RU2587540C1 - Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относиться к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использована для диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC. Для этого выделяют ДНК из анализируемого образца крови. Затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце нефлуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций. По результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Группа изобретений относится также к набору праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК. Использование данной группы изобретения позволяет определять количество TREC и KREC наивных Т и В клеток в образцах крови с применением набора заявленных праймеров. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр., 4 табл.

Description

Изобретение относится к области иммунологии и медицины и предназначено для осуществления диагностики состояния иммунной системы пациента с целью определения нарушения функций иммунной системы, в том числе наличие первичной и вторичной иммунной недостаточности, оценки эффективности методов лечения и применяемых лекарственных средств, прогнозирования эффективности профилактики заболеваний.

Контроль состояния иммунной системы пациента позволяет своевременно диагностировать нарушения иммунного статуса организма человека, оценивать эффективность методов лечения и лекарственных средств, а также противопоказания к их применению, прогнозировать развитие заболеваний и эффективность вакцинации и т.п., что имеет большое значение для различных областей медицины.

Известен экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°С в течение 10 мин в присутствии 0,288 М NaCl в буферном растворе, посредством оценки иммунного статуса (патент RU 2422831, приоритет от 19.10.2009). Степень ингибирования лизиса определялась как разность показателей лизиса в контрольной пробе (с использованием стандартизированных эритроцитов барана в вероналовом солевом буфере) и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации NaCl. Предлагаемый способ отличается относительной простотой и доступностью, а также сокращает время на проведение анализа до 25 минут, однако не обеспечивает достаточной точности и полноты диагностики нарушения иммунного статуса.

Известен способ диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом, при котором в пробе венозной крови определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14^bright CD16^-HLA-DR⁺ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14^bright методом многоцветной проточной цитометрии и при повышенном относительном содержании активированных классических моноцитов (более 68,8%) диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности (патент RU 2527332, приоритет от 24.05.20130). Предлагаемый способ позволяет повысить точность выявления особенностей иммунного ответа у детей с первичным перитонитом, однако, в силу своей специфичности, имеет ограниченное применение и требует проведения целого комплекса дополнительных исследований для получения более полной оценки состояния иммунной системы.

Известен способ оценки тяжести больных с постнекротическими свищами поджелудочной железы путем исследования крови больного, при котором оценку состояния больного производят на основе показателя клеточного иммунитета - иммунорегуляторного индекса (RU 2442162, приоритет от 02.07.2010). При проведении исследований определяют методом проточной цитометрии субпопуляционный состав лимфоцитов, рассчитывают соотношение CD3+4+ Т-хелперов к CD3+8+Т-цитоксическим лимфоцитам (иммунорегуляторный индекс) и при его уровне 0,5-0,3 оценивают состояние больного как тяжелое. Предложенный способ позволяет оценить уровень клеточного иммунитета больного и по полученным результатам определить состояние больного, однако, также имеет ограниченное применение и не обладает достаточной точностью.

Известны способы определения состояния иммунной системы пациента по определению количественного содержания Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (Иммунодефициты: принципы диагностики и лечения, Сетдикова Н.Х. и др., ФАРМУС ПРИНТ, М., 2006). Указанные способы имеют широкую область применения, но не обеспечивают достаточно точной оценки изначального состояния иммунной системы пациента, поскольку не учитывают качество и функциональную зрелость лимфоцитов, а количество лейкоцитов в момент проведения анализа может зависеть не только от общего состояния иммунной системы пациента, но и от наличия других факторов, влияющих на иммунную, систему, в том числе, от характера и интенсивности воздействия чужеродных антигенов и/или наличия вредных электромагнитных излучений, загрязнений атмосферы и прочих сопутствующих факторов, которые могут оказать негативное воздействие на иммунную реакцию.

С учетом данных причин более точную оценку состояния иммунной системы обеспечивает способы, основанные на определении количества наивных Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, т.е. клеток, еще не контактирующих с антигеном и не вступивших в иммунный ответ. Известно, что во время созревания в тимусе при перестройке генов T-клеточного рецептора в тимоцитах образуется последовательность кольцевой ДНК, или TREC (signal joint T-cell receptor rearrangement excision circle: sjTREC или TREC). TRECs представляют собой нехромосомные нереплицирующиеся кольцевые ДНК продукты рекомбинации вариабельных сегментов генов, кодирующих TCR а и b цепи, в процессе созревания Т-клеток, которая присутствует в наивных Т-лимфоцитах периферической крови. Предполагается, что эта нехромосомная кольцевая ДНК не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. Измерение количества TREC методом количественной полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998 Dec 17; 396(6712):690-5].

Количественный анализ TREC активно применяется для оценки функции тимуса и неогенеза T-клеток. Он был использован для диагностики иммунодефицитов [Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal Е, Spirer Z, et al. (2010) Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res 67(2): 211-216], для неонатального скрининга ПИД у новорожденных [Puck JM (2007) SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. J Allergy Clin Immunol 120(4): 760-768] и как предиктор восстановления Т-клеточной функции после пересадки костного мозга [Roifman CM, Somech R, Grunebaum Е (2008) Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplant 41(11): 947-952]. Квантификация TREC с помощью real-time PCR и конструирование плазмиды, несущей фрагмент TREC, необходимой для построения калибровочной кривой, была описана Douek D.C, с соавторами еще в 1998 году. В дальнейшем различные варианты real-time PCR (моноплексные и мультиплексные с мишенью, отражающей количество геном эквивалентов в исследуемой ДНК) были предложены, для некоторых была проведена достаточно тщательная аналитическая и клиническая валидация.

Кроме того, определение количества TREC используют для оценки вклада тимопоэза в восстановление Т-клеточного пула на периферии после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток или костного мозга [Farge D, Henegar С, Carmagnat М, Daneshpouy М, Marjanovic Z, Rabian С, Ilie D, Douay C, Mounier N, Clave E, Bengoufa D, Cabane J, Marolleau JP, Gluckman E, Charron D, Toubert A. Analysis of immune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 2005 May; 52(5):1555-63.].

В работе [Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep; 124(3):522-7] Baker и др. пытались оценить возможность применения количественного анализа TREC в ДНК, выделенной из Guthrie - карточек (примерно 3 мкл крови). Авторы показали, что тест адекватен для выявления новорожденных детей с ПИД и в настоящее время он применяется для этих целей в штате Висконсин (США). Для анализа авторы использовали систему, предложенную в работе Douek DC, Vescio RA, Betts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000 May 27; 355(9218):1875-81.

Применение известных способов и тест-систем, использующих количественный анализ TREC, позволяет, до определенного уровня, повысить точность оценки количества наивных Т-лимфоцитов, однако этого уровня недостаточно для получения приемлемого уровня точности диагностики состояния иммунной системы. В связи с этим для повышения точности диагностики количественные методы дополняются иными методами, т.е. являются, по существу, «полуколичественными», но все равно не обеспечивают достаточной точности и способны выявлять только грубые отклонения от нормы. Кроме того, оценка состояния иммунной системы только по количеству наивных Т-лимфоцитов, без учета количества наивных В-лимфоцитов, в принципе не в состоянии обеспечить полную и точную диагностику состояния иммунной системы.

Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle), описанные в работах [Borte S, von

U, Fasth A, Wang N, Janzi M, Winiarski J, Sack U,

Q, Borte M,

L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15; 119(11):2552-5], где предложено одновременное определение TREC и KREC, но в дуплексном варианте и только с использованием прибора 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Авторы декларировали аналитическую чувствительность не менее 10 молекул TREC и KREC в реакции. Однако авторы не привели аналитических характеристик их варианта системы и также использовали только приборы ABI 7500 и ViiA7 от Applied Biosystems. Более того, работа содержит явные ошибки и разночтения. Так авторы используют праймеры и зонды для KREC, АСТВ и TREC. А в качестве стандартов используют плазмиды TREC, KREC и TRAC. В то же время авторы выставляют довольно низкие уровни отсечения - 15 TRECs/mkL и 10 KRECs/mkL для скрининга врожденных иммунодефицитов. Таким образом, описанный авторами способ и тест-система не могут быть использованы на практике без дальнейшего улучшения и соответствующей доработки.

Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle),

Известен способ определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток на основе количественного анализа TREC и BREC - В-рецепторного эксционного кольца (В - cell receptor excision circle) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (патент ЕР 1849877, приоритет от 24.04.2006). Предложенный способ, в отличие от предыдущего аналога, не содержит препятствий для практического использования, но также не обладает достаточной точностью, необходимой для диагностики состояния иммунной системы, т.к. в способе не оговорена необходимость одновременной амплификации молекул ДНК TREC, KREC с помощью ПЦР, проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул, что снижает сопоставимость получаемой информации и, соответственно, ее ценность для последующего анализа. Кроме того, отсутствует точный контроль за количеством циклов амплификации, что также сказывается на точности результатов анализа и не позволяет вносить соответствующие поправки.

Известно, что основной набор для ПЦР включает фрагмент ДНК, который требуется амплифицировать, праймеры, Taq-полимеразу или иную ДНК-полимеразы, буферный раствор и зонды (патент RU 2532853, приоритет от 11.03.2009). При этом, выбор праймеров и зондов определяется, прежде всего, выбором объекта, присутствие или отсутствие которого необходимо обнаружить, и выбором метода детектирования, в соответствии с которыми для каждого способа анализа нуклеиновых кислот с использованием ПЦР формируют набор, включающий праймеры и зонды, в состав которых могут также включаться биологические объекты для обеспечения внутреннего положительного или отрицательного контроля, используемые в качестве образцов стандартов. Так, в изобретении по патенту RU 2532853 при реализации способа определения целевой нуклеиновой кислоты для внутреннего положительного контроля предлагается использовать плазмидную ДНК или продукт ПЦР, когда целевой нуклеиновой кислотой является ДНК. Известны наборы праймеров и зондов с детектируемыми флуоресцентными метками, используемые для различных объектов, например, для амплификации вируса папилломы человека (патент RU 2530550, приоритет от 30.09.2009), идентификации гистоплазмоза и т.п., в том числе и для амплификации TREC и BREC (ЕР 1849877, приоритет от 24.04.2006). Однако известные способы не обеспечивают достаточной для клинической практики точности определения TREC и KREC в образцах крови.

Задачей настоящего изобретения является создание способа диагностики состояния иммунной системы пациента, позволяющего на основе оценки количества TREC и KREC наивных Т и В клеток, в образцах крови и выбранного для него набора праймеров и зондов повысить точность диагностики состояния иммунной системы пациента до необходимого в клинической практике уровня при сокращении времени проведения анализа и обеспечении возможности автоматической интерпретации полученных результатов.

Решение указанной задачи обеспечивается тем, что в отличие от известных способов диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC, новым является то, что выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.

Кроме того, стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами.

Кроме того, количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 10⁵ ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:

количество TREC = (количество копий TREC/количество копий IL17RA)*200000;

количество KREC = (количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.

Кроме того, аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.

Кроме того, решение указанной задачи обеспечивается набором праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающим:

олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,

и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 10⁴, 10³, 10², 5 копий на мл.

Одновременная амплификация участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул позволяет повысить точность проводимых измерений и достоверность результатов анализа, а также сократить время проведения анализа.

Использование олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, облегчает процесс детектирования.

Использование для регистрации полученных результатов гибридизационно-флуоресцентной детекции и определение в режиме реального времени абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.

Использование оценки абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК повышает достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, а также сокращает время проведения диагностики.

Применение предложенных стандартных образцов ДНК позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.

Использование в качестве нормировочного локуса гена IL17RA позволяет исключить ошибки при определении количества циклов амплификации.

Использование предложенного набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающего:

олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,

и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 10⁴, 10³, 10², 5 копий на мл,

обеспечивает оптимизацию реализации способа и получение заявленного технического результата.

Результаты исследований иллюстрируются графическими изображениями:

Фиг. 1 - результаты квантификации стандартной ДНК TREC;

Фиг. 2 - результаты квантификации стандартной ДНК KREC;

Фиг. 3 - результаты квантификации стандартной ДНК IL17RA;

Фиг. 4 - таблица стандартов и калибраторов.

Предлагаемый способ диагностики может быть реализован на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.

Первоначально производят взятие проб исследуемого материала. Материалом для исследования могут являться образцы крови в жидком виде или сухие пятна крови на бумаге, например периферическая кровь (ПК) больных с подозрением на иммунодефицит или сухие пятна крови новорожденных на любом подходящем носителе. Взятие ПК осуществляется в пробирки с ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови) в конечной концентрации 2 мг/мл. ПК берут из вены обычным способом.

Для выделения ДНК используют наборы «АмплиПрайм РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) или любые другие с близкими характеристиками.

Например, метод выделения ДНК может быть основан на лизисе образцов (кровь или сухие пятна крови на бумаге) в 4 М растворе гуанидинтиоционата, и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками этанолом, растворении осадка ДНК в 50 мкл воды.

В качестве нормировочного локуса используют ген IL17RA, позволяющий получить наиболее точные данные о процессе амплификации.

Амплификацию осуществляют с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов типа TaqMan, несущих на 5′-конце флуорофоры (FAM, HEX, ROX и др.) и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.).

Праймеры и зонды для ПЦР подобраны с учетом структур TREC и KREC таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК (перестроенной и не перестроенной в Т и В клетках), а также с учетом минимизации образумых в мультиплексной реакции праймер-димеров.

Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт», который обеспечивается использованием химически модифицированной Taq-полимеразы.

Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали экспериментально с использованием режима «градиент температур», оптимальная температура составила 62°С.

Пример 1. Получение стандартных плазмидных образцов.

Фрагменты TREC, KREC и гена IL17RA для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров:

в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1х буфер для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9); 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК человека, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан), 0,5 е.а. Pfu-полимеразы (Биосан). Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология) согласно следующей программе: 3 мин при 95°С начальной денатурации, 35 циклов: 10 с при 95°С для денатурации, 10 с при 60°С для гибридизации праймеров, 40 с при 72°С для элонгации.

Продукты амплификации с праймерами TREC3/TREC4 длиной 1192 п.н., IL17-Ra3/IL17-Ra4 длиной 455 п.н. и bp и KREC3/KREC4 длиной 482 п.н. гидролизовали эндонуклеазой рестрикции HindIII (Сибэнзим, Новосибирск) и лигировали с вектором pBluscriptII SK(+), гидролизованным той же эндонуклеазой, в течение 3-х часов с 100 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы (Биосан). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетоки Е. coli штамма XL1-Blue (Stratagene). У плазмиды клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки, секвенировали методом Сенгера.

Секвенирование было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора Big dye 3.1 (Центр коллективного пользования «Геномика», ИХБФМ СО РАН). Плазмидные ДНК (pST-TREC, pST-KREC и pST-IL17RA) выделяли из 100 мл ночной культуры в среде LB с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) согласно инструкции фирмы производителя. Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически (набор Qubit™ BR, Invitrogen). 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 10⁷-10¹ копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ TrisHCl рН 7.6 и ДНК фага лямбда 5 нг на мкл. Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (BioRad, Hercules, CA) согласно инструкциям производителя. Образцы стандартных образцов 8 мкл смешивали с 2Х ПЦР смесью и праймерами и зондами. Капли формировали с помощью Droplet Generator (DG) используя 70 µL DG Oil на лунку картриджа DG8 и 20 µL полной PCR смеси. Полученные капли (40 µL) переносили в 96-луночный ПЦР планшет, запечатывали и проводили ПЦР. Далее флуоресцентный сигнал, генерируемый в процессе гидролиза Taqman проб в каплях, был считан с помощью Droplet Reader, концентрация молекул TREC, KREC и IL17RA была определена с помощью математического обеспечения QuantaSoft. Концентрация полученных стандартных образцов было скорректирована с учетом данных цифровой ПЦР.

Пример 2. Аналитическая характеризация разработанной системы для количественного анализа TREC и KREC.

Для проверки специфичности использовались ДНК клеточных линий нелимфоидного происхождения, несущих неперестроенные Т и В клеточные рецепторы, а именно - HEK293, HeLa, Н460, а также образцы ДНК из мочи и слюны. По результатам проведенного тестирования специфичность составила 100%.

Линейный диапазон количественного определений копийности TREC, KREC и IL17RA определялся с помощью ПЦР на разведениях стандартных плазмид от 10⁹ коп/мл до 10³ коп/мл, при этом обращалось внимание на коэффициент R² и разброс значений Ct для повторов. Было показано, что в области концентраций от 10⁹ коп/мл до 5×10⁴ коп/мл для всех трех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Ct от концентрации с коэффициентом корреляции R² не хуже 0.98. Наименьшее количество копий, надежно детектируемых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл было: 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для IL17RA.

Пример 3. Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста

Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста осуществляется на основе анализа ДНК достаточно представительной выборки соответствующей возрастной группы (50-60 чел.) людей одного поколения, имеющих нормальные иммунологические параметры, с использованием известных методов и оборудования. В качестве примера определения референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста ниже приведены данные для детей возраста 0-17 лет, для получения которых использовали ДНК группы 56 здоровых (29 мальчиков и 27 девочек) с нормальными иммунологическими параметрами (Таблица 1). Для определения референсных значений для TREC и KREC у взрослых были использованы те же клинико-лабораторные и статистические подходы, что и у детей.

Полученные референсные значения приведены в Таблицах 2 и 3.

Пример 4. Клинические примеры

Пациент №1

Мальчик 4-х месяцев с диагнозом двусторонняя аспирационная пневмония, врожденный порок сердца (тетрада Фалло), состояние после наложения подключично-легочного анастамоза слева, ларингомаляция, хронический микроаспирационный синдром, недостаточность питания смешанного генеза, последствия перинатального поражения ЦНС. Концентрация TREC - на момент обследования показатели 4,04×10⁴ копий, концентрация KREC 1,38×10⁴ копий. Дальнейшая оценка состояния иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствует о течении иммунодефицита, связанного с другими уточненными значительными дефектами.

Пациент №2

Девочка 17 лет. Концентрация TREC 1,04×10⁴ копий, концентрация KREC - на момент обследования показатели 3,18×10² копий. Дальнейшие исследования иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствует о снижении выхода в периферическую кровь зрелых В-лимфоцитов. Диагноз после генетического исследования: общая вариабельная иммунодефицитная недостаточность (ОВИН).

Пациент №3

Мальчик, 1 месяц. Концентрация TREC в крови из полости сердца 1,81×10³ копий, концентрация KREC в крови из полости сердца 1,89×10 копий, что указывает на высокую вероятность прижизненного течения тяжелого комбинированного иммунодефицита с низким содержанием Т- и В-клеток. Посмертный диагноз после генетического исследования: тяжелый комбинированный иммунный дефицит с низким содержанием Т- и В-клеток.

Пациент №4

Мужчина 36 лет, носитель ВИЧ с возраста 30 лет. Последние несколько месяцев состояние здоровья резко ухудшилось, самочувствие страдает. Показатели общего анализа крови в пределах возрастных норм. Концентрация TREC в крови на момент обследования составляет 4,11×10¹ копий, концентрация KREC 2,33×10³ копий. Дальнейшее обследование методом проточной цитометрии показало крайне низкое содержание субпопуляции Т-хелперов, что, в свою очередь, требует незамедлительного проведения антиретровирусной терапии.

Использование группы изобретений позволяет повысить достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, уменьшить ошибки определения концентрации молекул TREC и KREC, особенно в области низких значений, а также уменьшить количество необходимых для анализа реакций за счет мультиплексирования.

Claims (5)

1. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC, при котором выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами,

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 10⁵ ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:
количество TREC = (количество копий TREC/количество копий IL17RA)*200000;
количество KREC = (количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.

5. Набор праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающий:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,

и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 10⁴, 10³, 10², 5 копий на мл.

Images