JPH05508553A - マウスモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクローナル抗体及びその用途に関する。

特に、本発明は多くの種類の癌の治療及び診断に有用なり１、Ｂ３及びＢ５と称 される３種のモノクローナル抗体に関する。

従来技術 放射線又は化学療法のような転移性ヒト癌に関する現在の治療は、急速に増殖す る癌細胞を選択的に殺す薬剤に集中している。残念ながら、多くの腫瘍は骨髄又 は胃腸管の上皮のような重要な正常組織と比較して異常に速い増殖速度を示さな い。他群の治療手段では治療のため腫瘍細胞の表面上における独特な化学構造を 標的にし、これら標的分子と選択的に結合する抗体がほとんどの場合で用いられ る。これら治療手段の１つは植物又は細菌毒素のような殺細胞剤と結合させた抗 体を用いる。これらの抗体−毒素複合体、すなわちイムノトキシンは、組織培養 物及び実験動物におけるモデル腫瘍系で腫瘍細胞を選択的に殺せることが示され た（Ｐａｓｔａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ。

４７：６４１−４８（１９８６）。ヒトの治療のためこのような腫瘍特異性抗体 を単離する多くの試みにもかかわらず、他の重要な正常組織とではなく腫瘍細胞 とのみ選択的に結合する抗体は極めてわずかに確認されたにすぎない。したがっ てこのような腫瘍特異性抗体の単離は、このような免疫指向性療法の適用にとり 重要である。

最初にＫｏｈｌｅｒ及びＭｆｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１５８：４９５−９ ７（１９７５））により記載され及びＫｏｐｒｏｖｓｋｉら（米国特許第４，１ ７２．１２４号明細書）で開示されたようなモノクローナル抗体法によれば、治 療剤の作製上純粋な形で抗体を単離することができた。しかしながら、２つの問 題が多くの既に単離された抗体の適用を妨げた。第一に、腫瘍細胞と反応する多 くのモノクローナル抗体は重要な正常ヒト組織とも反応する。第二に、単離され た抗体の多くは、エンドサイト−シスによる細胞内への毒素複合体の侵入を効率 的に媒介しない表面因子と結合してしまう。本発明には多くの重要な正常組織と ではなく一部のヒト腫瘍と選択的に結合する３種のモノクローナル抗体Ｂ１、Ｂ ３及びＢ５が含まれる。これらの抗体は、イムノトキシンの標的因子として取り 込まれた場合に、これらの毒性剤が細胞内に効率的に侵入できることも示された 。

以前に、ルイスＹ抗原と反応する抗体が単離され及び特徴付けされた。最近、ル イスＹ抗原と反応する２種の抗体ＢＲ６４及びＢＲ９６が記載され（Ｈｅｌｌｓ ｔｒｏｍ　ｅｔａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、５０：２１８３−９０（Ｌ９ ９０））　、その一方はヒト心筋中における毛細血管との反応性のため免疫療法 に有用でない。しかしながら、ＢＲ９６はこの抗体で作製されたイムノトキシン を有用にするかもしれない反応性を示す。免疫化のため異なる種々の細胞を用い かつ形態学的スクリーニング法を用いて単離された前記３種の新規モノクローナ ル抗体Ｂ１、Ｂ３及びＢ５は、ＢＲ９６と類似しているがしかし同一ではない。

腫瘍、正常組織及び炭水化物エピトープとの反応性に関するこれらの差異は、こ れら３種の新規抗体を一部の種類のヒト癌の治療及び診断にとり有用にするかも しれない。

発明の要旨 本発明はＢ１、Ｂ３及びＢ５と称される３種のモノクローナル抗体及びそれらの 用途に関する。

Ｂｌ、Ｂ３及びＢ５は、種々のムチン産生及びムチン非産生霊長類癌腫に対して 強い反応性を示す。このため、これらの抗体はヒト癌の診断及び治療で利用され る標的化治療剤の設計上有用である。

特に、本発明は細胞表面エピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生ずるバ イプリドーマに関するが、上記エピトープは正常霊長類組織、悪性ヒト培養細胞 系及びヒト腫瘍で発現することを特徴とする。

本発明は上記性質を有する細胞表面エピトープに特異的なモノクローナル抗体も 含む。上記モノクローナル抗体のクラスはＩｇＧ又はＩｇＭである。

前記悪性ヒト培養細胞系はＡ４３１、ＭＣＦ−１、■ＴＢ２０及びＨＴＢ３３か らなる群より選択される。正常霊長類組織は、例えば、食道、膀胱又は胃に由来 する。

前記ヒト腫瘍は結腸、胃又は卵巣癌腫に由来する。

本発明はまた、各々１９９０年１０月１２日付で受託された受託番号ＡＴＣＣＨ Ｂ１０５７２．１９９０年ｌＯ月１２日付で寄託されたＨＢ１０６７３及び１９ ９０年１０月１０日付で寄託されたＨＢ１０６６９を有する３種の別々のハイブ リドーマに関する。

受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０５７２のハイブリドーマにより産生されるモノクロー ナル抗体はＢ１である。受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０６７３のハイブリドーマによ り産生されるモノクローナル抗体はＢ３であり受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０６６９ のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体はＢ５である。

更に本発明は、治療を行う上で十分な量のモノクローナル抗体の複合体を治療が 必要な患者に投与することからなる癌の治療法も含む。モノクローナル抗体を、 例えば、毒素、放射性核種又は化学療法剤と結合させる。毒素とは例えばシュー ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）エクソトキシンである。化学療法剤とは、 例えば、ビンブラスチン又はダウノマイシンである。

本発明は、 患者から血液サンプルを採取し、 癌流出抗原と反応させて抗原−抗体複合体を形成させるために十分な量のモノク ローナル抗体を上記サンプルに加え、そして 上記複合体の存在又は不存在を調べることによって癌が上記患者に存在するか否 かについて検出する工程からなる患者における癌の診断法も含む。

更に、本発明は、 患者から組織又は液体サンプルを取り出し、モノクローナル抗体をサンプルに加 え、そしてサンプル中における抗体の存在を視覚化する工程からなる患者におけ る癌の診断法も含む。

本発明は、腫瘍増殖を阻害するために十分な濃度のモノクローナル抗体を薬学上 許容されるキャリアと共に含む医薬組成物も含む。

図面の簡単な説明 図１は、マウスにおけるＢ　Ｅ　−Ｐ　ＥＡｒｇ５７の抗腫瘍活性について表し たものである。ヌードマウス（２０ｇ）はＯ８目に３×１０６個の細胞を皮下注 射された。処置は、−回当たり０．７５μｇの投与量で４．６及び８日月に腹腔 内で行われた。

発明の詳細な説明 本発明の８１及びＢ３モノクローナル抗体を作成するために、マウスを正常ヒト 腎臓膜に対して寛容化させ、ＭＣＦ　−７細胞で免疫することができる（Ｍａｙ 　ｅｔ　ａｔ、。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｃａｔ ａｌｏｇ　ｏｆ’　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｆｄｏｍａｓ　（Ｍ ａｙ　ｅｔ　ａｌ、、ＡＴｃｃ　１９Ｈ）、８ｔｈ　Ｅｄ、（１９８９）；Ｍａ ｔｔｈｅｖ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉ−ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１００ニア ３−８２（１９８７）及びＷｉｌｌｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８４：２４７４−７８（１９ｇ７））。逆に、Ｂ５モノクローナル抗体を作成す るためには、マウスを寛容化せずにＡ４３１細胞で免疫することができる（Ｍａ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、前掲）。次いで免疫マウスから牌臓を摘出し、懸濁化した細 胞を、例えばポリエチレングリコールを用いてＡＧ８マウスミエローマ細胞と融 合させることができる。適切なりローンはスクリーニング操作が実施された後に 選択できる。１回のスクリーニング操作では、正常ヒト肝臓、腎臓又は結腸組織 とではなくヒト結腸癌及び胃癌と反応するクローンを選択する。この選択過程は 、癌の選択的ヒト免疫療法においてこのような抗体を使用するために正常組織よ りもむしろ腫瘍と反応するクローンを選択する上で重要である。

このような抗体をサブクローニングした後、クローンのイソタイプが決定できる 。本発明者らはＢ１及びＢ３クローンに関するイソタイプがＩｇｏｌにであり、 −万Ｂ５クローンに関するイソタイプがＩｇＭであることを確認した。抗体はク ローンの上澄から精製できる。

抗体が産生されたら、それらの性質が特徴付けられる。

例えば、霊長類組織エピトープがＢ１、Ｂ３及びＢ５抗体と反応する性質を正確 に特徴付けることができる。

反応性は、免疫組織化学法を用いて生細胞の表面への検出しうる結合性として定 義される。重要な正常組織にではなく腫瘍に対して毒性である標的剤が設計され るような決定が必要である。

正常ヒト組織、ヒト腫瘍及び正常カニクイザル組織に関する反応性の分布が下記 表Ｉに要約されている。

表■に示されるように、Ｂ１、Ｂ３及びＢ５反応性エピトープはすべて胃及び小 腸のムチン、食道の分化細胞層、扁桃、気管及び膀胱の上皮において種々の量で みられる。Ｂ１、Ｂ３及びＢ５モノクローナル抗体と反応するこれらのエピトー プ又は抗原は、膵臓、唾液腺及び乳腺の場合のような不均一に分布した覆々の他 の上皮でもみることができる。Ｂ３は胎児内皮と反応する能力を有しており、こ れはＢ３モノクローナル抗体が胎児発育で発現される抗原を表すことを示唆して いる。

更に表Ｉに示されるように、Ｂ１、Ｂ３及びＢ５抗体の反応性の全体的パターン は、ＢＲ９６と称される既に単離された抗体の反応性のパターンとは異なる（Ｈ ｅｌ　ｌ５ｔｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、５０：２１８３− ９０（１９９０））ｏ　Ｂ　Ｒ９６はＢ１、Ｂ３及びＢ５で観察される場合と同 じ反応性パターンを一部示す。例えばＢＲ９６反応性は、Ｂ１及び８３反応性の ようにヒト腎臓における遠位尿細管で特に著しい。しかしながら腎臓細管、肺臓 の１１型肺胞、結腸及び膵管のムチンにおけるようなある部位においては、これ ら４種の抗体間には明確な差異がある。例えば、ＢＲ９６反応性はＢ５反応性の ように正常ヒト結腸サンプル中のムチンに存在しない。このような情報は治療目 的で投与されるモノクローナル抗体が正常組織に対して毒性であるか否かについ て調べる上で重要である。

上記４種の抗体は正常サル組織でも評価できる（表■参照）。ヒトサンプルの場 合に類似した組織が反応性である：しかしながら、ヒト組織と同様に、腎臓細管 、小腸ムチン、膀胱上皮、膵臓、頚部ムチン、子宮内展線並びに気管及び舌の上 皮におけるＢ１、Ｂ３、Ｂ５及びＢＲ９６反応性の間には明確な差異がある。こ れらの差異はこれら抗体の各々が異なるエピトープを認識することを示す。この ため、そのエピトープの化学構造は異なる。

種々の癌細胞系を免疫螢光法を用いてＢ１、Ｂ３、Ｂ５及びＢＲ９６との反応性 に関して試験することもできる。このような研究の結果は下記表■に示されると おりである。

表■ ヒト培養細胞系におけるＢ１、Ｂ３、Ｂ５及びＢＲ９６の免疫螢光局在 細胞系　且　Ｕ　閃　ＢＩ？９６ ＾４３１（類表皮癌）　＋＋十ｈＢ１　＋＋＋＋ｈＢｔ＋＋＋＋ｈＢｔ＋＋＋＋ ＭＣＦ−７（乳癌）　＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋　＋÷十＋０ＶＣＡＲ−３ （卵巣癌）　−＋＋十＋１１６ｊ　＋＋＋＋ＫＢ　（頭痛）　＋／−ｈｅｔ　＋ ＋＋＋ｈｅｔ　−ＨＴ−２９（結腸癌）　＋　＋＋＋＋　＋＋＋十ｈＢｔ＋／　 −ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）　＋＋＋＋　＋＋＋＋　ｌｄ　＋＋＋＋Ｄυ１ ４５（前立腺癌）　＋ｈＢｔ＋＋ｈｅｔ　＋＋＋＋１１６ｔ＋＋＋＋ＨＴＢ２０ （乳癌）　＋＋＋　＋＋＋　＋十＋＋ｈＢ＠　＋＋＋ＨＴＢ３３（頭痛）　＋＋ ＋　＋＋＋１１６ｊ　＋＋＋＋１１６ｊ　＋＋＋ｈｅｔ−不均一；（−）−陰性 ；（十−弱い陽性；＋十−中度：÷＋十−強度；　＋＋＋＋−非常に強い）；ｎ ｄ−決定されず表■で明らかに示されるように、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ５及びＢＲ９６ は一部の細胞系と均一に反応する。しかしながら、特１．：　ＯＶ　ＣＡ　Ｒ− ３、ＫＢ及びＨＴ−２９細胞に関する反応性には差異がある。同様に、このよう なデータは４種の抗体により認識されるエピトープが構造的観点から異なること を示唆している。更に、エピトープ構造及びその結果としてのモノクローナルと の反応性におけるこのような差異は一部の患者で治療上有利であろう。

腫瘍は、ペルオキシダーゼ免疫組織化学法を用いて４種の抗体と反応する抗原の 発現に関して試験することもできる。表■（下記）はＢ１、Ｂ３、Ｂ５及びＢＲ ９６抗体が結腸及び胃起源の癌腫並びに粘液性卵巣癌腫とよく反応することを示 している。反応性は少数の乳癌、食道癌及び他の癌腫で検出することができる。

表■、■及び■の結果はＢ１、Ｂ３及びＢ５が多くの一般腫瘍と反応し、限られ た数の正常組織部位と明らかに反応することを示す。加えてこれらの抗体は、一 部の各種組織サンプルで反応性に関して明確な差異を示し、それらが検出する正 確なエピトープが異なることを示している。

Ｂ１、Ｂ３及びＢ５エピトープを保持するＭＣＦ−７細胞が放射性アミノ酸を用 いて代謝標識され、しかる後抽出され、抽出物が免疫沈降された場合、Ｂ１、Ｂ ３及びＢ５で沈降される分子の反応種はゲル電気泳動及びオートラジオグラフィ ーで分析することができる。Ｂ１及びＢ３は、非常に高い分子量（＞　２５０． ０００ドルトン）のタンパク質のバンドを特異的に免疫沈降させ、これは高分子 量ムチンとの反応性に一致する。Ｂ５はＩｇＭ抗体であるため、技術的理由から この方法は反応性タンパク質を特異的に示すことができない。

モノクローナル抗体Ｂ１、Ｂ３及びＢ５はイムノトキシン作製用の標的化剤とし て用いることができ、その場合にそのモノクロ−チル抗体は毒素、例えばシュー ドモナスエクソトキシン、に結合させられる（下記表■参照）ｏ　Ｐａ５ｔａｎ ら（米国特許第４，５４５．９８５号明細書）で既に開示されたように、シュー ドモナスエクソトキシンとモノクローナル抗体との複合体は、抗体のエピトープ 反応性部位によって標的とされた細胞を殺す上で効力を示す。次いで、Ｂ１、Ｂ ３又はＢ５をこのような毒素に結合させることによって得られた構成物は、これ らのモノクローナル抗体と反応性である腫瘍を有した患者に導入され、イムノト キシンは患者内で腫瘍細胞と結合して、それらを殺す。これらのモノクローナル 抗体と反応性である正常組織も抗原性部位が血液の循環と近接しているならば影 響をうける。胃腸管の腔内でのムチンとの反応のような、Ｂ１、Ｂ３及びＢ５と 反応性である抗原の発現部位の多くの場合において、反応性エピトープは、免疫 組織化学法によると、血液循環と比較的近接していないようである。このため、 このようなイムノトキシンの毒性効果がヒト患者にあるという全体的確実性に関 して予測することは不可能である。しかしながら、これらの表面抗原を発現する 腫瘍細胞はそれらをイムノトキシンに近接させない位置にはまれにしか存在せず 、シたがって腫瘍細胞はＢＩＢ３又はＢ５を用いて作製されたイムノトキシンに よる標的化殺細胞作用をうけやすい。

表■ Ｂ３とリジン５７がアルギニンに変換されたシュードモナスエクソトキシン変異 体から構成されるイムノトキシン （Ｂ　３−　Ｐ　Ｅ”ｇ５７’ｉ　）活性Ａ４３１類表皮癌　０．２　＞１０［ ＩＭＣＦ−７乳癌　ＯＪ　＞１００ ここでＩＤ５ｏとは１６時間インキュベートで５０％までタンパク質合成を阻害 する薬剤の濃度である。

モノクローナル抗体に結合させた細菌又は植物毒素に加えて、他のエフェクター 剤もヒト癌を治療又は診断するため標的化モノクローナル抗体と共に用いてもよ い。

例えば、腫瘍と結合する抗体に結合させた放射性核種は、放射線の高局在濃度に よって殺細胞を起こすことができる。化学療法剤、例えばビンブラスチン又はダ ウノマイシン、は抗体に結合させて、抗体と反応する細胞に高濃度で放出されう る。Ｂ　１、Ｂ３及びＢ５は、患者に導入された場合に反応性ヒト腫瘍をうまく 退行させるようなエフェクター剤の組合せに標的機構を与える。

癌患者における腫瘍へのイムノトキシンの標的化に加えて、周囲組織中に流出し 、血流により取り出されると予想される、遠隔部位で採取された血液サンプルで 検出ｊ２うる腫瘍細胞上の表面ムチンのような物質をもこれらの抗体は認識する 。このような流出抗原は、これらの流出抗原と反応する抗体を用いた初期癌及び 再発癌の診断にとり有用であることとされている。この抗原のうち現行上有用な 例は、再発を予想するか又は腫瘍の初期診断を確認するために卵巣癌の患者由来 の血清で分析できるＣＡ１２５抗原である。したがって、ＢＩ　Ｂ３及びＢ５を 腫瘍の診断に使用することができる。

またこれらの抗体とある種の腫瘍細胞との選択的反応性は、腫瘍のタイプ及び起 源を明らかにする腫瘍の解剖病理学的診断において、更に特定群の細胞が前腫瘍 の再発又は他所の別の初期腫瘍の発生を表すか否かについて活用することができ る。このような診断決定は各特定の患者における抗腫瘍療法のその後の計画にと り有用である。特に、組織切片（例えば、生検）又は細胞学的調製品（例えば、 Ｐａｐ塗抹標本、滲出液）での免疫組織化学病理学的診断は本発明のモノクロー ナル抗体を用いて実施できる。

このような標的化抗体のもう１つの可能な用途は、外部ボディスキャン（ｅｘｔ ｅｒｎａｌ　ｂｏｄｙ　ｓｃａｎｎｉｎｇ）　（画像化診断）又は診査手術時に 放射線検出プローブを用いる位置決定のいずれかにより検出しうる放射性同位元 素に結合させた抗体Ｂ１、Ｂ３又はＢ５を用いる肉眼的な腫瘍の病巣の診断であ る。

マウスモノクローナル抗体として単離されたＢ１、Ｂ３及びＢ５の初期クローン に加えて、ヒトのような他の種の不変領域を組み込んだこれら抗体の不変領域の 変更も実施できるが、その場合に得られた抗体はヒト患者に導入された場合に外 来抗原自体として低い免疫原性を示す。医薬組成物もそのモノクローナル抗体を 用いて得ることができる。

更にこれら抗体の可変領域に関与する遺伝子も単離でき、標的化剤は、毒素遺伝 子のような他のタンパク質あるいは直接又は免疫系のような内在メカニズムの活 性化のいずれかにより細胞を殺すように命じうる他のエフェクタータンパク質に 関する遺伝子とタンデムにしてこれらの可変領域遺伝子を用いて構成することが できる。免疫グロブリン遺伝子の可変領域は、抗体Ｂ１、Ｂ３及びＢ５と反応す る抗原を発現する標的細胞にキメラ抗体毒素タンバグ質を結合させてそれらを殺 すことができる抗原結合部位についてコードする。

本発明は、本発明を制限しない下記例により説明できる。

ヒト腫瘍細胞系０ＶＣＡＲ−３、ＫＢ、ＭＣＦ　−７、ＨＴ−２９、ＭＤＡ−Ｍ Ｄ−４６８、ＤＵ１４５、ＨＴＢ２０及びＨＴＢ３３は既に記載されている（Ｈ ａｙ　ｅｔａｌ、、Ａｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ　Ｃａｔａｌｏｇ　ｏｆＣｅｔｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｊ ｄｏｓａｓ、８ｔｈ　Ｅｄ、（１９８８））。抗体Ｂ１及びＢ３の場合、マウス を正常ヒト腎臓膜に対して寛容化させ（Ｍａｔｔｈｅｖ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉ ｖｗｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１００ニア３−８２（１９７ｇ））、既に記載 された方法（Ｖｉｌｌｉｎｇｈａｓ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：２４７４−７８（１９ ７ｇ））を用いてＭＣＦ−７細胞で免疫した。抗体Ｂ５の場合には、マウスを寛 容化させず、Ａ４３１細胞で免疫した。免疫マウスから膵臓を摘出し、懸濁した 細胞をＡＧ８マウスミエローマ細胞と融合させた。得られたクローンは各々Ｂ１ 又はＢ３及びＢ５に関して生ＭＣＦ−７及びＡ４３１細胞でローダミン間接免疫 ケイ光法を用いるスクリーンファースト（ＳｃｒｅｅｎＰａｓｔ）　［Ｌｉｆｅ 　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ゲイザースバーグ、ＭＤＩ大規模スク リーニングチャンバーで２週間後にスクリーニングした。選択されたクローンは 、ヒト腫瘍及び正常組織のクリオスタット切片でペルオキシダーゼ免疫組織化学 法を用いて二次スクリーニングした。ヒト結腸癌及び胃癌と反応したが、正常ヒ ト肝臓、腎臓又は結腸と反応しないクローンＢ１、Ｂ３及びＢ５を選択した。サ ブクローニング後これらクローンのイソタイプを、クローンＢ１及びＢ３に関し てはＩｇＧ体は無血清規定培地及び硫酸安沈殿沈降を用いてこれらクローンの上 澄から精製した。

例■ ヒト無腫瘍組織、ヒト腫瘍及びサル組織における抗体Ｂ１、Ｂ３及びＢ５と反応 する抗原の分布決定正常ヒト組織、カニクイザル組織及びヒト腫瘍のサンプルを 新鮮凍結し、クリオスタット切片を一次抗体としてＢ１、Ｂ３及びＢ５を用いて 既に記載されたような（Ｈｌｌｉｎｇｈａｍ、ＰＯＣＵＳ、１２：６２−６７（ Ｌ９９０））ペルオキシダーゼ免疫組織化学法で調製した。抗体の局在化はジア ミノベンジジンを用いてペルオキシダーゼ基質反応の進行により検出した。組織 切片は扁桃、胃、食道及び膀胱の上皮と小腸及び結腸のムチンにおいてＢ１、Ｂ ３及びＢ５の主要な反応性を立証した。同様の局在化はサルの食道、小腸、胃、 膀胱、唾液腺及び膵臓組織でみられたが、異なる抗体間の一部の差異が着目され る（表Ｉ参照）。ヒト腫瘍は結腸、胃、卵巣及び食道の癌腫でＢｌ、Ｂ３及びＢ ５に関して強い反応性を示したが、可変的な局在化は乳房、頚部、前立腺、子宮 内膜及び肺臓由来の癌腫でみられる（表■参照）。表■でみられる場合を除きす べての局在化は、細胞の表面上に存在すると思われる抗原反応を表し、これらの 部位を免疫療法用の可能な標的とすることができる。

例■ 抗腫瘍剤としてのＢＥ−ＰＥの有効性の決定Ｂ３を既に記載されたように（Ｗｌ ｌｌｌｎｇｈａｓ　ｅｔ　ａｌ、ｅＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．Ｕ ＳＡ、８４：２４７４−７８（１９７８））　シュードモナスエクソトキシンに 結合させた。これを行うため、ＰＥのリジン５７がアルギニンに変異されたＰＨ の変異体ｃ　ｐ　ｒ：　Ａｒｇ５７　＞を用いた。イムノトキシンを精製し、組 織培地で試験したところ、標的とするＡ４３１及びＭＣＦ−７細胞を殺すことが 示された（表■）。コントロール抗体（ＭＯＰＣ２１）もＰＥＡｒｇ５７に結合 させたが、それは殺細胞活性を有しなかった。次いでＢ５−ＰＥ”ｇ５７をマウ スに腹腔内投与した。マウスにＳｃ０万個のＡ４３１癌細胞を０日目に移植した ところ、そのマウスは４日目までに急速に増殖している小さな癌を有していた。

イムノトキシンを図１で示されたように４．６及び８日目に腹腔内投与したとこ ろ、腫瘍は退行し、見掛は上消失したが、一方希釈液で処置されたコントロール の動物では腫瘍が急速に増殖した。

日　数 要　約　書 本発明はモノクローナル抗体及びその用途に関する。

特に、本発明は多くの種類の癌の治療及び診断に有用なり１、Ｂ３及びＢ５と称 される３種のモノクローナル抗体に関する。

補正書の謳訳文提出書（特許法第１８４条の８）１．　特許出願の表示 ｐｃＴ／ＵＳ　９１１０７２２６ ２、発明の名称 マウスモノクローナル抗体 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国バージニア用、スプリングフィールド、ポート、ロイヤ ル、ロード、５２８５ 名　称　アメリカ合衆国 ４、代理人 （郵便番号１０Ｇ） 東京都千代田区丸の白玉丁目２番３号 ５、　補正書の提出年月日 １９９２年８月７日 請求の範囲 １、　受託番号魔ＡＴＣＣＨＢ１０５７２、ＡＴＣＣＨＢ１０６７３及び／又は ＡＴＣＣＨＢ１０６６９を有する群から選択されるハイブリドーマ細胞系の特徴 を有し、細胞表面エピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリ ドーマであって、上記エピトープが正常霊長類組織、悪性ヒト培養細胞系及びヒ ト腫瘍で発現されることを特徴とする、ハイブリドーマ。

２、　細胞表面エピトープに特異的なモノクローナル抗体であって、 上記エピトープが正常霊長類組織、悪性ヒト培養細胞系及びヒト腫瘍で発現され ることを特徴とし、受託番号Ｎｏ、ＡＴＣＣＨＢ１０５７２、ＡＴＣＣＨＢ１０ ６７３及び／又はＡＴＣＣＨＢ１０６６９を有するハイブリドーマ細胞系の群か ら選択されるハイブリドーマ細胞系の特徴を有するハイブリドーマにより産生さ れ、上記モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧ又はＩｇＭである、モノクローナ ル抗体。

３、　悪性ヒト培養細胞系がＡ４３１、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ２０及びＨＴＢ３３ からなる群より選択される、請求項１に記載のハイブリドーマ。

４、　悪性ヒト培養細胞系がＡ４３１、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ２０及びＨＴＢ３３ からなる群より選択される、請求項２に記載のモノクローナル抗体。

５、　正常霊長類組織が食道、膀胱又は胃に由来する、請求項１に記載のハイブ リドーマ。

６、　正常霊長類組織が食道、膀胱又は胃に由来する、請求項２に記載のモノク ローナル抗体。

７、ヒト腫瘍が結腸、胃又は卵巣癌腫に由来する、請求項１に記載のハイブリド ーマ。

８、　腫瘍が結腸、胃又は卵巣癌腫に由来する、請求項２に記載のモノクローナ ル抗体。

９、　受託番号Ｎ［ＬＡＴＣＣＨＢ１０５７２である、ハイブリドーマ細胞系。

１０、　受託番号磁ＡＴＣＣＨＢ１０６７３である、ハイブリドーマ細胞系。

１１、　受託番号Ｐｋ１．ＡＴＣＣＨＢ１０６６９である、ハイブリドーマ細胞 系。

１２、　そのモノクローナル抗体がＢ１である、請求項９に記載されたハイブリ ドーマにより産生されるモノクローナル抗体。

１３、　そのモノクローナル抗体がＢ３である、請求項１０に記載されたハイブ リドーマにより産生されるモノクローナル抗体。

１４、　モノクローナル抗体が８５である、請求項１１に記載されたハイブリド ーマにより産生されるモノクローナル抗体。

１５、毒素、放射性核種又は化学療法剤と結合させた請求項２．１２〜１４のい ずれか一項記載のモノクローナル抗体を含んでなる、複合体。

１６、　毒素がシュードモナスエクソトキシンである、請求項１５に記載の複合 体。

１７、　化学療法剤がビンブラスチン又はダウノマイシンである、請求項１５に 記載の複合体。

１８、　癌の診断に用いられる、請求項２．１２〜１４のいずれか一項に記載の モノクローナル抗体。

国際調査報告 □□１τμ閣ｌ漉 ”−判１−−〜−一−１１“　ａ１ツＩＩｎｒロフχ７１、；ＩＥｔ＋ＤＳ　Ｒ Ｅ＾Ｒ（ド［Ｄ／Ｒ１：＾ＲＣド　↑ＥＲとＳ：←−ｙｈ１１ｄｒ＋ｍｐ＋　ｅ ｌｒ　ＭＯｎｐｒｌＯｎａｌ　ｐｒ１４ａｔｅ＋ｅ６１＋ｇｎａｎ）　ｒｙ　（ ａｒｒ＊ｎ□積６？　ｎｒ　ｔｕｍｏｒう＾−’（Ｓ　＋＋ｒ　イーｒＦ＋ｗ１ ７’ｌ　ｎｒ　＋８丁１＋ａｌ＋２０　ｎｒ　１１１１　＠５ｏｐｈδ９υＢ　 ｒｙ　ｂｌδｄｃｌｅ秩@ｏｒ ５ｔｏｍａ（ｈ　Ｃ６１０ｎ　ｏｒ　（１＃８ｔｒｉｃ　Ｏｒ　０Ｖｙｓａｎ　 ｍｕｃｉｎ７ｂ１１１１ｎｇｌ＋ａｍ、Ｍ４＋−１、Ｃ。

ａ６ａｎｏｃａｒｃ１ｎｏｍａ？

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞表面エピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイプリドー マであって、上記エビトープが正常霊長類組織、悪性ヒト培養細胞系及びヒト腫 瘍で発現されることを特徴とする、ハイブリドーマ。
2. ２．細胞表面エビトープに特異的なモノクローナル抗体であって、 上記エビトープが正常霊長類組織、悪性ヒト培養細胞系及びヒト腫瘍で発現され 、上記モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧ又はＩｇＭであることを特徴とする 、モノクローナル抗体。
3. ３．悪性ヒト培養細胞系がＡ４３１、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ２０及びＨＴＢ３３か らなる群より選択される、請求項１に記載のハイプリドーマ。
4. ４．悪性ヒト培養細胞系がＡ４３１、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ２０及びＨＴＢ３３か らなる群より選択される、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
5. ５．正常霊長類組織が食道、膀胱又は胃に由来する、請求項１に記載のハイブリ ドーマ。
6. ６．正常霊長類組織が食道、膀胱又は胃に由来する、請求項２に記載のモノクロ ーナル抗体。
7. ７．ヒト腫瘍が結腸、胃又は卵巣癌腫に由来する、請求項１に記載のハイプリド ーマ。
8. ８．腫瘍が結腸、胃又は卵巣癌腫に由来する、請求項２に記載のモノクローナル 抗体。
9. ９．受託番号がＡＴＣＣＨＢ１０５７２である、ハイブリドーマ細胞系。
10. １０．受託番号がＡＴＣＣＨＢ１０６７３である、ハイブリドーマ細胞系。
11. １１．受託番号がＡＴＣＣＨＢ１０６６９である、ハイプリドーマ細胞系。
12. １２．そのモノクローナル抗体がＢ１である、請求項９に記載のハイブリドーマ により産生されるモノクローナル抗体。
13. １３．そのモノクローナル抗体がＢ３である、請求項１０に記載のハイブリドー マにより産生されるモノクローナル抗体。
14. １４．そのモノクローナル抗体がＢ５である、請求項１１に記載のハイプリドー マにより産生されるモノクローナル抗体。
15. １５．請求項２に記載のモノクローナル抗体の複合体の癌の治療のための使用。
16. １６．モノクローナル抗体を毒素、放射性核種又は化学療法剤と結合させた、請 求項１５に記載の使用。
17. １７．毒素がシュードモナスエクソトキシンである、請求項１５に記載の使用。
18. １８．化学療法剤がビンプラスチン又はダウノマイシンである、請求項１５に記 載の使用。
19. １９．血液サンプルを患者から採取し、癌流出抗原と反応して抗原−抗体複合体 を形成させるために十分な量の請求項２に記載のモノクローナル抗体を上記サン プルに加え、そして 上記複合体の存在又は不存在を調べることによって癌がその患者に存在するか否 かについて検出することを特徴とする癌の診断のための請求項２に記載されたモ ノクローナル抗体の使用。
20. ２０．組織又は液体サンプルを患者から取り出し、上記サンプルに請求項２に記 載のモノクローナル抗体を加え、そして 上記サンプル中における抗体の存在を視覚化することを特徴とする、癌の診断に 関する請求項２に記載のモノクローナル抗体の用途。
21. ２１．薬学上許容されるキャリアと共に請求項２に記載のモノクローナル抗体を 腫瘍増殖を阻害する上で十分な濃度で含んでなる、医薬組成物。