CN110640158A - 应用dna纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用 - Google Patents

应用dna纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DNA纳米技术领域，更具体的说，是一种应用DNA纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用。本发明采用DNA折纸术合成了一种DNA纳米带，并以该DNA纳米带为模板合成了铜纳米簇，本发明的铜纳米簇排列更加整齐，荧光强度稳定、抗热性强，性能更加优越，有望于无标签荧光生物测定方面展现出更大的潜力。

Description

应用DNA纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及DNA纳米技术领域，更具体的说，是一种应用DNA纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用。
背景技术
DNA折纸技术就是利用DNA特殊的碱基配对机制使DNA通过自组装形成高度有序纳米结构，如：复杂的二维物体、三维物体和表面图案。在DNA折纸技术日趋完善的条件下，DNA不仅仅为一种遗传物质，更是开发出了DNA更为复杂的结构与功能。
金、银和铜等贵金属纳米团簇是指由几十个金属原子形成的团簇，通常直径为2nm左右，由于其优异的荧光性能、超细尺寸、良好的生物相容性、低毒性，贵金属纳米团簇在体内成像、体外化学和生物检测等方面吸引了人们的广泛关注，一些合成方法如模板法，配体辅助法，电化学合成法，腐蚀合成法已被成功用于纳米团簇的合成。特别是自从2010年Mokhir等人报道了双链DNA(以下简称dsDNA)可以作为低浓度CuSO4形成的铜纳米团簇(以下简称CuNCs)的有效模板后，dsDNA-CuNCs因其高效的合成速率(通常只需几分钟，而其他荧光金属NCs的合成通常需要数小时或数天)和大的斯托克斯位移(340nm激发CuNCs，并在600nm左右发出荧光)显示出了巨大的无标签荧光生物测定的潜力。CuNCs形成的机理如下：首先是将铜(II)还原为铜(I)，然后将铜(I)歧化为铜(II)和铜(0)，最后形成的铜(0)聚集在dsDNA上，从而产生稳定的纳米颗粒。已经报道了其在核酸、酶、蛋白质、小分子生物分子、金属离子分析等生物传感器的研究。
现有dsDNA-CuNPs在其形成后荧光强度衰减过快，且耐热性不足，为此，需要研发荧光强度稳定、性能更加优越的铜纳米簇。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，包括以下步骤：
S1,准备浓度相同的以下五条DNA链，备用；
Staple 1-1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTATGAGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；
Staple 1-2：5’-TATGAGCGCACAATGGTCGGATTCGATGAACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Staple 1-3：5’-GTAGTCGTTCAACTCGTATTCTCATATGCTCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
Scaffold strand 1-1：5’–C A G G G C T G T A C T C A T A C G C T C A TA C GTTCATCACGACTACATACGAGT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
Scaffold strand 1-2：5’-T G A G A A T A C G A G T T G A G A A T C C GA C CATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，如SEQ ID NO.5所示；
S2，取相同体积S1中的五条DNA链混合，之后依次加入tris-HAc溶液、Mg(Ac)2溶液和超纯水，得混合液；
S3，将S2的混合液进行反应，反应条件为：99-100℃热水自然冷却，冷却23-24h后，得DNA纳米带；
S4，取S3的DNA纳米带，加入到NaCl溶液中，然后依次加MOPS溶液、超纯水和CuSO4溶液，孵育10-15min后，加入抗坏血酸钠溶液，制得铜纳米簇。
进一步的，S1中，每条DNA链的浓度均为100μmol/L。
进一步的，S2中，DNA链，tris-HAc溶液，Mg(Ac)2溶液和超纯水的体积比为2：10：10；70。
进一步的，S2中，tris-HAc溶液浓度为400mmol/L，Mg(Ac)2溶液浓度为100mmol/L。
进一步的，S2中，tris-乙酸溶液的pH为7.5。
进一步的，S4中，DNA纳米带，NaCl溶液，MOPS溶液，超纯水，CuSO4溶液和抗坏血酸钠溶液的体积比为25；46.5：50：55.5；5：5。
进一步的，S4中，NaCl溶液的浓度为600mmol/L，MOPS溶液的20mmol/L，CuSO4溶液的浓度为0.01mol/L，抗坏血酸钠溶液的浓度为0.1mol/L。
进一步的，S4中MOPS溶液的pH为7.5。
本发明的目的之二在于提供利用上述方法合成的铜纳米簇。
本发明的目的之三在于提供上述铜纳米簇无标签荧光生物测定中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用DNA折纸术合成了一种DNA纳米带，并以该DNA纳米带为模板合成了铜纳米簇，与传统的dsDNA-铜纳米簇相比，本发明设计的铜纳米簇排列更加整齐，荧光强度能够保持很长一段时间而不衰减，性能更加优越。
附图说明
图1为本发明DNA纳米带的平面结构示意图。
图2为本发明铜纳米簇的原子力显微镜示意图。
图3为为本发明铜纳米簇在激发波长为351nm时的荧光发射谱图。
图4为时间与荧光强度相关折线图。
图5为温度与荧光强度相关折线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法
步骤如下：
S1,准备浓度均为100μmol/L的以下五条DNA链(由Invitrogen公司人工合成)，备用：
Staple 1-1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTATGAGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；
Staple 1-2：5’-TATGAGCGCACAATGGTCGGATTCGATGAACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Staple 1-3：5’-GTAGTCGTTCAACTCGTATTCTCATATGCTCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
Scaffold strand 1-1：5’–C A G G G C T G T A C T C A T A C G C T C A TA C GTTCATCACGACTACATACGAGT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
Scaffold strand 1-2：5’-T G A G A A T A C G A G T T G A G A A T C C GA C CATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，如SEQ ID NO.5所示；
S2，将S1中五条DNA链各取2μL，之后依次加入10μL浓度400mmol/L的tris-HAc溶液，10μL浓度100mmol/L的Mg(Ac)2溶液，70μL超纯水，得混合液；
S3，将S2的混合液进行反应，反应条件为：100℃热水自然冷却，冷却24h后即得DNA纳米带；
如图1所示，本发明DNA纳米带由三个平行螺旋结构域的重复矩形单位组成，每个结构域都含有一段48bp的DNA螺旋。在每个矩形单位中，两条48个碱基长的DNA链作为支架链(scaffold strand1-1scaffold strand1-2)。在三条含32个碱基的短DNA链(staple1-1staple1-2staple1-3)的帮助下，以光栅填充模式进行。相邻的单元通过三个订书钉连接在一起形成一个长条带。
S4，取S3的DNA纳米带25μL，加入到46.5μL浓度600mmol/L的NaCl溶液中，然后依次加入50μL浓度20mmol/L的MOPS溶液、55.5μL超纯水、5μL浓度0.01mol/L的CuSO4溶液，孵育10min后，加入5μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸钠溶液，制得铜纳米簇。
实施例2
为了证明本发明中铜纳米簇的成功合成，应用原子力显微镜和荧光光度法等方法做了相关证明，步骤如下：
S1.用双面胶把云母片粘到圆铁片上并用胶带撕云母片使其表面平整。
S2.取实施案例1合成的铜纳米簇2μL滴到S1中制好的云母片中，之后用100μL超纯水冲洗云母片表面。
S3.将S2制好的样置于原子力显微镜进行表征。
结果如图2所示，结果证明：原子力图表明他是DNA纳米带，带状结构。
S4.取实施案例1合成的铜纳米簇180μL置于700μL比色皿中，设置激发波长为351nm进行荧光扫描。
图3所示，结果证明594nm处的峰为铜纳米簇的荧光峰。
为了验证本发明的铜纳米簇的荧光强度稳定性，我们将本发明实施例1制备的铜纳米簇(DNR1-CuNCs)与双链DNA(dsDNA)作为模板合成的铜纳米簇(dsDNA-CuNCs)进行对比，结果如图4、图5所示，室温下DNR1-CuNCs的荧光强度显著高于dsDNA-CuNCs的荧光强度，且DNR1-CuNCs荧光强度随时间变化，较dsDNA-CuNCs荧光强度降低少，性能更加优越，随着温度升高，DNR1-CuNCs荧光强度降低程度也小于DNR1-CuNCs，表现出较强的耐热性。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 西北大学
<120> 应用DNA 纳米带模板法合成的铜纳米簇、合成方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagccctgta agatgaagat agcgtatgag ta 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tatgagcgca caatggtcgg attcgatgaa cg 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtagtcgttc aactcgtatt ctcatatgct ca 32
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagggctgta ctcatacgct catacgttca tcacgactac atacgagt 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgagaatacg agttgagaat ccgaccattg tgcgctatct tcatctta 48

Claims (10)

1.应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1,准备浓度相同的以下五条DNA链，备用：
Staple 1-1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTATGAGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示；
Staple 1-2：5’-TATGAGCGCACAATGGTCGGATTCGATGAACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Staple 1-3：5’-GTAGTCGTTCAACTCGTATTCTCATATGCTCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
Scaffold strand 1-1：5’–CAGGGCTGTACTCATACGCTCATACGTTCATCACGACTACATACGAGT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
Scaffold strand 1-2：5’-TGAGAATACGAGTTGAGAATCCGACCATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，如SEQ ID NO.5所示；
S2，取相同体积S1中的五条DNA链混合，之后依次加入tris-HAc溶液、Mg(Ac)2溶液和超纯水，得混合液；
S3，将S2的混合液进行反应，反应条件为：99-100℃热水自然冷却，冷却23-24h后，得DNA纳米带；
S4，取S3的DNA纳米带，加入到NaCl溶液中，然后依次加MOPS溶液、超纯水和CuSO4溶液，孵育10-15min后，加入抗坏血酸钠溶液，制得铜纳米簇。
2.根据权利要求1所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S1中，每条DNA链的浓度均为100μmol/L。
3.根据权利要求2所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S2中，DNA链，tris-HAc溶液，Mg(Ac)2溶液和超纯水的体积比为2：10：10；70。
4.根据权利要求3所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S2中，tris-HAc溶液浓度为400mmol/L，Mg(Ac)2溶液浓度为100mmol/L。
5.根据权利要求4所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S2中tris-乙酸溶液的pH为7.5。
6.根据权利要求1所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S4中，DNA纳米带，NaCl溶液，MOPS溶液，超纯水，CuSO4溶液和抗坏血酸钠溶液的体积比为25；46.5：50：55.5；5：5。
7.根据权利要求6所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S4中，NaCl溶液的浓度为600mmol/L，MOPS溶液的20mmol/L，CuSO4溶液的浓度为0.01mol/L，抗坏血酸钠溶液的浓度为0.1mol/L。
8.根据权利要求7所述的应用DNA纳米带模板法合成铜纳米簇的方法，其特征在于，S4中MOPS溶液的pH为7.5。
9.利用权利要求1所述方法合成的铜纳米簇。
10.如权利要求9所述的铜纳米簇在无标签荧光生物测定中的应用。
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