CN108226530A - 一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒。所述试剂盒包括：Myo探针A、Myo探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；本发明还公开了所述的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量试剂盒的制备方法，该方法包括：Myo探针A的制备、Myo探针B的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本明首次将邻位连接技术方法应用在Myo的定量检测上，与现有技术方法相比，具有灵敏性高、特异性强、高通量等优点，可提高急性心肌梗死诊断的准确性，具有极大的市场价值。

Description

一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒、制备及使 用方法
技术领域
本发明涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内Myo的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin，Myo)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，大量存在于横纹肌(骨骼肌以及心肌)细胞中的血红素蛋白。心肌或者骨骼肌受损时，肌红蛋白会因为细胞膜的破裂而被释放到血管系统，可以在血液中检测到。肌红蛋白是急性心肌梗死发生后最早可检测的标志物，在急性心肌梗死的早期诊断及鉴别诊断中具有重要的临床意义。
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是临床常见的一种急性缺血性心脏病，其诊断依据主要以心电图特异性变化、血清生化标志物以及临床体征性病史为主。大量临床资料表明，AMI患者中约20.0％的患者早期没有典型的临床症状，约50.0％的患者出现特征性的心电图改变。早诊断、早治疗、早溶栓可明显改善患者疾病预后和降低病死率。MYO是近年来新发现的一种高度灵敏、高度特异性的反映心肌损伤的血清标志物，其广泛存在于心肌组织中。MYO在心肌损伤时迅速地表达，1-3h血内肌红蛋白浓度迅速升高，12h时几乎所有AMI患者的肌红蛋白都升高。因此胸痛发作6-12h内肌红蛋白不升高是排除AMI良好的指标(即阴性指标)，同时也是早期检测AMI最快的指标。由于在AMI后血中肌红蛋白很快从肾脏清除，发病18-30h内可完全恢复到正常水平，所以肌红蛋白的测定有助于在AMI 病程中观察患者有无再梗死或梗死再扩展病症，同时也是溶栓治疗中判断有无再灌注的较敏感而准确的指标诊断、预后的重要指标备受关注。
目前检测Myo含量的常用方法包括有免疫比浊法和化学发光法等。免疫比浊法存在液态的胶乳试剂稳定性不佳，灵敏度低、且定量准确度差。而化学发光法虽然具有操作简单、检测速度快、高通量检测等优点，但是也存在非均相反应、批内批间变异大等缺点。为促进我国急性心肌梗死的诊断水平，本发明提出的基于一种邻位连接技术检测Myo含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于急性心肌梗死诊断，可以提高急性心肌梗死判断的准确性，具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测Myo的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于邻位连接技术定量检测Myo含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗Myo抗体偶联寡聚核苷酸的Myo探针A；
2)抗Myo抗体偶联寡聚核苷酸的Myo探针B；
在上述技术方案中，所述抗Myo抗体为针对Myo不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的Myo检测试剂盒。其主要组成包括：
1)Myo探针A；
2)Myo探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Myo探针A和Myo探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗Myo抗体，4-待测物(Myo)，5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗Myo抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶
图2是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
Myo探针A的制备：
1)取0.1mg抗Myo抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到Myo探针A。
实施例2
Myo探针B的制备：
1)取0.1mg抗Myo抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，即得到Myo探针B。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)Myo探针A；
2)Myo探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Myo探针A和Myo探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL的Myo 标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μL Myo探针A，加入100μL Myo 探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL连接缓冲液反应10min后，再加入20μL qPCR 反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。
以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
相关性比对：如图3所示，与罗氏Myo电化学试剂盒的相关性为：y＝0.994x+6.442，R2＝0.997。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：Myo探针A、Myo探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；
2)使用方法：将待测样本加入到反应孔中，再加入Myo探针A和Myo探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
3)检测方法：对上述2)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
2.一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)Myo探针A的制备；
2)Myo探针B的制备。
3.根据权利要求1所述的Myo探针A和探针B均为抗Myo抗体偶联的寡聚脱氧核苷酸。
4.根据权利要求3所述的抗Myo抗体为针对Myo不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的Myo探针A上的寡聚脱氧核苷酸a序列为：5’-GCATTGATCTAGTCATTCTAGTTATGTAGGGCCAACGACGACTGCAGATGAATTAATGAGGA-3’。
6.根据权利要求3所述的Myo探针B上的寡聚脱氧核苷酸b序列为：5’-CGTAGCCGGCATATGGTACGACGACATGTACAGATACGACTGACGATCAGTACGTTTAAGGATAC-3’。
7.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的连接缓冲液为0.02％BSA，20mmol/L Tris，50mmol/L KCl，20mmol/LMgCl2，0.03U/μL DNA连接酶，100mmol/L寡核苷酸桥链。
8.根据权利要求7所述寡聚核苷酸桥链的序列为5’-TCGTACCATATGCCGGCTACGTCCTCATTAATTCATCTG-3’。
9.根据权利要求1所述的一种邻位连接技术用于定量检测Myo含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的qPCR反应液包含PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan probe、Taq DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的PCR正向引物序列为5’-ATTGATCTAGTCATTCTAGTTATG-3’、PCR反向引物序列为5’-ATCCTTAAACGTACTGATCGTCAGTCG-3’、TaqMan probe序列为5’-TGAATTAATGAGGACGTAGCCGGCATATGGTAC-3’。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276087A (zh) * 2013-05-30 2013-09-04 杭州金溪生物技术有限公司 高灵敏度的蛋白检测方法
CN104267196A (zh) * 2014-10-16 2015-01-07 东南大学 一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法
CN104313157A (zh) * 2014-10-27 2015-01-28 东南大学 一种邻位连接技术检测ngal的方法
CN105132379A (zh) * 2015-07-25 2015-12-09 大庆麦伯康生物技术有限公司 抗Myo单克隆抗体产生的杂交瘤
CN105779649A (zh) * 2016-03-29 2016-07-20 扬州大学 一种检测禽白血病病毒的免疫pcr试剂盒
CN106591436A (zh) * 2016-11-24 2017-04-26 湖南大学 用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法
CN106932590A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 复旦大学 一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276087A (zh) * 2013-05-30 2013-09-04 杭州金溪生物技术有限公司 高灵敏度的蛋白检测方法
CN104267196A (zh) * 2014-10-16 2015-01-07 东南大学 一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法
CN104313157A (zh) * 2014-10-27 2015-01-28 东南大学 一种邻位连接技术检测ngal的方法
CN105132379A (zh) * 2015-07-25 2015-12-09 大庆麦伯康生物技术有限公司 抗Myo单克隆抗体产生的杂交瘤
CN106932590A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 复旦大学 一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方法
CN105779649A (zh) * 2016-03-29 2016-07-20 扬州大学 一种检测禽白血病病毒的免疫pcr试剂盒
CN106591436A (zh) * 2016-11-24 2017-04-26 湖南大学 用于检测人体内低丰度抗体的邻位连接核酸探针与试剂盒及其制备方法

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