CN106591436A

CN106591436A - 用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN106591436A
Application number: CN201611044127.9A
Authority: CN
Inventors: 常荣山; 谭蔚泓
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明提供了用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要通过在抗原分子上修饰四种不同的单链寡核苷酸链，一半抗原分子上修饰两种不同的寡核苷酸单链，另一半抗原分子上修饰另外两种不同的寡核苷酸单链；在加入待测体液后，试剂中经过修饰的抗原分子与待测体液中的抗体结合，孵育一段时间后，再加入试剂盒里预带的一段荧光标记的寡核苷酸桥链，然后加入DNA链接酶进行实时荧光PCR反应;反应后，通过这些合成的核苷酸链的铰链，形成抗原‑DNA‑抗体复合物；通过检测荧光强度来定量检测待测抗体的浓度。本发明的有益效果：本发明试剂盒不使用抗体，特异性高，可以检测到体液中飞摩尔浓度的痕量抗体，检测精度高。

Description

用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

抗原抗体反应是指，抗体能特异性地识别相应的抗原并与之结合。这种特异性结合在体外也能发生，这特特异性结合就是许多免疫检测方法的基础。在抗体分子的N端，不同的抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的，此区为“多变区”（variable region, V区），它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。每个抗体分子有两个多变区，可以特异识别结合两个抗原分子。邻位连接技术采用了核酸适体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针(proximity probes)。当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时，它们将在空间位置上相互临近，通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测，实现了特殊蛋白质的定量检测。邻位连接技术检测的灵敏度可以达到酶联免疫吸附法的1000倍。

发明内容

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探试剂盒及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针，包括5′端标记为巯基的DNA探针A，所述DNA探针A序列为CAGGTAGTAGTACGTCTGTTTCACGATGAGACTGGATGAA；

5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针B，所述探针B序列为TCACGGTAGCATAAGGTGCAAGATAATACTCTCGTAGCAC；

5′端标记为巯基的DNA探针D，所述DNA探针序列为GGCCTCCTCCAATTAAAGAATCACGATGAGACTGGATGAA；

5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针E，所述探针E序列为TCACGGTAFCATAAGGTGCAGTACCCAAATAACGGTTCAC 。

一种包括如以上所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒，其特征在于：包括3′端标记为巯基的DNA探针A，5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针B，3′端标记为巯基的DNA探针D、5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基探针E，用于溶解抗体的交联缓冲液、用于溶解抗原的孵育缓冲液、链接缓冲液。

优选地，所述交联缓冲液为55mmol/L磷酸钠, 150 mmol/L氯化钠, 20mmol/LEDTA, 且所述交联缓冲液的pH =7.2。

优选地，所述孵育缓冲液成分为2% BSA, 0.2% Triton X-100, 8 mmol /L EDTA，PBS。

优选地，所述链接缓冲液中包括具有荧光标记的寡核苷酸桥链，所述链接缓冲液成分为20 mmol /LTris, 50 mmol /LKCl, 20 mmol /L MgCl₂, 20 mmol /L DTT, 25 μmol /L NAD, 0.025 U/μL DNA连接酶, 100 nmol /L 寡核苷酸桥链， 0.01% BSA, 且所述链接缓冲液 pH=7.5。

优选地，所述寡核苷酸桥链的序列号为CUACCGUGAUUCAUCCAG。

一种以上所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

S1、抗原修饰，将抗原溶解到交联反应缓冲液中形成抗原液，将探针溶解在交联反应缓冲液中分别形成探针液，将探针液加入到抗原液中，进行脱盐柱后、浓缩形成相应的探针混合溶液，与抗原液混合，过夜后形成经过探针修饰过的抗原溶液；

S2、孵育，将S1中形成的经过探针修饰过的抗原（探针A，B修饰到一半抗原上，D，E修饰到另外一半抗原上，步骤S1修饰的抗原各半）加入到孵育缓冲液中，再加入待测液，孵育；再加入链接缓冲液进行二次孵育，加入尿嘧啶切除液后进行三次孵育；所述二次孵育和三次孵育温度相同；

S3、PCR反应，将以上S2中三次孵育后的孵育液与PCR反应液混合进行PCR反应，所述反应参数为95℃10分钟， 95℃15秒, 60℃ 30秒， 12个循环；吸取PCR反应液按照1:20的比例，用纯水稀释，然后再吸取这样的稀释液，与2倍的qPCR扩增液，扩增引物按照，8.5:10:1.5的比例混合，进行qPCR扩增。

S4、荧光检测，检测反应液的荧光强度。

优选地，所述S1中抗原包括蛋白类抗原和小分子化合物半抗原。

本发明的有益效果：本发明试剂盒不使用抗体，特异性高，可以检测到体液中飞摩尔浓度的痕量抗体，检测精度高。

附图说明：

图1本发明邻近连接的原理示意图。

图2本发明的检测示意图。

具体实施方式

本发明的原理示意图如图1所示，将一对邻位连接核酸探针修饰在同一个抗原分子上，再加入待测抗体，一个待测抗体可以识别并结合两个核酸探针修饰过的抗原分子，这样就形成了笼状结构，在空间位置上相互临近；然后，加入的标记了荧光的DNA桥链，通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反应待测抗体的浓度。

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

检测人抗胰岛素抗体

1）抗原修饰：将人胰岛素配制成浓度为1mg/mL的抗原液，溶解在9μL的交联反应缓冲液中。所述交联缓冲液成分为：55mmol/L磷酸钠（sodium phosphate）, 150 mmol/L氯化钠（sodium chloride）, 20mmol/L EDTA, 其pH =7.2。再加入1微升的浓度为4 mmol/L的sulfo-SMCC DMSO溶液，在室温下反应2小时。

3′端标记为巯基的DNA探针A，所述DNA探针A的序列为：

CAGGTAGTAGTACGTCTGTTTCACGATGAGACTGGATGAA

将DNA探针A溶解在交联缓冲液中，其浓度为100微摩尔/升，吸取3μL探针A液加入到50μL人胰岛素抗原液中，再加入100 mmol/L DTT溶液，在37°C下反应1小时。反应液先经过截流分子量7000道尔顿脱盐柱，再经过截流分子量3000道尔顿的脱盐柱后，总体积浓缩到60μL。最后将10μL的抗原溶液与60μL的巯基DNA探针A溶液混合， 4℃下过夜。

5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针B，所述探针B的序列为：

TCACGGTAGCATAAGGTGCAAGATAATACTCTCGTAGCAC。

探针B 的修饰与探针A完全相同。

2）和上述步骤1完全相同，将 3′端标记为巯基的DNA探针D（序列为GGCCTCCTCCAATTAAAGAATCACGATGAGACTGGATGAA），5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基探针E（序列为TCACGGTAFCATAAGGTGCAGTACCCAAATAACGGTTCAC ）标记在相同量的人胰岛素抗原上。

A. 孵育：1飞摩尔的DNA标记抗原(上述步骤1,2修饰的抗原各半)溶解在2μL的孵育缓冲液(2% BSA, 0.2% Triton， X-100，8 mmol/L EDTA，PBS)，加入到2μL的待测液中，37°C孵育30分钟。再次加入116μL的链接缓冲液（20 mmol/LTris, 50 mmol/LKCl, 20 mmol/LMgCl₂, 20 mmol/L DTT, 25 μmol/L NAD, 0.025 U/μL DNA连接酶, 100 nmol /L DNA桥链0.01%BSA，pH7.5）。DNA桥链序列为CUACCGUGAUUCAUCCAG。

B. 30 ℃孵育30分钟。再加入10μL尿嘧啶切除液(0.025 U/μL，Epicenter Bio公司生产)，30 °C继续孵育15分钟。

3）PCR反应：将25μL上述孵育液与25μL的两倍PCR反应液（Master Mix，Qiagen）混合，引物浓度为10 nmol /L，PCR反应参数：95℃ 10分钟， 95℃ 15秒,60℃ 30 秒，进行12个循环。吸取PCR反应液按照1:20的比例用纯水稀释，然后再吸取这样的稀释液8.5μL，与10μL的 2倍qPCR扩增液（Life Technologies），1.5μL的扩增引物（浓度为0.7μmol/L）混合，进行qPCR扩增, 进行16 个循环。

4）实时定量荧光检测：在qPCR仪上检测反应液的荧光强度，当样品的荧光强度超过阈值后，就可以通过荧光强度大小，对应的扩增曲线，找到待测样品的浓度。

实施例2

检测二硝基酚抗体

1）抗原修饰：将二硝基酚-BSA配制成浓度为1mg/mL的抗原液，溶解在9μL的交联反应缓冲液中。所述交联缓冲液成分为：55mmol/L磷酸钠（sodium phosphate）, 150 mmol/L氯化钠（sodium chloride）, 20mmol/L EDTA, 其pH =7.2。再加入1微升的浓度为4 mmol/L的sulfo-SMCC DMSO溶液，在室温下反应2小时。

3′端标记为巯基的DNA探针A的序列为：

CAGGTAGTAGTACGTCTGTTTCACGATGAGACTGGATGAA

吸取3μL探针A液（100 μmol /L，），再加入100 mmol /L DTT溶液，在37℃下反应1小时。反应液先经过截流分子量7000道尔顿脱盐柱，再经过截流分子量3000道尔顿的脱盐柱后，，总体积浓缩到60μL。最后将10μL的抗原溶液，60μL的巯基DNA探针溶液混合， 4℃下过夜。

探针B 的修饰与探针A完全相同。

所述5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基探针B的序列为：

TCACGGTAGCATAAGGTGCAAGATAATACTCTCGTAGCAC

2）和上述步骤完全相同，将3′端标记为巯基的DNA DNA探针D（序列为GGCCTCCTCCAATTAAAGAATCACGATGAGACTGGATGAA），5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基探针E（序列为TCACGGTAFCATAAGGTGCAGTACCCAAATAACGGTTCAC )，标记在相同量的二硝基酚-BSA上。

A. 孵育：1飞摩尔的DNA标记抗原（上述步骤1,2修饰的抗原各半）加入到2μL的孵育缓冲液（2% BSA, 0.2% Triton， X-100, 8 mmol /L EDTA，PBS)中，加入2μL的待测液，37℃下孵育30分钟。再次加入116μL的链接缓冲液（20 mmol /LTris, 50 mmol /LKCl, 20mmol /L MgCl₂, 20 mmol /L DTT, 25 μmol /L NAD, 0.025 U/μL DNA连接酶, 100 nmol/L DNA桥链 0.01% BSA, pH7.5）。所述DNA桥链序列为CUACCGUGAUUCAUCCAG。

B. 30℃孵育30分钟，再加入10μL尿嘧啶切除液(0.025 U/μL，Epicenter Bio公司生产)，30 ℃继续孵育15分钟。

3）PCR反应：将25μL上述孵育液与25μL的2倍PCR反应液（Master Mix ，Qiagen）混合，引物浓度为10 nmol /L，PCR反应参数： 95℃ 10分钟， 95℃ 15秒,60℃ 30 秒，进行12个循环。吸取PCR反应液按照1:20的比例用纯水稀释，然后再吸取这样的稀释液8.5μL，与10μL的 2倍qPCR扩增液（（Life Technologies），1.5μL的扩增引物（浓度为0.7μmol/L）混合，进行qPCR扩增,进行16 个循环。

4）实时定量荧光检测：在QPCR仪上检测反应液的荧光强度，当样品的荧光强度超过阈值后，就可以通过荧光强度大小，对应的扩增曲线，找到待测样品的抗体浓度。

以上实施例经过荧光强度检测后检测数据如图2所示，其中纵坐标为荧光强度，横坐标上方的与横坐标平行的虚线为阈值，比如，扩增27个循环时，线2表示，荧光强度刚过阈值，为480，对应的抗体浓度是0.000394微克/毫升；线3上荧光强度为1400，对应的抗体浓度是0. 00394微克/毫升；线4上荧光强度为1800，对应的抗体浓度是0.0394微克/毫升；线5上荧光强度为2000，对应的抗体浓度是0.394微克/毫升；线6、线7上荧光强度几乎一样，抗体浓度超过了3.94微克/毫升。

以上列举了2种典型实施方式，需要说明的是，本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims

1.用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针，其特征在于：包括3′端标记为巯基的探针A，所述DNA探针A序列为CAGGTAGTAGTACGTCTGTTTCACGATGAGACTGGATGAA；

5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针B，所述DNA探针B序列为TCACGGTAGCATAAGGTGCAAGATAATACTCTCGTAGCAC；

3′端标记为巯基的探针D，所述DNA探针D序列为GGCCTCCTCCAATTAAAGAATCACGATGAGACTGGATGAA；

5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针E，所述DNA探针E序列为TCACGGTAFCATAAGGTGCAGTACCCAAATAACGGTTCAC 。

2.一种包括如权利要求1所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒，其特征在于：包括3′端标记为巯基的DNA探针A、5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针B、3′端标记为巯基的DNA探针D、5′端标记为磷酸基、3′端标记为巯基的探针E，用于溶解抗体的交联缓冲液、用于溶解抗原的孵育缓冲液、链接缓冲液。

3.根据权利要求2所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒，其特征在于：所述交联缓冲液为55mmol/L磷酸钠, 150 mmol/L氯化钠, 20mmol/L EDTA, 且所述交联缓冲液的pH =7.2。

4.根据权利要求2所述的所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针，其特征在于：所述孵育缓冲液成分为2% BSA, 0.2% Triton， X-100, 8 mmol /L EDTA，PBS。

5.根据权利要求2所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒，其特征在于：所述链接缓冲液中包括具有荧光标记的寡核苷酸桥链，所述链接缓冲液成分为20 mmol /LTris, 50 mmol /LKCl, 20 mmol /L MgCl₂, 20 mmol /L DTT, 25 μmol /LNAD, 0.025 U/μL DNA连接酶, 100 nmol /L 寡核苷酸桥链， 0.01% BSA, 且所述链接缓冲液 pH=7.5。

6.根据权利要求5所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸桥链的序列为CUACCGUGAUUCAUCCAG。

7.一种如权利要求2所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

S1、抗原修饰，将抗原溶解到交联反应缓冲液中形成抗原液，将探针溶解在交联反应缓冲液中分别形成探针液，将探针液加入到抗原液中，进行脱盐柱后、浓缩形成相应的探针混合溶液，与抗原液混合，过夜后形成经过探针修饰后的抗原溶液；

S2、孵育，将S1中形成的经过探针修饰后的抗原（探针A，B修饰到一半抗原上，D，E修饰到另外一半抗原上，步骤S1修饰的抗原各半）加入到孵育缓冲液中，再加入待测液，孵育；再加入链接缓冲液进行二次孵育，加入尿嘧啶切除液后进行三次孵育；所述二次孵育和三次孵育温度相同；

S3、PCR反应，将以上S2中三次孵育后的孵育液与PCR反应液混合，进行PCR反应，所述反应参数为95℃10分钟， 95℃15秒, 60℃ 30秒， 12个循环；吸取PCR反应液按照1:20的比例用纯水稀释，然后再吸取这样的稀释液，与2倍的qPCR扩增液，扩增引物按照，8.5:10:1.5的比例混合，进行qPCR扩增；

S4、荧光检测，检测反应液的荧光强度。

8.一种如权利要求7所述的用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针试剂盒的制备方法，其特征在于：所述S1中抗原包括蛋白类抗原和小分子化合物半抗原。