CN109097444A - 一种基于y型dna模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种基于y型dna模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，包括下列核酸序列：序列H1：5’端为a区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区；序列H2：5’端为b区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区；序列H3：5’端为c区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区；其中目标核酸序列3’端为a*区，a与a*、b与b*、c与c*互补配对。还提供了采用上述的试剂盒检测基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大方法。本发明的方法无需进行核酸修饰即可产生荧光信号，并且基于无酶信号放大策略，反应条件温和。

Description

一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂 盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种生物传感技术，具体来说是一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法。
背景技术
基于核酸扩增的信号放大技术已经被广泛应用于疾病的靶向诊疗、基因表达、药物筛选及即时诊断等领域。相比传统的聚合酶链式反应技术(Polymerase ChainReaction，PCR)，基于核酸恒温扩增反应的信号放大技术具备反应条件温和、信号放大效率高、成本低廉及不易受干扰等优点，成为当前信号放大技术领域的研究热点。
众多核酸恒温扩增技术中，催化发夹组装(Catalytic Hairpin Assembly，CHA)等以核酸杂交反应熵为驱动力的信号放大技术，因反应无需酶的参与而受到广泛青睐。但是，目前建立的检测荧光检测方法，往往需要对核酸探针进行荧光染料修饰或采用核酸染料作为荧光信号，不仅提高了实验成本，而且核酸染料还具有一定的生物毒性。
DNA模板的荧光铜纳米簇是近年来发展的新型荧光纳米颗粒，具有优异的荧光特性，合成方法简单、快速，被广泛用于目标的非标记检测中。然而，将DNA模板荧光铜纳米簇与上述无酶信号放大技术结合，需要通过磁分离等方式除去过量的核酸，降低背景信号，无法实现快速的均相检测。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法，所述的这种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法要解决现有技术中非酶信号放大技术的荧光检测中需要信号标记的技术问题。
本发明提供了一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，包括下列核酸序列：
序列H1：5’端为a区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区；
序列H2：5’端为b区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区；
序列H3：5’端为c区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区；
其中目标核酸序列3’端为a*区，a与a*、b与b*、c与c*互补配对。
具体的，
H1序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中5’端序列gcttga为a区，中间序列gatgttagggagtagtgc-tccaatcacaac-gcactactccct为茎环结构，环部分序列为tccaatcacaac，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区，b*区序列为ctccct；
H2序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中5’端序列agggag为b区，中间序列tagtgcgttgtgattgga-aacatctcaagc-tccaatcacaac为茎环结构，环部分序列为aacatctcaagc，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区，c*区序列为cacaac；
H3序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中5’端序列gttgtg为c区，中间序列attggagcttgagatgtt-gcactactccct-aacatctcaagc为茎环结构，环部分序列为gcactactccct，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区，a*区序列为tcaagc；
优选的，目标核酸序列为单链，包含10～40个碱基。
优选的，a、a*、b、b*、c、c*区具有4～8个碱基。
优选的，序列H1、H2、H3中的茎环结构的环结构具有10～15个碱基。
优选的，序列H1、H2、H3中的茎结构中一侧具有14～22个碱基与另一侧的碱基互补配对。
优选的，所述的试剂盒还包括反应缓冲液和铜纳米簇合成缓冲液，是含盐离子浓度的缓冲体系。
本发明还提供了一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测方法，包括如下步骤：
1)将所述核酸序列H1、H2和H3加入到待测样品液中，室温反应1～2h后，加入20～200U核酸外切酶Ⅲ，反应30～60min；
2)向步骤1)中加入铜纳米簇合成缓冲液和抗坏血酸钠混匀，加入后抗坏血酸钠的终浓度1～4mM，再加入硫酸铜溶液，加入后硫酸铜溶液的终浓度0.1～0.5mM，室温反应10min；
3)测试步骤2)中溶液的荧光强度，测试参数为激发波长：340nm，扫描范围：510-640nm，夹缝：15/15nm，扫描速度：600nm/min。
所述核酸序列H1、H2和H3中的反应缓冲液为pH＝8.0的20mM Tris-HCl，包含100～500mM氯化钠，10～30mM氯化钾，5～20mM氯化镁；
所述铜纳米簇合成缓冲液为pH＝7.6的10mM 3-吗啉丙磺酸，包含100～250mM氯化钠；
4)将H1、H2和H3链于95℃退火5min，形成茎环结构。当存在目标序列时，目标核酸的a*区与H1的a区结合，激活支点介导的催化发夹组装反应，依次循环打开H2和H3的茎环结构，最终形成大量的Y型DNA结构用于原位合成荧光铜纳米簇。
本发明通过催化发夹组装反应，茎环结构的3’端由凹陷末端转变为突出末端，因而可以通过引入核酸外切酶Ⅲ降解未参加反应的茎环序列，从而有效降低背景信号。
本发明采用目标序列诱导激活支点介导的催化发夹组装反应，依次循环打开三个茎环结构序列，最终形成大量的Y型DNA结构用于原位合成荧光铜纳米簇。本发明的方法无需进行核酸修饰即可产生荧光信号，并且基于无酶信号放大策略，反应条件温和。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明利用目标核酸序列诱导的催化发夹组装反应，无需酶参与反应；以形成大量的Y型DNA结构为模板，原位合成荧光铜纳米簇，无需对核酸进行修饰，合成条件简单；此外，利用外切酶Ⅲ对凹陷末端的选择性降解能力，能够有效降低背景信号，提高检测灵敏度。
附图说明
图1为基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测示意图。
图2为验证目标核酸存在实验条件下Y型结构DNA模板是否形成。其中1为仅含有H1序列；2为H1和目标序列；3为H1、H2和目标序列；4为H1、H2、H3和目标序列；5为H1、H2和H3。可以看出仅仅当目标序列和H1H2H3共同存在时，才能形成迁移速度较慢的Y型DNA结构。
图3为不同浓度目标核酸对应的光谱图(A)和标准曲线(B)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，以特异性目标核酸序列(5’-gcactactccctaacatctcaagc(a*)-3’)的检测为例，包括以下部分：
1)序列H1、H2和H3，具体序列如下：
序列H1：
5’-gcttga(a)-gatgttagggagtagtgc-tccaatcacaac(环部分)
gcactactccct(b*)-aacatc-3’
序列h2:
5’-agggag(b)-tagtgcgttgtgattgga-aacatctcaagc(环部分)
-tccaatcacaac(c*)-gcacta-3’
序列h3:
5’-bttgtg(c)-attggagcttgagatgtt-gcactactccct(环部分)
-aacatctcaagc(a)tccaat-3’
2)所述反应缓冲液为pH＝8.0的20mM Tris-HCl，其中还含有100～500mM氯化钠，10～30mM氯化钾，5～20mM氯化镁；
所述铜纳米簇合成缓冲液为pH＝7.6的10mM 3-吗啉丙磺酸，其中还含有100～250mM的氯化钠。
一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测方法的示意图如图1所示，具体步骤为：
(1)所述H1、H2和H3干粉用上述的反应缓冲液稀释到10μM的浓度，95℃退火5min，然后冷却至室温，4℃保存；
(2)在离心管中分别加入10μL步骤(1)中的H1、H2和H3，55μL上述的反应缓冲溶液和10μL待测核酸样品，室温(20～30℃)反应120min后，加入5μL核酸外切酶Ⅲ(100U)，室温(20～30℃)反应40min；
(3)向步骤(2)中加入280μL铜纳米簇合成缓冲，再依次加入抗坏血酸钠和硫酸铜溶液，抗坏血酸钠的终浓度为1mM，硫酸铜溶液的终浓度为200μM，反应10min，测定580nm处的荧光强度。
实施例2
将所述H1、H2和H3序列的干粉用上述的反应缓冲液稀释到10μM的浓度，95℃退火5min，然后冷却至室温，4℃保存；
依次按照如下条件制备样品：H1和目标序列；H1、H2和目标序列；H1、H2、H3和目标序列；H1、H2和H3。
其中目标序列浓度为100nM，H1、H2和H3的浓度均为500nM。
将上述样品在室温(20～30℃)反应120min后，加入溴酚蓝和SYBR Green I对样品进行染色10min；将染色后的样品在3％的琼脂糖中进行电泳实验。
结果如图2所示，仅仅当目标序列和H1、H2和H3共同存在时，才能形成迁移速度较慢的Y型DNA结构。
实施例3
将所述H1、H2和H3序列的干粉用上述的反应缓冲液稀释到10μM的浓度，95℃退火5min，然后冷却至室温，4℃保存；
在离心管中分别加入10μL退火处理的H1、H2和H3，55μL上述的反应缓冲溶液和10μL不同浓度的目标核酸(0～200nM)，室温(20～30℃)反应120min后，加入5μL核酸外切酶Ⅲ(100U)，室温(20～30℃)反应40min；向反应液中加入280μL铜纳米簇合成缓冲液，依次加入抗坏血酸钠和硫酸铜溶液，抗坏血酸钠的终浓度为1mM，硫酸铜溶液的终浓度为200μM，反应10min，测定580nm处的荧光强度。
结果如图3所示，随着目标核酸浓度的增加，580nm处的荧光强度不断增强，并且在20～150nM的浓度范围内，荧光强度和目标核酸的浓度呈现良好的线性关系。
本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 上海理工大学
<120> 一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttgagatg ttagggagta gtgctccaat cacaacgcac tactccctaa catc 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggagtagt gcgttgtgat tggaaacatc tcaagctcca atcacaacgc acta 54
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgtgattg gagcttgaga tgttgcacta ctccctaaca tctcaagctc caat 54

Claims (8)

1.一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于包括下列核酸序列：
序列H1：5’端为a区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区；
序列H2：5’端为b区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区；
序列H3：5’端为c区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区；
其中目标核酸序列3’端为a*区，a与a*、b与b*、c与c*互补配对。
2.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：
H1序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中5’端序列gcttga为a区，中间序列gatgttagggagtagtgc-tccaatcacaac-gcactactccct为茎环结构，环部分序列为tccaatcacaac，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区，b*区序列为ctccct；
H2序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中5’端序列agggag为b区，中间序列tagtgcgttgtgattgga-aacatctcaagc-tccaatcacaac为茎环结构，环部分序列为aacatctcaagc，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区，c*区序列为cacaac；
H3序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中5’端序列gttgtg为c区，中间序列attggagcttgagatgtt-gcactactccct-aacatctcaagc为茎环结构，环部分序列为gcactactccct，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区，a*区序列为tcaagc。
3.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：目标核酸序列为单链，包含10～40个碱基。
4.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：a、a*、b、b*、c、c*区具有4～8个碱基。
5.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：序列H1、H2、H3中的茎环结构的环结构具有10～15个碱基。
6.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：序列H1、H2、H3中的茎结构中一侧具有14～22个碱基与另一侧的碱基互补配对。
7.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：还包括反应缓冲液和铜纳米簇合成缓冲液，所述的反应缓冲液和铜纳米簇合成缓冲液均为含盐离子浓度的缓冲体系。
8.采用权利要求1所述的试剂盒检测基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将所述核酸序列H1、H2和H3加入到待测样品液中，室温反应1～2h后，加入20～200U核酸外切酶Ⅲ，反应30～60min；
2)向步骤1)中加入铜纳米簇合成缓冲液和抗坏血酸钠混匀，加入后抗坏血酸钠的终浓度1～4mM，再加入硫酸铜溶液，加入后硫酸铜溶液的终浓度0.1～0.5mM，室温反应10min；
3)测试步骤2)中溶液的荧光强度，测试参数为激发波长：340nm，扫描范围：510-640nm，夹缝：15/15nm，扫描速度：600nm/min；
所述核酸序列H1、H2和H3中的反应缓冲液为pH＝8.0的20mM Tris-HCl，包含100～500mM氯化钠，10～30mM氯化钾，5～20mM氯化镁；
所述铜纳米簇合成缓冲液为pH＝7.6的10mM 3-吗啉丙磺酸，包含100～250mM氯化钠；
4)将H1、H2和H3链于95℃退火5min，形成茎环结构，当存在目标序列时，目标核酸的a*区与H1的a区结合，激活支点介导的催化发夹组装反应，依次循环打开H2和H3的茎环结构，最终形成大量的Y型DNA结构用于原位合成荧光铜纳米簇。
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