CN108342450A - 一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种邻位连接技术用于定量检测NT‑proBNP含量的试剂盒。所述试剂盒包括：NT‑proBNP探针A、NT‑proBNP探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；本发明还公开了所述的一种邻位连接技术用于定量检测NT‑proBNP含量试剂盒的制备方法，该方法包括：NT‑proBNP探针A的制备、NT‑proBNP探针B的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本明首次将邻位连接技术方法应用在NT‑proBNP的定量检测上，与现有技术方法相比，具有灵敏性高、特异性强、高通量等优点，可提高急性心肌损伤、慢性心力衰竭和动脉粥样硬化等诊断的准确性，具有极大的市场价值。

Description

一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒、制 备及使用方法
技术领域
本发明涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内NT-proBNP的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
心血管疾病(CVD)是全球主要死因，大约30％的死亡原因由心血管疾病引起。世界卫生组织(WHO)预测，这一状况还将持续。心血管疾病不受性别、社会经济和地理影响，估计每年有2360万人死于心血管疾病。急性心肌损伤、慢性心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病的诊断与治疗近年来虽有很大进展，但因其早期诊断较困难，常会漏诊或误诊，以致到晚期才开始治疗，疗效差，病死率高，是临床医生面临的重大挑战，特别是老年人，容易患慢性呼吸道疾病，症状不典型致误诊，漏诊更多。
国外多项研究证实，N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)是很好的心衰诊断标志物。人类的心脏除了是一个非常有效的弹性泵，还是一个重要的内分泌器官，心肌细胞产生结构相关的肽类家族统称为尿钠肽，包括心房尿钠肽和脑钠肽，与很多生理活性蛋白一样，由单独的基因编码，以前体的形式合成。NT-proBNP的分子量为8.5KD，不是一个活性激素，由proBNP 裂解而来，半衰期为60-120min，由肾清除，体外稳定时间长达24小时，具有更高灵敏度，且不受rh-BNP影响，便于临床医生准确发现早期和轻度心力衰竭，故而2002年12月美国 FDA批准了NT-proBNP在临床的应用。NT-proBNP用于对高危人群的筛查，具有重要的指导意义，如糖尿病、遗传性心脏病、高血压及既往有心梗、风湿性心脏病史已行换瓣手术的患者，都应定期作NT-proBNP的检测，及时了解心脏功能状况。
目前检测NT-proBNP含量的常用方法包括有酶联免疫吸附试验法和化学发光法等。这些方法均存在相应的缺点，酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，而化学发光法虽然具有操作简单、检测速度快、高通量检测等优点，但是也存在非均相反应、批内批间变异大等缺点。而本发明提出的基于一种邻位连接技术检测NT-proBNP含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于心血管疾病的监测，可以提高急性心肌损伤、慢性心力衰竭和动脉粥样硬化等诊断的准确率，具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测NT-proBNP的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于邻位连接技术定量检测NT-proBNP含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗NT-proBNP抗体偶联寡聚核苷酸的NT-proBNP探针A；
2)抗NT-proBNP抗体偶联寡聚核苷酸的NT-proBNP探针B；
在上述技术方案中，所述抗NT-proBNP抗体为针对NT-proBNP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的NT-proBNP检测试剂盒。其主要组成包括：
1)NT-proBNP探针A；
2)NT-proBNP探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入NT-proBNP探针A和NT-proBNP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗NT-proBNP抗体，4-待测物(NT-proBNP)， 5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗NT-proBNP抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶
图2是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
NT-proBNP探针A的制备：
1)取0.1mg抗NT-proBNP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到NT-proBNP探针 A。
实施例2
NT-proBNP探针B的制备：
1)取0.1mg抗NT-proBNP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，得到NT-proBNP探针B。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)NT-proBNP探针A；
2)NT-proBNP探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入NT-proBNP探针A和NT-proBNP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0pg/mL、20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL、10000pg/mL、35000pg/mL的NT-proBNP标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μL NT-proBNP探针A，加入100μL NT-proBNP探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL 连接缓冲液反应10min后，再加入20μL qPCR反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。
以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
相关性比对：如图3所示，与罗氏NT-proBNP电化学试剂盒的相关性为：y＝0.983x+43.11， R2＝0.999。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：NT-proBNP探针A、NT-proBNP探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；
2)使用方法：将待测样本加入到反应孔中，再加入NT-proBNP探针A和NT-proBNP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
3)检测方法：对上述2)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
2.一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)NT-proBNP探针A的制备；
2)NT-proBNP探针B的制备。
3.根据权利要求1所述的NT-proBNP探针A和探针B均为抗NT-proBNP抗体偶联的寡聚脱氧核苷酸。
4.根据权利要求3所述的抗NT-proBNP抗体为针对NT-proBNP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的NT-proBNP探针A上的寡聚脱氧核苷酸a序列为：5’-GCATTGATCTAGTCATTCTAGTTATGTAGGGCCAACGACGACTGCAGATGAATTAATGAGGA-3’。
6.根据权利要求3所述的NT-proBNP探针B上的寡聚脱氧核苷酸b序列为：5’-CGTAGCCGGCATATGGTACGACGACATGTACAGATACGACTGACGATCAGTACGTTTAAGGATAC-3’。
7.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的连接缓冲液为0.02％BSA，20mmol/L Tris，50mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，0.03U/μL DNA连接酶，100mmol/L寡核苷酸桥链。
8.根据权利要求7所述寡聚核苷酸桥链的序列为5’-TCGTACCATATGCCGGCTACGTCCTCATTAATTCATCTG-3’。
9.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测NT-proBNP含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的qPCR反应液包含PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan probe、TaqDNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的PCR正向引物序列为5’-ATTGATCTAGTCATTCTAGTTATG-3’、PCR反向引物序列为5’-ATCCTTAAACGTACTGATCGTCAGTCG-3’、TaqMan probe序列为5’-TGAATTAATGAGGACGTAGCCGGCATATGGTAC-3’。
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