TW201809005A - 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途 - Google Patents

抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供特異性結合至GPRC5D的抗體。亦描述能夠編碼所提供之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體或抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標示之抗體或抗原結合片段。此外，描述使用所提供抗體之方法。舉例而言，所提供之抗體可用來診斷、治療、或監測GPRC5D表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或者用來判定對象是否罹患GPRC5D表現性癌症，並因而可適合用GPRC5D特異性抗癌症治療劑諸如本文中所述之針對GPRC5D及CD3的多特異性抗體來進行治療。

Description

抗GPRC5D抗體、結合GPRC5D與CD3之雙特異性抗原結合分子及其用途 【相關申請案之交互參照】
本申請案主張2016年7月20日申請之美國臨時專利申請案序號62/364,811之優先權。前述申請案之完整內容全文以引用方式併入本文中。
本文所提供之揭露係關於特異性結合G蛋白偶聯受體C類5組成員D(GPRC5D)的單株抗體、特異性結合GPRC5D與決定簇3(cluster determinant 3,CD3)的多特異性抗體、及生產和使用所述抗體的方法。
多發性骨髓瘤(MM)係第二常見的血液惡性疾病(hematological malignancy)，且構成所有癌症死亡的2%。MM係一種異質性疾病且大部分由染色體易位所引起，尤其是t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(Drach等人，(1998)Blood 92(3)：802-809；Gertz等人，(2005)Blood 106(8)：2837-2840；Facon等人，(2001)Blood 97(6)：1566-1571)。受MM影響的病患可能經歷各種起因於骨髓浸潤、骨破壞、腎衰竭、免疫不全、及癌症診斷之心理負擔的疾病相關症狀。截至2006年，MM的5年相對存活率約為 34%，這突顯MM係一種難以治療的疾病，而其目前還沒有治癒選項。
G蛋白偶聯受體C類5組成員D(GPRC5D)係孤兒、非典型的C類GPCR，其在2001年首次被識別(Bräuner-Osborne等人，Biochim Biophys Acta.1518(3)：237-248,2001)。GPRC5D及其他5組GPCR對C受體而言具有異常短的胺端區，且因此預期其與A類受體構形類似。就此而言，彼等係獨特的，並與C類GPCR具有序列同源性且具有與A類受體相當的預測結構拓撲。尚未描述GPRC5D活化之功能性後果且配體仍然未知。基因具有三個外顯子且係位於人類染色體12p13.3上。GPRC5D受體在各種物種之間係高度保留並與食蟹獼猴(cynomolgus monkey)GPRC5D共有92%同一性。
GPRC5D mRNA主要表現在來自MM病患的所有惡性漿細胞中(Atamaniuk JA等人，Eur J Clin Invest 42(9)953-960；2012；Frigyesi-blood及Cohen等人，Hematology 18(6)：348-35；2013)。GPRC5D表現在病患之間係可變的，並與漿細胞負荷和諸如Rb-1缺失的基因畸變充分相關(Atamaniuk JA等人，Eur J Clin Invest 42(9)953-960；2012)。
此GPRC5D在漿細胞譜系上的獨有表現將其指定為抗骨髓瘤抗體的理想目標。
本文提供特異性結合至GPRC5D之抗體及其抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體及抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體和經可偵測標示之抗體及抗原結合片段。此外，描述使用所提供抗體及抗原結合片段之方法。舉例而言，該等GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段可用來診斷或監測GPRC5D表現性癌症(GPRC5D-expressing cancer)之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或者用來判定對象是否罹患GPRC5D表現性 癌症，並因而可適合用GPRC5D特異性抗癌症治療劑諸如本文中所述之針對GPRC5D及CD3的多特異性抗體來進行治療。
本文進一步提供免疫特異性結合至GPRC5D及CD3之多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之GPRC5D x CD3多特異性抗體的相關多核苷酸、表現所提供之抗體的細胞、以及相關聯之載體和經可偵測標示之多特異性抗體。此外，描述使用所提供多特異性抗體之方法。舉例而言，該等GPRC5D x CD3多特異性抗體可用來診斷或監測GPRC5D表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或者用來判定對象是否罹患GPRC5D表現性癌症，並因而可適合用GPRC5D特異性抗癌症治療劑諸如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體來進行治療。
GPRC5D特異性抗體
本文中描述對於GPRC5D具有特異性之單離抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段結合人類GPRC5D。在一些實施例中，該等GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段結合人類GPRC5D及食蟹獼猴(cynomolgus monkey)GPRC5D。在一些實施例中，該等GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段結合至具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的多肽之一或多個殘基。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段在活體外可以28nM或更小之EC50誘導ADCC。
表1提供本文中所述之一些GPRC5D特異性抗體實例的概要：
在一些實施例中提供一種GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供一種GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在本文所述之一些實施例中，該GPRC5D特異性抗體或其抗原結合片段與包含重鏈及輕鏈之抗體或抗原結合片段競爭對於GPRC5D之結合，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。
IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。彼等的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞(諸如自然殺手細胞或巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcgR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。本文中所述之抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應功能之經修飾版本。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcgR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa及FcgRIIIb)和抑 制性(FcgRIIb)FcgR或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於Fcg RI、Fcg RIIa、Fcg RIIb、Fcg RIIIb及/或Fcg RIIIa之親和力降低、(c)對於FcgRI之親和力降低、(d)對於FcgRIIa之親和力降低、(e)對於FcgRIIb之親和力降低、(f)對於Fcg RIIIb之親和力降低、或(g)對於FcgRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有L234A、L235A、及/或K409R取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，該抗體之Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
除了所述之GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段外，亦提供能夠編碼所述抗體及抗原結合片段之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。
使用GPRC5D特異性抗體之方法
亦揭示使用所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之方法。此節中討論之方法所使用的特定抗體包括具有如表1所述之抗體的CDR組之抗體。舉例而言，此等抗體或抗原結合片段可用於治療癌症，其係藉由干擾GPRC5D-受體交互作用，或者其中該抗體係與毒素共軛，從而使該毒素靶向GPRC5D表現性癌症。此外，此等抗 體或抗原結合片段可用於偵測生物樣本(諸如血液或血清)中之GPRC5D的存在；用於定量生物樣本(諸如血液或血清)中之GPRC5D的量；用於診斷GPRC5D表現性癌症；決定治療罹患癌症之對象的方法；或者監測對象中之GPRC5D表現性癌症的進展。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症可為淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)。所述方法可在該對象接受GPRC5D表現性癌症之治療前進行，諸如用針對GPRC5D及CD3之多特異性抗體治療。另外，所述方法可在該對象接受GPRC5D表現性癌症之治療後進行，諸如用本文中所述之針對GPRC5D及CD3之多特異性抗體治療。
所述之偵測生物樣本中之GPRC5D的方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之一或多者。
所述之診斷對象中之GPRC5D表現性癌症的方法亦涉及使該生物樣本暴露於本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；然而，該等方法亦包括定量存在於該樣本中之GPRC5D的量；將存在於該樣本中之GPRC5D的量與已知標準品或參考樣本比較；以及判定該對象之GPRC5D水準是否落入與癌症相關聯之GPRC5D水準。
本文中亦描述監測對象中之GPRC5D表現性癌症的方法。所述方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；定量存在於該樣本中由該抗體、或其抗原結合片段所結合之GPRC5D的量；將存在於該樣本中之GPRC5D的量與已知標準品或參考樣本比較，或者與先前得自該對象之類似樣本中之GPRC5D的量比較；以及基於所比較之樣本中之GPRC5D的量之差異來判定對象之GPRC5D水準是否指示癌症進展、消退或穩定疾病。
得自或衍生自對象的樣本為生物樣本，諸如尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(cells that are not tissue associated)、組織、手術切除之 腫瘤組織、活體組織切片、細針穿刺樣本、或組織標本(histological preparation)。
所述GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可經標示以用於所述方法或所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法中。舉例而言，本文中所述之抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、111In-DOTA、111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。
GPRC5D特異性抗體套組
本文中所述者為包括所揭示之GPRC5D特異性抗體或其抗原結合片段之套組。所述套組可用來進行該等使用本文中所提供之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之方法，或者所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體或抗原結合片段及用於偵測生物樣本中之GPRC5D之存在的試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之抗體(或其抗原結合片段)之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。
GPRC5D x CD3多特異性抗體
經由TCR/CD3複合體將T淋巴球重新導向至表現GPRC5D的MM細胞代表一種有吸引力的替代方法。T淋巴球的TCR/CD3複合體係由TCR阿法(α)/貝他(β)或TCR伽馬(γ)/德他(δ)異二聚體、以及共表現於細胞表面之不變CD3次單元(稱為伽馬(γ)、德他(δ)、艾普西龍(ε)、澤塔(ζ)、及艾塔(η))所組成。人類CD3ε係被描述於UniProt P07766(CD3E_HUMAN)。在目前最佳技術中所描述的一種抗CD3ε抗體係SP34(Yang SJ,The Journal of Immunology (1986)137；1097-1100)。SP34與靈長動物CD3及人類CD3反應。SP34可購自Pharmingen。在目前最佳技術中所描述的進一步抗CD3抗體係UCHT-1(見WO2000041474)。在目前最佳技術中所描述之進一步抗CD3抗體係BC-3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute；用於GvHD的I/II期試驗，Anasetti等人，Transplantation 54：844(1992))。SP34與UCHT-1及BC-3的不同點在於SP-34辨識只存在CD3的ε鏈上的表位(見Salmeron et al.,(1991)J.Immunol.147：3047)，然而UCHT-1及BC-3則辨識由ε鏈及γ鏈兩者形成之表位。與抗體SP34具有相同序列的抗體之序列係在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837、及WO2010037838中提及。與抗體SP34的VH具有96%同一性的序列係在US8236308(WO2007042261)中提及。
本文中所述者為結合CD123及CD3之單離多特異性抗體(「GPRC5D x CD3多特異性抗體(GPRC5D x CD3 multispecific antibody)」)及其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，提供免疫特異性結合至GPRC5D的一種重組抗體、或其抗原結合片段。
在一些實施例中，該多特異性抗體之GPRC5D特異性臂(GPRC5D-specific arm)結合人類GPRC5D及食蟹獼猴(cynomolgus monkey)GPRC5D。在一些實施例中，該等GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段之該GPRC5D特異性臂結合人類GPRC5D之胞外域。在較佳實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段係雙特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，提供一種單離GPRC5D x CD3雙特異性抗體，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成免疫特異性結合GPRC5D之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成免疫特異性結合CD3之第二抗原結合部位，或其GPRC5D x CD3雙特異性結合片段。在另一實施例中，提供表現該抗體或雙特異性結合片段之單離細胞。在一些實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體之GPRC5D結合臂(或「GPRC5D特 異性臂」)係源自本文中所述之GPRC5D抗體(例如，源自具有表1中所列示之CDR序列的抗體)。
在一些實施例中，該等GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段之該GPRC5D特異性臂係IgG、或其衍生物。在一些實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體之CD3結合臂(或「CD3特異性臂(CD3-specific arm)」)係衍生自小鼠單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。(K.R.Abhinandan及A.C.Martin,2008.Mol.Immunol.45,3832-3839)。在一些實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體之該CD3結合臂包含選自表2之一個VH域及一個VL域。
IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。彼等的Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性 (CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞(諸如自然殺手細胞或巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcgR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcgR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa及FcgRIIIb)和抑制性(FcgRIIb)FcgR或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於Fcg RI、Fcg RIIa、Fcg RIIb、Fcg RIIIb及/或Fcg RIIIa之親和力降低、(c)對於FcgRI之親和力降低、(d)對於FcgRIIa之親和力降低、(e)對於FcgRIIb之親和力降低、(f)對於Fcg RIIIb之親和力降低、或(g)對於FcgRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG1、或其衍生物。在一些實施例中，舉例來說，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG1抗體的Fc區包含在該Fc區中之L234A、L235A、及F405L取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG4、或其衍生物。在一些實施例中，舉例來說，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG4抗體的Fc區包含在該Fc區中之S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生 之該CD3特異性抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞及/或初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段活化初級人類CD4+ T細胞及/或初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
除了所述GPRC5D x CD3多特異性抗體外，亦提供能夠編碼所述GPRC5D x CD3多特異性抗體之多核苷酸序列。在一些實施例中，提供一種單離合成性多核苷酸，其編碼該GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之GPRC5D x CD3多特異性抗體的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。在一些實施例中，提供用於藉由培養細胞來產生該GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的方法。
本文中進一步提供包含該等GPRC5D x CD3多特異性抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
使用GPRC5D x CD3多特異性抗體之方法
亦揭示使用所述GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之方法。舉例而言，該等GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有需要之對象中的GPRC5D表現性癌症。在一些實施例中，該GPRC5D表現性癌症係淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤。
所述之治療有需要之對象中的GPRC5D表現性癌症之方法包括向該對象投予治療有效量的所述GPRC5D x CD3多特異性抗體或其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在較佳實施例中，提供用於治療患有癌症之對象之方法，其係藉由向有需要之病患投予治療有效量的該GPRC5D x CD3 雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段達一段足以治療該癌症的時間。
本文中進一步提供用於抑制癌細胞生長或增生之方法，其係藉由投予治療有效量的該GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段來抑制癌細胞之生長或增生。
本文中亦提供將T細胞重新導向至GPRC5D表現性癌細胞之方法，其係藉由投予治療有效量的該GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
GPRC5D x CD3特異性抗體套組
本文中描述包括所揭示之GPRC5D x CD3多特異性抗體的套組。所述套組可用來進行該等使用本文中所提供之GPRC5D x CD3多特異性抗體之方法，或者所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體及用於治療GPRC5D表現性癌症之試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之多特異性抗體(或其多特異性抗原結合片段)之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、及/或該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。
圖1：所選之抗GPRC5D mAb針對人類GPRC5D及未轉染之HEK 293細胞的濃度依賴性結合概況。亦觀察到三個mAb(GC5B36、GC5B168、及GC5B205)結合至未轉染(GPRC5D空(GPRC5D null))之HEK 293細胞。
圖2：抗GPCR5D x CD3雙特異性抗體劑量依賴性結合至人類GPRC5D HEK293F細胞。
圖3：使用FACS比較雙特異性抗體在MM1R及H929細胞對過 表現之人類GPCR5D HEK293細胞及未轉染之HEK293細胞的結合概況。
圖4A及圖4B：抗GPCR5D x CD3抗體針對表現人類GPRC5D之細胞的T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化。
圖5A及圖5B：抗GPCR5D x CD3抗體針對表現食蟹獼猴GPRC5D之細胞的T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化。
圖6A及圖6B：GPRC5DxCD3 Ab在預防性NSG小鼠模型中有效地殺滅H929細胞。GCDB32(6A)及GCDB35(6B)在10ug劑量導致完全腫瘤生長抑制，而GCDB32在1ug劑量亦能夠100%抑制腫瘤生長。
圖7A及圖7B：在Fc阻斷之不存在(7A)及存在(7B)下的效力比較。
圖8A至圖8D：GCDB32、GCDB35、GCDB40、及GCDB43至Fcγ受體的結合。
圖9A及圖9B：融合瘤衍生之mAb的FACS結合評估。
圖10A及圖10B：GPRC5D x CD3雙特異性抗體針對H929細胞的T細胞媒介之細胞毒性。
圖11A至圖11E：GPRC5D x CD3雙特異性抗體結合至GPRC5D陽性細胞系(H929、MM1R、LP1、OPM2)及陰性細胞系(NALM6)。
圖12A至圖12D：GPRC5DxCD3雙特異性Ab在活體內係有效的腫瘤抑制劑。所有GPRC5D x CD3雙特異性Ab(顯示於12A的GCDB32、顯示於12B的GCDB53、顯示於12C的GCDB61、及顯示於12D的GCDB72)在10ug及1ug劑量皆完全抑制多發性骨髓瘤細胞(H929)腫瘤生長。在0.1ug劑量觀察到差異，觀察到GCDB72具有80%腫瘤生長抑制。
圖13：將GPRC5D+ MM1.R細胞系用各種濃度的先導抗體(lead antibody)染色60分鐘，以測量表面結合概況(n=3)。使用經藻紅素(phycoerythrin)標示之人類IgG4Fc作為二級抗體以捕捉訊號 (Southern Biotech，殖株HP6025)。結合係藉由FACS判定以正規化幾何平均螢光強度表示。在GraphPad Prism 6中使用具有可變斜率(四個參數)的非線性回歸及最小平方法擬合法來完成數據繪圖及擬合。
圖14A及圖14B：將GPRC5D+細胞系用各種濃度的FAB6300及GC5M481抗體染色60分鐘，以測量表面結合概況。使用經藻紅素(phycoerythrin)標示之人類IgG4Fc作為二級抗體以捕捉訊號(Southern Biotech，殖株HP6025)。結合係以分布圖表示(黑線是同型且紅線意謂特定GPRC5D抗體)(圖14A)。圖14B顯示先導分子在GPRC5D+多發性骨髓瘤細胞系上的結合模式。陰影、虛線指示同型對照組，而實線指示先導分子結合。
圖15A及圖15B：使用來自兩位不同MM病患的冷凍骨髓衍生單核細胞，以相較於IgG4同型對照組，評估GPRC5D x CD3雙特異性抗體結合、漿細胞細胞毒性、及T細胞活化。關於細胞毒性測定，將來自正常健康供體的T細胞外源添加至病患BM MNC樣本，並與四種先導分子培養48小時。在所有供體樣本中，GPRC5D x CD3雙特異性抗體以劑量依賴性方式結合至漿細胞，並將平均螢光強度記錄在Y軸上。請注意回應於GPRC5D x CD3雙特異性抗體處理的活漿細胞(CD138+)損失、及伴隨之T細胞CD25上調。
圖16：在第0天向NSG小鼠皮下植入MM.1S人類多發性骨髓瘤細胞。在研究第7天靜脈內植入人類PBMC。在第15、18、22、24、29、32、及36天，以PBS、GCDB72(0.1μg、1μg、10μg、及50μg/動物(分別等效於0.005、0.05、0.5、及2.5mg/kg))及空對照組抗體靜脈內給藥。每週兩次測量皮下腫瘤，並將結果呈現為各組之平均腫瘤體積，以mm3±SEM表示。相較於PBS，GCDB72抗體處理當以1μg(0.05mg/kg)給藥時顯著地抑制sc腫瘤生長(TGI=64%,p0.0001)。10μg/動物(0.5mg/kg)及50μg/動物(2.5mg/kg)之GCDB72劑量完全消退腫瘤生長 (p0.0001)。空對照組抗體具有可忽略的效果或不具效果。統計顯著性係使用Graphpad Prism軟體(第6版)以使用杜凱(Tukey)多重比較檢定的多重比較使用二因子ANOVA來評估。當機率值(p)0.05時，將各組之間的差異視為顯著的。
圖17：在第0天向NSG皮下植入MM.1S人類多發性骨髓瘤細胞。在研究第7天靜脈內植入人類PBMC。在第15、18、22、24、29、32、及36天，以PBS、GCDB72(0.1μg、1μg、10μg、及50μg/動物(分別等效於0.005、0.05、0.5、及2.5mg/kg))及空對照組抗體靜脈內給藥。將體重呈現為自處理開始至研究結束的絕對體重。
定義
各種關於實施方式之態樣的用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些用語係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指示。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。
於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
本文中所使用之用語「約(about)」在指稱一可測量的值(諸如數量、持續時間及類似者)時，意欲涵蓋在指定值之高達±10%內的變異，若此類變異為適合執行所揭示之方法者。除非另有指示，所有用於說明書及申請專利範圍中以表達成分量、特性(諸如分子量、反應條件等)之數目應理解為在所有情況中皆經用語「約(about)」所修飾。因此，除非另有相反指示，以下說明書及隨附申請專利範圍中所提出之數值參數為近似值，其可視本發明所尋求獲得之所欲特性而有所變化。無論如何，且並非意圖限制申請專利範圍的範 疇之等效原則的應用，每一個數值參數應至少鑑於所報導的有效位數之數目並藉由應用一般捨入計數來加以詮釋。
儘管闡明本發明內容之廣域範圍的數值範圍及參數為近似值，仍盡可能精確地報導特定實例中所提出的數值。然而，任何數值固有地包含由在彼等的個別測試測量值中發現之標準偏差所必然產生的某些誤差。
「單離(isolated)」意指生物組分(諸如核酸、肽或蛋白質)已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分(即其他染色體及染色體外DNA及RNA、和蛋白質)實質上分開、與該等其他生物組分分開生產、或經純化而遠離該等其他生物組分。已「單離(isolated)」之核酸、肽及蛋白質因而包括藉由標準純化方法所純化之核酸及蛋白質。「單離(isolated)」核酸、肽及蛋白質可為組成物之一部分且仍為單離，只要該組成物並非該核酸、肽及蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。本文中所使用之「單離(isolated)」抗體或抗原結合片段意指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體或抗原結合片段的抗體或抗原結合片段(例如，特異性結合至GPRC5D之單離抗體係實質上不含特異性結合GPRC5D以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至GPRC5D之表位、異構體或變異體的單離抗體可對於其他相關抗原例如來自其他物種之相關抗原(諸如GPRC5D物種同源物)具有交叉反應性。
「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或(更典型地)雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混雜分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指 包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對於DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。
「實質上相同(substantially the same)」之意義可隨著使用該用語處之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性(例如，特異性及親和力)幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異(不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質)之演化成功所致。因此，在提及核酸序列時，「實質上相同(substantially the same)」意指在兩或更多個序列之間有至少65%同一性(identity)。較佳的是，該用語係指在兩或更多個序列間有至少70%同一性，更佳為至少80%同一性，更佳為至少85%同一性，更佳為至少90%同一性，更佳為至少91%同一性，更佳為至少92%同一性，更佳為至少93%同一性，更佳為至少94%同一性，更佳為至少95%同一性，更佳為至少96%同一性，更佳為至少97%同一性，更佳為至少98%同一性，而更佳為至少99%或更高之同一性。兩個序列間之同一性百分比為該等序列所共有之同一性位置數目的函數(即同源性%=同一性位置#/總位置#×100)，並且將需要被導入以最佳排比這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)之演算法來判定，該演算法已納入ALIGN程式(版本2.0)中，其採用PAM120加權殘基表、缺口長度 罰分為12及缺口罰分為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)演算法來判定。
在蛋白質之胺基酸序列內發生不會實質影響蛋白質功能之變異的程度遠低於核酸序列，因為相同的簡併性理論不適用於胺基酸序列。因此，在提及抗體或抗原結合片段時，「實質上相同(substantially the same)」意指抗體或抗原結合片段與所述抗體或抗原結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。其他實施例所包括的GPRC5D特異性抗體、或抗原結合片段具有不與本文中所述之抗體及抗原結合片段共有顯著同一性之架構、支架、或其他非結合區，但的確包含一或多個CDR或其他賦予結合所需且與本文中所述之此類序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，諸如質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、或病毒，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
「殖株(clone)」係自單一細胞或共同源始細胞(ancestor)藉由有絲分裂所衍生之細胞群。「細胞系(cell line)」係能夠在活體外穩定生長許多代之初級細胞殖株。在本文中所提供之一些實例中，細胞係藉由DNA轉染細胞加以轉形。
用語「表現(express)」及「生產(produce)」在本文中係同義地使用，並且係指基因產物之生物合成。這些用語涵蓋將基因轉錄成RNA。這些用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。抗體或其抗原結合片段之表現或生產可在細胞之細胞質內，或者進到細胞外環境中，諸如細胞培養之生長介質。
用語「治療(treating或treatment)」係指任何成功地或有成功跡象地減輕或改善傷害、病理變化或病況，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減少、緩解或消退或者使病況對於病患而言更 可忍受、減慢退化或衰退速率、使退化終點較不耗弱、改善對象之身體或心理健康、或延長存活時間。治療可藉由客觀或主觀參數來加以評估；包括身體檢查、神經檢查或精神狀況評估的結果。
「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療結果所需之有效劑量量及時間量。GPRC5D x CD3抗體之治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、及抗體在個體中誘發所欲反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效果超過其任何毒性或有害效果之量。
「抗體(antibody)」係指免疫球蛋白之所有同型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、及IgY)，包括各種單體、聚合及嵌合形式，除非另有指定。用語「抗體(antibody)」所具體涵蓋者為多株抗體、單株抗體(mAb)、及類抗體多肽，諸如嵌合抗體及人化抗體。
「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」為可對特定抗原展現結合親和力之任何蛋白質結構。抗原結合片段包括藉由任何習知技術所提供者，諸如酶切割、肽合成、及重組技術。一些抗原結合片段係由保有親系抗體分子之抗原結合特異性的完整抗體之部分組成。舉例而言，抗原結合片段可包含已知結合特定抗原之抗體的至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)或一或多個CDR。合適抗原結合片段之實例包括但不限於雙價抗體(diabody)及單鏈分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc、及Fv分子、單鏈(Sc)抗體、個別抗體輕鏈、個別抗體重鏈、抗體鏈或CDR及其他蛋白質、蛋白質支架間之嵌合融合物、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體、由VL、VH、CL及CH1域所組成之單價片段、或如WO2007059782中所述之單價抗體、包含兩個由鉸鏈區之雙硫橋所連接之Fab片段之雙價片段、主要由V.sub.H及C.sub.H1域所組成之Fd片段；主要由抗體單臂之VL及VH域所組成的Fv片段、dAb片段(Ward等人，Nature 341,544-546(1989))(其主要由VH域組成且亦稱為域抗體(domain antibody))(Holt等人；Trends Biotechnol.2003 Nov.；21(11)：484-90)；駱駝或奈米抗體(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.2005 Jan.；5(1)：111-24)；單離互補決定區(CDR)、及類似者。所有抗體同型皆可用來生產抗原結合片段。此外，抗原結合片段可包括非抗體蛋白質架構諸如蛋白質支架，以成功地將多肽區段納入可賦予對所關注之指定抗原的親和力之位向。抗原結合片段可經重組生產，或藉由酶或化學切割完整抗體來生產。片語「抗體或其抗原結合片段(an antibody or antigen-binding fragment thereof)」可用來意謂指定抗原結合片段納入該片語中所指涉之抗體的一或多個胺基酸區段。
用語「CDR」及其複數「CDRs」係指互補決定區(CDR)，其中三個構成輕鏈可變區之結合特徵(CDRL1、CDRL2及CDRL3)及三個構成重鏈可變區之結合特徵(CDRH1、CDRH2及CDRH3)。CDRs有助於抗體分子的功能活性並被包含支架或架構區的胺基酸序列分開。確切的定義性CDR邊界及長度有不同的分類及編號系統。因此CDRs可用Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義來指稱。儘管邊界不同，這些系統之各者在可變序列內所謂的「超變異區(hypervariable region)」的組成上具有一些程度的重疊。因此根據這些系統的CDR定義在關於相鄰架構區的長度及的邊界區域方面可能不同。見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.NIH Publication No.91-3242(1991)；Chothia等人，「Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,」J.Mol.Biol.196：901(1987)；及MacCallum等人，「Antibody-Antigen Interactions：Contact Analysis and Binding Site Topography,」J.Mol.Biol.262：732(1996)，各者之全文以引用方式併入本文中。
一般而言，CDRs形成可被歸類為正則結構之圈環結構。用語「正則結構(canonical structure)」係指抗原結合(CDR)圈環所採取的主鏈構形。從比較性結構研究中，發現六個抗原結合圈環中的五個僅具有有限的可用構形類型(repertoire)。各正則結構可藉由多 肽主鏈的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應圈環可能具有非常類似的三維結構，儘管圈環的大部分中具有高度胺基酸序列變異性(Chothia等人，「Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins,」J.Mol.Biol.196：901(1987)；Chothia等人，「Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions,」I 342：877(1989)；Martin及Thornton,「Structural Families in Loops of Homologous Proteins：Automatic Classification,Modelling and Application to Antibodies,」J.Mol.Biol.263：800(1996)，各者之全文以引用方式併入本文中。)另外，所採取的圈環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在一種關係。特定正則類別的構形係由圈環長度及位於圈環內以及保留性架構內(即在圈環之外)的關鍵位置之胺基酸殘基來判定。因此可基於這些關鍵胺基酸殘基的存在來指派特定正則類別。
用語「多肽(polypeptide)」與用語「蛋白質(protein)」可交換使用，且就其最廣義來說係指二或更多個次單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽物之化合物。次單位可藉由肽鍵連接。在另一實施例中，次單位可藉由其他鍵連接，例如酯、醚等。如本文中所使用之用語「胺基酸(amino acid)」係指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及D和L光學異構物、胺基酸類似物及擬肽物。三或更多個胺基酸的肽常被稱為寡肽，如果肽鏈很短。若肽鏈很長，肽常被稱為多肽或蛋白質。
當「特異性結合(specific binds/binds specifically)」或其衍生用語用於抗體、或抗體片段的上下文時，代表經由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之域結合至所關注蛋白質之一或多個表位，並且在含有混合分子群體之樣本中不會優先結合其他分子。典型而言，抗體以小於約1×10-8M之Kd結合至同源(cognate)抗原，如由表面電漿共振測定或細胞結合測定所測得者。諸如「[抗原]特異性([antigen]-specific)」抗體之用語(例如GPRC5D特異性抗體)係意欲傳達該引述之抗體特異性結合該引述之抗原。
「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA、或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或(更典型地)雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混雜分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對於DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。
「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，諸如質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、或病毒，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」可為任何類型的細胞，例如初代細胞、培養中之細胞、或來自細胞系之細胞。在特定實施例中，用語「宿主細胞(host cell)」係指經核酸分子轉染的細胞及該細胞的後代或潛在後代。該細胞的後代可能因為例如發生在後繼世代或核酸分子整合至宿主細胞基因體時發生的突變或環境影響，而不與經核酸分子轉染之親代細胞同一。用語「表現(expression)」及「生產(production)」在本文中係同義地使用，並且係指基因產物之生物合成。這些用語涵蓋將基因轉錄成RNA。這些用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。抗體或其抗原結合片段之表現或生產可在細 胞之細胞質內，或者進到細胞外環境中，諸如細胞培養之生長介質。「實質上相同(substantially the same)」之意義可隨著使用該用語處之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性(例如，特異性及親和力)幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異(不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質)之演化成功所致。因此，在提及核酸序列時，「實質上相同(substantially the same)」意指在兩或更多個序列之間有至少65%同一性(identity)。較佳的是，該用語係指在兩或更多個序列間有至少70%同一性，更佳為至少80%同一性，更佳為至少85%同一性，更佳為至少90%同一性，更佳為至少91%同一性，更佳為至少92%同一性，更佳為至少93%同一性，更佳為至少94%同一性，更佳為至少95%同一性，更佳為至少96%同一性，更佳為至少97%同一性，更佳為至少98%同一性，而更佳為至少99%或更高之同一性。兩個序列間之同一性百分比為該等序列所共有之同一性位置數目的函數(即同源性%=同一性位置#/總位置#×100)，並且將需要被導入以最佳排比這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)之演算法來判定，該演算法已納入ALIGN程式(版本2.0)中，其採用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分為12及缺口罰分為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)演算法來判定。
在蛋白質之胺基酸序列內發生不會實質影響蛋白質功能之變異的程度遠低於核酸序列，因為相同的簡併性理論不適用於胺基酸序列。因此，在提及抗體或抗原結合片段時，「實質上相同(substantially the same)」意指抗體或抗原結合片段與所述抗體或抗原結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、或99%同一性。其他實施例所包括的GPRC5D特異性抗體、或抗原結合片段具有不與本文中所述之抗體及抗原結合片段共有顯著同一性之架構、支架、或其他非結合區，但的確包含一或多個CDR或其他賦予結合所需且與本文中所述之此類序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。
用語「對象(subject)」係指人類及非人類動物，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長動物、小鼠、兔、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、及爬蟲動物。在所述方法之許多實施例中，該對象為人類。
本文中所用之用語「重新導向(redirect或redirecting)」係指GPRC5D x CD3抗體將T細胞活性自其固有同源特異性有效地傳遞到針對表現GPRC5D之細胞的反應性之能力。
本文中所用之「樣本(sample)」係指單離自對象之類似流體、細胞、或組織(例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、以及存在於對象內之流體、細胞、或組織的總稱。在一些實施例中，樣本係生物流體。生物流體在生理溫度下一般為液體並且可包括存在於、抽取自、表現自或以其他方式擷取自對象或生物來源之天然出現流體。某些生物流體衍生自特定組織、器官或局部區域而某些其他生物流體可能更全域性或全身性位於對象或生物來源中。生物流體之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、糞便、痰、分泌組織及器官之黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水(諸如與非實質腫瘤有關之腹水)、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹腔液及其他體腔液、支氣管灌洗收集液及類似者。生物流體亦可包括與對象或生物來源接觸之液體溶液，例如細胞及器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液及類似者。本文中所用之用語「樣本(sample)」涵括自對象取出之材料或存在於對象中之材料。
「已知標準品(known standard)」可為具有已知量或濃度之GPRC5D的溶液，其中該溶液可為天然出現溶液，諸如來自已知 患有早期、中期、晚期、進行性、或穩定性癌症之病患的樣本，或者該溶液可為合成溶液，諸如具有已知量之GPRC5D稀釋於其中的緩衝水。本文中所述之已知標準品可包括單離自對象之GPRC5D、重組或純化之GPRC5D蛋白質、或與疾病病況相關聯之GPRC5D濃度值。
如本文所用，用語「G蛋白偶聯受體C族5組成員D(G-protein coupled receptor family C group 5 member D)」及「GPRC5D」尤其包括人類GPRC5D蛋白，例如描述於GenBank登錄號BC069341、NCBI參考序列：NP_061124.1、及UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9NZD1(亦請參見Brauner-Osborne,H.等人，2001,Biochim.Biophys.Acta 1518,237-248)。
用語「CD3」係指人類CD3蛋白質之多重次單元複合體(multi-subunit complex)。CD3蛋白質多重次單元複合體由6個不同之多肽鏈組成。這些多肽鏈包括CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、兩個CD3ε鏈(SwissProt P07766)、及一個與T細胞受體α及β鏈相關聯之CD3 ζ鏈同二聚體(homodimer)(SwissProt 20963)。用語「CD3」包括任何CD3變異體、異構體及物種同源物，其係由細胞(包括T細胞)所天然表現，或者可表現在經編碼這些多肽之基因或cDNA轉染的細胞上，除非另有註明。
「GPRC5D x CD3抗體(GPRC5D x CD3 antibody)」為多特異性抗體，可選地為雙特異性抗體，其包含兩個不同之抗原結合區，其中一個特異性結合至抗原GPRC5D而另一個特異性結合至CD3。多特異性抗體可為雙特異性抗體、雙價抗體、或類似分子(例如請參見PNAS USA 90(14),6444-8(1993)以獲得雙價抗體之說明)。本文中所提供之雙特異性抗體、雙價抗體、及類似者除了結合GPRC5D之一部分外，可結合任何合適目標。用語「雙特異性抗體(bispecific antibody)」係理解為具有兩個由不同抗體序列所定義之不同抗原結合區的抗體。此可理解為不同之目標結合但亦包括對於一個目標中之不同表位的結合。
「參考樣本(reference sample)」係可與另一個樣本(諸 如測試樣本)比較之樣本，以允許用於表徵所比較之樣本。參考樣本將具有一些經表徵之性質，該等性質可作為與測試樣本比較之基礎。舉例而言，參考樣本可用來作為GPRC5D水準的指標，以用於指示對象患有癌症。參考樣本不必然需要與測試樣本一起分析，因此在一些情況中，參考樣本可為已預先判定以表徵給定病況之一數值或數值範圍，諸如指示對象中之癌症的GPRC5D水準。該用語亦包括用於比較目的之樣本，該樣本已知與生理狀態或疾病病況(諸如GPRC5D表現性癌症)相關聯，但具有未知量的GPRC5D。
如在提及GPRC5D表現性癌症之進展時所使用之用語「進展(progression)」，包括癌症從較不嚴重狀態到較嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性增加、轉移程度增加、癌症生長或擴散之速度增加、及類似者。舉例而言，「結腸癌進展(the progression of colon cancer)」包括該癌症從較不嚴重狀態進展到較嚴重狀態，諸如從第I期進展到第II期、從第II期進展到第III期等。
如在提及GPRC5D表現性癌症之消退時所使用之用語「消退(regression)」，包括癌症從較嚴重狀態到較不嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性減少、轉移程度減少、癌症生長或擴散速度減少、及類似者。舉例而言，「結腸癌消退(the regression of colon cancer)」包括該癌症從較嚴重狀態消退到較不嚴重狀態，諸如從第III期進展到第II期、從第II期到第I期等。
如在提及穩定性GPRC5D表現性癌症時所用之用語「穩定性(stable)」，係意欲描述疾病病況在臨床相關之時期內並未(或尚未)顯著地變化到足以被認為癌症正在進展或癌症正在消退。
本文中所述之實施例不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，其當然可能有所變化。
GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段
本文中描述特異性結合GPRC5D之單離單株抗體或抗原結合片段。抗體分子之一般結構包含抗原結合域，其包括重鏈及輕 鏈；及Fc域，其具有各式功能，包括補體固定(complement fixation)及結合抗體受體。
所述GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段包括所有同型(IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)、及四鏈免疫球蛋白結構之合成性多聚體。所述抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中所發現之IgY同型。
GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該等抗體或抗原結合片段可為小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗體或抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類病患時較不具抗原性。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係嵌合者。本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
在一些實施例中，該等抗體為人化(humanized)抗體。人化抗體可為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。大體上，人化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體(recipient antibody))，其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。
本文中所述之抗體或抗原結合片段可以各種形式出現，但將包括表1中所示之抗體CDR的一或多者。
本文中描述免疫特異性結合至GPRC5D之單離抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段係人類IgG、或其衍生物。雖然本文中所例示之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段，所例示之抗體或抗原結合片段可經嵌合化。
在一些實施例中提供一種GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供一種GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段，其包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：1之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：5之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：9之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：1之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：5之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：9之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：16之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：19之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：52實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：52實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：56實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：2之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：6之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：10之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：2之重 鏈CDR1、含有SEQ ID NO：6之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：10之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：16之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：19之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：53實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：53實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：56實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：3之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：7之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：3之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：7之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：14之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：20之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：54實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：54實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：57實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：4之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：8之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：12之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：4之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：8之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：12 之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：15之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：55實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：55實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：58實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：61之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：67之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：72之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：61之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：67之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：72之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：78之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：80之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：82實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：82實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：92實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：2之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：28之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：30之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：2之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：28之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：30之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO： 16之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：19之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：83實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：83實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：56實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：73之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：73之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：14之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：20之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：84實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：84實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：57實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：14之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：20之輕鏈CDR3。此GPRC5D 特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：85實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：85實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：57實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：62之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：68之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：74之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：62之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：68之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：74之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：14之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：20之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：86實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：86實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：57實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：63之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：69之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：75之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：63之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：69之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：75之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：13之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：78之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：80之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中， GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：87實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：87實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：92實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：64之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：70之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：12之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：64之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：70之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：12之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：15之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：88實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：88實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：58實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：65之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：68之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：76之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：65之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：68之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：76之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：95之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：79之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：81之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：89實質上相 同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：89實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：93實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：66之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：71之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：77之重鏈CDR3。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：66之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：71之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：77之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：15之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：18之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：21之輕鏈CDR3。此GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：91實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：91實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO：94實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該雙特異建構體中有一個臂係抗GPRC5D臂。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體係IgG1同型之一些實施例中，該抗體包含IgG1Fc區(SEQ ID NO：60)。
SEQ ID NO.60
在抗體係IgG4同型之一些實施例中，該抗體在其Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代(SEQ ID NO：73)。
SEQ ID NO.59
以上段落中所討論之由CDR及/或可變域序列所定義的特定抗體可包括這些修飾。
亦揭示編碼該等免疫特異性結合至GPRC5D之抗體或抗原結合片段的單離多核苷酸。該等能夠編碼本文中所提供之可變域區段的單離多核苷酸可被包括於相同(或不同)之載體上以生產抗體或抗原結合片段。編碼GPRC5D抗體的例示性多核苷酸序列係顯示於下：
重鏈序列(SEQ ID NO：96)：
輕鏈序列(SEQ ID NO：90)：
編碼重組抗原結合蛋白質之多核苷酸亦在本揭露之範疇內。在一些實施例中，所述多核苷酸(及彼等所編碼之肽)包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括但不限於限制部位(restriction site)或轉譯起始部位(translation start site)。
本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段包括具有單一或多個胺基酸取代、刪除、或添加之變異體，並且該等變異體保有所述GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段之生物特性(例如，結合親和力或免疫效應活性)。在本發明之上下文中，下列符號係用來描述突變，除非另有指明；i)取代指定位置中之胺基酸係寫成例如S228P，其代表用脯胺酸取代位置228中之絲胺酸；且ii)在特定變異體中，使用特定三個或一個字母之代碼(包括代碼Xaa及X)來指示任何胺基酸殘基。因此，用絲胺酸取代位置228中之精胺酸係標為：S228P，或者用任何胺基酸殘基取代位置228中之絲胺酸係標為S228P。刪除位置228中之絲胺酸的情況係以S228*指示。具有通常知識者可生產具有單一或多個胺基酸取代、刪除、或添加之變異體。
這些變異體可包括：(a)其中一或多個胺基酸殘基係經保留性或非保留性胺基酸取代之變異體、(b)其中一或多個胺基酸係經添加至該多肽或自該多肽刪除之變異體、(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體、及(d)其中該多肽係與另一肽或多肽(諸如融合夥伴、蛋白質標籤或其他化學部分，其可將有用特性賦予該多肽，諸如例如針對抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部分及類似者)融合之變異體。本文中所述之抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之保留性或非保留性位置之胺基酸殘基係經另一物種之對應殘基所取代的變異體。在其他實施例中，非保守性位置之胺基酸殘基係經保守性或非保守性殘基取代。獲得這些變異體之技術(包括基因(刪除、突變等)、化學、及酶技術)皆為所屬技術領域中具有通常知識者所習知。
本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可 體現數種抗體同型，諸如IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在一些實施例中，該抗體同型係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型，較佳為IgG1或IgG4同型。抗體或其抗原結合片段之特異性大部分是由CDR之胺基酸序列及排列來決定。因此，一種同型之CDR可轉移到另一種同型而不會改變抗原特異性。或者，已經建立使融合瘤從生產一種抗體同型轉換到生產另一種(同型轉換)而不會改變抗原特異性之技術。因此，此等抗體同型係在所述抗體或抗原結合片段之範疇內。
亦提供包含本文中所述之多核苷酸的載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所關注之多肽的序列之重組表現載體因而被考慮為在本揭露之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列(例如，啟動子、增強子)、選擇標記、及多腺核苷酸化信號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母及病毒載體。
本實施方式之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種與合適調節元件可操作地連接之重組蛋白質的合成性、基因體性、或cDNA衍生性核酸片段。此等調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合部位之序列、及控制轉錄和轉譯之終止的序列。表現載體(尤其是哺乳動物表現載體)亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、連接至所欲表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列(諸如必要的核糖體結合部位)、多腺核苷酸化部位、剪接供體及受體部位、或轉錄終止序列。亦可納入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。
在用來轉形脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如以下文獻所述建構：Okayama及Berg,3 Mol.Cell.Biol.280(1983)。
在一些實施例中，抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次 黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此等病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，GPRC5D特異性抗體或其抗原結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element,ISRE)之啟動子，諸如蛋白質激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1、及類似者。
本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入部位(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化部位(例如SV40)，其可在任一前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列(即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸)，或者以其他方式放置。調節元件(諸如IRES模體)亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。
該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正向及負向選擇標記，例如抗生素抗藥性基因(例如新黴素抗藥性基因、潮黴素(hygromycin)抗藥性基因、康黴素(kanamycin)抗藥性基因、四環素抗藥性基因、青黴素抗藥性基因、嘌呤黴素(puromycin)抗藥性基因、殺稻瘟菌素(blasticidin)抗藥性基因)、麩胺酸合成酶基因、HSV-TK、用於更昔洛威(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶 基因(Gadi等人，7 Gene Ther.1738-1743(2000))。編碼選擇標記或選殖部位之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖部位之核酸序列的上游或下游。
本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。舉例而言，該等載體可用來產出生產GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段的細胞。因此，另一個態樣的特點在於經載體轉形的宿主細胞，載體包含編碼特異性結合GPRC5D之抗體或其抗原結合片段(諸如本文中所描述及例示之抗體或抗原結合片段)的核酸序列。
許多用於將外來基因引入細胞之技術皆為所屬技術領域所習知，並且可用來建構重組細胞以依據本文中所描述及例示之各種實施例來實施所述之方法。所使用之技術應提供異源基因序列之穩定轉移至宿主細胞，以使該異源基因序列可由細胞後代所繼承及表現，並且使接受者細胞之必要發育及生理功能不受干擾。可使用之技術包括但不限於染色體轉移(例如，細胞融合、染色體媒介之基因轉移、微細胞媒介之基因轉移)、物理方法(例如，轉染、球形質體(spheroplast)融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑)、病毒載體轉移(例如，重組DNA病毒、重組RNA病毒)及類似者(描述於Cline,29 Pharmac.Ther.69-92(1985))。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導之細菌原生質體與哺乳動物細胞融合亦可用來轉形細胞。
適用於表現本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段的細胞，較佳為真核細胞，更佳為源自植物、囓齒動物、或人類之細胞，例如但不限於NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293細胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系、和其他者。此外，抗體之表現可使用融合瘤細胞來達成。用於生產融合瘤之方法在所屬技術領域中已充分建立。
經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞係經 擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水平、增強之生長特性、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因給定次殖株之固有特性或因突變而來。突變可透過使用化學品、UV波長光、放射線、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合來實現。
使用GPRC5D特異性抗體之治療方法
本文中提供用於治療之GPRC5D特異性抗體或其抗原結合片段。特定而言，這些抗體或抗原結合片段可用來治療癌症，諸如GPRC5D表現性癌症。因此，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含投予如本文中所述之抗體，諸如GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，用法可為藉由干擾GPRC5D-受體交互作用，或者其中該抗體係與毒素共軛，從而使該毒素靶向該GPRC5D表現性癌症。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)。用於這些方法中之抗體包括上文所述之抗體，例如具有表1所述特徵(例如CDR或可變域序列)及在這些抗體的進一步討論中之特徵的GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段。
在本文中所述之一些實施例中，GPRC5D特異性抗體之免疫效應(effector)性質可透過以所屬領域中具有通常知識者習知之技術所進行之Fc修飾來強化或靜默。舉例而言，Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)、向下調控細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)等)可藉由修飾Fc中負責這些活性之殘基來提供及/或控制。
「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」或「ADCC」係指一種細胞媒介反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、及巨噬細胞)辨識目標細胞上的已結合抗體，然後造 成目標細胞溶解。
單株抗體誘導ADCC之能力可藉由工程改造其寡醣組分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈廣為周知之雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞所生產之抗體典型具有約至少85%之聚醣海藻糖(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖經由改善Fc.gamma.RIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此等mAb可使用已報導會導致成功表現相對高量去岩藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型之Fc寡醣)的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konno等人，Cytotechnology 64：249-65,2012)、應用變異體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shields等人，J Biol Chem 277：26733-26740,2002)、應用變異體CHO系EB66作為宿主細胞系(Olivier等人，MAbs；2(4),2010；紙本發行前之電子發行版本；PMID：20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278：3466-3473,2003)、引入特異性針對α1,6-岩藻糖基轉移酶(FUT8)基因之小型干擾RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng 88：901-908,2004)、或共表現β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III及高基氏體α-甘露糖苷酶II或強效α-甘露糖苷酶I抑制劑基夫鹼(kifunensine)(Ferrara等人，J Biol Chem 281：5032-5036,2006，Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93：851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng 99：652-65,2008)。
在本文中所述之一些實施例中，由GPRC5D抗體所誘發之ADCC亦可藉由抗體Fc中之某些取代而增強。例示性取代例如為在胺基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430處之取代(殘基編號依據EU索引)，如美國專利第6,737,056號中所述。
偵測GPRC5D之方法
本文中提供用於偵測生物樣本中之GPRC5D的方法，其藉由使該樣本接觸本文中所述之抗體、或其抗原結合片段。如本文中所述，該樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，所述方法包括藉由使生物樣本接觸任何本文中所述之GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段來偵測該樣本中之GPRC5D。
在一些實施例中，該樣本可與超過一種本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段接觸。舉例而言，樣本可與第一GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，然後與第二GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，其中該第一抗體或抗原結合片段與該第二抗體或抗原結合片段並非相同抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可固定至表面(諸如多孔盤、晶片、或類似基材)。在其他實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可完全未經固定(或貼附)至任何東西。
所述GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段可經可偵測地標示。在一些實施例中，經標示之抗體及抗原結合片段有助於經由本文中所述之方法偵測GPRC5D。許多此等標記係所屬領域中具有通常知識者所熟知者。舉例而言，合適標記包括(但不應將之視為限制於)放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色團(chromophore)標記、ECL標記、或酶。更具體而言，所述標記包括釕、111In-DOTA、111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸(HIS標籤)、吖啶染料、花青(cyanine)染料、螢光酮(fluorone)染料、(oxazin)染料、啡啶染料、玫瑰紅染料、Alexafluor®染料、及類似者。
所述GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段可用於各式測定中以偵測生物樣本中之GPRC5D。一些合適測定包括(但不應將 之視為限制於)西方墨點分析、放射免疫測定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA測定。
在本文所述之一些實施例中，偵測對象中之GPRC5D表現性癌細胞可用來判定該對象可用針對GPRC5D之治療劑來治療。
GPRC5D係以可偵測水準存在於血液及血清樣本中。因此，本文中提供用於偵測衍生自血液之樣本(諸如血清樣本)中之GPRC5D的方法，其藉由使該樣本與特異性結合GPRC5D之抗體或其抗原結合片段接觸。該血液樣本或其衍生物可經稀釋、份化(fractionated)、或以其他方式處理以產出可對其執行所述方法的樣本。在一些實施例中，GPRC5D可藉由所屬技術領域中所習知之許多測定來在血液樣本或其衍生物中偵測，諸如但不限於西方墨點分析、放射免疫測定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
用於診斷癌症之方法
本文中提供用於診斷對象中之GPRC5D表現性癌症的方法。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)。在一些實施例中，如上所述，偵測生物樣本(諸如血液樣本或血清樣本)中之GPRC5D提供診斷對象(該樣本自其獲得)中之癌症的能力。或者，在一些實施例中，其他樣本(諸如組織樣本、細針穿刺樣本、切除腫瘤組織、循環細胞、循環腫瘤細胞、及類似者)亦可用來評估該對象(該樣本自其獲得)是否患有癌症。在一些實施例中，可能已經知道該對象(該樣本自其獲得)患有癌症，但該對象所罹患之癌症類型可能尚未診斷出來或者初步診斷結果可能尚未明朗，因此偵測獲自該對象之生物樣本中之GPRC5D可讓該癌症之診斷得以作出或明朗化。舉例而言，可能已經知道對象患有癌症，但 可能不知道或不清楚該對象之癌症是否為GPRC5D表現性。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患GPRC5D表現性癌症，其藉由判定衍生自該對象之生物樣本中所存在之GPRC5D的量；以及比較所觀察到之GPRC5D量與對照(或參考)樣本中之GPRC5D量，其中源自該對象之樣本中的GPRC5D量與對照(或參考)樣本中之GPRC5D量的差異為該對象罹患GPRC5D表現性癌症之指示。在另一個實施例中，獲自對象之生物樣本中所觀察到之GPRC5D的量可與已知和癌症的某些形式或期別相關聯之GPRC5D水準比較，以判定該對象之癌症的形式或期別。在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中之GPRC5D的量係藉由使該樣本與免疫特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段(諸如本文中所述之GPRC5D特異性抗體)接觸來評估。用於評估GPRC5D之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括血液性癌症，諸如多發性骨髓瘤(MM)。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，診斷GPRC5D表現性癌症之方法將涉及：使對象之生物樣本與GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段(諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者)接觸；定量該樣本中所存在且被該抗體或其抗原結合片段結合的GPRC5D量；將該樣本中所存在之GPRC5D量與已知標準品或參考樣本比較；以及判定該對象之GPRC5D水準是否落入與癌症相關聯之GPRC5D水準。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予或處方癌症特異性治療之額外步驟。在另一實施例中，在該診斷方法之後可接著進行傳送判定結果以利於癌症治療之額外步驟。在一些實施例中，該癌症特異性治療可針對GPRC5D表現性癌症，諸如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患 GPRC5D表現性癌症，其藉由判定獲自該對象之血液或血清樣本中所存在之GPRC5D的量；以及比較所觀察到之GPRC5D量與對照(或參考)樣本中之GPRC5D量，其中源自該對象之樣本中的GPRC5D量與對照(或參考)樣本中之GPRC5D量的差異為該對象罹患GPRC5D表現性癌症之指示。
在一些實施例中，該對照(或參考)樣本可衍生自未罹患GPRC5D表現性癌症之對象。在一些實施例中，該對照(或參考)樣本可衍生自罹患GPRC5D表現性癌症之對象。在該對照(或參考)樣本係衍生自未罹患GPRC5D表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之GPRC5D的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量增加，係該評估對象罹患GPRC5D表現性癌症之指示。在該對照樣本係衍生自未罹患GPRC5D表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之GPRC5D的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量減少或類似，係該評估對象未罹患GPRC5D表現性癌症之指示。在該對照或參考樣本係衍生自罹患GPRC5D表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之GPRC5D的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量類似，係該評估對象罹患GPRC5D表現性癌症之指示。在該對照(或參考)樣本係衍生自罹患GPRC5D表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之GPRC5D的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量減少，係該評估對象未罹患GPRC5D表現性癌症之指示。
在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中之GPRC5D的量係藉由使該樣本與特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段(諸如本文中所述之抗體)接觸來評估。用於評估GPRC5D之存在的樣本可衍生自血液樣本、血清樣本、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。
在各種態樣中，GPRC5D的量係藉由使樣本與特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例 中，樣本可由超過一種類型的特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由特異性結合GPRC5D之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，接著由特異性結合GPRC5D之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段可用於此方法。
可使用GPRC5D特異性抗體及抗原結合片段之各種組合來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以進行所述之診斷方法。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括淋巴瘤，諸如多發性骨髓瘤(MM)。
在某些實施例中，GPRC5D的量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫測定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
在所述診斷方法之各種實施例中，使用對照或參考樣本。此樣本可作為陽性或陰性測定對照組以確保所使用之測定的正確運作；舉例而言，具有此性質之測定對照組可能常用於免疫組織化學測定。或者，該樣本可為來自健康對象之生物樣本中之GPRC5D量的標準參考品。在一些實施例中，所觀察到之受測對象的GPRC5D水準可與來自已知患有GPRC5D表現性癌症之對象的樣本中所觀察到之GPRC5D水準比較。在一些實施例中，該對照對象可能罹患所關注之特定癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有早期癌症，該癌症可為或非為GPRC5D表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有中期癌症，該癌症可為或非為GPRC5D表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有晚期癌症，該癌症可為或非為GPRC5D表現性癌症。
用於監測癌症之方法
本文中提供用於監測對象中之GPRC5D表現性癌症的方法。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括淋巴瘤，諸如多發 性骨髓瘤(MM)。在一些實施例中，所述方法涉及評估GPRC5D表現性癌症是否正在進展、消退、或保持穩定，其藉由判定衍生自該對象之測試樣本中所存在之GPRC5D的量；以及比較所觀察到之GPRC5D的量與在較早時間點以類似方式獲自該對象之生物樣本中之GPRC5D的量，其中測試樣本與較早樣本中之GPRC5D的量之間的差異提供該癌症是否正在進展、消退、或保持穩定之指示。就此而言，測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量增加可能指示GPRC5D表現性癌症之進展。反之，測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量減少可能指示GPRC5D表現性癌症之消退。
因此，測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量的差異不顯著可能指示GPRC5D表現性癌症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，衍生自該對象之生物樣本中之GPRC5D的量係藉由使該樣本與特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗體片段(諸如本文中所述之抗體)接觸來評估。用於評估GPRC5D之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如，手術切除之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，監測GPRC5D表現性癌症之方法將涉及：使對象之生物樣本與GPRC5D特異性抗體、或其抗原結合片段(諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者)接觸；定量該樣本中所存在的GPRC5D量；比較該樣本中所存在之GPRC5D量與在較早時間點以相同方式得自相同對象之生物樣本中所判定的GPRC5D量；以及判定該對象之GPRC5D水準是否隨時間改變。測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量增加可能指示癌症之進展。反之，測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量減少可能指示GPRC5D表現性癌症之消退。因此，測試樣本之GPRC5D量相對於較早樣本所觀察到之量的差異不顯著可能指示GPRC5D表現性癌症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，樣本之GPRC5D水準可與已知標準品 或參考樣本單獨比較，或另外與在較早時間點評估之樣本所觀察到的GPRC5D水準比較。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予癌症特異性治療之額外步驟。在一些實施例中，該癌症特異性治療可針對GPRC5D表現性癌症。
在各種態樣中，GPRC5D的量係藉由使樣本與特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例中，樣本可由超過一種類型的特異性結合GPRC5D之抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由特異性結合GPRC5D之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，接著由特異性結合GPRC5D之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之抗體可用於此方法。
表1所述之抗體及抗原結合片段之各種組合可用來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以進行所述之監測方法。在一些實施例中，GPRC5D表現性癌症包括血液性癌症，諸如多發性骨髓瘤(MM)。
在某些實施例中，GPRC5D的量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫測定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
用於偵測GPRC5D之套組
本文中提供用於偵測生物樣本中之GPRC5D的套組。這些套組包括本文中所述之一或多種GPRC5D特異性抗體或其抗原結合片段、以及套組之使用說明。
所提供之GPRC5D特異性抗體、或抗原結合片段可為在溶液中；經凍乾；經固定至基材、載劑、或盤；或經可偵測地標示。
所述套組亦可包括可用於執行本文中所述之方法的額外組分。舉例來說，該等套組可包含用於自對象獲得樣本之手段、對照 或參考樣本(例如來自患有緩慢進展癌症之對象及/或未患有癌症之對象的樣本)、一或多個樣本隔間、及/或描述本發明方法之執行及組織特定對照組或標準品的說明資料。
用於判定GPRC5D水準之手段可進一步包括例如緩衝液或其他用於判定GPRC5D水準之測定中的試劑。該等說明可為例如用於執行該測定之印刷說明及/或用於評估GPRC5D表現水準之說明。
所述套組亦可包括用於自對象單離樣本之手段。這些手段可包含可用來自對象獲得流體或組織之一或多個設備項目或試劑。用於自對象獲得樣本之手段亦可包含用於自血液樣本單離血液組分(諸如血清)之手段。較佳的是，該套組係針對人類對象使用而設計。
多特異性抗體
本文中所述之抗GPRC5D抗體的結合域辨識在表面上表現GPRC5D之細胞。如上所述，GPRC5D表現可為癌性細胞之指示。更特異性靶向細胞之特定子集可藉由製造雙特異性分子(諸如結合至GPRC5D及另一目標(諸如CD3及BCMA)的抗體或抗體片段)來達成。此係藉由製造包含結合至GPRC5D之第一區及結合至其他目標抗原之第二結合區的分子來達成。該等抗原結合區可採取任何能夠特異性辨識目標之形式，例如該結合區可為或可包括重鏈可變域、Fv(重鏈可變域與輕鏈可變域之組合)、基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type III domain)的結合域(諸如來自纖連蛋白素、或基於來自纖連蛋白素的III型域的一致序列、或來自固生蛋白(tenascin)、或基於來自固生蛋白的III型域的一致序列，諸如來自Janssen Biotech,Inc.的Centyrin分子，見例如WO2010/051274及WO2010/093627)。因此，提供包含兩個分別結合GPRC5D及另一抗原之不同抗原結合區的雙特異性分子。
一些本文中所述之多特異性抗體包含兩個分別結合 GPRC5D及CD3之不同抗原結合區。在較佳實施例中，提供結合GPRC5D及CD3之多特異性抗體(GPRC5D x CD3多特異性抗體)及其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體包含第一重鏈(HC1)及第一輕鏈(LC1)(配對形成特異性結合GPRC5D之第一抗原結合部位)和第二重鏈(HC2)及第二輕鏈(LC2)(配對形成特異性結合CD3之第二抗原結合部位)。在較佳實施例中，該GPRC5D x CD3多特異性抗體係包含GPRC5D特異性臂及CD3特異性臂之雙特異性抗體，該GPRC5D特異性臂包含第一重鏈(HC1)及第一輕鏈(LC1)(配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位)，該CD3特異性臂包含第二重鏈(HC2)及第二輕鏈(LC2)(配對形成特異性結合GPRC5D之第二抗原結合部位)。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體包括具有全長抗體結構之抗體。本文中所用之「全長抗體(full length antibody)」係指具有兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈之抗體。全長抗體重鏈(HC)包括重鏈可變域及恆定域VH、CH1、CH2、及CH3。全長抗體輕鏈(LC)包括輕鏈可變域及恆定域VL及CL。全長抗體可在任一或兩個重鏈中缺乏C端離胺酸(K)。用語「Fab臂(Fab-arm)」或「半分子(half molecule)」係指特異性結合抗原之一個重鏈-輕鏈對。在一些實施例中，該等抗原結合域中之一者係非基於抗體的結合域，例如基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type 3 domain)的結合域，例如Centyrin。
本文中所提供之多特異性抗體的GPRC5D結合臂可衍生自上述GPRC5D特異性抗體之任一者。在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體殖株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體殖株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3和輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含下列植株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3：GC5B81、GC5B465、GS5B483、 GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。
在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含下列植株之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3和輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：GC5B81、GC5B465、GS5B483、或GC5B596。在此類GPRC5D結合臂之一些示例性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體植株的重鏈可變域。在此類GPRC5D結合臂之一些示例性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體植株的重鏈可變域及輕鏈可變域。在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含下列植株之重鏈可變域：GC5B81、GC5B465、GS5B483、或GC5B596。在此類GPRC5D結合臂之一些例示性實施例中，結合GPRC5D之第一抗原結合區包含下列植株之重鏈可變域及輕鏈可變域：GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。
表3提供GPRC5D x CD3雙特異性抗體之列表，該等雙特異性抗體具有一個對GPRC5D有特異性的重鏈和輕鏈對、及另一個對CD3有特異性的重鏈和輕鏈對，在該表中列出特定抗體ID以描述用來生產所述實施例的抗原特異性抗體臂。
在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該GPRC5D結合臂亦結合食蟹獼猴GPRC5D，較佳結合其胞外域。
在一些實施例中，該多特異性抗體之GPRC5D結合臂係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在GPRC5D結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，該GPRC5D結合臂在其Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。
在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該第二抗原結合臂結合人類CD3。在一些較佳實施例中，該GPRC5D x CD3雙特異性抗體之CD3特異性臂係衍生自結合及活化人類初級T細胞及/或食蟹獼猴初級T細胞之CD3特異性抗體。在一些實施例中，該CD3結合臂結合在CD3ε之N端的表位。在一些實施例中，該CD3結合臂接觸包括CD3ε之六個N端胺基酸的表位。在一些實施例中，該雙特異性抗體之CD3特異性結合臂係衍生自小鼠單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。在一些實施例中，該CD3結合臂包含抗體SP34之CDR。此等CD3結合臂可以5×10-7M或更低(諸如1×10-7M或更低、5×10-8M或更低、1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、或者1×10-9M或更低)之親和力結合至CD3。該CD3特異性結合臂可為小鼠單株抗體SP34之臂的人化版本。人類架構適應(HFA)可用來人化CD3特異性臂係自其衍生之抗CD3抗體。在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該CD3結合臂包含選自表2之重鏈及輕鏈對。
在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG，或其衍生物。在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在CD3結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，該CD3結合臂 之Fc區中含有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類及食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級人類CD3+ T細胞。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
在一些實施例中，提供具有GPRC5D結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該GPRC5D結合臂包含下列抗體植株之重鏈：GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。在一些實施例中，提供具有GPRC5D結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該GPRC5D結合臂包含下列抗體植株之重鏈及輕鏈：GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597。在一些實施例中提供具有CD3結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該CD3結合臂包含抗體殖株CD3B219之重鏈。在一些實施例中提供具有CD3結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該CD3結合臂包含抗體殖株CD3B219之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，提供具有GPRC5D結合臂及CD3結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該GPRC5D結合臂包含下列抗體植株之重鏈：GC5B81、GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597，該CD3結合臂包含抗體植株CD3B219之重鏈。在一些實施例中，提供具有GPRC5D結合臂及CD3結合臂之GPRC5D x CD3雙特異性抗體，該GPRC5D結合臂包含下列抗體植株之重鏈及輕鏈：GC5B81、 GC5B465、GS5B483、GC5B596、GC5B382、GC5B379、GC5B373、GC5B376、GC5B385、GC5B370、GC5B602、GC5B603、GC5B599、GC5B601、GC5B598、或GC5B597，該CD3結合臂包含抗體植株CD3B219之重鏈及輕鏈。
例示性GPRC5D x CD3雙特異性抗體係提供於表23中。
已經描述雙特異性抗體之不同格式並且近來已由下列文獻所回顧：Chames及Baty(2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12：276。
在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體係雙價抗體、交叉抗體(cross-body)、或經由如本發明中所述之受控Fab臂交換所獲得之雙特異性抗體。
在一些實施例中，雙特異性抗體包括具有互補CH3域以迫使異二聚化的類IgG分子；重組類IgG雙靶向分子，其中該分子之兩側各包含至少兩種不同抗體之Fab片段或該Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化雙價抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區或其部分；Fab融合分子，其中不同之Fab片段係融合在一起；基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)，其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。
在一些實施例中，具有互補CH3域分子之類IgG分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes(Genentech)、CrossMAbs(Roche)及靜電匹配者(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、股交換工程改造域抗體(Strand Exchange Engineered Domain body,SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)及DuoBody(Genmab A/S)。
在一些實施例中，重組類IgG雙靶向分子包括Dual Targeting(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗體(Two-in-one Antibody)(Genentech)、交聯單株抗體(Cross-linked Mabs)(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)及CovX-body(CovX/Pfizer)。
在一些實施例中，IgG融合分子包括雙可變域(Dual Variable Domain,DVD)-Ig(Abbott)、類IgG雙特異性抗體(IgG-like Bispecific)(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)及BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)和TvAb(Roche)。
在一些實施例中，Fc融合分子包括ScFv/Fc Fusions(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、Dual Affinity Retargeting Technology(Fc-DART)(MacroGenics)及Dual(ScFv).sub.2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine--China)。
在一些實施例中，Fab融合雙特異性抗體包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific(Biotecnol)及Fab-Fv(UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager(BiTE)(Micromet)、Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology(DART)(MacroGenics)、Single-chain Diabody(Academic)、TCR-like Antibodies(AIT,ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion(Merrimack)及COMBODY(Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。
本發明之全長雙特異性抗體可使用例如兩個單特異性雙價抗體之間的Fab臂交換(或半分子交換)來產製，其於各半分子中之重鏈CH3介面引入取代以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在活體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親系單特異 性抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵係經還原。其中一個親系單特異性抗體所生成的游離半胱胺酸與第二親系單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親系抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所生成之產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，這兩個Fab臂或半分子各自結合不同表位，即GPRC5D上的一表位及CD3上的一表位。
本文中所用之「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
本文中所用之「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「孔中鈕(knob-in-hole)」策略(請參見例如PCT Inti.Publ.No.WO 2006/028936)可用來產製全長雙特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域介面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸(孔)引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸(鈕)引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負 電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/028637或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美國專利公開號US2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。
除了上述方法外，本發明之雙特異性抗體可在無細胞環境中活體外產生，此藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)以兩個親體單特異性同二聚體抗體形成該雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於國際專利公開號W02011/131746之方法。在該等方法中，第一單特異性雙價抗體(例如，抗GPRC5D抗體)及第二單特異性雙價抗體(例如，抗CD3抗體)係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性條件。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90min。
除了所述GPRC5D x CD3多特異性抗體外，亦提供能 夠編碼所述GPRC5D x CD3多特異性抗體之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之GPRC5D x CD3多特異性抗體的細胞。亦描述能夠表現所揭示載體之細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。
使用多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之治療組成物及治療方法
以上討論之GPRC5D雙特異性抗體(例如以上討論之GPRC5D x CD3雙特異性抗體)可用於治療中。特定而言，GPRC5D雙特異性抗體可用於治療癌症。本文中亦提供用於治療哺乳動物中之過度增生性病症的治療組成物，其包含治療有效量之本文中所述之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。在一個實施例中，該醫藥組成物係用於治療GPRC5D表現性癌症，包括(但不限於)以下：GPRC5D表現性B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)；及其他表現有GPRC5D但尚未被判定之癌症。可用來治療癌症(諸如血液性癌症，包括以上討論之特定癌症)之具體雙特異性抗體包括抗體GC5B81、GC5B465、GS5B483、或GC5B596。
本文中所提供之醫藥組成物包含：a)有效量的本發明之多特異性抗體或抗體片段、及b)醫藥上可接受之載劑，其可為惰性或生理活性。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。本文中所用之用語「醫藥上可接受之載 劑(pharmaceutically acceptable carrier)」包括生理相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑、及類似者。合適載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括下列之一或多者：水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似物，以及其任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑(諸如糖、多元醇、或氯化鈉)納入該組成物中。特定而言，合適載劑之相關實例包括：(1)達爾伯克氏(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4，含有或未含有約1mg/mL至25mg/mL人類血清白蛋白、(2)0.9%鹽水(0.9% w/v氯化鈉(NaCl))、及(3)5%(w/v)葡萄糖；並且亦可含有抗氧化劑如色胺(tryptamine)及穩定劑如Tween 20®。
本文中之組成物亦可包含視需要用於治療特定病症之額外治療劑。較佳的是，多特異性抗體或抗體片段與補充性活性化合物將具有不會互相不利影響之互補活性。在較佳實施例中，該額外治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在較佳實施例中，該額外治療劑係化學治療劑。
本發明之組成物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體、及固體劑量形式，但較佳形式取決於預期投予模式及治療應用。典型較佳組成物係呈可注射或可輸注溶液之形式。較佳投予模式係非經腸(例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下)。在較佳實施例中，本發明之組成物係以推注(bolus)靜脈內投予或藉由在一段時間內連續輸注投予。在另一較佳實施例中，彼等係藉由肌肉內、皮下、關節內、滑膜內、腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍途徑來注射，以產生局部以及全身性治療效果。
用於非經腸投予之無菌組成物可藉由將本發明之抗體、抗體片段或抗體共軛物(conjugate)以所需量納入適當溶劑中，接著藉由微過濾進行滅菌來製備。在溶劑或媒劑方面，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者，以及其組合。在許多情況中，較佳的是在組成物中包括等滲劑諸如糖、多元醇、或氯化鈉。這些組成物亦可含有佐劑，尤其是潤濕、等張、乳化、分散及穩 定劑。用於非經腸投予之無菌組成物亦可製備為無菌固體組成物之形式，其可在使用時溶於無菌水或任何其他注射用無菌介質中。
多特異性抗體或抗體片段亦可經口投予。在經口投予之固體組成物方面，可使用錠劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、囊劑(sachet))、或粒劑。在這些組成物中，依據本發明之活性成分係於氬氣流下與一或多種惰性稀釋劑(諸如澱粉、纖維素、蔗糖、乳糖、或二氧化矽)混合。這些組成物亦可包含非為稀釋劑之物質，例如一或多種潤滑劑(諸如硬脂酸鎂或滑石)、著色劑、塗層(糖衣錠)或糖釉(glaze)。
在經口投予之液體組成物方面，可使用含有惰性稀釋劑(諸如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油)之醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。這些組成物可包含非為稀釋劑之物質，例如潤濕、增甜、增稠、調味或穩定用產品。
劑量取決於所欲之效果、治療持續期間及所使用之投予途徑；成人口服劑量通常介於每天5mg到1000mg，並且單位劑量含有範圍在1mg到250mg的活性物質。一般而言，醫師將會視待治療對象之年齡、體重及任何其他特定因素來決定適當劑量。
本文中亦提供用於殺滅GPRC5D +之方法，其藉由向有需要之病患投予結合該GPRC5D且能夠徵集T細胞以殺滅該GPRC5D +細胞(即T細胞重新導向(T cell redirection))之多特異性抗體。任何本發明之多特異性抗體或抗體片段皆可使用在治療上。例如，在一個實施例中，GPRC5D x CD3多特異性抗體可使用在治療上以治療對象中的癌症。
在較佳實施例中，本發明之多特異性抗體或抗體片段係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在更佳實施例中，以上所揭示並且含有本發明之多特異性抗體或抗體片段的醫藥組成物之一者係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在一實施例中，該病症係癌症。特定而言，該癌症係GPRC5D表現性癌症，包括(但不限於)以下：GPRC5D表現性B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)；及其他表 現有GPRC5D但尚未被判定之癌症。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。
因此，本發明之醫藥組成物可用於治療或預防各種癌症，包括(但不限於)以下：GPRC5D表現性癌症，包括(但不限於)以下：GPRC5D表現性B/漿細胞癌，諸如急性多發性骨髓瘤(MM)或癌前骨髓瘤(premalignant myeloma)(諸如MGUS(未定性的單株免疫球蛋白症(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance))及SMM(和緩性多發性骨髓瘤(Smoldering Multiple myeloma)))及漿細胞瘤；及其他表現有GPRC5D但尚未被判定之癌症。
類似地，本文中進一步提供一種用於抑制所選細胞群生長之方法，其包含在周邊血液單核細胞(PBMC)存在下，使GPRC5D表現性目標細胞、或含有此等目標細胞之組織與有效量的本發明之多特異性抗體或抗體片段(單獨或與其他細胞毒性劑或治療劑組合)接觸。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。在較佳實施例中，該額外治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在較佳實施例中，該額外治療劑係化學治療劑。用於抑制所選之細胞群生長的方法可在活體外、活體內、或離體(ex vivo)實施。
活體外用途之實例包括在將自體骨髓移植到同一病患之前先對其處理以殺滅染病或惡性細胞；在移植骨髓之前先對其處理，以殺滅勝任T細胞並預防移植物抗宿主病(GVHD)；處理細胞培養，以殺滅除了未表現目標抗原之所欲變異體以外的所有細胞；或殺滅表現非所欲抗原之變異體。非臨床活體外用途之條件可由所屬技術領域中具有通常知識者所輕易決定。
臨床離體使用之實例係於自體骨髓移植治療癌症之前從骨髓移除腫瘤細胞。治療可實施如下。自病患或其他個體獲取骨髓，接著將骨髓在加入本發明之細胞毒性劑的含血清培養基中進行培養。濃度範圍係約10uM至1uM，在約37℃下進行約30分鐘至約48小時。精確濃度及培養時間條件(即劑量)可由所屬技術領域中具有通常知識者所輕易決定。在培養之後，將骨髓細胞用含血清之培養基洗滌，然後依據習知方法藉由靜脈輸液送回病患體內。在病患於收獲骨髓到重新輸回經處理細胞之間的時間內接受其他治療如根除性化學療法(ablative chemotherapy)或全身放射線照射的情況下，該等經處理之骨髓細胞係使用標準醫療設備冷凍儲存於液態氮中。
在臨床活體內用途中，向有需要之對象投予治療有效量之多特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，該等GPRC5D x CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有需要之對象中的GPRC5D表現性癌症。在一些實施例中，該GPRC5D表現性癌症係B細胞癌，諸如多發性骨髓瘤(MM)。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在一些實施例中，該多特異性抗體或抗原結合片段將以已測試過無菌性之溶液形式投予。
以上治療方法及用途中之劑量方案係經調整以提供最佳之所欲反應(例如，治療回應)。舉例而言，可投予單次推注、可在一段時間內投予數次分開之劑量、或者可依治療情況之急迫性所示來按比例提高或降低劑量。非經腸組成物可配製為劑量單元形式以增進投予便利性及劑量一致性。
多特異性抗體及片段之有效劑量及劑量方案取決於待治療之疾病及病況並且可由所屬領域中具有通常知識者決定。本發明化合物之治療有效量的例示性、非限定範圍係約0.001至10mg/kg，諸如約0.001至5mg/kg，例如約0.001至2mg/kg，諸如約0.001至1 mg/kg，例如約0.001、約0.01、約0.1、約1或約10mg/kg。
所屬技術領域中具有通常知識之醫師或獸醫師可輕易決定並處方所需之醫藥組成物的有效量。舉例而言，醫師或獸醫師可從低於欲達所欲治療效果所需的該醫藥組成物中所採用之多特異性抗體或片段的劑量水準開始，然後逐漸提高劑量直到達到所欲效果。一般而言，本發明之雙特異性抗體之合適每日劑量將為該化合物有效產生治療效果之最低劑量的量。投予可為例如非經腸，諸如靜脈內、肌肉內或皮下。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可依mg/m2計算之每周劑量來輸液投予。此等劑量可基於例如以上提供之mg/kg劑量，並且依據下式：劑量(mg/kg)×70：1.8提供。此投予可重複例如1至8次，諸如3至5次。該投予可藉由在2至24小時(諸如2至12小時)期間內連續輸注來執行。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由在長期間(諸如超過24小時)內緩慢連續輸注來投予，以降低毒性副作用。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可以每周劑量投予，該每周劑量經計算為至多給予八次之固定劑量，諸如當每周給予一次時給予四至六次。此方案可視需要例如在六個月或十二個月之後重複一或多次。此等固定劑量可基於例如以上所提供之mg/kg劑量，並且體重估計為70kg。劑量可藉由測量本發明之雙特異性抗體經投予後在血液中的量來判定或調整，其係藉由例如採集生物樣本並使用靶向本發明之多特異性抗體之GPRC5D抗原結合區的抗遺傳型抗體(anti-idiotypic antibody)來測量。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由維持療法來投予，諸如例如一周一次進行六個月或更長的期間。
多特異性抗體或片段亦可預防性投予以降低發展癌症之風險、延緩癌症進展事件之開始發生、及/或當癌症處於緩解時降低復發之風險。
如本文中所述之多特異性抗體及其片段亦可以組合療法來投予，即與所欲治療之疾病或病況的其他相關治療劑組合。因此， 在一個實施例中，含抗體之藥劑係與一或多種額外治療劑(諸如化學治療劑)組合。在一些實施例中，該其他治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。此類組合式投予可為同時、分開或依序(以任何順序)進行。針對同時投予，該等劑可作為一個組成物或作為分開之組成物(視情況而定)投予。
在一個實施例中，提供一種用於治療涉及對象中表現GPRC5D之細胞的病症之方法，該方法包含向有需要之對象投予治療有效量的多特異性抗體或片段(諸如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體)，及進行放射性療法。在一個實施例中，提供一種用於治療或預防癌症之方法，該方法包含向有需要之對象投予治療有效量的多特異性抗體或片段(諸如本文中所述之GPRC5D x CD3抗體)，及進行放射性療法。放射性療法可包含放射線照射或者提供給病患相關聯之放射性藥品投予。放射線源可位於受治療病患外部或內部(放射線治療例如可為體外放射治療(external beam radiation therapy,EBRT)或近程放射治療(brachytherapy,BT)之形式)。可用於實施此等方法之放射性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131、及銦-111。
套組
本文中亦提供者包括套組，例如包含所述多特異性抗體或其抗原結合片段、及該抗體或片段用於殺滅特定細胞類型之使用說明。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。該等說明可包括對於在活體外、活體內或離體使用該多特異性抗體或其抗原結合片段之指示。
典型而言，套組將具有內含多特異性抗體或其抗原結合片段之隔間。該多特異性抗體或其抗原結合片段可呈凍乾形式、液體 形式、或其他可經修改以被包括在套組中之形式。套組亦可含有實施該套組中之說明上描述之方法所需的額外元件，諸如用於重組凍乾粉劑之滅菌溶液、在向病患投予前用於與該多特異性抗體或其抗原結合片段組合之額外劑、及協助向病患投予該多特異性抗體或其抗原結合片段之工具。
診斷用途
本文中所述之多特異性抗體及片段亦可用於診斷目的。因此，亦提供包含如本文中所界定之多特異性抗體或片段的診斷組成物、及其用途。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之GPRC5D x CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體、或其GPRC5D x CD3雙特異性抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種用於診斷癌症之套組，其包含含有雙特異性GPRC5D x CD3抗體之容器、及一或多種用於偵測該抗體對於GPRC5D之結合的試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤、或其他可偵測標籤。該等試劑亦可包括用於酶反應之二級或三級抗體或試劑，其中該等酶反應產生可視覺化之產物。舉例而言，本文中所述之多特異性抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、111In-DOTA、111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。
實施例
本文所提供之揭露亦提供以下非限制性實施例。
1.一種特異性結合至GPRC5D的單離抗體或其抗原結合片段，其包含：a.具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (CDR1)、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈CDR3；b.具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR3；c.具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR3；d.具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3；e.具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3；f.具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈CDR3；g.具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：73之胺基酸序列的重鏈CDR3；h.具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR3；i.具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR3；j.具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3；k.具有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3；l.具有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的重鏈CDR3；或m.具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：77之胺基酸序列的重鏈CDR3。
2.如實施例1所述之單離抗體、或抗原結合片段，其中a.包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈 CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：73之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈 CDR3；h.包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3； l.包含具有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或m.包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：77之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
3.一種單離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至GPRC5D，且包含選自由以下所組成之群組的可變重(VH)鏈區：SEQ ID NO：52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91。
4.如實施例3所述之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下所組成之群組的可變輕(VL)鏈區：SEQ ID NO：56、57、58、92、93、或94。
5.如實施例3所述之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下所組成之群組的VH區：SEQ ID NO：52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91；及選自由以下所組成之群組的VL區：SEQ ID NO：56、57、58、92、93、或94。
6.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：52、53、或83且與包含SEQ ID NO：56之VL鏈區配對。
7.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO： 54、84、85、86、或90且與包含SEQ ID NO：57之VL鏈區配對。
8.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：55或88且與包含SEQ ID NO：58之VL鏈區配對。
9.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：82或87且與包含SEQ ID NO：92之VL鏈區配對。
10.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：89且與包含SEQ ID NO：93之VL鏈區配對。
11.如實施例5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：91且與包含SEQ ID NO：94之VL鏈區配對。
12.如實施例1至11中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的多肽。
13.如實施例1至12中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
14.如實施例1至13中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組者。
15.如實施例1至14中任一者所述之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。
16.如實施例1至15中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
17.如實施例1至9中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其係IgG1或IgG4同型。
18.如實施例17所述之抗體，其中該IgG1在其Fc區中具有K409R取代。
19.如實施例17所述之抗體，其中該IgG1在其Fc區中具有F405L取代。
20.如實施例20所述之抗體，其中該IgG4在其Fc區中具有 F405L取代及R409K取代。
21.如實施例16所述之抗體，其進一步在其Fc區包含S228P取代、L234A取代、及L235A取代。
22.如實施例1至14中任一者所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人類GPRC5D並與食蟹獼猴GPRC5D交叉反應。
23.如實施例17所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段在活體外以小於約28ng/mL的EC50誘導ADCC。
24.一種單離細胞，其表現如實施例1至11中任一者所述之抗體或抗原結合片段。
25.如實施例24所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
26.如實施例24所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。
27.一種單離GPRC5D x CD3雙特異性抗體，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成特異性結合GPRC5D之第二抗原結合部位，或其GPRC5D x CD3雙特異性結合片段。
28.如實施例27所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC1包含SEQ ID NO：25，且LC1包含SEQ ID NO：26。
29.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：52，且LC2包含SEQ ID NO：56。
30.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：53，且LC2包含 SEQ ID NO：56。
31.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：54，且LC2包含SEQ ID NO：57。
32.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：55，且LC2包含SEQ ID NO：58。
33.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：82，且LC2包含SEQ ID NO：92。
34.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：83，且LC2包含SEQ ID NO：56。
35.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：84，且LC2包含SEQ ID NO：57。
36.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：85，且LC2包含SEQ ID NO：57。
37.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：86，且LC2包含SEQ ID NO：57。
38.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：87，且LC2包含SEQ ID NO：92。
39.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：88，且LC2包含SEQ ID NO：58。
40.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異 性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：89，且LC2包含SEQ ID NO：93。
41.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：91，且LC2包含SEQ ID NO：94。
42.如實施例28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：85，且LC2包含SEQ ID NO：57。
43.如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
44.如實施例43所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG4同型。
45.如實施例27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合人類骨髓瘤細胞表面上的GPRC5D。
46.如實施例27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合人類多發性骨髓瘤細胞表面上的GPRC5D。
47.如實施例27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在活體外以小於約0.22nM的EC50誘導人類T細胞活化。
48.如實施例27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在活體外以小於約0.89nM的EC50誘導表現GPRC5D之細胞的T細胞依賴性細胞毒性。
49.一種單離細胞，其表現如實施例27至42中任一者所述之抗體或雙特異性結合片段。
50.如實施例49所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
51.如實施例49所述之細胞，其中該抗體或雙特異性結合片段係經重組生產。
52.一種用於治療患有癌症之對象的方法，該方法包含：向有需要之病患投予治療有效量的如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段達一段足以治療該癌症的時間。
53.一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含：投予治療有效量的如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以抑制癌細胞之生長或增生。
54.一種將T細胞重新導向至GPRC5D表現性癌細胞之方法，該方法包含：投予治療有效量的如實施例27至42中任一者之所述GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
55.如實施例52、53、或54所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。
56.如實施例55所述之方法，其中該血液性癌症係GPRC5D表現性B細胞癌。
57.如實施例56所述之方法，其中該GPRC5D表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。
58.如實施例52所述之方法，其包含投予第二治療劑。
59.如實施例58所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。
60.如實施例59所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。
61.如實施例59所述之方法，其中該第二治療劑係與該雙特異性抗體同時、依序、或分開投予至該對象。
62.一種醫藥組成物，其包含如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
63.一種用於藉由培養如實施例49至51中任一者所述之細胞來產生如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的方法。
64.一種單離合成性多核苷酸，其編碼如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2。
65.一種套組，其包含如實施例27至42中任一者所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及/或如實施例63所述之多核苷酸及用於上述者之包裝。
實例
下列實例係提供用來增補前述揭露及提供對於本文中所述之申請標的之更佳理解。不應將這些實例視為限制所述之申請標的。應瞭解本文中所述之實例及實施例僅用於說明性之目的，並且根據該等實例及實施例之各種修飾或變化將為所屬領域中具有通常知識者所顯而易知且應被納入本發明之真實範疇內，而且在不偏離本發明之真實範疇下可作出這些修飾或變化。
實例1：抗原
由於生產重組GPRC5D抗原的困難，使用標準方法產生展示GPRC5D[人類(SEQ ID NO：22)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：23)、及鼠類(SEQ ID NO：24)]之經轉染細胞系，以將其作為全細胞抗原使用，用於抗體產生及表徵化研究(表4)。
實例2：使用噬菌體展示技術產生GPRC5D抗體
在藉由噬菌體產生GPRC5D抗體中遵循兩個不同方法：標準細胞淘選(負向選擇)及FACS細胞噬菌體淘選(競爭性選擇)。
標準細胞噬菌體淘選(負向選擇)：
已詳細描述了自行開發(in-house)之重新式(de novo)噬菌體庫(Shi等人(2010)J.Mol.Biol.397：385-396；國際專利公開號WO09/085462)。這些庫係建立於三個人類VH生殖基因(IGHV1-69、3-23、5-51)及四個人類VL生殖基因(A27、B3、L6、O12)上，其係設計成在CDR-H3中具有高度多樣性。對在噬菌體外殼蛋白pIX上展示Fab變體的三個重新式噬菌體庫(DNP00004-169HC/LC混合物、DNP00005-323HC/LC混合物、及DNP00006-551HC/LC混合物)在第1、3、5輪針對GPRC5D表現性HEK293 G5穩定細胞(目標細胞)進行淘選，且在第2及4輪，將前一輪的經擴增之Fab-pIX噬菌體施加至HEK293背景細胞(負向選擇)(請參見表5)。將結合至目標細胞的第1輪重新式Fab-pIX噬菌體回收以用於過夜擴增。將第1輪所選之噬菌體施加至背景細胞以用於第2輪，其中將未結合之Fab-pIX噬菌體回收以用於經負向選擇之噬菌體過夜擴增。執行另一組正向及負向輪的淘選，即第3及4輪。最終輪係將上一輪經負向選擇並擴增之噬菌體分成兩個淘選樣本來執行，一者針對目標細胞且一者針對背景細胞淘選。
標準細胞噬菌體淘選(背景選擇)：
將Fab-pIX噬菌體展示庫添加至HEK293細胞，並遵循類似於執行先前提及之標準細胞淘選程序的環境及培養時間(表6)。在三輪之後，使用對應於結合HEK293之Fab-pIX噬菌體的DNA，以生產用於NGS的PCR擴增物。此等NGS結果將會被使用於在NGS2.0內的額外動態消減分析(dynamic subtractive analysis)，以幫助辨別可能的目標特異性Fab候選者。
FACS細胞噬菌體淘選(競爭性選擇)
藉由同時將Fab-pIX噬菌體施加至目標細胞與背景細胞之混合物的方式，執行三輪的淘選。針對第1及2輪，藉由使用GFP訊號，將具有附接之Fab-pIX噬菌體的目標細胞分選出。為了自經分選之細胞捕捉結合之Fab-pIX噬菌體，施用酸細胞裂解，之後進行大腸桿菌感染。在最終輪，將第2輪經擴增之Fab-pIX噬菌體及細胞混合物分選成兩個群體，針對GFP目標細胞閘控(gated)並針對非GFP背景細胞閘控。藉由酸裂解及大腸桿菌感染，捕捉到兩細胞群的結合之Fab-pIX噬菌體。
噬菌體淘選之次世代定序(NGS)
在葡萄糖阻遏(glucose repression)下，完成六個最後一輪淘選樣品的過夜生長。使用這些培養物製造小量製備DNA(mini-prep DNA)，Qiagen QIAspin DNA套組。使用六個DNA樣本作為PCR模板，以產生自HCDR1至HCDR3測量的擴增物。將六個擴增物凝膠純化，且針對標準細胞淘選係藉由將版本2.1、3.0分開來儲集，而針對FACS細胞淘選係完全儲集。將這些經儲集且凝膠純化之擴增物提供至Genewiz NGS服務以藉由MiSeq 1x300技術處理。檔案由Genewiz遞交並上傳至區域伺服器(nas2.0)。在此伺服器內，使用NGS2.0軟體應用以加載、讀取、並分析序列檔案。根據拷貝數(>50)及目標細胞(+)對背景細胞(-)序列的比(比>5：1)，選擇前88個序列以用於IgG轉化。由於藉由NGS僅可變重鏈序列經判定，全重鏈建構體需經電子建構成適當的架構。此外，由於僅重鏈序列為已知的，候選者之各者係與四個親代輕鏈(A27、B3、L6、O12)配對。候選者之最終轉化係以人類IgG4PAA完成。
ELISA篩選及標準定序
自NGS所使用之相同DNA製備，完成限制酶消化及自我連接以切下基因pIX，使可溶性Fab能夠表現。針對三個淘選樣本之各者挑選九十二個植株，藉由ELISA評估Fab表現，並藉由桑格法(Sanger method)定序以判定重鏈及輕鏈兩者。將在LCDR內具有多樣化序列的最終候選者選殖至哺乳動物表現質體。
實例4：透過噬菌體展示技術獲得之GPRC5D抗體的初步表徵化 GPRC5D結合：
如上所述，使用人類GPRC5D細胞作為抗原完成全細胞噬菌體淘選。在NGS分析之後，僅各候選者之重鏈序列為已知。因此，各重鏈需與4個親代輕鏈(A27、B3、L6、O12)配對，導致來自87個Hc序列之348個mAb使用NGS而被識別。使用FACS初步 評估這些mAB至食蟹獼猴GPRC5D的結合。選擇食蟹獼猴GPRC5D細胞系用於初步篩選以最大化可能的結合訊號，此係因為食蟹獼猴GPRC5D細胞系相較於人類GPRC5D細胞系具有較高表現水準。簡言之，藉由將蛋白質濃度正規化至1ug/ml，並在每孔以100ul的蛋白質與200,000個細胞混合來執行FACS篩選。使mAb與細胞在4℃下培養1小時。接著用PBS及0.2% FBS洗滌細胞三次。接著，添加與PE(Jackson批號709-116-149)共軛之抗人類二級mAb作為偵測試劑。將細胞與二級抗體在4℃下培養1小時。接著用PBS及0.2% FBS洗滌細胞三次。使用PBS及0.2% FBS再次洗滌細胞，接著在FACS陣列上分析。
觀察到大量結合至食蟹獼猴GPRC5D的命中(hit)，包括15個MFI大於100,000的mAb、23個MFI小於100,000但大於10,000的mAb、及63個MFI小於10,000但大於1000的mAb。(表8)。
選擇具有最高結合親和力的40個mAb用於額外表徵化，其係由重複至食蟹獼猴GPCR5D細胞的結合研究、以及使用FACS之至表現人類GPRC5D之細胞的結合評估所組成(表9)。分析這些數據以選出17個mAb用於純化及產生GPRC5D x CD3雙特異性抗體(經突出顯示)。選擇用於純化及產生GPRC5D x CD3雙特異性抗體的mAb所使用之因子包括結合至人類GPRC5D的特異性、與食蟹獼猴GPRC5D的交叉反應性、及Hc序列的多樣性。舉例而言，GC5H36係與三個不同輕鏈配對並針對結合進行分析(GC5B162、GC5B163、GC5B164)。僅GC5B164進至下一步，因為觀察到相較於GC5B162或GC5B163，此mAb對GPRC5D人類具有較高MFI。
使用FACS，判定所選之mAb之各者針對人類GPRC5D表現性HEK293細胞及未轉染之HEK293細胞的濃度依賴性 結合概況(圖1)。觀察到所有mAb皆以劑量依賴性方式結合至人類GPRC5D。亦觀察到三個mAb(GC5B36、GC5B168、及GC5B205)結合至未轉染(GPRC5D空(GPRC5D null))之HEK 293細胞，且這三個抗體由於此與細胞之非特異性交互作用而被去優先化。
選擇剩下的14個mAb用於產生具有抗CD3臂CD3B219及抗RSV空臂B23M46的雙特異性抗體(表10)。
在重組期間，一個雙特異性抗體GCDB38沉澱，而另一個GCDB36含有>10%聚集。所有其他的雙特異性抗體通過了標準釋出標準，並分析空臂雙特異性抗體對人類GPRC5D表現性HEK293細胞的濃度依賴性結合(圖2)。
觀察到所有雙特異性抗體皆以劑量依賴性方式結合。包括了GC5B320作為結合比較物，以了解雙價mAb與單價雙特異性抗體之間的結合差異。包括了GCDB44作為結合比較物，以了解抗CD3雙特異性抗體與抗RSV空臂mAb之間的結合差異。當比較mAb GC5B320與雙特異性抗體GCDB30和GCDB44時，觀察到預期之表觀結合親和力降低。此外，觀察到相較於GCDB30(抗RSV空臂雙特異性Ab)，GCDB44(抗CD3雙特異性Ab)對抗人類GPRC5D細胞 具有略微較高的結合親和力，說明抗CD3臂結合至此細胞系經正面影響。
亦將雙特異性抗體小組針對MM1R及H929細胞之結合概況化，MM1R及H929細胞係內源性表現GPRC5D(圖3)。使用FACS比較雙特異性抗體在MM1R及H929細胞對過表現之人類GPCR5D HEK293細胞及未轉染之HEK293細胞的結合概況。觀察到雙特異性抗體以一範圍之親和力結合至內源性表現在MM1R及H929細胞上之GPRC5D。觀察到最高結合係至人類GPRC5D HEK細胞，其係過表現之穩定細胞系，具有遠高於MM1R或H929細胞之受體密度。由於觀察到針對H929及MM1R細胞之低結合親和力，GCDB37、GCDB38、GCDB39、及GCDB41並未進至下一步。
活體外T細胞依賴性細胞毒性
接著，將雙特異性抗體小組在使用MM1R及H929細胞的T細胞媒介之細胞毒性測定中的效力概況化(圖4A及圖4B、表11)。簡言之，將目標細胞(H929、MM1.R、OPM2、LP-1、及道迪(Daudi)或HEK親代及HEK+GPRC5D細胞)計數，並將1,000萬個細胞以1350rpm離心3分鐘，且將細胞團塊再懸浮於1ml的稀釋之CFSE溶液(CellTrace FCSE增生染色劑係以18μl的無菌DMSO重構，並取1μl溶液稀釋於10ml的無菌PBS中)，並在室溫下於黑暗中培養8分鐘。培養後，將1ml的HI FBS加至細胞懸浮液，以淬熄剩餘的CFSE。將細胞以含有10% FBS的RPMI-1640洗滌兩次。將細胞重構於10ml的RPMI中，然後計數細胞，並在表格中記錄細胞存活率(cell viability)。將細胞稀釋成每毫升2.2×10^5個，並在37℃下培養直到使用。
將來自正常供體之泛T細胞在37℃水浴中解凍，且接著將細胞以1350rpm在4℃下離心3分鐘。丟棄上清液，並以1.1×10^6/ml濃度重構於培養基中。將2×10^5個目標細胞加至96孔U底盤的孔中，然後加入Fc阻斷劑(至最終濃度2mg/ml)。將所有細 胞系於室溫下培養10分鐘以阻斷Fc受體活性。將1×10^5個T細胞加至孔中(效應：目標比為5：1)。在混合目標細胞及T細胞之後，在各孔中加入20μl的GPRC5D x CD3雙特異性Ab稀釋液。將GPRC5D x CD3雙特異性抗體於PBS中稀釋至800μg/ml(10X)。滴定係在96孔U底盤中以PBS製備為4倍連續稀釋液。最後一行僅放入PBS(媒劑對照組)。將盤在37℃、5% CO2下培養48小時。
兩天後(48小時)，將盤離心，並將100μl的上清液儲存在-80℃下以用於細胞介素釋放測定。將細胞於200μl的PBS中洗滌，並在室溫下於50μl的近紅外線活/死染色劑(1：200稀釋)及抗CD25 PE抗體(1：50稀釋)中培養20分鐘。接著將細胞於200μl的FACS緩衝液中洗滌一次，且最後重構於150μl的FACS緩衝液中。使用FACSCanto II及FlowJo 7.6分析細胞，以得出目標細胞毒性(目標%)及T細胞活化CD25+(活T細胞%)。在GraphPad Prism 6中使用具有可變斜率(四個參數)函數的非線性回歸，利用最小平方法來完成數據繪圖及擬合。
所有雙特異性抗體在T細胞媒介之H929細胞殺滅中具活性，並觀察到一範圍之效力(表11)。在兩細胞系觀察到類似的排 名次序。然而，MM1R細胞中觀察到較低的EC50。有趣的是，結合親和力不必然與在T細胞媒介之細胞毒性測定中的效力相關。舉例而言，GCDB44係最高親和力結合之雙特異性抗體，但在細胞毒性測定中最不具效力。而具有類似雖然略微較低的結合親和力之GCDB43在細胞毒性測定中則最具效力。
接著，為評估與食蟹獼猴GPRC5D之功能性交叉反應性，將雙特異性抗體小組針對使用食蟹獼猴GPRC5D HEK293細胞的T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化概況化(圖5A及圖5B)。所有雙特異性抗體在此測定中具活性，儘管觀察到針對表現食蟹獼猴GPRC5D+之細胞的一範圍之效力。
活體內功效
接著，完成指標性活體內研究以了解這些GPRC5D X CD3雙特異性抗體之活體內效力。選擇GCDB32及GCDB35(圖5A及圖5B)在H929預防性腫瘤模型中測試。在注射人類PBMC一週後，將H929細胞植入NSG小鼠。雙特異性抗體處理係與植入H929細胞同時起始，並以每2或3天(q2d或q3d)10ug、1ug、及0.1ug/動物之劑量總共持續五個處理。各組使用十隻小鼠，並包括PBS作為媒劑對照組。在第11天停止處理，且在第25天(圖6A及圖6B)或第26天(圖12A至圖12D)終止研究。所有在預防性模型中所測試之GPRC5D x CD3抗體除了GCDB35以外，在10及1ug/動物劑量皆顯示100%腫瘤生長抑制，GCDB35在1ug/動物劑量顯示大約80%腫瘤生長抑制。在十倍較低劑量(0.1ug/動物)下，這些雙特異性抗體顯示不同程度的功效，範圍自10至80%腫瘤生長抑制。
在Fc阻斷劑存在下之活體外T細胞依賴性細胞毒性
接著，為了解GPRC5D靶向臂之特異性，在Fc阻斷劑存在下在T細胞重新導向細胞毒性測定中，評估GPRC5D x CD3雙特異性抗體小組。對了解特異性而言，此實驗係關鍵的，因為雙特異性 抗體之目標細胞係B細胞表現性Fcγ受體，其在活體外測定中能夠與雙特異性抗體之Fc部分交互作用。在T細胞媒介之細胞毒性測定中觀察到數個雙特異性抗體之效力偏移，其中觀察到GCDB40及GCDB34有最大偏移(圖7A至圖7B)。
接著，完成直接測量四個最有效雙特異性抗體(GCDB32、GCDB35、GCDB40、及GCDB43)與Fcγ受體之間的結合交互作用(圖8A至圖8D)。針對以上列出之Fcγ受體及雙特異性抗體之各者進行一輪Alpha Screen分析。所有樣本皆重複測定。在FcγRI上，該四種雙特異性抗體表現如同B21M hIgG4 PAA。即，彼等不比相應之同型對照更具競爭性。在FcγRIIIa上在hIgG1 WT對照組與該四種雙特異性抗體之間亦觀察到類似差異，其中GCD43最像IgG4PAA同型，而其他雙特異性抗體對FcγRIIIa具有略微較高的親和力。在FcγRIIa及FcγRIIb兩者上，該四種雙特異性抗體以下列次序競爭：GCDB40>GCDB32>GCDB43>GCDB35。GCDB40對FcγRIIa及FcγRIIb最具競爭性或係以最高親和力結合。事實上，GCDB40在FcγRIIa及FcγRIIb競爭達到與hIgG1 WT相同的程度，確證所觀察到在包括Fc阻斷劑時在T細胞媒介之細胞毒性測定中觀察到的效力偏移。由於與FcγRIIa及FcγRIIb之預期外的交互作用，GCDB40並未進至下一步。
競爭分級(binning)測定
評估抗GPRC5D mAb至人類GPCR5D細胞的互相競爭結合。簡言之，將細胞以50,000細胞/孔接種在50uL的培養基，並使其在37C下沉降90分鐘。接著，將孔用3% BSA在室溫下阻斷1小時。遵循標準程序，將mAb以釕(II)參-聯吡啶(ruthenium(II)tris-bipyridine)、N-羥琥珀醯亞胺(Ru標記)標示。在分開的96孔盤中，將5uM的競爭mAb與50nM的經Ru標示之mAb培養。自細胞盤移除阻斷溶液，並添加25uL的mAb溶液。經盤在室溫下振盪培養1小時。在將盤用PBS洗滌三次之後，添加150uL的MSD讀取緩衝 液(不含界面活性劑)，並使用MSD盤讀取器偵測經Ru標示之抗體的結合。
所有抗體屬於相同競爭組，其中僅GC5B420及GC5B421沒有完全被GC5B81、GC5B285、及/或GC5B332競爭(阻斷<70%)(表12)。鑑於相較於mAb之尺寸，GPRC5D之胞外域的小尺寸，吾人假定兩個mAb同時結合至GPRC5D在空間上可能為不可能的。
實例4：使用融合瘤技術產生GPRC5D抗體
在第0、10、及20天，將三隻Balb/c小鼠用pCMV6-neo(CMV促進劑)質體DNA表現性全長人類GPRC5D尾根部皮下免疫。小鼠在第59天接受最終腹腔內及靜脈內免疫，其係用大鼠嗜鹼性白血病(RBL)細胞過表現之全長人類GPRC5D。在第63天，收集淋巴結及脾臟，執行B細胞富集，且使用細胞產生~3500個分泌mAb之融合瘤。
實例5：透過融合瘤技術獲得之GPRC5D抗體的初步表徵化 GPRC5D結合
使用FACS針對至RBL及人類GPRC5D表現性RBL細胞的結合，對融合瘤進行篩選。計算各mAb結合至GPRC5D_RBL 細胞相對於未轉染之RBL細胞的經背景調整之MFI比率，並將任何結合比率大於3之樣本視為可能為正向。九十九個融合瘤具有大於3的比率並進至下一步用於v區選殖。三十一個mAb序列經辨識、合成、表現、及純化。31個mAb中之兩者展現高於背景的與RBL_GPRC5D細胞之結合(圖9A及圖8B)。選擇GCDB390及GCDB396用於表現、純化、及產生與抗CD3臂之雙特異性抗體，以分別產生雙特異性抗體GCDB46及GCDB47。
T細胞依賴性細胞毒性
在T細胞媒介之細胞毒性測定中評估GCDB46及GCDB47(圖10A及圖10B)。觀察到兩雙特異性抗體皆為有效，所報導之EC50分別為0.67及0.1nM。基於這些數據，兩mAb皆進至下一步以連同三種噬菌體衍生之mAb先導最佳化(lead optimization)。
實例6：命中評估、選擇、及最佳化
基於總結於表13之結合、功能、交叉反應性、及選擇性，選擇五個GPRC5D雙特異性抗體用於先導最佳化(GCDB32、GCDB43、GCDB35、GCDB46、GCDB47)。
先導最佳化之目的在於解決GCDB32(GC5B81親代mAb)、GCDB43(GC5B285親代mAb)、及GCDB35(GC5B164親代mAb)之潛在的轉譯後修飾(PTM)序列風險，如表14所概述。
所有經測定之GC5B81的PTM變體皆具有實質降低的結合親和力，說明此殘基(HC W102)對互補位(paratope)之關鍵性(表15)。
結合研究識別出GC5B285及GC5B164兩者之數種突變，其保有至人類GPRC5D的結合(表16及表17)。
表17：GC5B285 PTM庫之CDR序列及結合數據。將突變部位加底
基於此結合數據，將所選之mAb產生為GPRC5D x CD3雙特異性抗體，且針對H929細胞之T細胞媒介之細胞毒性進行評估(表18)。
在T細胞媒介之細胞毒性測定中觀察到一範圍之效力，其不必然是由所觀察之結合親和力預測。舉例而言，GC5B465及GC5B463以類似的親和力結合至人類GPRC5D，差別僅在於2個胺基酸序列(表17)，而作為GPRC5D x CD3雙特異性Ab觀察到效力具有12.5倍的差異(表18)。基於功能性數據，選擇GC5B465及GC5B483作為GC5B285(GCDB43為CD3雙特異性)及GC5B164(GCDB35為CD3雙特異性)之最佳化序列。
亦針對鼠類融合瘤衍生之GPCR5D mAb(分別以GC5B390及GC5B396、或GCDB46及47作為CD3雙特異性)完成 人類架構適應。結合研究識別出GC5B396之數種架構及GC5B390之一種架構，其保有至人類GPRC5D的結合(表19)。
基於結合數據，將數種抗GPCR5D mAb產生為CD3雙特異性抗體，且針對H929細胞之T細胞媒介之細胞毒性進行評估(表18)。功能性分析辨識出GCDB63、GCDB67、及GCDB69為有效且完全人化之GPRC5D x CD3雙特異性抗體。基於這些數據，選擇對應之抗GPRC5D mAb、GC5B515、GC5B532、及GC5B540作為GC5B390及GC5B391之完全人化序列。
接著，完成額外的完全人化序列之先導最佳化，其目的在於解決GC5B515、GC5B532、及GCDB540之潛在的轉譯後修飾序列風險。在重鏈序列產生G56S突變以移除GC5B515之潛在的脫醯胺風險(表20)。
GC5B532及GC5B540之重鏈含有潛在的異構化及氧化風險兩者。產生M64K及G99A突變以改善此風險(表20)。所有經測試之具有G99A突變的變體皆具有實質降低的結合親和力，而M64K及G56A變體則不受影響。基於結合數據，僅GC5B596進展至功能性評估，且在T細胞媒介之細胞毒性測定中作為CD3雙特異性(GCDB72)顯出效力。
因此，選擇四種GPRC5D雙特異性mAb用於額外表徵 化：GCDB32、GCDB53、GCDB61、及GCDB72。描寫於下表21及表22中者係用於產生雙特異性分子之GPRC5D mAb的CDR及重鏈和輕鏈序列。
實例7：製備具有IgG4 S228P、L234A、L235A之雙特異性格式之GPRC5D及CD3抗體
將4種單特異性GPRC5D抗體(請參見表21)表現為IgG4，其具有Fc取代S228P、L234A、及L235A或S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K(CD3臂)(根據EU索引編號)。亦產生包含VH及VL區之單特異性抗CD3抗體CD3B219，其具有SEQ ID NO：25之重鏈及SEQ ID NO：26之輕鏈，和具有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代之IgG4恆定區。
該等單特異性抗體係使用標準方法利用Protein A管柱(HiTrap MabSelect SuRe管柱)純化。在沖提之後，將儲集物透析至D-PBS、pH 7.2。
雙特異性GPRC5D x CD3抗體係藉由在活體外Fab臂交換中組合單特異性CD3 mAb及單特異性GPRC5D mAb而產生(如WO2011/131746中所述)。簡言之，將約1至20mg/mL之1.08：1莫耳比的抗GPRC5D/抗CD3抗體在PBS、pH 7至7.4、及75mM 2-巰乙醇胺(2-MEA)中混合在一起，並在25至37℃下培養2至6小時，接著使用標準方法經由透析、滲濾(diafiltration)、切向流過濾、及/或 旋轉細胞過濾來移除2-MEA。
GPRC5D x CD3雙特異性Ab之重鏈及輕鏈係顯示於下表23。
實例8：GCDB32、GCDB53、GCDB61、及GCDB72之功能性表徵化
評估GCDB32、GCDB53、GCDB61、及GCDB72至鼠類GPRC5D之結合(表24)。觀察到所有四種雙特異性抗體以一範圍之結合親和力結合至鼠類GPRC5D。
亦使用過表現之人類及食蟹獼猴GPRC5D細胞系的T細胞重新導向細胞毒性測定評估與食蟹獼猴GPRC5D之交叉反應(表 25)。一種GPRC5D x CD3雙特異性抗體係等效針對人類及食蟹獼猴GPRC5D(GCDB32)，而其他所測試之雙特異性在誘導食蟹獼猴GPRC5D之細胞毒性上相較於人類GPRC5D則較不具效力。
額外表徵化之目的在於了解活體外結合(圖11A至圖11E)及效力(表26)。
雖然觀察到一範圍之結合親和力，其中GCDB61係最強結合劑(binder)且GCDB72及GCDB32係最弱結合劑，但雙特異性抗體小組之活體外效力非常類似。然而，排名次序分析，GCDB72在各種經分析之B細胞系中最具效力。使用病患衍生之MNC的離體結合及效力實驗產出與活體外測定較大的類似結果(表27及圖15A和圖15B)。
表27：MM病患衍生之MNC的GPCR5D x CD3雙特異性抗體結合、
GCDB61對病患MNC具有最高結合親和力，而GCDB72及GCDB32係最弱結合劑。再一次，儘管觀察到結合親和力之差異，所有雙特異性抗體在T細胞重新導向細胞毒性測定中顯出次奈莫耳(sub-nanomolar)功效。分子在活體外及離體效力基礎上幾乎無法區別，然而活體內數據提供了差異(圖12A至12D)。
在注射人類PBMC一週後，將H929細胞植入NSG小鼠。雙特異性抗體處理係與植入H929細胞同時起始，並以每2或3天(q2d或q3d)10ug、1ug、及0.1ug/動物之劑量總共持續五個處理。各組使用十隻小鼠，並包括PBS作為媒劑對照組。在第11天停止處理，且在第26天終止研究(圖12A至圖12D)。所有在此預防性模型中測試之GPRC5D x CD3雙特異性分子在10及1ug/動物之劑量顯示100%腫瘤生長抑制。在最低劑量0.1ug/動物時觀察到差異，其中GCDB72較其他測試之雙特異性抗體顯出優越性，觀察到80%腫瘤生長抑制。
實例9：GPRC5D抗體在GPRC5D + MM1.R細胞系之結合概況。
使用FACS測量GPRC5D抗體在GPRC5D+人類MM細胞系(MM1.R，購自ATCC(美國菌種保存中心，American Type Culture Collection))之結合親和力。圖13顯示所有先導抗體皆以劑量依賴性方式結合至GPRC5D表現性MM.1R細胞，其中除了GC5B602以外，所有先導抗體之EC50值皆在0.10nM至135nm之範 圍內，GC5B602之值係顯著低於商業抗體FAB6300(R& D Systems，批號FAB6300A，植株編號571961)之值，產出121.7nM之EC50值。
將GPRC5D+ MM1.R細胞系用各種濃度的先導抗體染色60分鐘，以測量表面結合概況(n=3)。使用經藻紅素標示之人類IgG4Fc作為二級抗體以捕捉訊號(Southern Biotech，殖株HP6025，批號9200-09)。結合係藉由FACS判定以正規化幾何平均螢光強度表示。在GraphPad Prism 6中使用具有可變斜率(四個參數)的非線性回歸及最小平方法擬合法來完成數據繪圖及擬合。
此外，使用三種GPRC5D+(JIM3、OPM-2、及MM.1R；購自ATCC之細胞系)多發性骨髓瘤細胞系，與商業抗體比較來評估GPRC5D mAb GC5M481結合概況(圖14A)。另外，使用食蟹獼猴GPRC5D表現性道迪細胞概況化GPRC5D mAb(GC5M481)之食蟹獼猴交叉反應性，其相較於親代細胞顯示強的結合(圖14A)。同樣，當使用GPRC5D+(JIM3、OPM-2、及MM.1R)細胞系評估結合潛力時(圖14B)，相較於同型對照組(灰色填充之虛線)，五種GPRC5D x CD3雙特異性抗體(GCDB32、GCDB48、GCDB53、GCDB61、及GCDB72)顯示顯著的結合，如由分布圖中之偏移而顯而易見(黑色實線)。
實例10：GCDB72針對在PBMC人化NSG小鼠中之皮下MM.1S人類多發性骨髓瘤異種移植物的抗腫瘤功效。
執行此活體內研究以判定GCDB72針對在PBMC人化NSG小鼠中建立之MM.1S人類多發性骨髓瘤(MM)異種移植物的功效。在研究第0天，向類似體重和年齡之雌性NSG小鼠在右背側後脇部皮下(sc)植入MM.1S人類MM細胞(每隻小鼠用1×107個細胞於200μL PBS中)。在植入腫瘤細胞後第7天，經由側尾靜脈靜脈內注射1×107個人類PBMC(於200μL PBS中)。處理在當平均腫瘤體積大約為72至78mm3的第15天起始，各小鼠接受靜脈(iv)投予PBS或 GCDB72 DuoBody抗體(0.1μg(0.005mg/kg)、1μg(0.05mg/kg)、10μg(0.5mg/kg)、及50μg(2.5mg/kg))。空DuoBody對照組、CD3 x空、及空x GPRC5D各以每隻小鼠10μg給藥。處理係大約每三天(q3d)投予，總共七次給藥。在兩個高劑量(10μg及50μg)的GCDB72觀察到穩健的抗腫瘤功效，其中MM.1S sc腫瘤在研究結束時，在100%(每組10隻中之10隻)的動物中完全消退(圖16)。再者，相較於經PBS處理之腫瘤，每隻小鼠1μg的劑量顯著地抑制65%腫瘤生長(p0.0001)，而0.1μg劑量具有極小的效果(TGI=19.3%，p=0.0023)。未將CD3 x空之效果視為有效(TGI=28%，p0.0001)，且空x GPRC5D具有可忽略的效果(3.1% TGI，p=0.9971)。在當每組有至少80%存活動物的第36天，判定TGI。在第36天由於GVHD，開始顯現顯著的體重減輕及/或死亡率。在當有60%或更少動物留在組中的第43天，終止研究。
實例11：GPRC5D抗體的抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)
將一小組抗人類GPRC5D mAb產生成IgG1 mAb。此外，如實例2中所述產生新的一小組抗人類GPRC5D mAb。描寫於下表28及表29中者係新的GPRC5D mAb之CDR及重鏈和輕鏈可變區序列。這些新的抗體係用於如實例7中所述產生雙特異性CD3分子，且亦作為IgG1 mAb併入以用於ADCC活性評估。
針對H929細胞之ADCC活性(表30及表31)。簡言之，將多發性骨髓瘤細胞在室溫下用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)標示30分鐘，並在兩次PBS洗滌之後，以0.2×106/ml再懸浮於RPMI+10% HI FBS中。將PBMC解凍，並在PBS洗滌之後，以每ml 3×106個細胞再懸浮於RPMI生長培養基。將10000或50000個目標細胞在抗體存在下與100000或2500000個PBMC混合，並在37℃下在CO2培養箱中培養3小時。在培養之後，將盤以200g離心4分鐘，且將100ul的上清液轉移至新的96孔盤，並在485/535nM測量螢光強度。將RFU值作圖以計算裂解百分比。
觀察到一範圍之效力，其在2pM至27.7nM之範圍內。結合親和力不必然預示在ADCC測定中之功效。舉例而言，GC5B382及GC5B379對人類GPRC5D細胞具有類似的結合親和力，但在ADCC測定中針對H929細胞之細胞毒性具有15倍的差異。類似地，作為GPRC5D x CD3雙特異性之細胞毒性誘導並未預示在ADCC測定中之效力，如由GC5B370及GC5B602所例示。當格式化為CD3雙特異性時，GC5B602(GCDB63)針對H929細胞具有次奈莫耳效力，而作為CD3雙特異性之GC5B370(GCDB41)基本上不具活性。相同v區當格式化為IgG1 mAb時在ADCC測定中導致相反的觀察結果，觀察到GC5B370較GC5B602有效(~1100x倍)。
序列表簡單說明
【序列表】
本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2017年6月28日)被命名為PRD3422USNP_SL.txt且檔案大小為57,673位元組。
<110> 楊森藥廠(JANSSEN PHARMACEUTICA NV)
<120> 抗GPRC5D抗體、結合GPRC5D及CD3 的雙特異性抗原結合分子、及其用途
<130> PRD3422WOPCT
<140>
<141>
<150> 62/364,811
<151> 2016-07-20
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成 多肽」
<400> 99
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註=「人工序列說明：合成 多肽」
<400> 100

Claims (65)

  1. 一種特異性結合至GPRC5D的單離抗體或其抗原結合片段，其包含：a.具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(CDR1)、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈CDR3；b.具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR3；c.具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR3；d.具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3；e.具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3；f.具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈CDR3；g.具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：73之胺基酸序列的重鏈CDR3；h.具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR3；i.具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：74之胺 基酸序列的重鏈CDR3；j.具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3；k.具有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3；l.具有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的重鏈CDR3；或m.具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：77之胺基酸序列的重鏈CDR3。
  2. 如請求項1所述之單離抗體、或抗原結合片段，其中a.包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有 SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：73之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：74之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：69之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：75之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含具有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：68之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：76之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：79之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或m.包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有 SEQ ID NO：71之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：77之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  3. 一種單離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至GPRC5D，且包含選自由以下所組成之群組的可變重(VH)鏈區：SEQ ID NO：52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91。
  4. 如請求項3所述之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下所組成之群組的可變輕(VL)鏈區：SEQ ID NO：56、57、58、92、93、或94。
  5. 如請求項3所述之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下所組成之群組的VH區：SEQ ID NO：52、53、54、55、82、83、84、85、86、87、88、89、或91；及選自由以下所組成之群組的VL區：SEQ ID NO：56、57、58、92、93、或94。
  6. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：52、53、或83且與包含SEQ ID NO：56之VL鏈區配對。
  7. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：54、84、85、86、或90且與包含SEQ ID NO：57之VL鏈區配對。
  8. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：55或88且與包含SEQ ID NO：58之VL鏈區配對。
  9. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：82或87且與包含SEQ ID NO：92之VL鏈區配對。
  10. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：89且與包含SEQ ID NO：93之VL鏈區配對。
  11. 如請求項5所述之抗體，其中該VH鏈區包含SEQ ID NO：91且與包含SEQ ID NO：94之VL鏈區配對。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的 多肽。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組者。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
  17. 如請求項1至9中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其係IgG1或IgG4同型。
  18. 如請求項17所述之抗體，其中該IgG1在其Fc區具有K409R取代。
  19. 如請求項17所述之抗體，其中該IgG1在其Fc區具有F405L取代。
  20. 如請求項20所述之抗體，其中該IgG4在其Fc區具有F405L取代及R409K取代。
  21. 如請求項16所述之抗體，其進一步在其Fc區包含S228P取代、L234A取代、及L235A取代。
  22. 如請求項1至14中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人類GPRC5D並與食蟹獼猴(cynomolgus monkey)GPRC5D交叉反應。
  23. 如請求項17所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段在活體外以小於約28nM的EC 50誘導ADCC。
  24. 一種單離細胞，其表現如請求項1至11中任一項所述之抗體或抗原結合片段。
  25. 如請求項24所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
  26. 如請求項24所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。
  27. 一種單離GPRC5D x CD3雙特異性抗體，其包含： a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成特異性結合GPRC5D之第二抗原結合部位，或其GPRC5D x CD3雙特異性結合片段。
  28. 如請求項27所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC1包含SEQ ID NO：25，且LC1包含SEQ ID NO：26。
  29. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：52，且LC2包含SEQ ID NO：56。
  30. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：53，且LC2包含SEQ ID NO：56。
  31. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：54，且LC2包含SEQ ID NO：57。
  32. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：55，且LC2包含SEQ ID NO：58。
  33. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：82，且LC2包含SEQ ID NO：92。
  34. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：83，且LC2包含SEQ ID NO：56。
  35. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合 片段，其中HC2包含SEQ ID NO：84，且LC2包含SEQ ID NO：57。
  36. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：85，且LC2包含SEQ ID NO：57。
  37. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：86，且LC2包含SEQ ID NO：57。
  38. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：87，且LC2包含SEQ ID NO：92。
  39. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：88，且LC2包含SEQ ID NO：58。
  40. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：89，且LC2包含SEQ ID NO：93。
  41. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：91，且LC2包含SEQ ID NO：94。
  42. 如請求項28所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：85，且LC2包含SEQ ID NO：57。
  43. 如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
  44. 如請求項43所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG4同型。
  45. 如請求項27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異 性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合人類骨髓瘤細胞表面上的GPRC5D。
  46. 如請求項27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合人類多發性骨髓瘤細胞表面上的GPRC5D。
  47. 如請求項27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在活體外以小於約0.22nM的EC 50誘導人類T細胞活化。
  48. 如請求項27至42所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在活體外以小於約0.89nM的EC 50誘導表現GPRC5D之細胞的T細胞依賴性細胞毒性。
  49. 一種單離細胞，其表現如請求項27至42中任一項所述之抗體或雙特異性結合片段。
  50. 如請求項49所述之細胞，其中該細胞係融合瘤。
  51. 如請求項49所述之細胞，其中該抗體或雙特異性結合片段係經重組生產。
  52. 一種請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製備治療癌症患者之醫藥品。
  53. 一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含：投予治療有效量的如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以抑制癌細胞之生長或增生。
  54. 一種將T細胞重新導向至GPRC5D表現性癌細胞之方法，該方法包含：投予治療有效量的如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
  55. 如請求項52、53、或54所述之方法，其中該癌症係血液性癌症。
  56. 如請求項55所述之方法，其中該血液性癌症係GPRC5D表現性B細胞癌。
  57. 如請求項56所述之方法，其中該GPRC5D表現性B細胞癌係多發性骨髓瘤。
  58. 如請求項52所述之方法，其包含投予第二治療劑。
  59. 如請求項58所述之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或靶向抗癌療法。
  60. 如請求項59所述之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。
  61. 如請求項59所述之方法，其中該第二治療劑係與該雙特異性抗體同時、依序、或分開投予至該對象。
  62. 一種醫藥組成物，其包含如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  63. 一種用於藉由培養如請求項49至51中任一項所述之細胞來產生如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的方法。
  64. 一種單離合成性多核苷酸，其編碼如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2。
  65. 一種套組，其包含如請求項27至42中任一項所述之GPRC5D x CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及/或如請求項63所述之多核苷酸及用於上述者之包裝。
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