ES2955791T3

ES2955791T3 - Aislamiento de células fetales usando FACS

Info

Publication number: ES2955791T3
Application number: ES20730073T
Authority: ES
Inventors: Bolette Nicolaisen; David Kølvraa; Inga Christensen; Katarina Ravn; Line Jeppesen; Lotte Hatt; Palle Jensen; Ripudaman Singh
Original assignee: ARCEDI BIOTECH APS
Current assignee: ARCEDI BIOTECH APS
Priority date: 2019-06-07
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: IL308999A; AU2020289708A1; US11573229B2; IL288621A; EP3980773B1; EP4242652A3; EA202193200A1; KR20220047929A; MX2021015044A; ZA202110215B; EP3980773C0; BR112021024474A2; SG11202113242QA; CN114041053A; US20210199664A1; IL288621B1; UA128273C2; US20230130312A1; CA3142663A1; JP2022536121A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos automatizados para aislar células fetales a partir de una muestra, tal como una muestra de sangre, derivada de una mujer embarazada. Las células fetales aisladas se pueden utilizar para identificar anomalías genéticas en el ADN fetal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aislamiento de células fetales usando FACS

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos automatizados para aislar células fetales de una muestra, tal como una muestra de sangre, derivada de una mujer embarazada. Las células fetales aisladas se pueden usar para identificar anomalías genéticas en el ADN fetal.

Antecedentes

Durante el embarazo, las células fetales de la placenta pueden invadir la circulación sanguínea materna. La mayoría de estas células fetales se originan en la placenta y son trofoblastos, trofoblastos endovasculares o trofoblastos extravellosos (EVT). Estas células fetales que invaden la circulación materna muestran características tanto endoteliales como epiteliales. El proceso por el cual los trofoblastos epiteliales cambian de características e invaden la circulación materna se denomina transición epitelial-mesenquimal (EMT). La EMT es un proceso mediante el cual las células epiteliales pierden gradualmente sus características epiteliales y adquieren un fenotipo similar al mesenquimal. La EMT se ha descrito en la embriogénesis temprana, en la que la migración y la desdiferenciación transitoria de las células epiteliales embrionarias son necesarias para la formación, p. ej., del tubo neural.

Usando un marcador mesodérmico (es decir, un marcador endotelial) como marcador de selección positiva, las células fetales presentes en un número muy bajo en una muestra de sangre materna se enriquecen junto con algunas células maternas. Posteriormente, se realiza la identificación positiva de las células fetales mediante la puesta en contacto de las células enriquecidas con un marcador epitelial utilizando de esta manera el fenómeno EMT. Ninguna de las células maternas normales presentes en una muestra de sangre expresa ningún marcador epitelial.

En los métodos de la técnica anterior, como se ilustra en la Figura 2A, las muestras de sangre materna se han sometido a procesamiento seguido de enriquecimiento para eliminar la mayoría de las células maternas. Posteriormente, las células se tiñeron con marcadores maternos y fetales marcados con fluorescencia y se escanearon en un portaobjetos. Este último proceso es tedioso y requiere mucho tiempo considerando la frecuencia extremadamente baja de células fetales en una muestra de sangre materna.

Compendio

En un aspecto, la invención se refiere a un método para aislar células fetales de una muestra biológica de una mujer embarazada, comprendiendo dicha muestra una fracción celular, comprendiendo dicho método las etapas de

a. poner en contacto células comprendidas en dicha fracción celular con uno o más agentes de marcaje fluorescentes dirigidos contra al menos un marcador epitelial y/o marcador endotelial de células fetales, b. clasificar dichas células mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) en base a la detección de dichos uno o más agentes de marcaje fluorescentes unidos a las células, y

c. identificar células fetales entre dichas células clasificadas que comprende una etapa de asignar un clasificador de origen fetal a células clasificadas individuales.

Los inventores han hecho la sorprendente observación de que es posible realizar una clasificación de células individuales usando FACS y posteriormente identificar aquellas células que tienen una alta probabilidad de ser fetales simplemente analizando el resultado del FACS en términos de un número de parámetros tales como dispersión y señales de uno o más anticuerpos marcados con fluorescencia. El resultado se puede combinar con un clasificador, que puede ser una puntuación numérica o binaria. Usando métodos de la invención, los inventores han desarrollado un método con una probabilidad muy alta de identificar células fetales entre las células clasificadas. Las ventajas sobre los métodos de la técnica anterior se ilustran en la Figura 1, siendo la principal ventaja que el proceso se puede automatizar por completo y que no requiere la recolección de células identificadas como probables células fetales.

Las células identificadas pueden verificarse como células fetales mediante análisis genético y pueden usarse además para identificar anomalías genéticas en las células.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para determinar una anomalía genética en un feto, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. Obtener una o más células fetales aisladas por un método de la invención, y

b. Detectar uno o más marcadores genéticos asociados con dicha anomalía genética en el genoma de dicha célula fetal.

Descripción de los dibujos

Figura 1

Base racional para usar FACS para el enriquecimiento y aislamiento de células fetales. A)=El acceso a las células fetales después de esta etapa es laborioso y reduce el rendimiento del proceso. B)=El acceso a las células fetales después de esta etapa es más rápido y con menos riesgo de contaminación con células maternas. Sin embargo, todavía requiere la intervención humana. C)=Sin recolección física de células fetales.

1 célula por placa de 96 pocillos seguido de análisis de células individuales.

Figura 2

Enriquecimiento de células fetales sin FACS (A) y con FACS (B)

A.1 y B.1 = muestreo, A.2 y B.2 = procesamiento de sangre, A.3 y B.3 = selección, enriquecimiento y tinción, A4 y B.5 = exploración y "selección" de células fetales y B.4 = FACs .

Figura 3

Coordenadas X e Y de la puerta 1 en el gráfico FACS para Alexa Fluor 488 (eje X) (anticuerpos CK) y PE (eje Y) (CD14 CD45). Las dos de las cinco coordenadas que conectan la línea diagonal no son fijas, sino que tienen un rango en los ejes x e y.

Figura 4

Clasificación de células individuales usando FACS y analizándolas usando análisis STR. A)=muestreo, B)=procesamiento de sangre, C=selección, enriquecimiento y tinción, D)=FACS y E) =ABI 3500 (análisis STR) Figura 5

Coordenadas X e Y de la puerta G7 en el gráfico FACS para Alexa Fluor 488 (eje X) (anticuerpos CK) y PE (eje Y) (CD14 CD45). La puerta G7 se usó para clasificar individualmente células individuales en tubos individuales.

Figura 6

Datos compilados del análisis STR en células clasificadas individuales. Los porcentajes de la figura son el promedio de los porcentajes individuales de cada muestra. A)=células maternas, B)=células fetales, C)=células fetales+maternas, D)=vacío y E)=otra contaminación

Figura 7

Flujo de trabajo de una implementación completa con enriquecimiento, identificación y análisis de células fetales después de la clasificación de células individuales usando FACS. A)=muestreo, B)=procesamiento de sangre, C=selección, enriquecimiento y tinción, D)=FACS, E)=amplificación del genoma completo (WGA), F)=ABI 3500 (análisis STR) y G)=hibridación genómica comparativa con matrices.

Figura 8

Estrategia de separación. A) Todos los eventos, FSC-A (eje X) y SSC-A (eje Y). Se excluyeron los eventos (restos celulares) con valores altos de SSC. B) Eventos de baja SSC, FSC-A (eje X) y Hoechst (eje Y). A continuación, las células restantes se separaron para células Hoechst+. C) Eventos Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). A partir de la fracción Hoechst+, las células CK+CD45'CD14‘ se clasificaron en células individuales.

Figura 9

Estrategia de separación para la primera clasificación. A) Todos los eventos, FSC-A (eje X) y SSC-A (eje Y). Se excluyeron los eventos (restos celulares) con valores altos de SSC. B) Eventos de baja SSC, FSC-A (eje X) y Hoechst (eje Y). A continuación, las células restantes se separaron para células Hoechst+. C) Eventos Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). A partir de la fracción Hoechst+, las células CKmedio a altoCD45-CD14-se clasificaron masivamente como una etapa de enriquecimiento.

Figura 10

Estrategia de separación para la segunda clasificación. A) Todos los eventos, FSC-A (eje X) y SSC-A (eje Y). Se excluyeron los eventos (restos celulares) con valores altos de SSC. B) Eventos de baja SSC, FSC-A (eje X) y Hoechst (eje Y). A continuación, las células restantes se separaron para células Hoechst+. C) Eventos Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). A partir de la fracción Hoechst+, las células CKaltoCD45'CD14' se clasificaron en células individuales.

Figura 11

Estrategia de separación para la primera clasificación para la muestra 3091-B. A) Todos los eventos, FSC-A (eje X) y SSC-A (eje Y). Se excluyeron los eventos (restos celulares) con valores altos de SSC. B) Eventos de baja SSC, FSC-A (eje X) y Hoechst (eje Y). A continuación, las células restantes se separaron para células Hoechst+. C) Eventos Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). A partir de la fracción Hoechst+, las células CD141+CD105medio a altoCD45'CD14‘ se clasificaron masivamente como una etapa de enriquecimiento.

Figura 12

Estrategia de separación para la segunda clasificación para la muestra 3091-B. A) Todos los eventos, FSC-A (eje X) y SSC-A (eje Y). Se excluyeron los eventos (restos celulares) con valores altos de SSC. B) Eventos de baja SSC, FSC-A (eje X) y Hoechst (eje Y). A continuación, las células restantes se separaron para células Hoechst+. C) Eventos Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). A partir de la fracción Hoechst+, las células CD141+CD105altoCD45'CD14‘ se clasificaron en células individuales.

Figura 13

Estrategia de separación para la segunda clasificación A) Eventos de SSC bajo, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y) . La segunda clasificación para la muestra AAL302-B. No se añadió Hoechst, CD45 o CDl4. B) Eventos de SSC bajo y Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). La segunda clasificación para la muestra AAL302-A. Se añadió Hoechst, pero no CD45 o CD14.

Figura 14

Estrategia de separación para la segunda clasificación A) Eventos de SSC bajo y Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). La segunda clasificación para la muestra KO₃81 donde no se añadió CD45. B) Eventos de SSC bajo y Hoechst, AF488 (eje X) y AF555 (eje Y). La segunda clasificación para la muestra KO₃80 donde no se añadió CD14.

Descripción detallada

Los desafíos asociados con el aislamiento de células fetales de una muestra de sangre materna se ilustran en la Figura 1. Típicamente, una muestra de sangre de 30 mL contiene aproximadamente 150 millones de células después de la lisis de los glóbulos rojos. Estos se pueden enriquecer en células fetales usando métodos de enriquecimiento como se describe en la presente memoria. Esto puede dar lugar a una muestra con aproximadamente 250.000 células. Entre estas, hay muy pocas células fetales, por lo que el cribado manual de células fetales o la selección de células de un portaobjetos es un método muy laborioso.

Un ejemplo de dicho método se ilustra en el diagrama de flujo de la Figura 2A, donde se toma una muestra de sangre, la muestra se procesa y se somete a enriquecimiento. Las células restantes se colocan en un portaobjetos y se escanean y seleccionan en un microscopio usando una combinación de procedimientos manuales y semiautomáticos.

Uno de nuestros ejemplos muestra que la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) puede usarse para enriquecer esta población aún más para que las células fetales reduzcan el número de células a examinar individualmente a varios miles de células. Un diagrama de flujo que ilustra este método se encuentra en la Figura 2B.

Los inventores han hecho el hallazgo sorprendente de que es posible clasificar células fetales individuales de una muestra de sangre materna enriquecida, por lo tanto, la invención también se refiere a un método de diagnóstico prenatal que comprende las etapas de:

1. proporcionar una muestra de sangre de una mujer que lleva un feto, comprendiendo dicha muestra de sangre una fracción celular,

2. enriquecer dicha muestra en células fetales,

3. poner en contacto dicha muestra con al menos un agente de mareaje fluorescente seleccionado de cada uno de los grupos:

i. agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo,

ii. agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células maternas, y

iii. agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células fetales

4. clasificación de células individuales de al menos una célula fetal en un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) de dicha muestra enriquecida en base a:

i. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células fetales, ii. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo, y

iii. selección negativa de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células maternas 5. identificar dicho al menos un trofoblasto fetal entre dichas células clasificadas, que comprende una etapa de asignar un clasificador de origen fetal a células clasificadas individualmente mediante la obtención de un genotipo de dicho trofoblasto fetal, y

6. diagnosticar el fenotipo del feto.

El propósito del enriquecimiento con MACS es reducir el número de células cargadas en la máquina FACS (véase la Figura 1 que muestra que el enriquecimiento reduce el número de células de aproximadamente 150 millones a aproximadamente 250.000). No es necesario realizar el enriquecimiento MAC^scomo se muestra en los ejemplos que demuestran que es posible la identificación de células fetales a partir de una muestra no enriquecida. Esto solo da como resultado una cantidad mucho mayor de eventos en la máquina FACS. Más específicamente, el ejemplo 3 muestra que se puede usar FACS para enriquecer una muestra en células fetales.

La clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) es un método para la separación de varias poblaciones de células dependiendo de sus antígenos de superficie (moléculas de CD).

En otras realizaciones, MACS se usa en una diana intracelular, tal como, por ejemplo, con microperlas contra marcadores epiteliales tales como microperlas de citoqueratina.

El sistema MACS de Miltenyi Biotec usa nanopartículas y columnas superparamagnéticas. Las nanopartículas superparamagnéticas son del orden de 100 nm. Se usan para etiquetar las células diana con el fin de capturarlas dentro de la columna. La columna se coloca entre imanes permanentes para que cuando el complejo de partícula magnética-célula pase a través de ella, las células etiquetadas puedan ser capturadas. La columna consiste en lana de acero que aumenta el gradiente del campo magnético para maximizar la eficiencia de la separación cuando la columna se coloca entre los imanes permanentes.

La clasificación de células activadas magnéticamente es un método comúnmente usado, a menudo en combinación con microperlas que son nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos que pueden usarse para tomar como diana células específicas. La clasificación de células activada magnéticamente se puede usar para enriquecer una población de células para las células deseadas. Las nanopartículas magnéticas se pueden conjugar directamente con un agente de marcaje. Las nanopartículas magnéticas también se pueden conjugar con otro agente capaz de unirse al agente de marcaje (marcaje secundario). Si se elige MACS como la etapa de enriquecimiento, se prefiere que esta etapa esté precedida por una etapa de poner en contacto las células comprendidas en la fracción celular con al menos un agente marcado con marcaje magnético dirigido contra un marcador de células fetales.

En una realización de la divulgación, la muestra se enriquece en células fetales mediante la selección de células marcadas con un agente de marcaje específico para uno o más marcadores endoteliales. Los ejemplos de marcadores endoteliales se describen adicionalmente más adelante en la presente memoria.

En una realización de la divulgación, la muestra se enriquece en células fetales mediante la selección de células marcadas con un agente de marcaje específico para uno o más marcadores epiteliales. Los ejemplos de marcadores epiteliales se describen adicionalmente más adelante en la presente memoria.

El o los marcadores epiteliales pueden usarse para el enriquecimiento de células fetales en la muestra. El enriquecimiento se puede realizar usando la inmovilización de los anticuerpos en una superficie sólida.

La clasificación de células es un método usado para purificar poblaciones de células en base a la presencia o ausencia de características físicas específicas. En los citómetros de flujo con capacidades de clasificación, el instrumento detecta células usando parámetros que incluyen el tamaño celular, la morfología y la expresión de proteínas, y luego la tecnología de gotitas para clasificar las células y recuperar los subconjuntos para su uso post-experimental.

Los clasificadores de células de citometría de flujo tienen un sistema de recolección a diferencia de los analizadores de citometría de flujo. El proceso de recolección comienza cuando se inyecta una muestra en una corriente de fluido envolvente que pasa a través de la celda de flujo y las intercepciones del láser. Luego, la corriente lleva la célula a través de una boquilla vibratoria. La perturbación en la corriente hace que se rompa en una gotita que contiene idealmente una célula. Un anillo de carga eléctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en gotitas. Se coloca una carga en el anillo inmediatamente antes de medir la intensidad de la fluorescencia, y la carga opuesta queda atrapada en la gotita cuando se separa de la corriente. Las gotitas cargadas caen entonces a través de un sistema de deflexión electrostática que desvía las gotitas hacia los contenedores en función de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente y la gotita que se desprende retiene la carga del mismo signo que la corriente. Luego, la corriente vuelve a ser neutra después de que la gotita se desprende.

Si se recolectan en condiciones estériles, las células clasificadas se pueden cultivar, manipular y estudiar adicionalmente.

La clasificación en dicho FACS puede ser tanto clasificación de células individuales como clasificación masiva, las células que se descartan y no muestran los umbrales dados son...

Las puertas se ajustan para definir cómo el instrumento FACS clasificará las células. Las células que se encuentran dentro de los ajustes se clasifican y las células que se encuentran fuera de las puertas se clasifican para investigaciones posteriores o se descartan. Dependiendo de cómo el usuario configure el instrumento FACS, la clasificación puede ser una clasificación masiva o una clasificación de células individuales. Una clasificación masiva da como resultado que las células que se encuentran dentro de los ajustes de puerta dados se recolecten en el mismo tubo. La clasificación de células individuales da como resultado que las células que se encuentran dentro de los ajustes dados se clasifiquen individualmente en tubos de recolección. La clasificación de células individuales suele consumir más tiempo que una clasificación masiva, como se ejemplifica en el ejemplo 5.

Como un instrumento FACS es capaz de clasificar varias 1.000 células/segundo, los diferentes ajustes pueden variar mucho dependiendo del experimento. Al clasificar en compartimentos de células individuales, es necesario tener un rendimiento bajo, tal como una placa de 96 pocillos. Por el contrario, cuando se usa la clasificación masiva, se pueden clasificar varios miles de células/tubo.

En una realización de la invención, se usa una clasificación masiva para enriquecer una muestra. En otra realización, la clasificación de células individuales se usa para células clasificadas como células individuales, como por ejemplo en compartimentos de células individuales.

Dependiendo de la estrategia de activación de un experimento, se puede reducir la cantidad de agentes que deben aplicarse a la muestra, así como el tiempo usado para un experimento, usando una clasificación masiva al principio seguida de una clasificación individual. Dichos parámetros pueden incluir adecuadamente la cuantificación de la dispersión frontal, la dispersión lateral y la fluorescencia emitida por los fluoróforos excitados por láseres dentro del citómetro de flujo.

La dispersión frontal se entiende como la perturbación en la dirección del camino de luz que provoca el objeto y típicamente se correlaciona con el tamaño de la célula.

La dispersión lateral se entiende como la luz reflejada lejos de la dirección del camino de luz y típicamente se correlaciona con la cantidad de gránulos en el camino del camino de luz.

La fluorescencia emitida se cuantifica cuando una fuente de luz tal como un láser excita los fluoróforos presentes en la muestra y pasa a través de filtros que el experto en la técnica sabe que se ajustan a los láseres y fluoróforos dados. Dado un fluoróforo con una longitud de onda de excitación y una longitud de onda de emisión específicas, el experto en la técnica puede seleccionar una fuente de luz con una longitud de onda adecuada y filtros de emisión y excitación adecuados.

Cuando los parámetros han sido medidos por el citómetro de flujo, las células pueden clasificarse.

Convenientemente, esto se hace clasificando cada célula en un compartimento separado. Las células clasificadas son preferiblemente células que expresan al menos un marcador epitelial y/o marcador endotelial y no expresan al menos un marcador celular específico para células sanguíneas. Se pueden encontrar ejemplos de cómo seleccionar celdas para la clasificación en los ejemplos donde se seleccionan puertas específicas para la clasificación. La puerta se elige para maximizar la probabilidad de clasificar las células fetales, mientras se mantiene relativamente bajo el número de células clasificadas. Las células restantes - no clasificadas - se descartan porque no se espera que contengan células fetales.

En otra realización preferida, el FACS se usa para el enriquecimiento, donde preferiblemente las células clasificadas se recogen en un tubo antes de que la muestra, ahora enriquecida, se clasifique en células individuales en el FACS.

En una realización, la muestra se enriquece en un FACS basado en la señal de un marcador epitelial.

En otra realización, la muestra se enriquece en un FACS basado en la señal de un marcador endotelial.

Por tanto, si se elige el FACS como la etapa de enriquecimiento, se prefiere que esta etapa esté precedida por una etapa de poner en contacto las células comprendidas en la fracción celular con al menos un agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células fetales.

Después de la etapa de enriquecimiento, se realiza la clasificación de células individuales por FACS. En una realización preferida, las células positivas para al menos un marcador epitelial y que son negativas o bajas para dicho al menos un marcador de células sanguíneas se clasifican en compartimentos de células individuales. Esto se ejemplifica en la Figura 8, C).

En otra realización preferida, las células se clasifican en compartimentos de células individuales basándose en una señal positiva para un marcador fetal, un marcador de núcleo y una señal negativa para un marcador materno. Esto se ejemplifica en la figura 8, B) y C).

En una realización preferida, la muestra se clasifica usando la misma estrategia de selección para el enriquecimiento y la clasificación de células individuales.

En otra realización, la muestra se clasifica usando la misma estrategia de selección para el enriquecimiento y la clasificación de células individuales, con una diferencia en el tamaño de la puerta para el enriquecimiento y la clasificación de células individuales.

Los métodos de aislamiento divulgados en la presente memoria usan preferiblemente agentes de marcaje fluorescentes para marcar selectivamente las células fetales y maternas. En una realización, los métodos se basan en el uso de marcadores de células sanguíneas, epiteliales y endoteliales para distinguir las células fetales de las células maternas y pueden usar además una tinción del núcleo para distinguir las células de los restos celulares.

En otras realizaciones, los agentes de marcaje son agentes de marcaje magnéticos, de manera que se pueden inmovilizar en los métodos usados en la invención, tal como MACS.

El marcador fetal puede ser uno o más marcadores epiteliales, tal como una o más citoqueratinas (CK). Las citoqueratinas son proteínas de queratina que se encuentran en el citoesqueleto intracitoplasmático del tejido epitelial. Las citoqueratinas varían en tamaño de 40-68 kDa. Son un componente importante de los filamentos intermedios, que ayudan a las células a resistir el estrés mecánico. La expresión de estas citoqueratinas en las células epiteliales es en gran parte específica de órganos o tejidos particulares. Las citoqueratinas se seleccionan del grupo que consiste en citoqueratina humana 1 CK1, citoqueratina humana 2 CK₂, citoqueratina humana 3 CK3, citoqueratina humana 4 CK4, citoqueratina humana 5 CK5, citoqueratina humana 6 CK6, citoqueratina humana 7 CK7, citoqueratina humana 8 CK8, citoqueratina humana 9 CK9, citoqueratina humana 10 CK10, citoqueratina humana 13 CK13, citoqueratina humana 14 CK14, citoqueratina humana 15 CK15, citoqueratina humana 16 CK16, citoqueratina humana 17 CK17, citoqueratina humana 18 CK18, citoqueratina humana 19 CK19.

En realizaciones preferidas, la citoqueratina es CK7, CK8, CK18, CK19 o una combinación de las mismas.

En una realización, el agente de marcaje contra los marcadores epiteliales es un agente de marcaje de CK general. Un agente de marcaje de CK general es un agente de marcaje que se dirige a varias citoqueratinas a la vez. En una realización, el agente de marcaje de CK general se dirige a citoqueratinas con un peso molecular de 58, 56, 52, 60, 51, 48 y 68 kDa.

En realizaciones preferidas, los agentes de marcaje son una combinación de agentes dirigidos a CK7, CK8, CK18, CK19, así como un agente de marcaje de CK general.

No hay necesidad de discriminar entre diferentes marcadores de citoqueratina, por lo tanto, adecuadamente, los agentes de marcaje fluorescentes que se dirigen a diferentes citoqueratinas pueden tener el mismo fluoróforo.

Los marcadores endoteliales se pueden usar para el enriquecimiento como se describe anteriormente, pero también se podrían usar para el marcaje fluorescente y la fluorescencia detectada se puede usar para calcular el clasificador.

Un parámetro adicional puede ser la fluorescencia de uno o más marcadores endoteliales marcados con fluorescencia. Un marcador endotelial es un marcador expresado preferentemente en/sobre células endoteliales. Dicho marcador endotelial preferiblemente no se expresa particularmente en o sobre ningún otro tipo de célula.

En una realización preferida, la fluorescencia del marcador endotelial se usa para clasificar individualmente las células fetales.

Dicho marcador endotelial puede seleccionarse del grupo que consiste en Thy-1 CD90, trombomodulina CD141, endoglina humana CD105, vimentina humana Vim, molécula de adhesión de células vasculares VCAM, molécula de adhesión intercelular 1 ICAM, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (Flt-1) VEGFR-1, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 VEGFR-2, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3 VEGFR-3, inhibidor del activador del plasminógeno 1 pAI-1, receptor de proteína C endotelial EPCR, CD146, ITGA5, ITGB5, CDH11, CDH3 y CD59.

En realizaciones preferidas, el marcador endotelial es CD105 y/o CD141.

En otra realización preferida, el marcador endotelial es CD90, CD105 y CD141.

Los agentes de marcaje fluorescentes contra el marcador endotelial se conjugan covalentemente como es conocido por un experto en la técnica. En realizaciones preferidas, con Alexa Fluor-488. En otra modalidad preferida, con FITC.

En una realización, se usa un marcador específico para las células sanguíneas maternas. Un marcador adecuado para las células maternas serán los marcadores no expresados en las células fetales. Un marcador preferido es un marcador de leucocitos.

En realizaciones preferidas, el marcador materno es un marcador de células sanguíneas, tal como CD14 y/o CD45.

En otra realización preferida, el marcador de células sanguíneas es la combinación de marcadores contra CD3, CD14, CD15, CD16 y CD19.

Una característica particular de la invención es el marcaje específico de células usando agentes de marcaje fluorescentes. Estos agentes pueden ser cualquier tipo de molécula que sea capaz de unirse específicamente a un tipo particular de célula, p. ej., mediante la unión a un marcador en la superficie o en el interior de las células.

Un grupo preferido de agentes de marcaje fluorescente son los anticuerpos.

Un agente de marcaje puede, según la invención, ser un anticuerpo, tal como cualquier anticuerpo adecuado conocido en la técnica que incluye otros fragmentos inmunológicamente activos de anticuerpos o anticuerpos de cadena única. Las moléculas de anticuerpo son típicamente moléculas en forma de Y cuya unidad básica consiste en cuatro polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, que están unidas covalentemente entre sí por enlaces disulfuro. Cada una de estas cadenas se pliega en dominios discretos. Las regiones C-terminales de las cadenas pesada y ligera se conservan en secuencia y se denominan regiones constantes, también conocidas como dominios C. Las regiones N-terminales, también conocidas como dominios V, son de secuencia variable y son responsables de la especificidad del anticuerpo. El anticuerpo reconoce específicamente y se une a un antígeno principalmente a través de seis regiones cortas determinantes de la complementariedad ubicadas en sus dominios V.

El agente de marcaje puede ser un único resto, p. ej., un polipéptido o una proteína, o puede incluir dos o más restos, p. ej., un par de polipéptidos tal como un par de dominios de anticuerpo de cadena única. Los métodos para generar anticuerpos son bien conocidos por un experto en la técnica, mediante estrategias de inmunización para la generación de anticuerpos monoclonales o policlonales o métodos in vitro para generar miembros de unión alternativos. Los anticuerpos policlonales pueden ser tales como anticuerpos policlonales de oveja, cabra, conejo o rata.

Además, se puede usar cualquier molécula adecuada capaz de unirse con alta afinidad, incluidos fragmentos de anticuerpos tales como anticuerpos de cadena única (scFv), en particular, anticuerpos Fab y scFv que se pueden obtener mediante presentación en fago (ver a continuación) o anticuerpos de dominio único (VHH) o anticuerpos quiméricos. El agente de marcaje puede derivar de una proteína o polipéptido natural; puede diseñarse de novo o puede seleccionarse de una biblioteca. Por ejemplo, el agente de marcaje puede derivar de un anticuerpo, un anticuerpo de cadena única (scFv), un anticuerpo de dominio único (VHH), una lipocalina, una molécula de MHC de cadena única, un Anticalin™(Pieris), un Affibody™, un nanocuerpo (Ablynx) o un Trinectin™(Phylos). Por lo tanto, los métodos para generar elementos de unión de diversos tipos son bien conocidos en la técnica.

En una realización de la invención, el agente de marcaje es un fragmento de un anticuerpo, preferiblemente un fragmento de unión a antígeno o una región variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos útiles con la presente invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmento Fab, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')²que tiene dos fragmentos de unión a antígeno que son capaces de entrecruzar el antígeno y otro fragmento residual (que se denomina pFc').

Los fragmentos adicionales pueden incluir diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a agentes de marcaje derivados de una proteína o polipéptido de origen natural; dicha proteína o polipéptido puede, por ejemplo, diseñarse de novo, o puede seleccionarse de una biblioteca. El agente de marcaje puede ser un único resto, p. ej., un polipéptido o un dominio proteico, o puede incluir dos o más restos, p. ej., un par de polipéptidos. El agente de marcaje puede ser, por ejemplo, pero exclusivamente, una lipocalina, una molécula de MHC de cadena única, un Anticalin™(Pieris), un Affibody™(Affibody), o un Trinectin™(Phylos), Nanocuerpos (Ablynx). El agente de marcaje puede seleccionarse o diseñarse mediante métodos recombinantes conocidos por personas bien conocidas en la técnica.

En otra realización de la invención, el agente de marcaje es un aficuerpo, tal como cualquier aficuerpo adecuado conocido en la técnica, en particular, anticuerpos como se definen en la presente memoria, tales como aficuerpos o fragmentos inmunológicos de aficuerpos. Los aficuerpos se seleccionan in vitro, a partir de una biblioteca de aficuerpos construida por variación combinatoria del dominio de unión a IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. El dominio de unión consiste en 58 residuos, de los cuales 13 se aleatorizan para generar bibliotecas de Affibody®. Por lo tanto, el tamaño de un aficuerpo es considerablemente menor que el de un anticuerpo (www.affibody.com).

Finalmente, el agente de marcaje puede ser un ligando de receptor unido directa o indirectamente a un fluoróforo.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar el marcaje selectivo de células fetales en la muestra biológica materna en base a una técnica de hibridación. Alternativamente, pueden usarse sondas que reconozcan ARNm expresado selectivamente por células fetales.

El ARN específico de células fetales, generalmente las secuencias de ARN mensajero (ARNm) pueden usarse como marcadores de células fetales. La presencia de dicho ARNm indica que el gen de la proteína fetal se está transcribiendo y expresando. Las sondas usadas para marcar células fetales en una muestra que contiene células fetales y maternas incluyen moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ARN que codifica una proteína específica. Las células fetales contienen ARNm distintos o especies de ARN que no se encuentran en otros tipos de células. La detección de estos ARN, puede servir para marcar células de origen fetal.

Asimismo, las células maternas pueden marcarse usando una sonda específica para un ARNm de células maternas.

Según la invención, la sonda puede ser cualquier tipo de sonda conocida en la técnica para la detección de moléculas de ARN o ADN. Las sondas convencionales conocidas por un experto en la técnica comprenden sondas de ARN y ADN sintetizadas a partir de nucleótidos de desoxinucleótidos, usando respectivamente un sintetizador comercial. Las sondas pueden estar compuestas por bases de nucleótidos naturales o análogos conocidos de las bases de nucleótidos naturales. Se contempla además que las sondas pueden ser oligómeros que comprenden uno o más análogos de nucleótidos que incluyen ácidos nucleicos peptídicos y otras moléculas sintéticas capaces de emparejamiento de bases de Watson Crick.

Para la detección de ADN cromosómico, se emplea con frecuencia hibridación in situ con fluorescencia (FISH).

En una realización, un agente de mareaje (tal como un anticuerpo) o una sonda sintética se marca directamente, al tener fluoróforos unidos covalentemente al mismo. En otra realización, un agente de marcaje (tal como un anticuerpo) o una sonda sintética se marca indirectamente, uniéndose a un segundo agente que tiene fluoróforos unidos covalentemente al mismo. La unión de dichas sondas o agentes de marcaje al objetivo en la célula puede observarse bajo un microscopio como una fluorescencia brillante o puede detectarse mediante un FACS.

Mediante el uso de una combinación de métodos de marcaje es posible mejorar las señales de las células fetales, facilitando así la identificación de las mismas.

Con el fin de mejorar la probabilidad y/o la selectividad de identificar las células fetales sobre el fondo de las células maternas, se pueden realizar dos o más marcajes selectivos. Los dos o más marcajes pueden ser una combinación de cualquiera de los marcajes usados para el marcaje único descrito anteriormente. Por consiguiente, el marcaje combinado puede realizarse mediante el uso de dos o más sondas de hibridación diferentes, tal como una combinación de una sonda de ADN y una sonda de PNA o LNA para la hibridación con el mismo ARN fetal o, más preferentemente, con diferentes ARN fetales. También, se pueden usar dos o más sondas de ADN diferentes (o sondas de PNA, o sondas similares capaces de una hibridación específica) para la hibridación con diferentes ARN fetales. Asimismo, se puede usar una combinación de diferentes agentes de marcaje, ya sea con especificidad por el mismo antígeno fetal o con especificidad por diferentes antígenos. En realizaciones adicionales, se puede realizar el marcaje con una combinación de sondas de nucleótidos y agentes de marcaje.

El fluoróforo se selecciona para emitir en el área de longitud de onda de los medios de detección, y además en combinación adecuada con un segundo marcaje opcional. En particular, los fluoróforos se pueden seleccionar de FITC (isofluocianato de fluoresceína) o TRlTc (isofluocianato de tetrametil rodanina) que tienen excitación a 495 nm y 520-530 nm, respectivamente. Los fluoróforos adicionales que se pueden usar se enumeran en las siguientes tablas con la longitud de onda de excitación y emisión de varios fluorocromos:

Tabla 1a: Sondas reactivas y conjugadas

Tabla 1b: Tintes Alexa Fluor (Molecular Probes)

Tabla 1c: Tintes de espectro (Vysis)

Tabla 1d: Tintes Cy (AP Biotech)

Los agentes de mareaje no marcados se pueden usar como se sabe en la técnica, mediante el uso de una segunda etapa de marcaje con, p. ej., un anticuerpo secundario contra el anticuerpo primario no marcado, marcándose dicho anticuerpo como se discutió anteriormente, tal como marcado con fluoróforo. Mediante estas dos etapas, puede ser posible mejorar las señales de las células fetales. Se pueden incluir etapas de detección adicionales mediante el uso de marcaje indirecto como se describe aquí a continuación.

Los anticuerpos marcados con fluorescencia pueden marcarse directa o indirectamente por al menos un fluoróforo. Un experto en la técnica podrá seleccionar los fluoróforos adecuados y puede ser cualquier fluoróforo tal como Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555, Isotiocianato de fluoresceína (FITC), Ficoeritrina (PE), BV421.

Cuando se usa más de un marcador epitelial, estos marcadores pueden estar unidos al mismo fluoróforo. Esto se debe a que a menudo no hay necesidad de discriminar entre células que tienen diferentes marcadores. Lo mismo se aplica a los casos en los que se usa más de un marcador endotelial y/o en los que se usa más de un marcador de células maternas.

El marcaje indirecto de agentes marcados con fluorescencia se puede realizar uniendo un fluoróforo a anticuerpos secundarios que se unen al agente de marcaje unido a los marcadores.

En una realización preferida, el anticuerpo secundario puede seleccionarse de FITC (isofluocianato de fluoresceína) o TRITC (isofluocianato de tetrametilrodanina) que tienen excitación a 495 nm y 520-530 nm, respectivamente. En la tabla anterior se enumeran fluoróforos adicionales que pueden usarse.

En otra realización preferida, el anticuerpo secundario puede seleccionarse de Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 555 que tienen excitación a 490 nm y 555 nm, respectivamente. Dado que el citómetro de flujo recogerá partículas más pequeñas y también cuantificará los parámetros de éstas, se usa preferiblemente un marcador para una célula eucariota. Para una persona experta en la técnica, dicho tinte será típicamente un tinte de intercalación en el ADN y pueden ser tintes tales como cualquier tinte Hoechst, DAPI, yoduro de propidio, 7-AAD, tinciones Vybrant DyeCycle, tinciones SYTOX o tinciones SYTO.

En otra realización, el tinte es tinción Vybrant DyeCycle Ruby.

Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos semiautomatizados o completamente automatizados para el aislamiento de células fetales individuales mediante el análisis de células clasificadas en un clasificador de células usando uno o más parámetros medidos usados para distinguir las células fetales de las células maternas y restos celulares. Los parámetros medidos se pueden usar para calcular un clasificador de origen fetal. De este modo, es posible identificar células clasificadas individuales que son fetales o que tienen una alta probabilidad de ser fetales. Las células aisladas se pueden usar para el análisis genético del genotipo fetal.

Un aspecto de la invención se refiere a un método de aislamiento de células fetales a partir de una muestra biológica de una mujer embarazada, comprendiendo dicho método las etapas de

a. proporcionar una muestra biológica de dicha mujer embarazada, comprendiendo la muestra biológica una fracción celular,

b. poner en contacto células comprendidas en dicha fracción celular con uno o más agentes de marcaje fluorescente dirigidos contra al menos un marcador epitelial y/o marcador endotelial de células fetales, c. clasificar dichas células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) en base a la detección de dichos uno o más agentes de marcaje fluorescentes unidos a las células, y

d. identificar células fetales entre dichas células clasificadas que comprende una etapa de asignar un clasificador de origen fetal a células clasificadas individuales.

En una realización, en donde la fracción celular se enriquece en células fetales antes de FACS.

El enriquecimiento puede comprender el enriquecimiento de células que expresan al menos un marcador endotelial. Los ejemplos de marcadores endoteliales se describen adicionalmente en la presente memoria. En una realización preferida, se usa un clasificador de origen fetal para distinguir las células fetales de las células maternas. Idealmente, esto se hace con tanta certeza que no es necesario verificar el origen fetal como se describe a continuación.

En una realización, el clasificador de origen fetal es un clasificador binario que clasifica la célula como fetal o no fetal. Dicho clasificador de origen fetal puede calcularse usando inteligencia artificial, red neuronal, bosque aleatorio, aprendizaje automático, análisis de regresión o árboles de clasificación usando un conjunto de entrenamiento que comprende células fetales y maternas de origen verificado.

En algunas realizaciones, el clasificador de origen fetal es binario, es decir, cada célula se clasifica como probablemente fetal o no probablemente fetal. En otras realizaciones, el clasificador asigna una probabilidad de origen fetal a cada célula.

En algunas realizaciones, el clasificador de origen fetal se calcula en base al origen verificado de la célula fetal. Tal como verificar el origen de las células fetales mediante la obtención de un genotipo fetal para células clasificadas individualmente, como se describe adicionalmente más adelante.

El clasificador de origen fetal se calcula en base a los parámetros detectados en el FACS para cada célula.

Por lo tanto, el método asigna un clasificador de origen fetal particular a cada célula clasificada. Después de clasificar las células de una muestra materna, el resultado final puede ser una matriz clasificada de células con un clasificador de origen fetal asociado. Los datos están organizados de manera que es posible asociar cada célula clasificada con su clasificador de origen fetal particular.

En las siguientes etapas del análisis genético de las células, se puede comenzar con las células a las que se les ha asignado la probabilidad más alta de ser de origen fetal y, si es necesario, se puede continuar con el siguiente valor más alto, etc. Para un análisis de ADN en una célula fetal, solo se requiere una célula del feto. Para estar más seguro, se puede preferir analizar más de una célula de un feto, tal como, por ejemplo, al menos 3 células del mismo feto.

La probabilidad se puede calcular con una función obtenida de la regresión usando un conjunto de entrenamiento que comprende células fetales y maternas de origen verificado.

En una realización preferida, el análisis de regresión es una regresión logística.

Un experto en la técnica sabrá que una regresión logística es el logaritmo natural o el logaritmo común. La regresión logística comprende un parámetro constante y valores específicos para los parámetros, obtenidos de la cuantificación de la fluorescencia, para calcular una probabilidad.

En una realización, la muestra biológica es una muestra de sangre, tal como una muestra de sangre periférica.

La muestra de sangre puede tener un volumen de 5-30 ml. Las muestras se pueden obtener en cualquier tubo adecuado para muestras de sangre.

I otra realización preferida, la muestra de sangre puede tener un volumen de 2-100 mL, tal como 3-70, 5-50 mL, 5-30 mL y 10-30 mL.

En una realización, una fracción celular se separa de la muestra biológica, adecuadamente mediante centrifugación de dicha muestra biológica. La centrifugación de la muestra biológica será preferiblemente entre 0 y 25 minutos, más preferiblemente entre 0 y 15 minutos y lo más preferiblemente entre 5 y 10 minutos. La fuerza centrífuga aplicada a la muestra estará preferiblemente entre 0 y 5.000 G, más preferiblemente entre 500 y 3.000 G y lo más preferiblemente entre 1.000 y 2.000 G, tal como 1.600 G.

Un experto en la técnica conocerá la centrifugación para separar una muestra de sangre en una fracción de plasma y celular. La fracción celular comprenderá glóbulos rojos, glóbulos blancos (leucocitos) y trofoblastos fetales, trofoblastos extravellosos fetales y trofoblastos endovasculares fetales.

En otra realización, la muestra biológica es un frotis cervical. La mucosidad del hisopo se puede disolver primero usando ácido acético o DDT. La fracción celular obtenida después de esta etapa puede fijarse en paraformaldehído. La fracción celular del frotis cervical comprende células fetales (trofoblastos, tales como citotrofoblastos, sincitiotrofoblastos y/o trofoblastos intersticiales) y células epiteliales escamosas, células epiteliales columnares, glóbulos blancos y glóbulos rojos. A continuación, las células fetales pueden enriquecerse usando HLA-G y/o CD105/CD141 y teñirse como se describe en la presente memoria para muestras de sangre.

En una realización de la invención, la fijación de las células de una muestra materna aumenta enormemente la estabilidad de las células fetales en una muestra materna, a la vez que permite el enriquecimiento e identificación de células fetales, p. ej., como se ha descrito adicionalmente anteriormente en la presente memoria. En una realización, el procedimiento de fijación se puede llevar a cabo en una muestra no enriquecida inmediatamente después de la toma de muestras (es decir, la etapa a del método descrito en la primera realización), lo que da lugar a la fijación de componentes celulares en la muestra materna. Al mismo tiempo, la fijación es tan leve que los eritrocitos maternos se pueden lisar selectivamente en una etapa posterior de lisis.

La fijación se realiza preferiblemente durante entre 1 y 60 minutos. Más preferiblemente, la fijación se realiza durante entre 5 y 30 minutos y, lo más preferiblemente, la fijación se realiza entre 5 y 15 minutos, tal como 10 minutos.

La solución de fijación comprende preferiblemente entre el 0,5 % y el 7,5 % de paraformaldehído, más preferiblemente entre el 1 % y el 6 % y lo más preferiblemente entre el 1,5 % y el 2 %.

Además de paraformaldehído, la solución de fijación comprende preferiblemente una sal en una concentración de entre 0,05 M y 0,3 M. Más preferiblemente, la concentración de sal es de entre 0,1 M y 0,2 M y la concentración más preferida es de entre 0,125 M y 0,175 M.

Preferiblemente, la etapa de fijación puede ir seguida de una etapa de lisis de glóbulos rojos que comprende poner en contacto la muestra fijada de la etapa a con un tampón de lisis

Típicamente, el tampón de lisis comprende un detergente no iónico, preferiblemente Tritón X-100. Las concentraciones preferidas del detergente son de entre el 0,01 % (p/p) y el 0,5 %, más preferiblemente entre el 0,05 %-0,3 % y lo más preferiblemente el 0,1 %.

En una realización preferida, la etapa de lisis se lleva a cabo inmediatamente después de la etapa de fijación. Es decir, tanto la fijación como la lisis se llevan a cabo después de la etapa a y antes de la etapa b del método descrito en la primera realización. Es decir, la solución de lisis se añade directamente a la muestra, p. ej., después de la fijación durante 10 minutos. Típicamente, la lisis se realiza durante un periodo de 1 minuto a 120 minutos, más preferiblemente de 5 a 60 minutos y lo más preferiblemente durante 6 a 10 minutos.

El tampón de lisis puede, además de la lisis de glóbulos rojos, también crear pequeñas aberturas en las membranas celulares de los glóbulos blancos que permiten que los agentes de marcaje penetren en la membrana celular y se unan a sus antígenos diana.

El origen de las células fetales se verifica obteniendo un genotipo fetal para células clasificadas individualmente. Cuando el genotipo sea distinto del genotipo materno, la célula será de origen fetal. Dicha verificación se puede realizar mediante un análisis repetido en tándem corto (análisis STR).

En otra realización, la verificación se puede realizar amplificando primero el genoma y sometiendo parte del material a un análisis repetido en tándem corto (análisis STR).

En otra realización, la verificación se realiza mediante el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), es decir, en una matriz de SNP, después de una amplificación del genoma completo.

En una realización adicional, el origen fetal se verifica mediante cualquiera de los métodos adecuados para detectar marcadores genéticos, como se describe adicionalmente más adelante. Tal como, por ejemplo, Secuenciación de Nueva Generación (NGS).

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para determinar una anomalía genética en un feto, comprendiendo dicho método las etapas de

a. Obtener una o más células fetales aisladas por un método como se define en la presente memoria, y

b. Detectar uno o más marcadores genéticos asociados con dicha anomalía genética en el genoma de dicha célula fetal

Los marcadores genéticos se detectan usando uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en RFLP, análisis de transferencia Southern, hibridación genómica comparativa basada en micromatrices (aCGH), análisis de repetición corta en tándem (análisis STR), amplificación del genoma completo, escaneo de genoma completo, matriz SNP, secuenciación de Polony, secuenciación de escopeta, secuenciación de firma masivamente paralela (MPSS), secuenciación de Sanger, métodos basados en PCR y métodos de secuenciación de nueva generación.

Los métodos de secuenciación de nueva generación se pueden seleccionar del grupo que consiste en secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación Roche 454, Torrente de iones: secuenciación Proton/PGM y/o secuenciación SOLiD.

La anomalía genética es aneuploidía, monosomía, polisomía, trisomía, variación del número de copias (CNV), variación de un solo nucleótido (SNV) o un trastorno monogénico.

En algunas realizaciones, el contenido de ADN de una sola célula fetal debe amplificarse para poder realizar métodos para detectar y verificar marcadores genéticos.

Se han desarrollado varios métodos para la amplificación de genoma completo de alta fidelidad, incluida la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), la PCR de oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) y la preamplificación de extensión de cebador (PEP). Mientras que DOP-PCR y PEP se basan en técnicas de PCR estándar, la MDA se puede lograr con una configuración de reacción isotérmica.

La detección/análisis del ADN fetal se puede realizar mediante los siguientes métodos: genotipado de SNP con conjuntos de cebador/sonda TaqMan, detección de mutaciones basadas en qPCR y PCR, secuenciación de nueva generación (NGS), análisis de repeticiones cortas en tándem/microsatélites, secuenciación de Sanger, RFLP y análisis de transferencia Southern y tecnologías de matriz, tales como la hibridación genómica comparativa.

Las afecciones fetales que se pueden determinar en base a los métodos y sistemas de la presente memoria incluyen la presencia de un feto y/o una afección del feto tal como aneuploidía fetal. Dicha anomalía fetal puede ser, por ejemplo, trisomía 13, trisomía 18, trisomía 21 (Síndrome de Down), Síndrome de Klinefelter (XXY) y otro número irregular de cromosomas sexuales o autosómicos.

Otras afecciones fetales que pueden detectarse usando los métodos de la presente memoria incluyen aneuploidía segmentaria, tal como duplicación de Ip36, síndrome dup(17)(μl I.2pI I.2), síndrome de Down, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, síndrome dup( 22)(ql I.2qI I.2), síndrome del ojo de gato.

En una realización, la anomalía fetal a detectar se debe a una o más deleciones en los cromosomas sexuales o autosómicos. Estas anomalías incluyen el síndrome de Cri-du-chat, el síndrome de Wolf-Hirschhorn, el síndrome de Williams-Beuren, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, el síndrome de Smith-Magenis, la neurofibromatosis, el síndrome de Alagille, el síndrome velocardiofacial, el síndrome de DiGeorge, deficiencia de esteroide sulfatasa, síndrome de Kallmann, microftalmia con defectos cutáneos lineales, hipoplasia suprarrenal, deficiencia de glicerol quinasa, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, factor determinante de testículo en Y, azospermia (factor a), azospermia (factor b), azospermia (factor c) o deleción de Ip36.

En algunos casos, la anomalía fetal es una disminución o aumento anormal en el número cromosómico, tal como el síndrome XO.

Ejemplos

Los anticuerpos mencionados en la sección de ejemplos son los anticuerpos específicos mencionados en la siguiente tabla:

Tabla 2. Anticuerpos usados en los ejemplos. Los anticuerpos indicados con FITC o PE son anticuerpos directamente conjugados.

Ejemplo 1 - Enriquecimiento y tinción de células fetales usando MACS, seguido de un segundo enriquecimiento de células fetales usando FACS, seguido de escaneo y recolección de células fetales

usando CellCelector

Se recogieron muestras de sangre de 13 mujeres embarazadas entre las edades gestacionales de 10 a 14 semanas. Las muestras se procesaron y las células fetales se enriquecieron usando los siguientes métodos: Procesamiento de la sangre

Se recogió un total de 30 mL de sangre periférica en tubos Cell-Free DNA BCT® (Streck, Omaha, EE. UU.).

Las muestras de sangre se centrifugaron a 1.000-2.000 g durante 2-10 minutos y se retiró el plasma. Las muestras de sangre se fijaron en un tampón de formaldehído al 1-10 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2-10 minutos, seguido de la lisis de los glóbulos rojos en detergente Tritón-X-100 al 0,1 1 % en PBS durante 6-10 minutos. Las células se lavaron posteriormente en PBS y un tampón de albúmina de suero bovino al 0,5 % y se sedimentaron antes del enriquecimiento en células fetales.

Enriquecimiento y tinción de células fetales usando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) de Miltenyi

El enriquecimiento de células fetales se realizó usando MACS, (Miltenyi Biotec, Alemania). Las células no enriquecidas sedimentadas después del "procesamiento de sangre" se incubaron con anticuerpos CD105 y CD141 (microperlas) durante 15 minutos a 1 hora, y la suspensión celular se aplicó a columnas MACS para enriquecimiento. Las células retenidas se sumergieron en un tubo de 15 mL y se lavaron (centrifugación durante 10 minutos), antes de volver a aplicar las células enriquecidas a una segunda columna para la tinción de anticuerpos. La tinción se realizó en la columna incubando la fracción celular enriquecida con un cóctel de anticuerpos de citoqueratina primarios que se dirigen a las células fetales y anticuerpos CD14 y CD45 que se dirigen a los glóbulos blancos maternos, durante 15 minutos a 1 hora. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las células en las columnas se enjuagaron tres veces con PBS. Después de eso, se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con los siguientes tintes fluorescentes: Alexa Fluor 488 (AF488) (dirigido a CK en las células fetales) y Alexa Fluor 555 (AF555) (dirigido a CD14 y CD45 en glóbulos blancos maternos) y las células se incubaron durante 15 minutos a 1 hora. Las células teñidas se lavaron dos veces en PBS antes de sumergirlas y guardarlas a 4 °C hasta FACS.

Enriquecimiento de células fetales usando FACS

Se añadieron 20 uL de Hoechst 333425 uM a las células enriquecidas con MACS. Las células se pasaron por un instrumento FACS para otra etapa de enriquecimiento (Figura 2). Las células fetales se clasificaron en un FACS Aria III (BD Biosciences, EE. UU.), con láseres de 405 nm (Hoechst 33342), 488 nm (Alexa Flour 488) y 561 nm (Alexa Fluor 555). Las señales de fluorescencia se recolectaron con los respectivos filtros de paso de banda: 450/50 nm, 530/30 nm y 585/42 nm. No se realizó compensación de fluorescencia ni exclusión de dobletes. El voltaje del tubo fotomultiplicador se estableció en los siguientes parámetros: FSC 300, SSC 390, AF488 360, AF555 236, Hoechst 500 y el umbral FSC-H fue 5.000. Se aplicó una boquilla de 100 μm y el instrumento FACS se configuró para clasificar en modo de rendimiento debido a la rareza de las células fetales circulantes. Todas las células se incluyeron en el gráfico de dispersión frontal/dispersión lateral (FSC/SSC). A partir de la fracción de Hoechst+, se creó un área (puerta G1) en el gráfico de fluorescencia AF488/AF555 para clasificar las células de interés. El análisis de las células clasificadas se realizó usando el software FlowJo (FlowJo, LLC EE. UU.). Un ejemplo de la puerta G1 con coordenadas X-Y se muestra en la Figura 3. De promedio, se clasificaron 2.244 células. Las células se untaron en portaobjetos de vidrio y se clasificaron usando CellCelector (escáner de fluorescencia-recolector de células). Había 107 células fetales entre las células clasificadas con un promedio de 7,9 células fetales por muestra (Tabla 3).

Tabla 3: Las muestras de sangre de trece mujeres embarazadas se procesaron como se describe en el texto y las células fetales se enriquecieron aún más usando FACS. De promedio, se registraron 342.000 eventos por muestra en el FACS y se aislaron 7,9 células fetales por muestra.

Ejemplo 2 - Enriquecimiento y tinción de células fetales usando MACS, seguido de clasificación de células individuales de células fetales usando FACS

Se recogieron muestras de sangre de 30 mL de 13 mujeres embarazadas entre las edades gestacionales de 10 a 14. Las muestras se procesaron y las células fetales se enriquecieron en perlas magnéticas, se tiñeron usando los métodos anteriores y se analizaron en el instrumento FACS Aria III con los ajustes descritos en el ejemplo 1. Se usó una puerta de clasificación (G7) en el gráfico FACS para Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555 (PE) para recolectar individualmente todas las células en esa puerta en tubos de PCR individuales que contenían 5 μl de tampón TE con una tasa de eventos de aproximadamente 100-600 eventos por segundo (Figura 5). Las células clasificadas se congelaron a -80 °C. Usando esta puerta, de promedio, se recogieron 17 células de cada muestra. Luego, las células se sometieron a análisis de repetición en tándem corto (STR) para descifrar su origen (fetal o materno) (Figura 4). Antes del análisis de STR, las células fetales se lisaron usando PrepGem Universal (Zygem, Nueva Zelanda) según las instrucciones del fabricante. Se generó un perfil de genotipo STR con electroforesis capilar de tamaño de fragmento usando un analizador genético ABI 3500. El análisis de los datos se realizó en el software de análisis de tamaño de fragmento GeneMapper ID-X (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.). Los resultados del análisis STR en células clasificadas individuales se presentan en la Tabla 4 y la Figura 6.

Tabla 4: Datos de muestras clasificadas de células individuales. Los orígenes (fetal o materno) de las células se descifraron mediante análisis STR. Se enriquecieron 13 muestras consecutivas con microperlas CD105 y CD141 usando MACS y, posteriormente, se clasificaron células individuales en un FACS Aria III usando tinción de citoqueratina, CD45, CD14 y Hoechst. Se clasificaron entre 4 y 47 células, y el análisis STR reveló de 3 a 36 células fetales entre las células clasificadas con un promedio de 9,6 células fetales por muestra.

De 13 muestras consecutivas, se clasificaron de 4-47 células con un promedio de 17,5 células (Tabla 4). Se identificaron entre 3 y 36 células fetales por análisis STR, dando un promedio de 9,6 células fetales. En comparación con el ejemplo 1 (7,9 células fetales identificadas), esto muestra que el aislamiento de células individuales es posible cuando se clasifica una muestra enriquecida con MACS en un FACS.

En este punto, se conocía el origen (fetal o materno) de todas las células clasificadas individuales. Además, para cada célula, se conocía el valor registrado para 5 parámetros diferentes (dispersión frontal (FSC-A), dispersión lateral (SSC-A), Hoechst Azul-A (tinción de núcleos), Alexa Fluor 488-A (anticuerpos dirigidos a CK en las células fetales) y Alexa Fluor 555 (PE-A) (dirigido a CD14 y CD45 en los glóbulos blancos maternos) en el instrumento FACS. Dada toda esta información, desarrollamos un modelo, usando un método matemático llamado regresión logística, para predecir la probabilidad de localizar células fetales para muestras futuras donde la información de STR no estará disponible.

Modelo:

El modelo para predecir células fetales se basa en un método matemático llamado regresión logística, que, para cada muestra, dará una probabilidad de que una célula clasificada individual sea fetal o no.

La función logística es la siguiente:

Donde X1, X2 .... Xp son variables específicas medidas para cada célula clasificada individual. Como se mencionó, en nuestro caso tenemos cinco variables (FSC-A, SSC-A, Hoechst Azul-A, Alexa Fluor 488-A y PE A) medidas por el instrumento FACS. X1, X2, X3, X4 y X5 corresponden a los valores registrados para f SC-A, SSC-A, Hoechst Azul-A, Alexa Fluor 488-A y Alexa Fluor 555 (PE-A) para cada célula, respectivamente.

p0, p1, p2... pp son los coeficientes o valores constantes en la ecuación. En nuestro caso, hay seis coeficientes donde p0 está solo (refleja la probabilidad cuando las cinco variables son cero), p1, p2, p3, p4 y p5 reflejan la influencia de FSC-A, SSC-A, Hoechst Azul-A, Alexa Fluor 488-A y Alexa Fluor 555 (PE-A) respectivamente sobre la probabilidad de que una célula sea fetal o materna. Sin embargo, esta influencia no se refleja en sus valores absolutos. Los seis coeficientes son valores constantes que se calculan a partir del conjunto de datos de "entrenamiento" en el que se conoce el origen de las células (fetales o maternales) y el valor de las cinco variables para cada célula (en el conjunto de datos actual consiste en 121 células fetales y 90 células maternas). Estos valores p se calculan de manera que para todas las células en el conjunto de datos de "entrenamiento" las células fetales obtienen una probabilidad tan alta como sea posible (cerca de 1) y las células maternas obtienen una probabilidad tan baja como sea posible (cerca de 0). Estos valores de p (p0, p1, p2, p3, p4 y p5) que se muestran en la Tabla 5 son exclusivos de nuestros datos.

Tabla 5: Coeficientes calculados a partir del conjunto de datos de 121 células fetales y 90 células maternas para los que se conocían los valores de las diferentes variables del instrumento FACS.

Al ejecutar este algoritmo para cada célula clasificada individual en una muestra, p(X) dará un valor entre 0 y 1. Cuanto mayor sea el valor de p(X) para una célula dada, mayor será la estimación del algoritmo de la probabilidad de que la célula sea una célula fetal. Ejecutamos este modelo en tres muestras clasificadas de células individuales para ensayar si podemos enriquecer el número de células fetales centrándonos solo en el 50 % de las células con la mayor probabilidad de ser fetales. La cantidad de células fetales diterta del 38-83 % después de clasificarlas y al enfocar en las células con mayor probabilidad, esto aumentó significativamente. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6: Datos de tres muestras clasificadas de células individuales, donde se ensayó el modelo de predicción de células fetales usando regresión logística. En las tres muestras, el número de células fetales aumentó en la primera mitad de la muestra que mostró tener una alta probabilidad de ser una célula fetal. Esto facilitaría el rendimiento y también disminuiría el COGS para el análisis genético posterior en células fetales individuales.

Al implementar el modelo para predecir la localización de las células fetales en los diferentes gráficos de FACS usando el enfoque anterior, el flujo de trabajo se ve como en la Figura 7. Después de clasificar individualmente las células, el ADN en todas las células se amplificará usando la amplificación del genoma completo (WGA). Luego, una fracción del producto WGA se usaría para realizar el análisis STR. El resto del ADN de las células que resultan ser fetales se usaría entonces para el análisis genético usando aCGH o cualquier otro enfoque posterior relevante.

Ejemplo 3 - Enriquecimiento de células fetales usando FACS, seguido de escaneo y recolección de células fetales usando CellCelector

Con el fin de explorar la posibilidad del aislamiento por FACS de células fetales sin necesidad de enriquecer las células fetales usando el enriquecimiento MACS, se recolectaron 10 mL de muestras de sangre de ocho mujeres embarazadas en edades gestacionales de 10 a 14 semanas. Las muestras de sangre se procesaron y los glóbulos blancos se sedimentaron como se describe en el ejemplo 1. Después del procesamiento de la sangre, las células se tiñeron con una concentración variable de un cóctel de solo anticuerpos CK en 4 muestras y un cóctel de anticuerpos CK, más anticuerpos CD14 y CD45 en 4 muestras. Las células situadas en la puerta G1 en el gráfico FACS para Alexa-Fluor 488 y Alexa Fluor 555 (PE) se clasificaron como en el ejemplo 1. De promedio, se registraron 55 mill. de eventos y se clasificaron 22.140 células de cada muestra. Las células se untaron en portaobjetos de vidrio y se clasificaron usando CellCelector (escáner de fluorescencia-recolector de células). De promedio, se recuperaron 4 células fetales de 10 mL de sangre completa, lo que muestra que el enriquecimiento se puede realizar exclusivamente usando FACS (Tabla 7).

Tabla 7: Datos de 8 muestras en las que se procesaron 10 mL de sangre y las células se analizaron en un instrumento FACS sin enriquecimiento previo de células fetales

Ejemplo 4 - Enriquecimiento y tinción de células fetales usando MACS, seguido de clasificación de células individuales de células fetales usando FACS

Con el fin de explorar la aplicabilidad de la invención en varias máquinas FACS, realizamos los ejemplos como se muestra en el ejemplo 2 en un FACS Melody (BD Biosciences, EE. UU.) en lugar de un FACS Aria III. En el siguiente ejemplo, mostramos que las células fetales pueden identificarse a partir de 30 mL de sangre que ha sido sangre procesada, enriquecida usando anticuerpos específicos para marcadores endoteliales (CD105 y CD141) en una plataforma MACS y posteriormente teñidas para marcadores epiteliales (CK) como se describe en el ejemplo 1. Las células enriquecidas y teñidas se clasificaron como células individuales en un FACS Melody (BD Biosciences, EE. UU.) usando tinción con citoqueratina, CD45, CD14 y Hoechst.

Clasificación de células individuales usando FACS

Justo antes del FACS, se añadieron 20 μL de una solución de Hoechst 33342 5 μM al sedimento celular enriquecido para teñir los núcleos.

Las células enriquecidas y teñidas se clasificaron en un FACS Melody (BD Biosciences, EE. UU.) con un láser de 405 nm, 488 nm y 561 nm. Las señales de fluorescencia se recolectaron con los respectivos filtros de paso de banda: 448/45 nm (Hoechst 33342), 527/32 nm (AF488) y 585/40 nm (AF555). No se realizó compensación de fluorescencia ni exclusión de dobletes. El voltaje del tubo fotomultiplicador se fijó en los siguientes parámetros: FSC: 278, SSC: 530, AF488: 336, AF555: 271, Hoechst: 470 y umbral FSC: 2.939. Se aplicó una boquilla de 100 μm y el instrumento FACS se configuró para clasificar en modo de rendimiento debido a la rareza de las células fetales circulantes.

En primer lugar, se excluyeron todos los eventos (restos celulares) con dispersión lateral muy alta (SSC), y las células restantes se seleccionaron para eventos Hoechst+. Posteriormente, los eventos Hoechst+ fueron seleccionados por ser CK+ y CD45- y CD14-. En la Figura 8 se muestra un ejemplo de la estrategia de selección. Las células se clasificaron individualmente en tubos de PCR de 200 μl que contenían 5 μl de tampón TE con una tasa de eventos de aproximadamente 100-600 eventos por segundo. Las células clasificadas se congelaron a -80 °C. Luego, las células se sometieron a análisis de repetición en tándem corto (STR) para descifrar su origen (fetal o materno) como se describe en el ejemplo 2.

Resultados experimentales del Ejemplo 4

Como se ve en la Tabla 8, se clasificaron entre 10 y 26 células con un promedio de 17,9 en 9 muestras consecutivas. Por análisis STR, se identificaron entre 0 y 16 células fetales por muestra con un promedio de 7,0 células fetales. Comparando con el ejemplo 1 (7,9 células fetales identificadas) y el ejemplo 2 (9,6 células fetales aisladas), se muestra que la elección de la máquina FACS no tiene efecto sobre el resultado de la invención.

Tabla 8: 9 muestras consecutivas se enriquecieron con microperlas CD105 y CD141 usando MACS y, posteriormente, se clasificaron células individuales en un FACS Melody usando tinción con citoqueratina, CD45, CD14 y Hoechst. Se clasificaron entre 10 y 26 células, y el análisis STR reveló de 0 a 16 células fetales entre las células clasificadas con un promedio de 7,0.

Ejemplo 5 - Enriquecimiento de células fetales usando FACS, seguido de clasificación de células individuales de células fetales usando FACS

Con el fin de explorar si se podía evitar el enriquecimiento usando MACS, reemplazamos el enriquecimiento MACS con un enriquecimiento FACS, que fue seguido por clasificación de células individuales en un instrumento FACS. En otras palabras, las células estaban pasando por "doble FACS". El enriquecimiento FACS eliminó la mayoría de las células maternas y los restos celulares, lo que permitió la posterior clasificación de células individuales de las células fetales sin contaminación materna. La identificación de células fetales en ambas rondas de FACS se basó únicamente en la tinción de citoqueratina, CD45, CD14 y Hoechst y sin marcadores endoteliales.

Recolectamos muestras de sangre de 10 ml de 10 mujeres embarazadas en edades gestacionales de 10-14 semanas. El procesamiento de la sangre se realizó como se describe en el ejemplo 1.

Tinción de células fetales

Después del procesamiento de la sangre, las células sedimentadas en un tubo se tiñeron con anticuerpos primarios dirigidos a CK7, CK8, CK18, CK19, CK de amplio espectro, CD14 y CD45 durante 15 minutos a 1 h. A continuación, las células se lavaron en PBS, se centrifugaron a 550 g durante 10 minutos y se retiró el sobrenadante. A continuación, se añadieron anticuerpos secundarios marcados con AF488 (dirigido a CK) y AF555 (dirigido a CD45+CD14) y se incubaron durante 15 minutos a 1 h. Las células se lavaron dos veces y el sobrenadante se retiró a 500 μl.

Enriquecimiento FACS y clasificación de células individuales

Justo antes de clasificarlas en un FACS Melody, las células se tiñeron con 500 μL de una solución de Hoechst 3334220 μM y se añadió PBS para obtener un volumen final de 4 mL. Los ajustes de FACS eran idénticos a los mencionados en el Ejemplo 4.

En primer lugar, se excluyeron todos los eventos con dispersión lateral muy alta (SSC), y las células restantes se seleccionaron entonces para eventos Hoechst+. Posteriormente, los eventos Hoechst+ se seleccionaron por expresar un nivel medio a alto de CK (CKmedio a alto) y ser CD45-CD14-. En la Figura 9 se muestra un ejemplo de la selección. Las células se clasificaron masivamente en un tubo Eppendorf de 1,5 mL que contenía 25 μL de PBS con una tasa de eventos de aproximadamente 5.000-20.000 eventos por segundo. Las células clasificadas se diluyeron hasta un volumen final de 500 μL y luego se clasificaron de nuevo usando la misma estrategia de selección, excepto que solo se seleccionaron células con una alta expresión de CK (CKalta). En la Figura 10 se muestra un ejemplo de la selección. Las células se clasificaron como células individuales en tubos de PCR que contenían 5 μL de tampón TE con una tasa de eventos de aproximadamente 100-600 eventos por segundo. La tasa de eventos se ajustó tan baja para evitar la contaminación de las células maternas, ya que el instrumento FACS se ajustó para clasificar en modo de rendimiento. Las células clasificadas se congelaron a -80 °C antes del análisis STR que se realizó como se ha descrito anteriormente.

Resultados experimentales del Ejemplo 5

La Tabla 9 representa el número de células clasificadas de la primera y la segunda clasificación junto con el número de células fetales identificadas por análisis STR. De la primera clasificación, se clasificaron aproximadamente de 15.000 a 33.000 células, y en la segunda clasificación se clasificaron de 5-32 células. A continuación, las células de la segunda clasificación se analizaron mediante STR, que reveló entre 0 y 9 células fetales por 10 mL de sangre con un promedio de 2,4 células fetales. Esto muestra que el aislamiento de células fetales se puede realizar exclusivamente usando FACS y tinción de marcadores epiteliales junto con CD45, CD14 y Hoechst.

Tabla 9: 10 muestras consecutivas se "clasificaron doblemente" en un instrumento FACS Melody. La primera clasificación rindió aproximadamente 15.000-32.000 células y estas células se cargaron de nuevo en el FACS y se clasificaron las células individuales. Se clasificaron entre 5 y 32 células, y el análisis STR mostró que existían 0-9 células fetales entre las células clasificadas como células individuales con un promedio de 2,4.

Ejemplo 6 - Enriquecimiento de células fetales usando FACS, seguido de clasificación de células individuales de células fetales usando FACS - Marcadores endoteliales fetales

En este ejemplo, mostramos que el "doble FACS" puede identificar células fetales solo basándose en la tinción de marcadores endoteliales (y sin tinción de marcadores epiteliales).

Recolectamos tres muestras de sangre de 10 mL de mujeres embarazadas en la semana gestacional 10-14. El procesamiento de la sangre se realizó como se describe en el Ejemplo 1.

Tinción de células fetales

Después del procesamiento de la sangre, las células se tiñeron con anticuerpos dirigidos a uno o más de los siguientes anticuerpos: CD105-FITC, CD141-FITC y CD90-FITC durante 15 minutos a 1 h (véanse las combinaciones de anticuerpos en la Tabla 10). Además, se utilizaron anticuerpos primarios para CD14 y CD45 y anticuerpos secundarios marcados con AF555 para teñir las células maternas. A continuación, las células se lavaron en PBS, se centrifugaron a 550 g durante 10 minutos y se retiró el sobrenadante a 500 μL.

Enriquecimiento FACS y clasificación de células individuales

Justo antes del FACS, las células se tiñeron con 500 μL de una solución de Hoechst 3334220 μM y se añadió PBS para obtener un volumen final de 4 mL. Los ajustes de FACS fueron idénticos a los mencionados en el ejemplo 4, excepto que el voltaje del tubo fotomultiplicador para AF488 se ajustó en 461 para CD105, CD141 y CD90 conjugados directamente.

En primer lugar, se excluyeron todos los eventos con dispersión lateral muy alta (SSC), y la fracción de SSC baja se seleccionó luego para eventos Hoechst+. Posteriormente, los eventos Hoechst+ se seleccionaron para expresión de un nivel medio a alto de CD105+CD141+CD90. Todas las células se seleccionaron para que fueran CD45- y CD14-. En la Figura 11 se muestra un ejemplo de la selección. Las células se clasificaron masivamente en un tubo Eppendorf de 1,5 mL que contenía 25 μL de PBS con una tasa de eventos de aproximadamente 5.000 a 20.000 eventos por segundo. Las células clasificadas se diluyeron hasta un volumen final de 500 μL y luego se clasificaron de nuevo usando la misma estrategia de selección excepto que solo se clasificaron las células que expresaban un alto nivel de CD105+CD141+CD90. En la Figura 12 se muestra un ejemplo de la selección. Las células se clasificaron como células individuales en tubos de PCR que contenían 5 μL de tampón TE con una tasa de eventos de aproximadamente 100-600 eventos por segundo. Las células clasificadas como células individuales se congelaron a -80 °C antes del análisis STR que se realizó como se describe en el ejemplo 2.

Tabla 10: Tinción de marcadores endoteliales. La muestra HO107-A se tiñó con anticuerpos dirigidos a CD105+CD141+CD90 y realizando "FACS doble", se identificó 1 célula fetal. En la muestra 3091-B, solo se tiñeron CD105 y CD141, y después de "FACS doble" también se detectó 1 célula fetal.

Resultados experimentales del Ejemplo 6

La Tabla 10 muestra 2 muestras teñidas con diferentes combinaciones de marcadores endoteliales. La primera clasificación dio aprox. 30.000-45.000 células, mientras que la segunda clasificación rindió en 10-20 células. En ambos casos, se encontró una célula fetal.

Ejemplo 7 - Enriquecimiento de células fetales usando FACS, seguido de clasificación de células individuales de células fetales usando FACS - Diferentes marcadores específicos de células maternas

En los ejemplos anteriores, se ha usado la tinción de CD45 y CD14 para la identificación de leucocitos maternos mientras que se ha usado Hoechst para la tinción de los núcleos. Los propósitos de estas tinciones eran aumentar la separación entre las células y los restos celulares, y entre las células maternas y las células fetales. En este ejemplo, investigamos si CD45, CD14 y Hoechst eran necesarios en la clasificación de células individuales fetales.

Recolectamos muestras de sangre de 10 mL de 5 mujeres embarazadas en edades gestacionales de 10-14 semanas. El procesamiento de la sangre se ejecutó como se describe en el ejemplo 1. Todas las muestras se tiñeron con anticuerpos CK como se describe en el Ejemplo 5. Además, todas las muestras se tiñeron con Hoechst, CD45 y CD14 como se describe en el ejemplo 5, a menos que se indique lo contrario en la Tabla 11. En una muestra, los leucocitos se tiñeron con anticuerpos dirigidos a CD3, CD14, CD15, CD16 y CD19 - todos conjugados directamente con PE durante 15 minutos a 1 h. Todas las muestras se enriquecieron en FACS usando la tinción de CK junto con la tinción de leucocitos y Hoechst si se incluyeron en la muestra, como se describe en el Ejemplo 5. Finalmente, las células se clasificaron como células individuales en un instrumento FACS usando la misma tinción que para el enriquecimiento FACS. Las células clasificadas como células individuales se analizaron mediante STR.

Tabla 11: Combinaciones de marcador materno y Hoechst.

Resultados experimentales del Ejemplo 7

El gráfico FACS para la muestra AAL302-B, que no se tiñó con Hoechst, CD45 o CD14, se puede ver en la Figura 13A. La separación de las células disminuyó considerablemente. Los pocos eventos que se separaron de la población principal se clasificaron, pero el análisis STR reveló que todos los eventos clasificados no contenían ADN, es decir, solo se clasificaron los restos celulares. Esto demuestra que es necesaria una tinción del núcleo como la de Hoechst con el fin de eliminar los restos celulares de la clasificación de células individuales.

Hoechst:

Cuando se añadió Hoechst, pero no se aplicó tinción de las células maternas (muestra AAL302-A), no se obtuvo una separación clara (Figura 13B). Solo las células maternas fueron identificadas por STR, lo que ilustra que la tinción de marcadores maternos aumenta en gran medida la separación de las células fetales de las células maternas.

CD 14 y CD45:

Cuando las células maternas se tiñeron con CD14, pero no con CD45 (muestra KO₃81), se obtuvo una separación, pero no se identificaron células fetales (Figura 14A). Sin embargo, cuando solo se realizó la tinción de CD45 y no la tinción de CD14 (muestra KO₃80, Figura 14B), se identificaron 3 células fetales, lo que muestra que la tinción de CD45 es esencial.

Otros marcadores de leucocitos:

CD45 también se conoce como el antígeno leucocitario común, ya que se expresa en todos los subgrupos de leucocitos (monocitos, granulocitos, células T, células B y células Nk ). Por lo tanto, para investigar si CD45 podría ser reemplazado por marcadores que representan todos los subgrupos de leucocitos, teñimos CD3 (células T), CD14 (monocitos), CD15 (granulocitos), CD16 (células NK) y CD19 (células B) junto con CK y tinción de Hoechst como se describió previamente en el Ejemplo 5. Esto dio como resultado 3 células fetales (Tabla 12), lo que demuestra que CD45 puede ser reemplazado por un grupo de otros marcadores de leucocitos.

Tabla 12: CD3, CD14, CD15, CD16 y CD19 se dirigen a los diferentes subgrupos de leucocitos en la sangre periférica. Al teñir los diferentes subgrupos en lugar de CD45 que se dirige a todos los subgrupos, se identificaron 3 células fetales.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de diagnóstico prenatal que comprende las etapas de:

a) poner en contacto células comprendidas en una muestra de sangre obtenida de una mujer que lleva un feto con al menos un agente de marcaje magnético dirigido contra un marcador de trofoblasto fetal,

b) enriquecer dicha muestra para trofoblastos fetales con clasificación de células activadas magnéticamente (MACS),

c) después de la etapa de enriquecimiento, la clasificación de células individuales por FACS se realiza poniendo en contacto las células enriquecidas con al menos un agente de marcaje fluorescente seleccionado de cada uno de los grupos:

i. agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo,

iii. agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales

d) clasificar las células individuales de las células marcadas con fluorescencia en un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) de dicha muestra enriquecida en base a:

1. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales, ii. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo, y

iii. selección negativa de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células maternas e) identificar trofoblastos fetales entre dichas células clasificadas, que comprende una etapa de asignar un clasificador de origen fetal a células clasificadas individualmente mediante la obtención de un genotipo de las células clasificadas individuales, y

f) diagnosticar el fenotipo del feto.

2. Un método de diagnóstico prenatal que comprende las etapas de:

a) poner en contacto células comprendidas en una muestra de sangre obtenida de una mujer que lleva un feto con al menos un agente de marcaje fluorescente seleccionado de cada uno de los grupos:

i. agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo,

b) enriquecer dicha muestra para trofoblastos fetales en un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) basado en la fluorescencia de dichos agentes de marcaje fluorescentes,

c) después de la etapa de enriquecimiento, la clasificación de células individuales por FACS se realiza mediante la clasificación de células individuales de las células marcadas con fluorescencia en un FACS de dicha muestra enriquecida en base a:

i. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales, ii. selección positiva de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo, y

iii. selección negativa de dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células maternas d) identificar trofoblastos fetales entre dichas células clasificadas, que comprende una etapa de asignar un clasificador de origen fetal a células clasificadas individualmente mediante la obtención de un genotipo de dicho trofoblasto fetal, y

e) diagnosticar el fenotipo del feto.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agente de marcaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales es un agente de mareaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador endotelial o epitelial.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agente de marcaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales es un agente de marcaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador endotelial, tal como un marcador seleccionado de Thy-1 CD90, trombomodulina CD141, endoglina humana CD105, vimentina humana (Vim), molécula de adhesión de células vasculares (VCAM), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1 (Flt-1) (VEGFR-1), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2), receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-3), inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1), receptor de proteína C endotelial (EPCR), CD146, ITGA5, ITGB5, CDH11, CDH3 y/o CD59.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agente de marcaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador de trofoblastos fetales es un agente de marcaje magnético y/o fluorescente dirigido contra un marcador epitelial, preferiblemente una citoqueratina, tal como citoqueratina humana 1 CK1, citoqueratina humana 2 CK2, citoqueratina humana 3 CK3, citoqueratina humana 4 CK4, citoqueratina humana 5 CK5, citoqueratina humana 6 CK6, citoqueratina humana 7 CK7, citoqueratina humana 8 CK8, citoqueratina humana 9 CK9, citoqueratina humana 10 CK10, citoqueratina humana 13 CK13, citoqueratina humana 14 CK14, citoqueratina humana 15 CK15, citoqueratina humana 16 CK16, citoqueratina humana 17 CK17, citoqueratina humana 18 CK18, citoqueratina humana 19 CK19.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos agentes de marcaje fluorescente son anticuerpos, sondas de nucleótidos, ligandos de receptores y/u otras moléculas de unión específicas.

7 El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra el núcleo se selecciona de cualquier tinte Hoechst, tal como Hoechst 33342, DAPⁱ, yoduro de propidio, 7-AAD, tintes Vybrant DyeCycle, tintes SYTOX o tintes SYTO.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de células maternas es un agente de marcaje fluorescente dirigido contra un marcador de leucocitos tal como un marcador seleccionado de CD45, CD3, CD14, CD15, CD16 y /o CD19.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho genotipo se obtiene mediante análisis STR y/o SNP.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho fenotipo se diagnostica mediante la detección de uno o más marcadores asociados con una anomalía genética en el genoma de la célula fetal, como la detección de dicha anomalía genética mediante uno o más métodos seleccionados de hibridación genómica comparativa basada en micromatrices (aCGH), análisis de repetición en tándem corto (análisis STR), amplificación de genoma completo, exploración de genoma completo, matriz SNP, secuenciación de Polony, secuenciación de escopeta, secuenciación de firma paralela masiva (MPSS), secuenciación de Sanger, métodos basados en PCR y métodos de secuenciación de nueva generación.

11. El método según la reivindicación 10, en donde dicha anomalía genética es aneuploidía, monosomía, polisomía, trisomía, variación del número de copias (CNV), variación de un solo nucleótido (SNV) o un trastorno monogénico.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra de sangre es entre 5-30 mL.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra de sangre comprende una fracción celular y dicha fracción celular se separa del plasma de dicha muestra de sangre, tal como mediante centrifugación.

14. El método según la reivindicación 13, en donde dicha fracción celular comprende glóbulos rojos, glóbulos blancos y trofoblastos fetales, trofoblastos extravellosos fetales y trofoblastos endovasculares fetales.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo, además, dicho método:

I. una etapa de fijación de las células sanguíneas posterior a la separación de dicha fracción de plasma, en donde la fijación es preferiblemente una fijación con paraformaldehído; y/o

II. una etapa de lisis selectiva de glóbulos rojos de dicha fracción celular usando un detergente posterior a la separación de dicha fracción celular de dicha fracción de plasma, en donde dicha lisis también permeabiliza las células restantes en dicha fracción celular.