CN106520927A - 一种核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸检测方法及试剂盒。根据待测的目标核酸序列，设计三条具有茎环结构的分子探针A，B和C。当样品中含有目标核酸序列时，目标核酸的a*区与A的a区结合，触发了支点介导的链置换反应，依次打开探针B、探针C的茎环结构并且与之结合，最终产生大量的Y型核酸纳米结构。该核酸纳米结构具有类抗体活性，通过相应的结合反应以及显色反应，可以通过肉眼观察到结果。本发明所述的支点介导链置换信号放大策略无需蛋白酶和热变性退火过程。本发明方法灵敏度高，对核酸的检测限为5fM；特异性好，能够识别单碱基突变的核酸序列；简便快捷，能够同时检测96或者384个样品。

Description

一种核酸检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种核酸检测方法及试剂盒。
背景技术
核酸检测广泛应用于医学诊断、食品安全和环境监测等领域。传统核酸检测方法包括核酸印迹、微阵列和核酸酶扩增法等。这些方法需要繁琐的实验步骤和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以用于大批量样本的快速检测。因此，发展高通量、超灵敏和低成本的核酸检测方法具有重要意义。信号放大策略是开发新型核酸检测方法的关键。支点介导的链置换反应是指在支点（由若干连续碱基组成的区段）推动下，两条互补的DNA通过杂交方式置换另一条互补DNA链的过程。这种支点介导的链置换反应可用于核酸信号的转换和放大，具有无需蛋白酶和热变性退火的优点。
目前，用于检测支点介导的链置换放大信号手段包括化学发光、电化学和荧光等。这些检测技术虽然具有较高的灵敏度，但是它们需要使用先进、复杂的仪器，这些不足在很大程度上限制了它们的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸检测方法及试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种核酸的检测试剂盒，所述试剂盒包括下列核酸序列：
序列A： 5’端为a区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质I，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有b*区；
序列B： 5’端为b区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质I，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有c*区；
序列C： 5’端为c区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质II，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有a*区；
其中，待测核酸序列3’端为a*区；a与a*、b与b*、c与c*互补配对。
优选的，待检测核酸为单链或双链通过处理得到的单链，包含10-40个碱基。
优选的，a、a*、b、b*、c、c*区具有4～8 个碱基。
优选的，序列A、B、C中的茎环结构的环结构具有10～15个碱基。
优选的，序列A、B、C中的茎环结构的茎结构中一侧具有14～22个碱基与另一侧的碱基互补配对。
优选的，序列A、B、C中的连接臂具有4～8 个碱基。
优选的，序列A和B的特异性亲和小分子物质I与序列C的特异性亲和小分子物质II不同。
优选的，特异性亲和小分子物质包括地高辛、生物素、Alexa Fluor 488、6-FAM、Cy3或Texas Red。
优选的，所述试剂盒还包括核酸杂交缓冲液，是含盐离子浓度的缓冲体系。
优选的，所述试剂盒中还包括固定装置，装置中包被有能与特异性亲和小分子物质II结合的功能蛋白II。
优选的，所述试剂盒中还包括催化显色反应的催化酶标记的功能蛋白I，所述功能蛋白I能与特异性亲和小分子物质I结合。
一种核酸检测方法，是利用上述任一项所述的检测试剂盒进行核酸检测。
优选的，所述核酸检测方法包括以下步骤：
1）将所述的核酸检测试剂盒中的核酸序列加入到待测样品液中，室温反应，使核酸序列充分组装；
2）步骤1）中反应完成后，将反应液加入到功能蛋白II包被的96孔板，室温充分反应；
3）步骤2）中反应完成后，清洗微孔板数次，然后加入辣根过氧化物酶标记的功能蛋白I溶液，室温反应；
4）步骤3）中反应完成后，清洗微孔板数次，然后加入四甲基联苯胺显色液，室温充分反应；
5）步骤4）中反应完成后，加入硫酸溶液，终止反应；
6）用酶标仪检测反应液在450纳米的OD值，检测得到OD值与核酸浓度正相关。
下面以某一特定目标核酸序列的检测为例，对本发明的技术方案作进一步的说明：
目标核酸序列含有24个碱基，其3’端为a*区段（4～8 个碱基），根据该目标核酸序列设计三条具有茎环结构的分子探针A，B和C，其中：
A的5’端为a区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有地高辛基团，其中b*区位于茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧；目标核酸序列的a*区与A的a区互补。
B的5’端为b区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有地高辛基团，其中c*区位于茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧；b区与A的b*段互补。
C的5’端为c区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有生物素基团，其中a*区位于茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧；c区与B的c*区互补。
将A、B、C探针溶液95℃水浴5min，然后冷却至室温，形成茎环结构。当样品中含有目标核酸序列时，目标核酸的a*区与A的a区结合，触发了支点介导的链置换反应，依次打开探针B、探针C的茎环结构并且与之结合，最终产生大量的带有2个地高辛基团修饰和1个生物素基团修饰的Y型核酸纳米结构。该核酸纳米结构具有类抗体活性，其生物素基团能够通过与链霉亲和素作用而固定于96孔板，其地高辛基团能够与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合，形成了抗原抗体复合物。辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺发生显色反应，将无色的显色液变为蓝色溶液。加入硫酸溶液，终止反应，并且将颜色变成黄色。
本发明的有益效果是：
（1）本发明所述的支点介导链置换信号放大策略无需蛋白酶和热变性退火过程；
（2）本发明所述的酶联免疫检测技术能够同时检测96或者384个样品；
（3）本发明所述的核酸检测方法具有较高的灵敏度，对核酸的检测限为5fM；
（4）本发明所述的核酸检测方法具有很好的特异性，能够识别单碱基突变的核酸序列；
（5）本发明所述的方法与核酸配体技术结合，能够应用于重金属离子、毒性小分子和蛋白质等的检测。
附图说明
图1为快速检测核酸的示意图；
图2为核酸检测的回归曲线；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种检测核酸试剂盒，以特异性目标核酸序列（5’-GCACTACTCCCTAACA TCTCAAGC（a*）-3’，SEQ ID NO.1）的检测为例，包括以下成分：
（1）分子探针A、B 和C；具体序列如下：
序列A：5’-GCTTGA（a）-GATGTTAGGGAGTAGTGC-TCCAATCACAAC（环部位）-GCACTACTCCCT （b*）AACATC-AAAAA（连接臂）-digoxigenin（分子物质I）-3’ (SEQ ID NO.2)；
序列B：5’-AGGGAG（b）-TAGTGCGTTGTGATTGGA-AACATCTCAAGC（环部位）-TCCAATCACAAC （c*）GCACTA-AAAAA（连接臂）-digoxigenin（分子物质I）-3’ (SEQ ID NO.3)；
序列C：5’-GTTGTG（c）-ATTGGAGCTTGAGATGTT-GCACTACTCCCT（环部位）-AACATCTCAAGC （a*）TCCAAT-AAAAA（连接臂）-biotin（小分子物质II）-3’ (SEQ ID NO.4)。
（2）核酸杂交缓冲液（含50 mM Na2HPO4，500 mM NaCl，pH 6.8）。
（3）链霉亲和素包被的96孔板。
（4）辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体。
（5）四甲基联苯胺显色液（含100 mM citric acid，200 mM Na2HPO4，0.32 mM TMB，2 mM H2O2，pH 4.3）。
（6）洗涤液（含0.2g NaH2PO4.2H2O，2.9g Na2HPO4.12H2O，8g NaCl，0.5% Tween 20，pH 7.4）。
一种检测核酸方法的示意图如图1所示，具体操作步骤为：
（1）所述三种分子探针（A、B和C）干粉用超纯水溶解制成浓缩贮备液，然后用磷酸盐缓冲液（50 mM Na2HPO4，0.5 M NaCl，pH 6.8）稀释到合适浓度，95℃温育5min，然后缓慢冷却室温，置于4℃保存；
（2）在离心管中分别加入4μL步骤（1）中制备的三种分子探针、28μL磷酸盐缓冲液和4μL待测核酸样品溶液，室温（18～27℃）反应60min；
（3）取步骤（2）反应液100μL加入链霉亲和素包被的96孔板，室温反应30min；
（4）将步骤（3）的96孔板洗涤3次，然后加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，室温反应30min；
（5）将步骤（4）的96孔板洗涤3次，然后加入100μL四甲基联苯胺显色液，室温反应15min；
（6）向步骤（5）的96孔板加入50μL硫酸溶液终止反应；
（7）酶标仪检测450纳米处吸收值，即可。
实施例 2：对不同浓度核酸的检测
配制特异性目标核酸的标准溶液，浓度分别为5.0 nM，500 pM，50 pM，5 pM，500 fM，50fM，5 fM 和 0 fM。将不同浓度的核酸样品分别加到实施例1所述的反应体系中，充分反应后检测450纳米处的吸光值，如图2A 所示，随着核酸浓度的增加，对应的吸光值逐渐增加。以核酸浓度对数值为横坐标，450纳米吸光值为纵坐标，绘制曲线（图2B），二者具有很好的线性关系，线性范围为5 fM～5 nM，线性方程是：Y = 0.282C + 1.531，（R2=0.98）（Y 为450纳米吸光值的对数值，C 为核酸浓度），根据3倍空白值标准偏差，检测限为5 fM。
实施例 3：特异性试验
配制浓度为5nM的不同核酸溶液，分别含有目标序列、一个碱基突变的序列、一个碱基缺失的序列和一个碱基插入的序列。将这些核酸溶液加入实施例1所述的检测体系中，待充分反应后检测OD450值变化，结果如图3所示。
图3显示：含有完全互补的目标核酸序列的样品的OD450显著增加，而单碱基突变、缺失和插入的核酸序列均没有明显的吸光值变化。说明本发明核酸检测方法具有很高的特异性和准确性。
由以上实验结果可知，本发明的核酸检测方法具有高的灵敏度，对核酸的检测限为5fM；检测过程方便、迅速，可同时检测96或384个样品；检测过程室温进行，不需要热变性退火。此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，能够识别单个碱基突变的核酸序列。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种核酸检测方法及试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工组合序列
<400> 1
gcactactcc ctaacatctc aagc 24
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工组合序列
<400> 2
gcttgagatg ttagggagta gtgctccaat cacaacgcac tactccctaa catcaaaaa 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工组合序列
<400> 3
agggagtagt gcgttgtgat tggaaacatc tcaagctcca atcacaacgc actaaaaaa 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工组合序列
<400> 4
gttgtgattg gagcttgaga tgttgcacta ctccctaaca tctcaagctc caataaaaa 59

Claims (10)

1.一种核酸的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括下列核酸序列：
序列A： 5’端为a区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质I，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有b*区；
序列B： 5’端为b区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质I，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有c*区；
序列C： 5’端为c区，中间为茎环结构和连接臂，3’端修饰有特异性亲和小分子物质II，其中茎环结构的茎结构中靠近连接臂的一侧包含有a*区；
其中，待测核酸序列3’端为a*区；a与a*、b与b*、c与c*互补配对。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：待检测核酸为单链或双链通过处理得到的单链，包含10-40个碱基。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：a、a*、b、b*、c、c*区具有4～8 个碱基。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：序列A、B、C中的茎环结构的环结构具有10～15个碱基。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：序列A、B、C中的茎环结构的茎结构中一侧具有14～22个碱基与另一侧的碱基互补配对。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：序列A、B、C中的连接臂具有4～8 个碱基。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：特异性亲和小分子物质包括地高辛、生物素、Alexa Fluor 488、6-FAM、Cy3或Texas Red。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括固定装置，装置中包被有能与特异性亲和小分子物质II结合的功能蛋白II。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括催化显色反应的催化酶标记的功能蛋白I，所述功能蛋白I能与特异性亲和小分子物质I结合。
10.一种核酸检测方法，其特征在于：利用权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒进行核酸检测。
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