4
35A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/
T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rからな
る群から選択され、残基の付番がEUインデックスに従う、請求項152に記載の単離抗
hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第1のIg定常領域の断片のC
H3ドメインにおける少なくとも1つの変異及び/又は前記第2のIg定常領域のCH3
ドメイン若しくは前記第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくとも1
つの変異を含む、請求項152又は153のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD
3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは前記第1のIg定常領域の断片のC
H3ドメインにおける前記少なくとも1つの変異及び/又は前記第2のIg定常領域のC
H3ドメイン若しくは前記第2のIg定常領域の断片のCH3ドメインにおける少なくと
も1つの変異が、T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T3
66W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/
L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392
M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L3
51Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/
K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407
V、及びT350V/T366L/K392L/T394Wからなる群から選択され、残
基の付番がEUインデックスに従う、請求項154に記載の単離抗hK2/抗CD3タン
パク質。 - 前記第1のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは第1のIg定常領域の断片のCH3
ドメインにおける前記変異及び前記2のIg定常領域のCH3ドメイン若しくは第2のI
g定常領域の断片のCH3ドメインにおける前記変異が、それぞれ、T350V_T36
6L_K392L_T394W又はT350V_L351Y_F405A_Y407Vで
ある、請求項155に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域又は前記第1のIg定常領域の断片及び前記第2のIg定常領
域又は前記第2のIg定常領域の断片が、以下の変異を含む、請求項135~156のい
ずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350
V_L351Y_F405A_Y407V及び前記第2のIg定常領域におけるL234
A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W;又は
b.前記第1のIg定常領域におけるL234A_L235A_D265S_T350
V_T366L_K392L_T394W及び前記第2のIg定常領域におけるL234
A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V。 - 前記第1のIg定常領域が、配列番号110又は配列番号378を有する、請求項15
7に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第2のIg定常領域が、配列番号109及び配列番号158を有する、請求項15
7又は158のいずれか一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記第1のIg定常領域が、配列番号378と少なくとも80%(例えば、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一
であるアミノ酸配列を含み、前記第2のIg定常領域が、配列番号109と少なくとも8
0%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも9
9%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項135~157のいずれか
一項に記載の単離抗hK2/抗CD3タンパク質。 - 前記単離タンパク質が、配列番号309と少なくとも80%(例えば、少なくとも85
%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であ
るアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を更に含む、請求項160に記載の単離抗hK2/抗
CD3タンパク質。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66
、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配
列番号255、256、275、258、259、及び261のHCDR1、HCDR2
、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号
251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号358のH
C2、及び配列番号267のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号63、65、66
、67、69、及び71のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR
2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、それぞれ配
列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、HCDR2
、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号136のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号
123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号351のHC1、配列番号359のH
C2、及び配列番号272のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、
143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号
251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号358のH
C2、及び配列番号267のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号141、142、
143、144、145、及び146のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号134のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号
123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号352のHC1、配列番号359のH
C2、及び配列番号272のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、
190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号
251のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号358のH
C2、及び配列番号267のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、
172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列
番号163のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列
番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.当該単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1、配列番号221のL
C1、及び配列番号360のHC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、
172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号162のVHと少なくとも
80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも
99%、又は100%)同一であるVH及び配列番号163のVLと少なくとも80%(
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一であるVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメイン
が、配列番号331のscFVと少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なく
とも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるscFV
を含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号354のHC1と少なくとも80%(
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一であるHC1、配列番号221のLC1と少なくとも80%(例えば
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は1
00%)同一であるLC1、及び配列番号360のHC2と少なくとも80%(例えば、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は10
0%)同一であるHC2を含む。 - 前記単離多重特異性タンパク質が、HC1及びHC2のC末端にリジン(例えば、K4
77)を含み、前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1と少なくとも
80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも
99%、又は100%)同一であるHC1及び配列番号362のHC2と少なくとも80
%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99
%、又は100%)同一であるHC2を含む、請求項167又は168に記載の単離抗h
K2/抗CD3タンパク質。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、183、
184、185、186、及び187のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号166のVH及び配列
番号444のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列
番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号355のHC1、配列番号445のL
C1、及び配列番号360のHC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号176、177、
178、179、180、及び181のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号164のVH及び配列
番号165のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列
番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号356のHC1、配列番号222のL
C1、及び配列番号360のHC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号188、189、
190、191、192、及び193のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号325のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号
123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号353のHC1、配列番号359のH
C2、及び配列番号272のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、
208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号116、117、118、119、120、及び121のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号122のVH及び配列番号
123のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号359のH
C2、及び配列番号272のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号206、207、
208、182、470、209のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、
LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが、そ
れぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1、H
CDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、配列番号316のscFVを含み、
前記リンパ球抗原に結合する第2の結合ドメインが、配列番号248のVH及び配列番号
151のVLを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号357のHC1、配列番号358のH
C2、及び配列番号267のLC2を含む。 - hK2に結合する第1のドメイン及びCD3に結合する第2のドメインを含み、以下で
ある、単離抗hK2/抗CD3タンパク質
a.前記hK2に結合する第1の結合ドメインが、それぞれ配列番号170、171、
172、173、174、及び175のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR
1、LCDR2、及びLCDR3を含み、前記リンパ球抗原に結合する第2のドメインが
、それぞれ配列番号255、256、257、258、259、及び261のHCDR1
、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む;
b.前記hK2に結合する第1の抗原結合ドメインが、配列番号162のVH及び配列
番号163のVLを含み、前記リンパ球抗原に結合する第2の抗原結合ドメインが、配列
番号331のscFVを含む;並びに/又は
c.前記単離多重特異性タンパク質が、配列番号361のHC1、配列番号221のL
C1、及び配列番号362のHC2を含む。 - 治療剤又は造影剤にコンジュゲートした請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タ
ンパク質を含む、免疫コンジュゲート。 - 請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。 - 請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードしている、ポリヌクレ
オチド。 - ポリヌクレオチドであって、
a.請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードしている;及び/
又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、2
33、234、235、236、237、238、239、240、241、242、2
43、244、245、246、247、263、271、274、282、292、2
93、294、295、303、304、305、306、312、317、363、3
64、365、366、367、368、369、370、371、372、373、3
74、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。 - ポリヌクレオチドであって、
a.請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも80%(例え
ば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は
100%)同一である単離タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、2
33、234、235、236、237、238、239、240、241、242、2
43、244、245、246、247、263、271、273、274、275、2
76、277、278、279、280、281、282、283、292、293、2
94、295、296、297、303、304、305、306、312、316、3
17、363、364、365、366、367、368、369、370、371、3
72、373、374、446、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列と少な
くとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少な
くとも99%、又は100%)同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチ
ド。 - 請求項179又は180に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項181に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質を生成する方法であって、前記
タンパク質が発現する条件で請求項182に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主
細胞によって生成された前記タンパク質を回収することと、を含む、方法。 - 治療剤又は造影剤にコンジュゲートした請求項96~175のいずれか一項に記載の単
離二重特異性タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。 - 請求項96~175のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質と、医薬的に許
容される担体とを含む、医薬組成物。 - ポリヌクレオチドであって、
a.請求項96~175のいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質をコードしてい
る;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、2
33、234、235、236、237、238、239、240、241、242、2
43、244、245、246、247、263、271、274、282、292、2
93、294、295、303、304、305、306、312、316、317、3
63、364、365、366、367、368、369、370、371、372、3
73、374、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチ
ド。 - ポリヌクレオチドであって、
a.請求項96~175のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも80%(
例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、
又は100%)同一である単離タンパク質をコードしている;及び/又は
b.配列番号225、226、227、228、229、230、231、232、2
33、234、235、236、237、238、239、240、241、242、2
43、244、245、246、247、263、271、273、274、275、2
76、277、278、279、280、281、282、283、292、293、2
94、295、296、297、303、304、305、306、312、316、3
17、363、364、365、366、367、368、369、370、371、3
72、373、374、446、450、若しくは451のポリヌクレオチド配列と少な
くとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少な
くとも99%、又は100%)同一であるポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチ
ド。 - 請求項186又は187に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項188に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項96~175のいずれか一項に記載の単離二重特異性タンパク質を生成する方法
であって、前記多重特異性タンパク質が発現する条件で請求項189に記載の宿主細胞を
培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記多重特異性タンパク質を回収する
ことと、を含む、方法。 - 対象におけるhK2発現癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項1~95のい
ずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項96~175のいずれか一項に記載の単離二
重特異性タンパク質、請求項176若しくは184に記載の免疫コンジュゲート、又は請
求項177若しくは185に記載の医薬組成物を、前記hK2発現癌を治療するのに十分
な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。 - 対象におけるhK2発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、請求項1~95のいず
れか一項に記載の単離タンパク質、請求項96~175のいずれか一項に記載の単離二重
特異性タンパク質、請求項176若しくは184に記載の免疫コンジュゲート、又は請求
項177若しくは185に記載の医薬組成物を、前記hK2発現腫瘍細胞の量を低減する
のに十分な時間にわたって、前記対象に投与することを含む、方法。 - 対象におけるhK2発現癌の定着を予防する方法であって、請求項1~95のいずれか
一項に記載の単離タンパク質、請求項95~175のいずれか一項に記載の単離二重特異
性タンパク質、請求項176若しくは184に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項1
77若しくは185に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、前記対象における前記h
K2発現癌の定着を予防することを含む、方法。 - hK2発現癌を発症するリスクを有する対象における非癌性状態を治療する方法であっ
て、請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項96~175のいず
れか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、請求項176若しくは184に記載の免疫
コンジュゲート、又は請求項177若しくは185に記載の医薬組成物を前記対象に投与
して、前記非癌性状態を治療することを含む、方法。 - 前記hK2発現癌が、前立腺癌又は乳癌である、請求項191~194のいずれか一項
に記載の方法。 - 前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性の前立腺癌、又はこれら
の任意の組み合わせである、請求項195に記載の方法。 - 前記乳癌が、アンドロゲン受容体(AR)陽性乳癌、再発性、難治性、若しくは悪性の
乳癌、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項195に記載の方法。 - 前記非癌性状態が、前立腺肥大、良性前立腺過形成(BPH)、又は診断された前立腺
癌の非存在下において高い前立腺特異的抗原(PSA)レベルを有する状態である、請求
項195に記載の方法。 - 前記単離タンパク質又は前記単離多重特異性タンパク質が、第2の治療剤と組み合わせ
て投与される、請求項191~198のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン枯渇療法、若しくは放射線、又は
これらの任意の組み合わせである、請求項199に記載の方法。 - 対象における前立腺癌又は乳癌の存在を検出する方法であって、請求項176又は18
4に記載の免疫コンジュゲートを、前立腺癌又は乳癌を有する疑いがある対象に投与する
ことと、前記免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによって
前立腺癌又は乳癌の存在を検出することと、を含む、方法。 - 請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項96~175のいずれ
か一項に記載の単離二重特異性タンパク質、請求項176若しくは184に記載の免疫コ
ンジュゲート、又は請求項177若しくは185に記載の医薬組成物を含むキット。 - 請求項1~95のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ
抗体。 - 以下を含む、キメラ抗原受容体(CAR):
a.hK2に結合する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
b.膜貫通ドメインと、
c.少なくとも1つの共刺激ドメインを任意選択で含む細胞内シグナル伝達ドメイン。 - CD8aヒンジ領域を更に含む、請求項204に記載のCAR。
- 以下である、請求項204又は205に記載のCAR
a.前記膜貫通ドメインが、CD8a膜貫通領域(CD8A-TM)ポリペプチドを含
み;
b.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9
(CD137)成分を含む共刺激ドメイン及びT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(
CD3z)成分を含む一次シグナル伝達ドメインを含む。 - 以下である、請求項204又は206に記載のCAR
a.前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%同一
であるアミノ酸配列を含む;
b.前記膜貫通ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であ
るアミノ酸配列を含む;並びに/又は
c.前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも9
0%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号28のアミノ酸配列と
少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号63、72、141、147、1
70、176、188、194、196、198、200、206、又は216のHCD
R1、配列番号64、65、73、142、148、171、177、183、189、
195、197、199、201、207、又は217のHCDR2、配列番号66、1
43、172、178、184、190、208、又は218のHCDR3、配列番号6
7、68、144、173、179、182、185、又は191のLCDR1、配列番
号69、70、145、174、180、186、192、又は470のLCDR2、及
び配列番号71、146、175、181、187、193、又は209のLCDR3を
含む、請求項204~207のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下のHCDR1、HCDR2、HCDR
3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項204~208のいずれか
一項に記載のCAR
a.それぞれ配列番号63、64、66、67、69、及び71;
b.それぞれ配列番号63、65、66、67、69、及び71;
c.それぞれ配列番号63、65、66、68、70、及び71;
d.それぞれ配列番号141、142、143、144、145、及び146;
e.それぞれ配列番号170、171、172、173、174、及び175;
f.それぞれ配列番号176、177、178、179、180、及び181;
g.それぞれ配列番号170、183、184、185、186、及び187;
h.それぞれ配列番号188、189、190、191、192、及び193;
i.それぞれ配列番号206、207、208、182、470、又は209;
j.それぞれ配列番号72、73、66、67、69、及び71;
k.それぞれ配列番号72、73、66、68、70、及び71;
l.それぞれ配列番号147、148、143、144、145、及び146;
m.それぞれ配列番号194、195、172、173、174、及び175;
n.それぞれ配列番号196、197、178、179、180、及び181;
o.それぞれ配列番号198、199、184、185、186、及び187;
p.それぞれ配列番号200、201、190、191、192、及び193;又は
q.それぞれ配列番号216、217、218、182、470、及び209。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号163のVLのLCDR1、LC
DR2、及びLCDR3、並びに配列番号162のVHのHCDR1、HCDR2、及び
HCDR3を含む、請求項204~209のいずれか一項に記載のCAR。 - 請求項204~209のいずれか一項に記載のCARであって、前記hK2に結合する
抗原結合ドメインが、配列番号138のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3
、並びに配列番号137のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む;又は
配列番号140のVLのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びに配列番号13
9のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、CAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項204~211のいず
れか一項に記載のCAR
a.配列番号137のVH及び配列番号138のVL;
b.配列番号162のVH及び配列番号163のVL;
c.配列番号164のVH及び配列番号165のVL;
d.配列番号166のVH及び配列番号167のVL;
e.配列番号168のVH及び配列番号169のVL;
f.配列番号204のVH及び配列番号205のVL;又は
g.配列番号166のVH及び配列番号444のVL。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号75のVH及び配列番号74のV
Lを含む、請求項204~212のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号138又は配列番号140のアミ
ノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくと
も95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVL及び配
列番号137又は配列番号139のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくと
も85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同
一であるアミノ酸配列を含むVHを含む、請求項204~211のいずれか一項に記載の
CAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、配列番号1、2、3、140、若しくは1
60のVL及び/又は配列番号4、5、6、139、159、若しくは161のVHを含
む、請求項213に記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、以下を含む、請求項215に記載のCAR
:
a.配列番号4のVH及び配列番号1のVL;
b.配列番号4のVH及び配列番号2のVL;
c.配列番号4のVH及び配列番号3のVL;
d.配列番号4のVH及び配列番号140のVL;
e.配列番号4のVH及び配列番号160のVL;
f.配列番号5のVH及び配列番号1のVL;
g.配列番号5のVH及び配列番号3のVL;
h.配列番号5のVH及び配列番号140のVL;
i.配列番号5のVH及び配列番号160のVL;
j.配列番号6のVH及び配列番号1のVL;
k.配列番号6のVH及び配列番号2のVL;
l.配列番号6のVH及び配列番号3のVL;
m.配列番号6のVH及び配列番号140のVL;
n.配列番号6のVH及び配列番号160のVL;
o.配列番号139のVH及び配列番号1のVL;
p.配列番号139のVH及び配列番号2のVL;
q.配列番号139のVH及び配列番号3のVL;
r.配列番号139のVH及び配列番号140のVL;
s.配列番号139のVH及び配列番号160のVL;
t.配列番号159のVH及び配列番号1のVL;
u.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
v.配列番号159のVH及び配列番号3のVL;
w.配列番号159のVH及び配列番号140のVL;
x.配列番号159のVH及び配列番号160のVL;
y.配列番号161のVH及び配列番号1のVL;
z.配列番号159のVH及び配列番号2のVL;
aa.配列番号161のVH及び配列番号3のVL;
bb.配列番号161のVH及び配列番号140のVL;又は
cc.配列番号161のVH及び配列番号160のVL。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインが、scFVである、請求項204~216の
いずれか一項に記載のCAR。 - 前記scFvが、VLとVHとの間に第1のリンカー(L1)を含む、請求項217に
記載のCAR。 - 前記L1が、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項218に記載のCAR。
- 前記scFVが、配列番号8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、21、22、23、133、134、135、136、308、3
16、318、319、320、321、322、323、324、325、404、4
05、406、407、408、又は409のアミノ酸配列を含む、請求項219に記載
のCAR。 - 前記scFVが、配列番号404又は配列番号405のアミノ酸配列と少なくとも80
%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99
%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項219に記載のCAR。 - 前記scFvが、配列番号133、配列番号134、配列番号135、又は配列番号1
36のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む
、請求項219に記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、シグナルポリペ
プチドを更に含む、請求項217~222のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記シグナルポリペプチドが、配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項223に記
載のCAR。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9(C
D137)成分、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3z)成分、表面抗原分
類(CD27)成分、表面抗原分類スーパーファミリーメンバー成分、及びこれらの組み
合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む、請求項204~224のいず
れか一項に記載のCAR。 - 前記CD137成分が、配列番号27のアミノ酸配列を含む、請求項204~225の
いずれか一項に記載のCAR。 - 前記CD3z成分が、配列番号28のアミノ酸配列を含む、請求項204~226のい
ずれか一項に記載のCAR。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号45のアミノ酸配列を含む、請求項20
4~227のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記CD8a-TMポリペプチドが、配列番号26のアミノ酸配列を含む、請求項20
4~228のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記CD8aヒンジ領域が、配列番号25のアミノ酸配列を含む、請求項204~22
9のいずれか一項に記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、4
3、44、149、150、151、152、410、411、412、413、414
、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424
、又は425のアミノ酸配列を含む、請求項223~230のいずれか一項に記載のCA
R。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号416
又は配列番号417のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少
なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミ
ノ酸配列を含む、請求項223~230のいずれかに記載のCAR。 - 前記hK2に結合する抗原結合ドメインを含む前記細胞外ドメインが、配列番号149
、配列番号150、配列番号151、又は配列番号152のアミノ酸配列と少なくとも8
0%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも9
9%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項223~230のいずれか
に記載のCAR。 - 配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57
、58、59、60、61、153、154、155、156、426、427、428
、429、430、431、432、433、434、435、435、436、437
、438、439、440、又は441のアミノ酸配列を含む、請求項204~233の
いずれか一項に記載のCAR。 - 配列番号432又は配列番号433のアミノ酸配列と少なくとも80%(例えば、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%
)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項204~233のいずれか一項に記載のCAR
。 - 配列番号153、配列番号154、配列番号155、又は配列番号156のアミノ酸配
列と少なくとも80%(例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98
%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を含む、請求項204~
233のいずれか一項に記載のCAR。 - 請求項204~236のいずれか一項に記載のCARを発現する、単離リンパ球。
- 前記リンパ球が、Tリンパ球である、請求項237に記載の単離リンパ球。
- 前記リンパ球が、ナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項238に記載の単離リ
ンパ球。 - 請求項204~236のいずれか一項に記載のCARをコードしている、単離ポリヌク
レオチド。 - 請求項240に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項240に記載のポリヌクレオチド又は請求項241に記載のベクターを含む、宿
主細胞。 - 請求項237~239のいずれか一項に記載のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤
とを含む、医薬組成物。 - hK2発現癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項237~23
9のいずれか一項に記載のリンパ球を、それを必要としている対象に投与し、それによっ
て、前記リンパ球が、前記対象における前記hK2発現癌の殺傷を媒介することを含む、
方法。 - 前記hK2発現癌が、前立腺癌又は乳癌である、請求項244に記載の方法。
- 前記hK2発現癌が、前立腺癌である、請求項245に記載の方法。
- 癌細胞の標的化殺傷の方法であって、前記癌細胞を、請求項244~246のいずれか
一項に記載のリンパ球と接触させ、それによって、前記リンパ球が前記癌細胞の標的化殺
傷を誘導することを含む、方法。 - 前記癌細胞が、前立腺癌細胞又は乳癌細胞である、請求項247に記載の方法。
- 前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項248に記載の方法。
- 対象における癌の存在を検出する方法であって、
a.前記対象から得られた細胞サンプルを請求項204~236のいずれか一項に記載
のCARと接触させ、それによって、CAR-細胞複合体を形成することと、
b.前記CAR-細胞複合体を検出することと、ここで、前記CAR-細胞複合体の検
出が、前記対象における前記癌の存在を示す、
を含む、方法。
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