CN114657184B - 一种多价适体功能化dna纳米结构探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多价适体功能化dna纳米结构探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用，所述探针的DNA纳米结构的一侧具有多条DNA核酸适体，能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白受体特异结合；其另一侧具有多个生物素位点，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒；所述探针由S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C共六条DNA单链合成，所述S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C的DNA序列分别如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明的探针可基于细胞膜表面生物标志物表达水平的不同实现目标细胞识别，本发明的探针合成简单、捕获CTCs效率高、易操作，同时，富集后的CTCs可通过DNA水解酶进行释放，对于CTCs的病理诊断和其他后续研究具有潜在意义。

Description

一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用。
背景技术
1869年澳大利亚籍医生Ashworth首次在癌症死亡患者血液中发现并提出循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)的概念(Aust Med J,1869,14,146-149)，CTCs是来源于原发性肿瘤或者从转移部位脱落、侵袭并进入血液循环系统的癌细胞。研究表明，血液中CTC数目的多少与癌症患者病情发展有很大关联，所以实时监测血液中CTCs数目变化对于评估癌症转移和疗效十分重要。尽管CTCs检测对癌症的早期诊断具有重要的临床研究及应用价值，但是外周血中的CTC含量极其稀少，研究表明平均每毫升血液中只有1～10个CTCs，而背景血细胞的含量则达到109量级，并且会以不同的形态存在于外周血中，具有很高的异质性，因此给CTCs的捕获与研究带来极大挑战(Lab Chip,2014,14,32-44)。
上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种重要的I型跨膜蛋白，在大多数癌细胞表面过度表达，参与细胞粘附、信号转导等多种生物学过程，可以作为CTCs捕获的靶点。但其在细胞膜表面分布不均，且存在聚集现象，因此，发展能够高效识别EpCAM的探针可以有效提高CTCs的捕获效率。传统的捕获CTCs的方法采用EpCAM相应的抗体对其识别，但抗体结构不稳定，不易保存，且结合能力有限(Progress in Biochemistry and Biophysics 2021,48(1):35-53)。核酸适体具有特异结合相应蛋白的能力，且易于合成、保存和功能化。因此，发展具有多价适体结构的探针对于提高CTCs的捕获效率意义重大。
磁性纳米材料具有独特的光学性能、磁性能、力学性能，并且比表面积大、体积小、易修饰，因此被广泛用于生物样品的富集与分离。DNA纳米结构由于易于功能化且生物相容性好，在生物探针的制备独具优势。但目前适用于高效富集CTCs的多价适体功能化DNA纳米结构探针还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用，该探针结构为长条形状，此外该DNA纳米结构一侧具有多条DNA核酸适体，可用于CTCs的高效捕获；另一侧具有多个生物素位点，可有效结合亲和素修饰的磁性颗粒，提高结合效率，实现CTCs的快速分离。该探针可以高灵敏和高选择地捕获循环肿瘤细胞，同时还能够保持CTCs的活性，用于CTCs的病理诊断和其他后续研究。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种多价适体功能化DNA纳米结构探针，所述探针的DNA纳米结构的一侧具有一条以上的DNA核酸适体，能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白受体特异结合；其另一侧具有一个以上的生物素位点，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒；所述探针由S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C共六条DNA单链合成，其中，
所述S1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
所述S2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
所述N1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
所述N2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述N3的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
所述SYL3C的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；
所述SYL3C含有能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白EpCAM受体特异结合的核酸适体序列；
所述S1为修饰了生物素分子的序列，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒。
一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)将终浓度均为10nM～2μM的S1、S2、N1、N2、N3共五条DNA单链溶解后，等比例混合在含有5～50mM Mg2+、pH为7.2～8.0的缓冲溶液中，通过高温退火的方式形成长带状纳米结构；
步骤2)向经步骤1)反应后的溶液中，等比例加入终浓度为10nM～2μM的适体链SYL3C，等温杂交，即可得到所述多价适体功能化DNA纳米结构探针。
优选地，步骤1)所述高温退火的方式为：温度控制在95℃持续5～10min，从95℃降温至25℃，降温速度为-0.1℃/10s，整个退火过程持续2h以上。
优选地，步骤2)所述等温杂交的温度为25～37℃，时间为2～5h。
一种多价适体功能化DNA纳米结构探针在富集循环肿瘤细胞中的应用。
优选地，所述富集循环肿瘤细胞的方法包括以下步骤：
步骤A)循环肿瘤细胞的捕获：循环肿瘤细胞加入DIO染料，细胞染色20～30min后，离心并重悬于1×PBS中，得到细胞悬浮液；使用胰蛋白酶进行处理1～5min后，用1×PBS吹打、离心，重悬于含FBS的高糖培养液DMEM中，得到重悬液；将多价适体功能化DNA纳米结构探针加入细胞重悬液中，于4～37℃下静置10～50min进行细胞捕获，得到样品A；
步骤B)磁分离循环肿瘤细胞：取用1～10μL 10mg/mL表面修饰链霉亲和素的磁性颗粒，使用清洗缓冲液进行清洗，至少清洗三次，结束后充分震动，超声5～10min；将经处理的磁性颗粒加入步骤A)制得的样品A中，于室温下孵育20～60min；通过磁性颗粒去除上清液后，使用1×PBS溶液清洗至少三次，去除未结合的细胞，得到样品B；
步骤C)荧光显微镜计数及富集效率的计算：将步骤B)制得的样品B再次使用1×PBS重新悬浮，随后通过倒置荧光显微镜对富集后的预先用荧光标记的目标细胞进行荧光成像计数，并计算富集效率。
优选地，步骤A)所述多价适体功能化DNA纳米结构探针的浓度为200nM。
优选地，步骤A)所述细胞捕获的温度为4℃，时间为40min。
优选地，步骤B)所述磁性颗粒的直径为0.2～2μm。
优选地，步骤C)所述富集效率的计算公式为：其中n为富集细胞数量，N为上样细胞数量。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的多价适体功能化DNA纳米结构探针，其结构为长条状DNA纳米带，纳米带一侧具有多条DNA核酸适体，可用于CTCs的高效捕获；另一侧具有多个生物素位点，可有效结合亲和素修饰的磁性颗粒，提高结合效率，实现CTCs的快速分离。
(2)本发明的多价适体功能化DNA纳米结构探针制备方法简单、材料成本低、合成产率高、结构稳定、生物相容性好，可以高灵敏和高选择地捕获CTCs，同时还能够保持CTCs的活性，用于CTCs的病理诊断和其他后续研究。
(3)本发明中采用的多价核酸适体与抗体相比，具有高亲和力、特异性、高稳定性、易于修饰等特点，有利于准确快速地识别细胞表面的CTCs，提高捕获效率。
附图说明
图1为基于多价适体功能化DNA纳米结构探针高效富集CTCs的原理图；
图2为未杂交核酸适体的长条状DNA纳米结构探针的原子力显微镜结构表征：A为未杂交核酸适体的长条状DNA纳米结构探针原子力显微镜图，B为该结构划线处对应的宽度和高度图；
图3为多价适体功能化DNA纳米结构探针的原子力显微镜结构表征：A为多价适体功能化DNA纳米结构探针的原子力显微镜图，B为该结构划线处对应的宽度和高度图；
图4为多价适体功能化DNA纳米结构探针对不同数量梯度的人乳腺癌细胞(MCF-7)捕获效率；
图5为多价适体功能化DNA纳米结构探针对不同数量梯度的人胰腺癌细胞(BxPC-3)捕获效率；
图6为多价适体功能化DNA纳米结构探针对不同数量梯度的人宫颈癌细胞(HeLa)捕获效率；
图7为多价适体功能化DNA纳米结构探针对不同细胞系的捕获特异性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于此，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备和结构表征实验
1、多价适体功能化DNA纳米结构探针
如图1所示，所述探针的DNA纳米结构的一侧具有多条DNA核酸适体，能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白受体特异结合；其另一侧具有多个生物素位点，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒；所述探针由S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C共六条DNA单链合成，具体如下：
所述S1如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5’-CAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGACGAGTTGAGAATACGAGT-TEG-Biotin-3’；
所述S1为修饰了生物素分子的序列，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒。
所述S2如SEQ ID NO.2所示，具体为：
5’-TGAGAATACGAGTTGAGAATCCGACCATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’。
所述N1如SEQ ID NO.3所示，具体为：
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’。
所述N2如SEQ ID NO.4所示，具体为：
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’。
所述N3如SEQ ID NO.5所示，具体为：
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCCCTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。
所述SYL3C如SEQ ID NO.6所示，具体为：
5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；
所述SYL3C含有能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白EpCAM受体特异结合的核酸适体序列。
2、多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法
(1)首先将形成裸长条状DNA纳米结构探针的五条DNA单链S1、S2、N1、N2、N3(终浓度均为1μM)混合在1×TAE-Mg2+缓冲液中(40mM Tris，2mM EDTA，12.5mM MgCl2，20mM HAc，pH＝7.8)。
(2)将样品放入PCR仪中通过高温退火的方式形成长带状纳米结构：95℃持续5min，然后从95℃降温至25℃降温速度为-0.1℃/10s，整个退火降温过程持续2h。
(3)随后向反应后的溶液加入1μM核酸适体链SYL3C，25℃下等温杂交4h，即可得到多价适体功能化DNA纳米结构探针。
3、DNA纳米结构探针的原子力显微镜结构表征，具体步骤如下：
使用1×TAE-Mg2+缓冲液稀释纳米结构探针至终浓度100nM，取样5～10μL滴在光滑平整的云母表面，吸附5min后，超纯水反复冲洗云母表面并吹干，随后进行原子力显微镜成像表征，未杂交核酸适体的DNA纳米结构探针和多价适体功能化DNA纳米结构探针的表征结果分别如图2和图3所示，其中B图均为对应A图中划线处对应的原子力显微镜高度宽度折线图。可以直观看到多价适体功能化DNA纳米结构探针在宽度上比未杂交核酸适体的纳米结构增加了6.01nm，在高度上比未杂交核酸适体的纳米结构增加了0.49nm。
实施例2
使用实施例1制得的多价适体功能化DNA纳米结构探针实现对人乳腺癌细胞(MCF-7)的捕获及细胞个数梯度实验，具体如下：
(1)MCF-7细胞染色：传代后的MCF-7细胞置于37℃的含有5％CO2的培养箱中培养，48h后使用1×PBS(含NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，pH＝7.4)清洗，去除清洗液后添加不含胎牛血清(FBS)的高糖培养液DMEM，5μL细胞膜染料DIO(1mM)，混合均匀后置于细胞培养箱中，染色20min。
(2)MCF-7细胞消化：染色结束后，去除培养瓶中染色剂，同时使用1×PBS清洗，至少清洗三次，避免多余染色剂影响细胞活性，加入胰蛋白酶(含乙二胺四乙酸(EDTA)0.02％)，将培养瓶再次置于细胞培养箱中持续约2min，之后补充含FBS的高糖培养液DMEM，缓慢吹打贴壁细胞，之后用离心管收集经吹打后培养瓶中的所有溶液。
(3)MCF-7细胞计数：离心管收集消化后的MCF-7细胞，在750rpm转速下离心3min，去除上清液后，添加1×PBS重新悬浮，打匀后从中抽取10μL，通过细胞计数仪对其进行计数，得出每微升细胞个数，并以此计算约1000个细胞需要取用的体积。
(4)多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获MCF-7细胞：将40μL 1μM的多价适体功能化DNA纳米结构探针，加入经过DIO染色、细胞数量约为1000个的离心管中，通过用缓冲液A(1×PBS，5mM MgCl2，pH＝7.4)将其体积补充到200μL，混合后置于4℃条件，冰上孵育40min，得到样品A。
(5)磁铁装置分离、纯化：取用5μL链霉亲和素修饰的磁性颗粒(10mg/mL)，使用清洗缓冲液B(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，pH＝7.4)洗涤三次，去除磁性颗粒表面的钝化剂和防腐剂，然后超声7～10min，放入(4)中所述冰上孵育的离心管(样品A)中，混合后放在360°旋转架上，置于室温下，旋转40min，随后将该离心管置于磁铁装置上，磁分离3min后去除上清液，然后添加200μL 1×PBS清洗，再次磁分离，去除上清液，该过程重复三次，最后使用200μL 1×PBS重新悬浮，得到样品B。
(6)倒置荧光显微镜成像：将(5)中得到的样品B置于96孔板(底部为玻璃材质)里，静置1h后进行荧光成像，物镜4×，拍摄捕获后的细胞荧光图。
(7)计算捕获效率：根据捕获效率计算公式：
其中n为富集细胞数量，N为上样细胞数量。
人工计数每一张倒置荧光图细胞数量，荧光图累积得到n数量值，同样的方法得到N数量值，两者相比得到捕获效率。
(8)细胞个数梯度捕获实验：DIO染色后的MCF-7细胞，消化后经细胞计数仪得到每微升的细胞个数，并以此计算约50、100、200、500、800个细胞需要取用的体积，其余操作方法不变，计算每一组已知数量细胞的捕获效率。
实验结果：本实施例中多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获MCF-7的捕获效率如图4所示，MCF-7平均捕获效率为88.21％。
实施例3
使用实施例1制得的多价适体功能化DNA纳米结构探针实现对人胰腺癌细胞(BxPC-3)的捕获及细胞个数梯度实验，具体如下：
参考实施例2中的多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获MCF-7操作，本实施例与之不同的一点在于所培养的细胞为BxPC-3，其余步骤均与实施例2一致。
实验结果：本实施例中多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获BxPC-3的捕获效率如图5所示，BxPC-3平均捕获效率为52.9％。
实施例4
使用实施例1制得的多价适体功能化DNA纳米结构探针实现对人宫颈癌细胞(HeLa)的捕获及细胞个数梯度实验，具体如下：
参考实施例2中的多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获MCF-7操作，本实施例与之不同的一点在于所培养的细胞为HeLa，其余步骤均与实施例2一致。
实验结果：本实施例中多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获HeLa的捕获效率如图6所示，HeLa平均捕获效率为6.87％。
实施例5
使用实施例1制得的多价适体功能化DNA纳米结构探针实现对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人胰腺癌细胞(BxPC-3)、人宫颈癌细胞(HeLa)的特异性捕获实验，具体如下：
(1)不同癌细胞系染色：传代后的MCF-7、BxPC-3、HeLa细胞置于37℃的含有5％CO2的培养箱中培养，48h后使用1×PBS(含NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，pH＝7.4)清洗，去除清洗液后添加培养液DMEM，5μL细胞膜染料DIO(1mM)，混合均匀后置于细胞培养箱中，染色20min。
(2)不同癌细胞系消化：染色结束后，去除培养瓶中染色剂，同时使用1×PBS清洗三次，避免多余染色剂影响细胞活性，加入胰蛋白酶(含EDTA 0.02％)，将培养瓶再次置于细胞培养箱中(MCF-7、HeLa放置约2min、BxPC-3放置约5min)，之后补充含FBS的培养液，缓慢吹打贴壁细胞，之后用离心管收集经吹打后培养瓶中的所有溶液。
(3)多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获不同癌细胞系：将40μL 1μM的多价适体功能化DNA纳米结构探针，加入经过DIO染色、一定数量的不同细胞的离心管中，通过用适体结合细胞缓冲液A(1×PBS，5mM MgCl2，pH＝7.4)将其体积补充到200μL，混合后置于4℃，冰上孵育40min。
(4)磁铁分离、纯化：取用5μL链霉亲和素修饰的磁性颗粒(10mg/mL)，使用清洗缓冲液B(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，pH＝7.4)洗涤三次，超声7～10min后，放入(3)中所述冰上孵育的每个离心管中，混合后放在360°旋转架上，置于室温下，旋转40min，随后将该离心管置于磁铁上，磁分离3min后去除上清液，然后添加200μL 1×PBS清洗，再次磁分离，去除上清液，该过程重复三次，最后使用200μL 1×PBS重新悬浮。
(5)多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获特异性：将每种细胞系离心管里的样品置于流式细胞仪样品单元，进行细胞荧光强度采集。
实验结果：如图7所示，多价适体功能化DNA纳米结构探针捕获CTCs具有特异性。
以上所述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例，其他的任何未背离本发明原理下所作的改变、替代、组合、简化均应是等效的置换方式，均落在本发明的保护和公开范围之内。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagggctggg catagaagtc agggcagaga cgagttgaga atacgagt 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagaatacg agttgagaat ccgaccattg tgcgctatct tcatctta 48
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctcaacttc aactcgtatt ctcaactcgt at 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctgactca caatggtcgg attccgtctc tg 32
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagccctgta agatgaagat agcgtctatg ccctaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57
<210> 6
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt tttttttttt 60
tttttttt 68

Claims (10)

1.一种多价适体功能化DNA纳米结构探针，其特征在于，所述探针的DNA纳米结构的一侧具有一条以上的DNA核酸适体，能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白受体特异结合；其另一侧具有一个以上的生物素位点，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒；所述探针由S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C共六条DNA单链合成，其中，
所述S1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
所述S2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
所述N1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
所述N2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述N3的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
所述SYL3C的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；
所述SYL3C含有能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白EpCAM受体特异结合的核酸适体序列；
所述S1为修饰了生物素分子的序列，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒。
2.权利要求1所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）将终浓度均为10 nM~2 μM的S1、S2、N1、N2、N3共五条DNA单链溶解后，等比例混合在含有5~50 mM Mg2+、pH为7.2~8.0的缓冲溶液中，通过高温退火的方式形成长带状纳米结构；
步骤2）向经步骤1）反应后的溶液中，等比例加入终浓度为10 nM~2 μM的适体链SYL3C，等温杂交，即可得到所述多价适体功能化DNA纳米结构探针。
3.根据权利要求2所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，步骤1）所述高温退火的方式为：温度控制在95℃持续5~10 min，从95℃降温至25℃，降温速度为-0.1℃/10 s，整个退火过程持续2 h以上。
4.根据权利要求2所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，步骤2）所述等温杂交的温度为25~37℃，时间为2~5 h。
5.一种非疾病诊断和治疗目的的如权利要求1所述的多价适体功能化DNA纳米结构探针在富集循环肿瘤细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述富集循环肿瘤细胞的方法包括以下步骤：
步骤A）循环肿瘤细胞的捕获：循环肿瘤细胞加入DIO染料，细胞染色20~30 min后，离心并重悬于1×PBS中，得到细胞悬浮液；使用胰蛋白酶进行处理1~5 min后，用1×PBS吹打、离心，重悬于含FBS的高糖培养液DMEM中，得到重悬液；将多价适体功能化DNA纳米结构探针加入细胞重悬液中，于4~37℃下静置10~50 min进行细胞捕获，得到样品A；
步骤B）磁分离循环肿瘤细胞：取用1~10 μL 10 mg/mL表面修饰链霉亲和素的磁性颗粒，使用清洗缓冲液进行清洗，至少清洗三次，结束后充分震动，超声5~10 min；将经处理的磁性颗粒加入步骤A）制得的样品A中，于室温下孵育20~60 min；通过磁性颗粒去除上清液后，使用1×PBS溶液清洗至少三次，去除未结合的细胞，得到样品B；
步骤C）荧光显微镜计数及富集效率的计算：将步骤B）制得的样品B再次使用1×PBS重新悬浮，随后通过倒置荧光显微镜对富集后的预先用荧光标记的目标细胞进行荧光成像计数，并计算富集效率。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤A）所述多价适体功能化DNA纳米结构探针的浓度为200 nM。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤A）所述细胞捕获的温度为4℃，时间为40 min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤B）所述磁性颗粒的直径为0.2~2 μm。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤C）所述富集效率的计算公式为：，其中n为富集细胞数量，N为上样细胞数量。
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