CN108699608A - 用于预测和诊断人巨细胞病毒(hCMV)先天性传播的方法和试剂盒 - Google Patents

用于预测和诊断人巨细胞病毒(hCMV)先天性传播的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过基于测定对象的样品中ISG15、IFIT3和USP18基因以及任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达计算所述对象阻止hCMV的传播的能力，进而预测和诊断哺乳动物对象中病毒病原体具体而言hCMV的子宫内‑传播的方法和试剂盒。

Description

用于预测和诊断人巨细胞病毒(hCMV)先天性传播的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒病原体具体而言人巨细胞病毒(hCMV)传播的诊断。更具体而言，本发明提供了用于在hCMV感染的哺乳动物对象中的早期妊娠期间预测和检测hCMV的子宫内-传播的方法和试剂盒。
背景技术
下面列出了被认为与本公开的主题背景相关的参考文献：
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对本文上述参考文献的承认不应被推断为意思是它们以任何方式与本公开的主题的可专利性相关。
发明背景
巨细胞病毒(CMV)是发达国家中先天性感染的最常见原因，影响美国和欧洲中所有活产中的0.5-2％1-4。胎儿CMV感染可导致多种长期残障，包括精神、听力和视力损害5-7。先天性CMV感染引起的严重残障比几种熟知的儿童期疾病诸如唐氏综合征或胎儿酒精综合征威胁更多的儿童4,8。
子宫内CMV传播主要在原发性母体感染期间发生，具有大约40％的母体-胎儿传播率8,9。规定CMV子宫内传播的机制是未知的。然而，传播被认为依赖于多个因素，包括母体和胎儿免疫系统、胎盘因素、母体病毒载量和病毒株9-13。
大量研究已经证明了T-细胞免疫在CMV感染的控制中的关键作用12。据显示，与非传播女性相比，将病毒传播至胎儿的患有原发性CMV感染的女性通常展示对CMV的延迟的T-细胞淋巴组织增生性应答14-17。另外，还已经报道了循环CMV-特异性效应子记忆T细胞(TEM)可以回归至CD45RA+表型，这与CMV病毒血症和母胎传播的控制相关联18。重要地，个体免疫应答异质性排除了预测胎儿CMV传播。
在缺乏有效的手段来阻止先天性hCMV传播的情况下，在约40％(REF)的原发性hCMV感染的女性将病毒传播给其胎儿的同时，在怀孕的早期阶段期间对子宫内-传播的早期和准确预测具有极其的临床重要性。
发明内容
本发明的第一方面涉及用于预测和诊断哺乳动物对象中病毒病原体——具体而言人巨细胞病毒(hCMV)——的子宫内-传播的方法。在更具体的实施方式中，本发明的方法可以包括以下步骤：在第一步骤(a)中，测定对象的生物样品中ISG15遍在蛋白类调节物(ISG15)、干扰素-诱导的具有三角形四肽(tetratricopeptide)重复的蛋白3(IFIT3)、遍在蛋白特异性肽酶18(USP18)、真核翻译起始因子2α激酶2(EIF2AK2)、包含HECT和RLD结构域的E3遍在蛋白蛋白连接酶5(HERC5)、包含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(RadicalS-Adenosyl methionine Domain Containing 2)(RSAD2)以及MX发动蛋白类GTP酶1(MX1)基因中至少一种的表达水平，从而获得样品中表达值Exsamp。接下来的步骤(b)包括计算样品的M(Msamp)值。应当注意，样品的M值指示检查的对象阻止所述病毒病原体——具体而言hCMV——的子宫内-传播的能力。在接下来的步骤(c)中，提供非传播对象的标准M(Mstand)值。应当注意，标准M值指示阻止病毒病原体——具体而言hCMV——的子宫内-传播所需的最小能力。最终步骤(d)包括确定步骤(b)中计算的样品的M(Msamp)值关于(c)中提供的非传播对象的标准M(Mstand)值是否是正或负中的任一个。因此，其中Msamp的正值指示了对象是非传播对象和Msamp的负值指示了对象是病毒病原体传播对象，具体而言hCMV传播对象，由此预测对象中病毒病原体的子宫内-传播。
本发明的第二方面涉及试剂盒，其包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18，以及任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子。
在进一步的方面，本发明提供了预后组合物，其包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18，以及任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子。
附图说明
为了更好的理解本文中公开的主题并举例说明其在实际中可以如何进行，现在将通过仅非限制性实例，参考附图描述实施方式，其中：
图1A-1G.对hCMV感染对象的五个微阵列数据集的分析
图1A是从(I)GSE14490、(II)GSE14816、(III)GSE17948、(IV)GSE19772和(V)GSE14408获得的组合数据的火山图，(I)GSE14490；对源自6个模拟感染的和匹配的6个hCMV感染的供体的树突细胞的分析，6hpi.(II)GSE14816；对源自3个模拟感染的和匹配的3个hCMV感染的供体的树突细胞的分析，24hpi.(III)GSE17948；对源自4个模拟感染的和匹配的4个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，24hpi.(IV)GSE19772；对源自2个模拟感染的和匹配的2个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，48hpi.(V)GSE14408；对源自6个模拟感染的和匹配的6个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，4hpi；
图1B对从火山图获得的顶部范围基因(top ranging gene)的STRING(用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具-版本9.1)分析；
图1C至1G分别为来自图1A中描述的5个数据集的hCMV感染之前和之后的ISG15基因表达。
图2.对hCMV感染(K＝2)的数学模型的模拟，所示数据针对四个不同的M值：0.495、0.65、0.80和0.95。
图3A-3C.被hCMV感染的18个怀孕女性的qRT PCR结果
图3A显示了在Z分数标准化之后三种选择的基因(IFIT3、ISG15和USP18)的总和；
图3B表1中概括的如图3A中的三种选择的基因的箱型图(box plot)允许根据表2预测先天性hCMV传播至胎儿。图表显示了分别5个和13个传播者(transmitter)和非传播者之间的分布；
图3C如图3A中所描述的标准化的三种基因的总和的接受者工作特性(ROC)曲线。
图4A-4C.使用hCMV感染的怀孕女性中测量的ISG15的RT-PCR水平计算M
图4A显示了如通过RT-PCR所测量的18位hCMV感染的怀孕女性中ISG15基因的水平；
图4B显示了对每个对象计算的M值；
图4C图解了与18位hCMV感染的怀孕女性的测量的ISG15表达水平相比计算的M值。
图5A-5G.来自被hCMV感染的怀孕女性的标准化的基因表达水平
图5A显示了IFIT3基因的标准化表达水平；图5B显示了USP18基因的标准化表达水平；图5C显示了ISG15基因的标准化表达水平；图5D显示了USP18基因的标准化表达水平；图5E显示了HERC5基因的标准化表达水平；图5F显示了RSAD2基因的标准化表达水平；图5G显示了MX1基因的标准化表达水平。
图6A和6B.来自被hCMV感染的怀孕女性的基因的标准化表达水平
图6A显示了七种选择的基因(ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1)的总和；
图6B显示了相对于如虚线框所示的选择的阈值七种选择的基因(ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1)的总和。
具体实施方式
人巨细胞病毒(hCMV)是人中先天性感染的最常见的原因，为新生儿带来潜在的严重后果。由于并非所有血清阳性hCMV感染的怀孕女性都将病毒传播给胎儿，所以鉴定那些赋予先天性感染和疾病的最高风险的人是极端重要的。
在本发明中，发明人已经使用计算工具并且鉴定了在将hCMV传播至它们的胎儿的女性和不将hCMV传播至它们的胎儿的女性中不同表达的基因库。
如本文中下面实施例中所示的，发明人将模拟对hCMV感染应答的干扰素(IFN)信号传导基因的数学模型与来自与hCMV感染相关的阵列数据集的积累数据相结合。发明人辨识了预测病毒的先天性传播的生物标记基因集。使用从30位hCMV血清阳性怀孕女性获得的从PBMC提取的总RNA，通过qRT-PCR，随后评估新生儿的临床状况和他们尿液中的病毒载量执行发明人预测模型的回顾性验证。通过筛选微阵列数据集在hCMV感染的怀孕女性中刺激的常见基因的无偏搜索揭示了过表达的基因集，其全部与IFN信号传导相关联。
比较hCMV感染之前和之后的变量的值(Δ)，能够区别两个群体，那些具有高表达和低表达的生物标记。在与数学模型的紧密关系中，对30位具有检测的病毒载量(≥200份病毒拷贝/ml血液)的血清阳性怀孕女性的qRT-PCR分析清楚地说明生产感染的新生儿的母亲具有高表达水平的生物标记，与具有这些基因的低表达水平的非转移女性显著的不同。
为了评估怀孕女性中hCMV的子宫内-传播的风险，对1、2、3、4、5、6、7或更多种生物标记的qRT-PCR分析结合数学测试，提供了胎儿天性(providence)的高置信预测(超过94％的准确性)。呈现的结果能够开发用于预测hCMV感染的怀孕女性将病毒传播给她们的胎儿的可能性的个人诊断试剂盒和方法。
在hCMV感染期间搜索高度表达的基因之后，发明人开发了一种可靠的试验来预测妊娠早期阶段期间hCMV的子宫内传播。该试验基于测量的特异性基因表达变化，随后进行通过回顾鉴定赋予先天性病毒传播风险的个体可靠证明的数学分析。因此，指示了朝向症状性新生儿并因此患有后遗症如感觉神经性听力损失、认知缺陷和运动缺陷的儿童的可能性很高。
具体而言，发明人限定了属于预测怀孕女性中hCMV的先天性传播的IFN–IFIT、OAS、IFI和UBIQUITIN途径的小的生物标记集。如本文中实施例中所示的，发明人已经发现了ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的表达可以用于以高置信水平(超过94％)区分和预测疾病是否被传递至新生儿，即怀孕女性是否将传播该疾病至她们的胎儿。生物标记源自怀孕女性怀孕2-22周期间的其PBMC。发明人发现ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的低表达被发现与不传播该疾病的女性相关联，而ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的高表达被发现与传播该疾病的女性相关联。
这些结果与本文所示和描述的数学模型一致。模型指出，在病毒初始进入时，IFN战斗(fighting)基因上调的速度应该超出(out paste)使用细胞资源由病毒产生的蛋白质，以防止病毒随后向胎儿转移。
因此，发明人已经得出结论，本文中描述的鉴定的基因适于预测、评估和监测hCMV向胎儿的传播。
因此，在第一方面，本发明涉及用于预测、监测和早期诊断病毒病原体传播——具体而言妊娠早期阶段期间的子宫内-传播——的方法。在更具体的实施方式中，本发明的方法可以包括下面的步骤：在第一步骤(a)中，测定对象的生物样品中ISG15遍在蛋白类调节物(ISG15)、干扰素-诱导的具有三角形四肽重复的蛋白3(IFIT3)、遍在蛋白特异性肽酶18(USP18)、真核翻译起始因子2α激酶2(EIF2AK2)、包含HECT和RLD结构域的E3遍在蛋白蛋白连接酶5(HERC5)、包含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(RSAD2)以及MX发动蛋白类GTP酶1(MX1)基因中至少一种的表达水平，从而获得样品中表达值Exsamp。接下来的步骤(b)包括计算样品的M(Msamp)值。应当注意，样品的M值指示检查的对象阻止病毒病原体的子宫内-传播的能力。在接下来的步骤(c)中，提供非传播对象的标准M(Mstand)值。应当注意，标准M值指示阻止病毒病原体的子宫内-传播所需的最小能力。最终步骤(d)包括确定步骤(b)中计算的样品的M(Msamp)值关于(c)中提供的非传播对象的标准M(Mstand)值是否是正或负中的任一个。因此，其中Msamp的正值指示了对象是非传播对象和Msamp的负值指示了对象是病毒病原体传播对象，由此预测对象中病毒病原体的子宫内-传播。
在一些实施方式中，本发明的方法可以包括，在第一步骤(a)中，测定ISG15、IFIT3和USP18中至少一种的表达水平。在一些其它实施方式中，本发明的方法包括，在第一步骤(a)中，测定ISG15的表达水平。在仍一些进一步可选实施方式中，方法包括，在步骤(a)中，测定ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达。在仍一些进一步实施方式中,本发明的方法可以包括，在第一步骤(a)中，测定ISG15、IFIT3、USP18的表达水平。在某些实施方式中，本发明的方法可以包括，在第一步骤(a)中，测定EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平。应当认识到，本发明的任意上述鉴定的基因可以与本文中公开的任意标记基因结合，以及与参与干扰素和/或遍在蛋白途径标记基因的任意基因结合。在一些具体的和非限制性的实施方式中，这类IFN-相关基因可以包括但不限于ADAR、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、IFNAR1、MX1、ISG15、IFNAR2、JAK1、TYK2、EGR1、IFI16、IFI6、XAF1、RNASEL、ISG20、PSMB8、ISGF3、IFI35、RSAD2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、IFITM1、IFITM2、IFITM3、GPB2、MX2、IPGK2、IFI44、IFI44L、IFI27、DDX58、TLR3、TLR7、TLR9、DDX58、DHX58、IFIH1、MAVS和DDX60中的至少一种。在一些具体的实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以进一步使用所述IFN-相关基因中的至少一种作为额外的生物标记(一个或多个)。在又进一步实施方式中，遍在蛋白途径相关基因可以包括ISG15、USP18、UBE2L6、HERC5、UBE2E1、MHC-TYPE1:HLA-A,B,C,E，并因此，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用所述基因中的至少一种作为额外的标记基因。
本发明提供的方法涉及病毒病原体的子宫内-传播的预测和早期诊断。本文所使用的术语“子宫内-传播”或“垂直传播感染”(或母幼儿传播)是由在怀孕或分娩期间从母亲直接传播至胚胎、胎儿或婴儿的细菌、病毒或在极少情况下寄生虫引起的感染。这可能在母亲获得作为怀孕中的并发疾病的感染时发生。
在一些实施方式中，此后描述的本发明的方法以及组合物和试剂盒可以适用于检测、诊断和预测“先天性感染”。在一些实施方式中，如果分娩后仍然存在垂直传播感染，则可以使用术语先天性感染。
仍进一步，在更具体的实施方式中，计算样品的M(Msamp)值可以按以下步骤执行：(a)获得由本发明方法所测定的所述样品的表达值Exsamp；(b)提供病毒病原体感染的对象的表达值的标准曲线；(c)由(b)的所述标准曲线获得最大表达值Exmax和最小表达值Exmin；和(d)计算所述样品的Msamp值，其中Msamp＝1-[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]。
在仍另一可选和相同的实施方式中，可以使用以下等价方程计算Msamp的值：
Msamp＝(Exmax-Exsamp)/(Exmax-Exmin)]。
在一些具体实施方式中，也如实施例2中所描述的，对于具有1.92的K的hCMV，如通过下式M＝1-1/K计算的所需的标准M为0.495(1-1/1.92)。因此，比标准M大的值(“正”)——具体而言，超过0.495——的样品的任何计算的M值清楚地指示对象为非传播对象。以类似的方式，低于0.495(“负”值)的任何计算的Msamp指示对象是hCMV传播对象。
因此，在一些具体实施方式中，本发明的方法具体地适用检测和预测可以是人巨细胞病毒(hCMV)的病毒病原体的子宫内-传播。
应当注意的是，虽然本发明涉及检测和预测病毒病原体——具体而言CMV——的子宫内-传播，但本发明也包括进一步的子宫内-传播的病原体。更具体地，在一些实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可适用于其他病毒病原体，例如风疹、单纯疱疹病毒-2或新生儿单纯疱疹、柯萨奇病毒、水痘(由水痘带状疱疹病毒引起)、HIV和人T淋巴细胞病毒。乙型肝炎也可归类为垂直传播感染，但乙型肝炎病毒是一种大型病毒，并不会穿过胎盘，因此它不能感染胎儿，除非发生母胎屏障破裂，诸如可能发生在分娩或羊水穿刺时出血。
更进一步，本发明包括的垂直传播的病原体可以进一步包括细菌，诸如衣原体和梅毒密螺旋体(引起梅毒、非性病性梅毒、品他病和雅司疹)以及寄生虫，诸如鼠弓形体。
在一些实施方式中，子宫内-传播的病原体可以被称为TORCH复合体(对于弓形体病、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹和梅毒)，或称为CHEAPTORCHES(对于水痘和带状疱疹、丙型肝炎、肠道病毒、AIDS(HIV感染)、微小病毒B19(产生继发于再生障碍性贫血的胎儿水肿(Hydrops faetalis))、弓形体病、其它(B组链球菌、李斯特菌属、念珠菌属、莱姆病)、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹、其它一切性传播的(淋病、衣原体感染、解脲脲原体、人乳头瘤病毒)和梅毒。应当注意，在某些实施方式中，本发明也包括这些病原体。
如本文所指示，本发明的具体实施方式提供了具体适用于预测、诊断和鉴定巨细胞病毒的子宫内-传播的方法、组合物和试剂盒。
巨细胞病毒(来自希腊语细胞(cyto-)，“细胞”和巨大(megalo-)，“大”)是疱疹病毒目中疱疹病毒科中β疱疹病毒亚科中的一种病毒属。CMV感染在人群体中无处不在，并且大多数个体最终被感染。人CMV是一种大型DNA病毒，与所有疱疹病毒一样，在宿主中建立终身潜伏期，并定期重新激活。人类和猴子充当天然宿主。目前该属有八个物种，包括人疱疹病毒5(HHV-5)类型物种。与HHV-5相关联的疾病包括腺热和肺炎。它通常缩写为CMV。
感染人类的物种通常被称为人CMV(HCMV)或人疱疹病毒-5(HHV-5)，并且是所有巨细胞病毒中研究最多的。在疱疹病毒科中，CMV属于β疱疹病毒亚科，其还包括鼠巨细胞病毒和玫瑰疱疹病毒(Roseolovirus)属(HHV-6和HHV-7)。它与包括单纯疱疹病毒(HSV)-1和-2和水痘-带状疱疹病毒(VZV)的α疱疹病毒亚科以及包括爱泼斯坦-巴尔病毒的γ疱疹病毒亚科内的其他疱疹病毒有关。
所有疱疹病毒都共享长期在体内保持潜伏的特征性能力。尽管可能在整个身体中发现它们，但CMV感染常常与人类和其他哺乳动物的唾液腺相关联。在几种哺乳动物物种中发现了其他CMV病毒，但从动物中分离出的物种与HCMV在基因组结构方面不同，并且尚未报道其导致人类疾病。
研究最多的是人巨细胞病毒(HCMV)，其也被称为人疱疹病毒5(HHV-5)。其它灵长类CMV物种包括感染黑猩猩和猩猩的黑猩猩巨细胞病毒(CCMV)，和感染猕猴的猿猴巨细胞病毒(SCCMV)和恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)；CCMV已知为黑猩猩(Panine)疱疹病毒2(PaHV-2)和猿(Pongine)疱疹病毒-4(PoHV-4)两者。SCCMV被称为猕猴(Cercopithecine)疱疹病毒-5(CeHV-5)和RhCMV，猕猴疱疹病毒8(CeHV-8)。在夜猴中发现的另外两种病毒被暂且归于巨细胞病毒属，并且称为夜猴(aotus)疱疹病毒1和夜猴疱疹病毒3。啮齿类动物也具有先前称为巨细胞病毒的病毒，其现在被重新分类至鼠巨细胞病毒属下；该属包含小鼠巨细胞病毒(MCMV)，也称为鼠类疱疹病毒1(MuHV-1)和在大鼠中发现的紧密相关鼠类疱疹病毒2(MuHV-2)。另外，还有许多尚未完全分类的在不同的哺乳动物中鉴定的名称为巨细胞病毒的其他病毒种类；这些主要分离自灵长类和啮齿类动物，并且全部被本发明所考虑。
美国CMV总体年龄调整患病率为大约60％。尽管只有0.5％至1％的儿童在子宫内获得CMV，但40％在生命的头十年内获得了感染。到60岁时，血清患病率增加到>80％。血清患病率在不同社会经济地位和族裔群体内不同，并且接近感染儿童或在儿童保育机构工作的个体中有所增加。在文件中充分地记载了，来自怀孕期间母亲的原发性感染(即血清阴性个体中的感染)的先天性CMV的风险最大。在大约三分之一的患有原发性CMV感染的母亲中发生了病毒的经胎盘传播，并且在子宫内大约这些感染的一半导致症状性临床综合征。流行病学数据表明，获取原发性感染相对于建立怀孕的时机是建立胎儿子宫内传播的风险的重要因素。虽然CMV血清阳性先兆(preconception)的女性比在怀孕期间已经具有原发性CMV感染的女性更少可能生出患有先天性CMV的婴儿，但是，在这种情况中仍出现经胎盘传播及其伴随的后遗症(胎儿感染率为1.4％)。这种情况下的传播似乎与血清阳性女性被新CMV毒株再感染有关。
母体非原发性感染导致与先天性CMV相关联的主要疾病负担。
经历原发性感染的育龄期(年龄15至44岁)的血清阴性女性具有CMV经胎盘传播的最高风险。对于怀孕女性来说，暴露于CMV感染的儿童——通常是她自己的在日托护理中获得感染的孩子，是常见的主要感染源。幼儿长时间在粘膜表面散出病毒。在文件中充分地记载了，症状性和非症状性婴儿在出生后多年在尿液和唾液中分泌病毒。
由于幼儿中CMV感染的慢性性质，它们作为病毒的优良病库。在生产前一年向幼儿提供护理的怀孕女性对于母体CMV感染具有增加的风险，这种情况增加了将病毒传播给胎儿的风险。CMV感染易于经由感染的尿液、唾液或其他体液在粘膜表面传播给怀孕的母亲，但呼吸或气雾传播并不常见。
CMV的病毒复制是细胞核的，并且是致溶菌的。进入宿主细胞通过将病毒糖蛋白附接于介导内吞作用的宿主受体实现。复制遵循dsDNA双向复制模型。DNA模板转录，伴有一些可选的剪接机制是转录的方法。翻译通过漏扫描发生。病毒通过细胞核出口离开宿主细胞，并芽殖。传播途径是接触、尿液和唾液。
如上所提到的，巨细胞病毒是子宫内感染的最常见原因，并且是感觉神经性听力损失和智力迟钝的最常见原因。
原发性感染被定义为在先前血清阴性人中的CMV感染。继发性感染或复发性CMV感染被定义为在宿主免疫存在下间歇性排泄病毒，并且可能是由于内源性病毒的再活化或暴露于来自外源性来源的新病毒株。因此应当理解，本发明的方法适用于原发性以及继发性CMV感染。
还进一步，本方法可以适用于可以涉及子宫内-传播的任何病毒。这类病毒的非限制性实例可以包括丙型肝炎病毒(HCV)、风疹和乙型肝炎病毒(HBV)、HIV和之前本文描述的任何病毒病原体。更具体地，已知特定病毒例如，HCV、HBV或风疹的K值允许计算阻止传播将所需的标准M(Mstand)值。如本文下面所描述的计算样品的M值将因此能够确定检查的对象是否可以将具体病毒传播给胎儿(对于低于Mstand的Msamp)，或可选地避免传播(对于高于Mstand的Msamp)。
在一些具体实施方式中，本发明的方法可以适用于人类女性对象。在更具体的实施方式中，本发明的方法可以适用于怀孕的人类女性。
在进一步实施方式中，怀孕的人类女性对象可以处于妊娠的早期阶段。如本文所使用，妊娠为在雌性胎生动物体内携带胚胎或胎儿。妊娠对于哺乳动物是典型的，但对于一些非哺乳动物也出现。在怀孕期间的哺乳动物可以同时具有一个或多个妊娠(多妊娠)。
妊娠的时间间隔被称为妊娠周期。在人产科学中，孕龄指胚胎或胎儿龄加两周。这约为自女性上次月经期(LMP)开始以来的持续时间。
人类怀孕大致可分为三个三月期(trimester)，每个约三个月长。在人类中，分娩通常发生在大约40周的孕龄，尽管在37至42周内发生分娩是常见的。8周后，胚胎被称为胎儿。
更具体地说，孕龄(或月经龄)是怀孕龄的量度，其中起点为女性的最后正常月经期(LMP)或其他方法估计的相应龄。这些方法包括自受精(如体外受精可能的)以来已知持续时间增加14天或通过产科超声检测术。使用孕龄的这种定义的流行是月经期基本上总是被注意到的，而通常缺乏一种方便的方式来辨别何时受精发生。
对于计算孕龄或妊娠阶段的怀孕起始可能与在堕胎争论的背景下怀孕起始或人类人格开始的定义不同。
如上所提到的，妊娠的阶段可以指三个主要阶段，也称为三月期。第一个三个月的三月期一般计算为从上一次生理期的第一天开始并发展至怀孕的第13周。在该三月期内，胎儿植入女性的子宫。
第二个三个月的三月期开始于怀孕的第14周并发展至第27周。在第二三月期内。
第三个三个月的三月期开始于妊娠周期的第28周并发展至婴儿的分娩。在该时段期间，胎儿的大小增加并且拉伸女性的子宫和腹部。
在一些具体实施方式中，本发明的方法可以适用于妊娠的任何阶段。在一些具体实施方式中，本发明可以适用于妊娠的早期阶段。在一些实施方式中，妊娠的早期阶段指第一个和第二个三月期，具体而言，怀孕的2至22周，更具体地，第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和更多周。
还进一步，可以通过使对所述基因特异性的检测分子与所述对象的生物样品接触或与从其获得的任何核酸或蛋白产物接触的步骤进行测定所述对象的生物样品中所述ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因中至少一种的表达水平。
更具体地，通过使至少一种检测分子或多种检测分子的任意组合或混合物与所述对象的生物样品接触或与从其获得的任何基因或核酸产物接触的步骤进行测定所述ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1生物标记基因中至少一种的表达水平，其中所述检测分子中的每种特异于所述生物标记基因中的一种。术语“接触”意思是带到一起、放在一起、在一起培育或混合在一起。如此，当两个项目被带到一起或放在一起时——如通过使它们触摸彼此或将其结合，第一项目与第二项目接触。在本发明的背景下，术语“接触”包括允许至少一种生物标记基因的至少一种检测分子和任选地对于测试样品的至少一种适合的对照参比基因之间的相互作用的所有测量或步骤。以如此方式进行接触使得例如，在测试样品中，至少一种生物标记基因的至少一种检测分子可以与至少一种生物标记基因相互作用或结合至至少一种生物标记基因。结合将优选为非共价的可逆结合，如，经由盐桥、氢键、疏水相互作用或其组合的结合。
在更具体的实施方式中，检测分子可以选自分离的检测核酸分子和分离的检测氨基酸分子。
在仍一些进一步实施方式中，核酸检测分子包括分离的寡核苷酸(一种或多种)，每种寡核苷酸特异性杂交至ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因中所述至少一种的核酸序列，并任选地杂交至对照参比基因。
在更具体的实施方式中，检测分子可以是引物对、至少一个引物、核苷酸探针或其任意组合中的至少一个。
根据某些实施方式，由本发明的方法检查的样品可以是周围血单核细胞、羊水和器官或组织的活组织检查中的任一个。
还进一步，根据其他实施方式，本发明的方法使用任意合适的生物样品。本说明书和权利要求中术语“生物样品”意思是包括从哺乳动物对象获得的样品。
应当认识到，在某些实施方式中，生物样品可以是，例如，羊水，骨髓，淋巴液，血细胞，血液，血清，血浆，尿，痰，唾液，粪便，精液，脊髓液或CSF，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部分泌物，眼泪，奶汁，任何人器官或组织，通过灌洗获得的任何样品——任选地乳房系统的，胸腔积液(plural effusion)，体外或离体细胞培养物和细胞培养物成分的样品。更具体的实施方式，样品可以是周围血单核细胞和羊水中的任何一种。
根据本发明的一些实施方式，样品是细胞样品。更具体地，细胞是血细胞(如，白细胞、巨噬细胞、B-和T-淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，其可以使用注射针从对象的静脉获得。应当注意，细胞可以从对象分离(如，用于体外检测)或可以任选地包括还没有从对象物理移出的细胞(如，体内检测)。
根据具体的实施方式，本发明的方法使用的样品是周围血单核细胞(PBMC)的样品。
如本文所使用，短语“周围血单核细胞(PBMC)”指单核细胞和淋巴细胞的混合物。本领域内已知若干用于分离白细胞的方法。例如，PBMC可以使用密度梯度离心过程从全血样品分离。通常地，在分离介质上使抗凝全血分层。在离心步骤的最后，从上到下视觉观察如下层：血浆/血小板、PBMC、分离介质和红细胞/粒细胞。然后移出并洗涤PBMC层以移除杂质(如，红细胞)，随后测定本发明的多核苷酸(一种或多种)生物标记的表达水平。
在仍另一实施方式中，样品可以是羊水。
羊水，一般称为怀孕女性的水(一种或多种)(拉丁语羊膜水(Latin liquoramnii))，是怀孕女性的羊膜囊或妊娠囊包含的保护性液体。羊水来自于妊娠囊或羊膜囊的形成。羊水产生自母体血浆，并受渗透压和静水压力而穿过胎膜。当在大约16周时胎儿肾脏开始起作用时，胎儿尿液也贡献至该流体。该流体通过胎儿组织和皮肤被吸收。在怀孕的第20-25周后当出现胚胎皮肤角质化时，该流体主要被胎儿消化道吸收。首先，羊水主要包括水与电解质，但在大约第12-14周时，液体中还包含蛋白质、碳水化合物、脂质和磷脂以及尿素，所有这些都有助于胎儿的生长。随着胎儿的成长，羊水的体积增加。从第10周到第20周，羊水从25ml增加到约400ml，和在分娩时约为1升。羊水正常具有7.0至7.5的pH。
如上所提到的，本发明提供了用于鉴定可能将病毒病原体——具体而言CMV——子宫内传播至胚胎的对象的预后和预测方法。“预后”定义为基于医学知识，对病症的未来情况进行的预报。这强调了本发明的主要优点，即基于本发明的生物标记基因中的至少一种的表达值和预测方法及由其计算的M值，预测病毒病原体传播至胚胎的能力。更具体地，在早期阶段确定对象可以传播CMV至胎儿的能力。
本发明的方法、组合物和试剂盒提供了对病毒病原体——具体而言CMV——的早期诊断和预测。“早期诊断”提供了在临床症状表现之前的诊断。本文所使用的之前意思是在这类症状表现之前几天、几周、几个月或甚至几年。在更具体的实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒提供了在感染之前对象传播风险的预测。具体地，方法提供了对非怀孕和非感染对象的预测，估计了检查的对象避免或阻止子宫内-传播f病毒病原体——具体而言CMV——的能力。更具体地，在怀孕、感染或临床症状中至少一种出现之前的至少1周、至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或甚至几年。
在一些实施方式中，本发明的方法可以提供在本说明书中讨论的任意临床症状——具体地与CMV感染相关联的任意临床症状——表现之前，预测病毒的传播。
在仍一些进一步具体实施方式中，本发明的诊断和预测方法可以将预测方法与一些治疗性和预防性应用结合。因此，在某些实施方式中，本发明的方法可以进一步包括通知、通告或咨询预测或诊断为子宫内-传播病毒病原体——具体而言hCMV——的对象，或预测传播病毒病原体至胚胎的对象的步骤。在仍一些进一步实施方式中，本发明的方法可以包括推荐、应用或建议防止由所述病毒病原体——具体而言CMV——引起的胚胎损伤的表现所需的进一步治疗性步骤的额外步骤。这些进一步治疗性和预防性步骤可以包括但不限于堕胎、抗病毒治疗等。
因此，在一些进一步实施方式中，本发明提供了用于预防和减少病毒-病原体相关联障碍——具体而言CMV相关障碍——的预防性方法。
如本文之前所提到的，先天性巨细胞病毒(CMV)感染是重大的公共卫生问题。CMV引起严重的神经发育后遗症，包括智力迟钝、脑瘫和感觉神经性听力损失(SNHL)。即使采用抗病毒治疗，这些损伤往往也是不可逆转的。发育中的胎儿中枢神经系统(CNS)损伤的发病机理是未知的。
具体地，先天性CMV感染是美国出生缺陷和儿童期障碍的主要原因。据估计，大约40,000名儿童(占所有分娩的0.2％至2％)出生伴有CMV，导致每年大约400例致命病例。只有10％至15％的患有先天性CMV感染的儿童在出生时表现出临床征兆，即使在出生时无症状的儿童也存在神经发育后遗症的风险。大多数伴有症状感染的儿童(60至90％)和10-15％的伴有无症状感染的那些儿童发展一种或多种长期的神经学后遗症，如智力迟钝、精神运动性阻滞、SNHL和眼科异常。目前的估计指示每年约8,000名儿童受子宫内CMV感染相关的一些神经学后遗症影响。
更具体地，子宫内感染被认为是由于母体病毒血症——伴随血原性扩散至胎儿。母胎传播率受多种因素的影响，包括暴露的三月期、母体年龄、CMV血清状态(serostatus)，母体免疫特性和病毒载量。胎儿传播的风险似乎随着孕龄的增加而增加，但是在第一个三月期内发生感染时，神经学结果更为严重。然而，病毒传播可能在整个妊娠周期内发生，并且神经学结果仍可能从妊娠晚期获得的感染中看到。
在与先天性CMV感染相关联的主要临床表现中，最毁坏性的是涉及发育中CNS的那些，因为与其他终末器官损伤相比，CNS损伤通常被认为是不可逆的。出生时CMV感染最常见的症状是子宫内发育迟缓、紫癜、黄疸、肝脾大、脑过小(microencephaly)、听力损害和血小板减少症。尽管由于网状内皮系统异常(诸如贫血、肝脾大和黄疸)造成的临床征兆是暂时的，但神经性缺陷在出生时是明显的，并且通常持续终生或在儿童早期趋于变得明显(如SNHL)。
常见的是由于感染造成的慢性损害，其包括心室扩张、白质神经胶质增生(whitematter gliosis)、萎缩(体积减小)、实质囊肿、室管膜囊肿、钙化和皮质畸形(最著名的是多小脑回(polymicrogyria))。
在第二个三月期内发生脑室周囊肿，小脑损害可能是妊娠18周前胎儿感染的结果，并且异常的沟的形成可能是由于18至24周之间的损伤。
神经造影/病理学异常的波谱中观察到的其它异常包括无脑回、孔洞脑和脑裂畸形。
CMV-诱导的听力损失被认为是由病毒诱导的迷路炎引起。来自先天性感染的婴儿的内耳组织学显示对如此结构的损害，该结构包括前庭内淋巴系统和前庭器官(球囊(saccule)和椭圆囊)，以及球囊膜的塌陷。损害被限制在内淋巴结构，轻微累及耳蜗，主要表现为底转处积水。
本发明的第二方面涉及包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18基因的表达水平的检测分子的试剂盒。
在一些具体实施方式中，本发明的试剂盒可以进一步包括特异于测定EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1中至少一种的表达水平的检测分子。在仍一些进一步实施方式中，本发明的试剂盒可以包括特异于测定ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的表达水平的检测分子。
在一些具体实施方式中，本发明的试剂盒可以进一步包括下列中至少一种：(a)用于计算测试对象的M(Msamp)值的工具。应当理解，这类值指示检查的对象阻止病毒病原体的子宫内-传播的能力。(b)非传播对象的标准M(Mstand)值。应当注意，Mstand值指示阻止所述病毒病原体的子宫内-传播所需的最小能力。该试剂盒可以进一步包括：(c)用于计算非传播群体的标准Mstand值的工具；(d)特异于测定生物样品中至少一种对照参比基因的表达水平的检测分子；和(e)至少一种对照样品。
在一些具体实施方式中，用于计算测试对象的M(Msamp)值的工具可以包括以下至少一种：
(a)检测分子，其特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3、USP18基因和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平，从而测定所述样品中的表达值Exsamp；
(b)预定校准曲线，其提供病毒病原体感染的对象中ISG15、IFIT3、USP18和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的标准表达值或由所述标准曲线计算的预定最大表达值Exmax和最小表达值Exmin；和
(c)用于计算Msamp值的公式，其中所述公式为：
Msamp＝[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]。
在一些具体实施方式中，病毒病原体可以是hCMV。因此，在某些实施方式中，本发明的试剂盒可以被用作用于预测哺乳动物对象中hCMV的子宫内-传播的诊断试剂盒。
在一些实施方式中，对象是hCMV感染的对象。更具体地，对象可以是人类女性对象。
在一些具体实施方式中，怀孕的人类女性对象可以是怀孕处于妊娠早期阶段的。在仍一些进一步实施方式中，女性对象可以是非感染的对象。在一些实施方式中，对象可以是怀孕的且非感染的。在一些进一步实施方式中，对象可以是非怀孕的且非感染的、非怀孕的且感染的或怀孕的且感染的对象。
因此，本发明提供了用于甚至在感染和/或怀孕发生之前预测病毒病原体的子宫内-传播的方法、组合物和试剂盒，并因此反映具体对象避免或阻止病毒病原体的子宫内-传播的能力。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒可以进一步包括使用说明书，其中所述说明书包括下述中至少一个：
(a)用于进行所述ISG15、IFIT3、USP18和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因表达的检测和定量的说明书；
(b)用于进行所述至少一种对照参比基因表达的检测和定量的说明书；和
(c)用于确定计算的所述样品的M(Msamp)值关于非传播对象的标准M(Mstand)值是否是正或负中的任一个的说明书。
在某些实施方式中，检测步骤进一步包括通过适合的工具检测来自检测分子的信号，其与来自对象的样品中的生物标记基因中至少一种的表达水平相关。根据一些实施方式，通过本文下面详细说明的实验方法中任一种由样品检测的信号反映了生物标记基因中至少一种的表达水平。应当注意，这类信号对表达水平数据可以从校准曲线计算并由其导出。
因此，在某些实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以任选地进一步包括使用通过检测生物标记基因中至少一种的增加的预定浓度中的每一个的信号而产生的校准曲线。获得这样的校准曲线可以指示评估表达水平与生物标记基因中至少一种的浓度线性相关的范围。应当注意的是，在该关系中，在没有观察到生物标记基因中至少一种的表达水平的变化时，应该评估校准曲线以排除测量的表达水平不展现饱和型曲线的可能性，即增加浓度展现相同信号的范围。
必须认识到，在某些实施方式中，上面描述的这类校准曲线也可以是由本发明提供的任何试剂盒中的部分或组成。
在一些实施方式中，检测分子包含分离的检测核酸分子和分离的检测氨基酸分子中的至少一种。
在进一步实施方式中，检测分子包括分离的寡核苷酸，每个所述的寡核苷酸与所述ISG15、IFIT3、USP18、任意任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因之一的RNA产物的核酸序列特异性杂交。
在一些具体实施方式中，检测分子可以是至少一种引物、至少一种引物对、至少一种核苷酸探针及其任意组合中的至少一种。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒可进一步包含用于进行核酸扩增类试验的至少一种试剂，此类试验选自实时PCR、微阵列、PCR、原位杂交和比较基因组杂交。
在一些具体实施方式中，本发明的试剂盒可进一步包括固体支持体，其中所述检测分子中的每一种以阵列布置。
在更具体的实施方式中，检测分子的阵列可以包括多个寻址容器(addressedvessel)。
还进一步，检测分子的阵列可以包括固体支持体，其在不同区域内容纳检测分子。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒可以适用于可以为血液样品和羊水中至少一种的样品。
在一些具体实施方式中，样品是血液样品，和试剂盒包括特异于测定所述血液样品中的ISG15、IFIT3、USP18、和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子(一种或多种)。
本发明进一步提供了特异于ISG15、IFIT3和USP18基因的检测分子的阵列。更具体地，这类检测分子可以是分离的检测核酸分子或分离的检测氨基酸分子(一种或多种)。
在一些具体实施方式中，阵列可以进一步包括特异于EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的检测分子。
在一些实施方式中，本发明的阵列可以进一步包括多个寻址容器，其包含所述检测分子(一种或多种)。
在某些实施方式中，本发明的阵列可以包括固体支持体，其在不同区域内容纳检测分子。
在进一步方面，本发明提供了预后组合物，其包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18基因的表达水平的检测分子。
在仍一些进一步实施方式中，本发明的诊断组合物可以进一步包括特异于测定生物样品中EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子。
在某些实施方式中，这类预后组合物可以适用于预测和诊断哺乳动物对象中病毒病原体——具体而言人巨细胞病毒(hCMV)——的子宫内-传播。
如上面所提，本发明的方法和试剂盒可以使用本文提供的标记基因，具体而言，ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1、其任意组合和其与任意额外生物标记基因的任意组合中任一种或至少一种。
在一些实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用ISG15作为标记基因。更具体地，ISG15遍在蛋白类调节物(ISG15)基因(GenBank登录号NM_005101；SEQ IDNO:1)编码ISG15蛋白(GenBank登录号NP_005092.1；SEQ ID NO:2)。ISG15被报道为在IFN-α或IFN-β刺激后缀合至细胞内靶蛋白的遍在蛋白类蛋白。其酶促途径部分不同于遍在蛋白的酶促途径，不同在于底物特异性和与连接酶的相互作用。ISG15缀合途径使用专用E1酶，但似乎与在特异性E2酶的水平下的遍在蛋白缀合途径交汇。靶标包括STAT1、SERPINA3G/SPI2A、JAK1、MAPK3/ERK1、PLCG1、EIF2AK2/PKR、MX1/MxA和RIG-1。其通过USP18/UBP43经历去缀合(deconjugation)。它显示了对嗜中性粒细胞的特异性趋化活性并活化它们以诱导嗜酸性粒细胞趋化因子的释放。它被表明作为一种反式作用结合因子，引导连接的靶蛋白与中间丝的缔合。
在仍一些进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用IFIT3作为标记基因。干扰素-诱导的具有三角形四肽重复的蛋白3(IFIT3)基因(GenBank登录号NM_001031683；SEQ ID NO:3，NM_001549；SEQ ID NO:4)编码IFIT3蛋白(GenBank登录号NP_001026853；SEQ ID NO:5，NP_001540；SEQ ID NO:6)。
在还进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用USP18作为标记基因。遍在蛋白特异性肽酶18(USP18)基因(GenBank登录号MN_017414；SEQ ID NO:7)编码USP18蛋白(GenBank登录号NP_059110SEQ ID NO:8)。由该基因编码的蛋白质属于裂解遍在蛋白与遍在蛋白化的蛋白底物的酶的遍在蛋白-特异性蛋白酶(UBP)家族。其在肝和胸腺中高度表达，并且定位于细胞核。USP18蛋白仅有效地裂解ISG15(遍在蛋白类蛋白)融合物，并在小鼠中该基因的缺失导致组织中ISG15缀合物的大量增加，这指示了该蛋白质是主要的ISG15-特异性蛋白酶。缺乏该基因的小鼠也是对干扰素超敏感的，这表明了该蛋白质在下调干扰素应答中的功能，不依赖于其对ISG15的异肽酶活性。USP18可以仅有效地裂解包括经由异肽键连接的天然ISG15缀合物的ISG15融合物。在健康和应激的生物体二者中，维持ISG15缀合蛋白的临界细胞平衡是必需的。
在仍一些进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用EIF2AK2作为标记基因。真核翻译起始因子2α激酶2(EIF2AK2)基因(GenBank登录号NM_001135651.2；SEQ ID NO:9，NM_001135652.2；SEQ ID NO:10，NM_002759.3，SEQ ID NO:11)分别编码ISG15蛋白(GenBank登录号NP_001129123；SEQ ID NO:12，NP_001129124；SEQ ID NO:13，NP_002750；SEQ ID NO:14)。EIF2AK2是在结合至dsRNA后通过自身磷酸化活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。活化形式的编码蛋白质可以磷酸化翻译起始因子EIF2S1，其又抑制蛋白合成。EIF2AK2还通过锰离子和肝素活化。
在进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用HERC5作为标记基因。包含HECT和RLD结构域的E3遍在蛋白蛋白连接酶5(HERC5)基因(GenBank登录号NM_016323；SEQ ID NO:15)编码HERC5蛋白(GenBank登录号NP_057407SEQ ID NO:16)。HERC5基因是遍在蛋白连接酶的HERC家族的成员并且编码具有HECT结构域和五个RCC1重复的蛋白质。促炎细胞因子上调该基因在内皮细胞中的表达。HERC5蛋白定位于细胞质和核周区域并起到介导蛋白靶标的ISG化的干扰素-诱导的E3蛋白连接酶的功能。它是用于ISG15缀合的主要E3连接酶。HERC5起到被干扰素诱导的细胞中先天抗病毒应答的正调节剂的作用。成为以广谱和相对非特异性方式识别靶蛋白的ISG化机器的部分。
在仍一些进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用RSAD2作为标记基因。包含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(RSAD2)基因(GenBank登录号NM_080657；SEQ ID NO:17)编码RSAD2蛋白(GenBank登录号NP_542388；SEQ ID NO:18)。RSAD2被报道为参与抗病毒防御。建议通过破坏质膜处的脂膜筏来削弱病毒芽殖，脂膜筏为对于许多病毒的芽殖过程必需的特征。另外，据报道，其通过与FPPS——一种参与胆固醇、法尼基化和忙牛儿基化蛋白、泛醌多萜醇和血红素合成的酶——结合并使其失活而起作用。而且，其被认为在被I型和II型干扰素诱导的细胞抗病毒态中起重要作用。最后，据报道，其显示对HIV-1病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒和甲病毒(aphavirus)的抗病毒效果，但不显示对水泡性病毒的抗病毒效果。
在进一步实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用MX1作为标记基因。抗黏液病毒(流感病毒)1(MX1)基因(GenBank登录号NM_002462SEQ ID NO:19，NM_001178046SEQ ID NO:21，NM_001144925SEQ ID NO:23)分别编码MX1蛋白(GenBank登录号NP_002453SEQ ID NO:20，NP_001171517SEQ ID NO:22，NP_001138397SEQ ID NO:24)。在小鼠中，干扰素-可诱导的Mx蛋白对抵抗流感病毒感染的特异性抗病毒态负责。由该基因编码的蛋白质类似于小鼠蛋白，如通过其抗原相关性、诱导条件、物理化学性质和氨基酸分析所确定的。该细胞质蛋白是发动蛋白家族和大GTP酶家族两者的成员。已经发现对于该基因的编码相同蛋白的两种转录变体。MX1可以调节TRPC的钙通道活性。环状装配(assembly)可以诱导膜制表(tabulation)。
在一些实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1作为标记基因。在一些可选实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用ISG15、IFIT3和USP18作为标记基因。还进一步，本发明的方法、组合物和试剂盒可以使用EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1作为标记基因。
在仍一些进一步实施方式中，必须认识到，本发明的方法和试剂盒可以使用进一步的标记基因。对于这类额外的基因的非限制性实例包括IFIT1和OAS2中至少一种。
在仍一些进一步实施方式中，额外的基因可以是本发明公开的任意标记基因，在一些具体实施方式中，为图1A和/或1B中公开的任意基因。还进一步，在某些实施方式中，参与遍在蛋白或干扰素途径中至少一种的任意基因可以被用作本发明的方法、试剂盒和组合物中的额外的标记。在一些具体的和非限制性的实施方式中，这类IFN-相关的基因可以包括但不限于ADAR、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、IFNAR1、MX1、ISG15、IFNAR2、JAK1、TYK2、EGR1、IFI16、IFI6、XAF1、RNASEL、ISG20、PSMB8、ISGF3、IFI35、RSAD2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、IFITM1、IFITM2、IFITM3、GPB2、MX2、IPGK2、IFI44、IFI44L、IFI27、DDX58、TLR3、TLR7、TLR9、DDX58、DHX58、IFIH1、MAVS和DDX60中至少一种。在一些具体实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以进一步使用所述IFN-相关的基因中至少一种作为额外的生物标记。在还进一步实施方式中，遍在蛋白途径相关的基因可以包括ISG15、USP18、UBE2L6、HERC5、UBE2E1、MHC-TYPE1:HLA-A,B,C,E，并因此，所述基因中至少一种可以被本发明的方法、组合物和试剂盒用作额外的标记基因。
应当注意的是，本发明的方法使用的每种检测分子是对一种生物标记特异性的。在一些实施方式中，该方法以及此后描述的本发明的方法、组合物和试剂盒可以提供和使用特异于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种，具体而言110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450和至多500种额外的生物标记基因的进一步的检测分子。在一些实施方式中，除特异于本发明的生物标记基因中至少一种——具体而言，ISG15遍在蛋白类调节物(ISG15)、干扰素-诱导的具有三角形四肽重复的蛋白3(IFIT3)、遍在蛋白特异性肽酶18(USP18)、真核翻译起始因子2α激酶2(EIF2AK2)、包含HECT和RLD结构域的E3遍在蛋白蛋白连接酶5(HERC5)、包含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(RSAD2)和MX发动蛋白类GTP酶1(MX1)中至少一种——的检测分子外，本发明的方法、组合物和试剂盒还可以提供和使用特异于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种生物标记基因的检测分子(一种或多种)，和任选地特异于额外的至少一种生物标记基因的进一步的检测分子(一种或多种)。在一些实施方式中，本发明的方法以及组合物和试剂盒可以提供和使用特异于至少一种额外的生物标记基因和至多499种额外的标记基因(一种或多种)的检测分子。在一些具体实施方式中，本发明的方法和试剂盒可以提供和使用特异于本发明的生物标记基因中至少一种的检测分子和特异于至少一种额外生物标记的检测分子，条件是使用特异于100、150、200、250、300、350、384、400、450和至多500种生物标记基因的检测分子。在还进一步具体的和非限制性实施方式中，至少一种额外的生物标记基因可以包括图1A和1B中提出的任意生物标记基因。
还进一步，在某些实施方式中，参与遍在蛋白或干扰素途径的至少一种的任意基因可以被用作本发明的方法、试剂盒和组合物中的额外的标记。
在一些具体的和非限制性的实施方式中，这类IFN-相关的基因可以包括但不限于ADAR、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、IFNAR1、MX1、ISG15、IFNAR2、JAK1、TYK2、EGR1、IFI16、IFI6、XAF1、RNASEL、ISG20、PSMB8、ISGF3、IFI35、RSAD2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、IFITM1、IFITM2、IFITM3、GPB2、MX2、IPGK2、IFI44、IFI44L、IFI27、DDX58、TLR3、TLR7、TLR9、DDX58、DHX58、IFIH1、MAVS和DDX60中至少一种。在一些具体实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒可以进一步使用所述IFN-相关的基因中至少一种作为额外的生物标记(一种或多种)。在还进一步实施方式中，遍在蛋白途径相关的基因可以包括ISG15、USP18、UBE2L6、HERC5、UBE2E1、MHC-TYPE1:HLA-A,B,C,E，并因此，所述基因中至少一种可以被本发明的方法、组合物和试剂盒用作额外的标记基因。
在仍一些进一步实施方式中，应当理解的是，本发明的方法以及此后描述的组合物和试剂盒可以涉及本发明的生物标记基因的表达水平的测定和特异于所述生物标记基因的检测分子的使用。具体地，本发明的生物标记基因(一种或多种)中至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种和至少七种可以进一步包括任意额外的生物标记基因或对照参比基因，条件是使用至多500种生物标记基因和对照参比基因。在一些实施方式中，本发明的生物标记基因(一种或多种)中至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种和至少七种可以形成通过本发明的方法确定的生物标记基因的至少大约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在仍一些进一步实施方式中，本发明的方法使用的并包括在本发明的任意的组合物和试剂盒中的特异于本发明发明的生物标记基因(一种或多种)中至少一种、至少二种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种和至少七种的检测分子可以形成根据本发明使用的检测分子的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。应当理解的是，对于每种选择的生物标记基因，可以使用至少一种检测分子。在针对某些生物标记基因使用多于一种检测分子的情况中，这种检测分子可以相同或不同的。
在更具体的实施方式中，本发明的方法可以涉及测定本发明的生物标记基因中至少1、2、3、4、5、6、7或更多种的表达水平，具体而言，本发明公开的基因，具体而言，ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因中至少一种，和任选地进一步本发明公开的生物标记基因中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、35、36、37、38、39、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种，例如本文公开的图1A、1B中任一个中公开的或任意进一步的标记基因(一种或多种)。应当认识到，可以使用进一步的生物标记，例如，本发明公开的任意生物标记。在一些进一步实施方式中，本发明的方法可以涉及测定额外的生物标记基因(一种或多种)的表达水平，具体而言，额外的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种，具体而言，110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450和至多500种额外的生物标记基因。
如上面所提到的，本发明的方法和试剂盒涉及测定样品中标记基因的表达水平。术语“表达的水平”或“表达水平”可互换地使用并且一般指编码生物样品中氨基酸产物或蛋白质的多核苷酸的量(数量)的数字表示。
“表达”一般指基因编码的信息被转化为细胞中存在和操作的结构的过程。例如，在实时聚合酶链反应(有时也称为RT-PCR或定量PCR(qPCR))中测量的生物标记基因表达值代表测试样品中测量的发光度，其中嵌入荧光染料被整合到对逆转录样品RNA进行的qPCR反应的双链DNA产物中，即为了试验的目的将测试样品RNA转化为DNA。发光度由检测器捕获，该检测器将信号强度转换为数值表示，该数值表示为就miRNA而言的所述表达值。因此，根据本发明，基因——具体地编码本发明的生物标记基因的基因——的“表达”可以指转录成多核苷酸。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们源自可变剪接产生的转录物或降解的转录物，或源自翻译后加工蛋白质——例如通过蛋白水解。下文将更详细地描述用于测定本发明的生物标记的表达水平的方法。
在某些和具体实施方式中，通过本发明的方法测定表达水平以获得表达值的步骤进一步包括额外的和任选的标准化步骤。根据该实施方式，除了测定本发明的生物标记的表达水平之外，测定相同样品中至少一种合适的对照参比基因(如，持家基因)的表达水平。根据这样的实施方式，根据所述测试样品中额外的任选步骤中获得的所述至少一种参比对照基因的表达水平，将步骤(a)中获得的本发明的生物标记的表达水平标准化，从而获得标准化的表达值。任选地，当适用时，也在至少一种对照样品或代表标准品中执行类似的标准化。
术语“表达值”因此指计算的结果，其使用实验上和通过本文详细描述的至少一个标准化步骤标准化“表达的水平”或“表达水平”获得的“表达的水平”或“表达水平”作为输入，获得本文中定义的“表达值”的计算的值。
更具体地，如本文所使用，“标准化的值”是标记基因的原始表达值除以来自同一样品的对照参比基因例如稳定表达的持家对照基因的表达值的商。由于人为误差和设备故障引起的，任何试验样品可能包含比预期更多或更少的生物材料。重要的是，相同的误差或偏差适用于本发明的标记基因和对照参比基因二者，其表达是基本上恒定的。因此，用标记基因原始表达值除以对照参比基因原始表达值得到商，其基本上没有任何技术故障或不准确性(除了为了测试目的破坏样品的主误差)，并构成所述标记基因的标准化表达值。然后可将该标准化的表达值与标准化的截止值进行比较，即，从标准化的表达值计算的截止值。在某些实施方式中，对照参比基因可以是在微阵列分析中分析的所有样品中保持稳定的基因。
在仍更具体的实施方式中，本发明的方法可以涉及将对测试样品测定的表达值与预定的标准值或截止值或者可选地至少一种对照样品的表达值进行比较。如本文所使用的，术语“比较”表示对贯穿全文详细描述的本发明的样品中获得的表达水平和/或表达值的任何检查，以便发现至少两种不同样品之间的相似性或差异。应当注意的是，在一些实施方式中，根据本发明的比较包括使用基于计算机的方法的可能性。
如上面所描述，本发明的方法提及预定的截止值(一个或多个)。应当注意的是，本文中有时简称为“截止”的“截止值”是满足高诊断灵敏度(真阳性率)和高诊断性特异性(真阴性率)二者的要求的值。
应当注意的是，在本文中关于一种或多种标记的能力使用术语“灵敏度”和“特异性”，以将样品正确分类为属于或落入与病毒病原体——具体而言CMV——的子宫内-传播相关联的预先建立的群体的范围内，或可选地属于与病毒病原体非传播至胚胎相关联的预先建立的群体。
“灵敏度”指示当适用时，本发明的生物标记关于将样品正确分类为属于可能传播病毒病原体——具体而言CMV——的子宫内-传播的预先建立的群体，或者可选地属于与病毒病原体非传播至胚胎相关联的预先建立的群体的性能，其中所述生物标记在此被认为是本文提供的任意选项。
“特异性”指示本发明的生物标记关于正确地将样品分类为属于或落入可能是非传播者或不可能传播的对象的预先建立的群体的范围内的性能，如将在此后讨论的。
简而言之，“灵敏度”涉及从一组样品中正确鉴定对象(样品)的比率，反之，“特异性”涉及正确鉴定传播对象的比率。
在一些实施方式中，“落入范围内”包括与截止值相差大约1％至大约50％或更多的值。
应当强调的是，本发明的性质使得进一步的对象数据的累积可以提高目前提供的截止值的准确性，其基于使用分析软件程序根据所述对象数据生成的ROC(接受者工作特性)曲线。对尽可能接近100％的预后灵敏度和预后特异性的最佳组合，沿着ROC曲线选择生物标记基因表达值，并且将所得值用作区分可能传递病毒的对象或非传播对象的截止值。
还进一步，正在使用对照样品的某些可选实施方式中(代替预定截止值或除预定截止值之外)，将测试样品中的本发明所使用的生物标记基因的标准化表达值与对照样品中的表达值进行比较。在某些实施方式中，这样的对照样品可以从健康对象(未感染且未怀孕)、健康怀孕但未感染的对象、感染病毒病原体——具体而言CMV——的非怀孕对象、已知在妊娠的不同具体阶段传播的怀孕对象和被确定为感染的非传播对象的对象中的至少一个获得。在更具体的实施方式中，可以针对诊断为CMV感染的对象、被诊断为传播的感染的怀孕对象，诊断为非传播和CMV感染的非怀孕对象的对象群体计算预定的截止值。
应该理解的是，本文使用的“标准”或“预定的标准”表示与来自测试样品的生物标记基因表达中的至少一种的水平比较的单个标准值或多个标准。可以提供标准，例如，以离散数值的形式或者是以不同颜色或阴影的图表的形式对不同表达水平进行量热；或者可以以在这些标准(标准曲线)的基础上制备的比较曲线的形式提供标准。
如本文之前所提到，在一些实施方式中，本发明的方法、组合物和试剂盒使用的检测分子可以包括基于核酸的分子。如本文所使用，“核酸分子”或“核酸序列”是与术语“多核苷酸(一种或多种)”可交换的，并且其通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA，或其任意组合。“核酸”非限制性地包括单链和双链核酸。如本文所使用，术语“核酸(一种或多种)”还包括上面描述的包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，具有由于稳定性或由于其他原因修饰的主链的DNA或RNA是“核酸”。如其在本文所使用，术语“核酸”涵盖核酸的这类化学地、酶促地或代谢地修饰形式，以及病毒和细胞——包括例如简单细胞和复杂细胞——的DNA和RNA特性的化学形式。“核酸”或“核酸序列”还可以包括单链或双链RNA或DNA的区域或任意组合。
如本文所使用，术语“寡核苷酸”定义为由两个或更多个——优选地多于三个——脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的分子。其确切大小将取决于许多因素，这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。寡核苷酸可以为大约3至大约1,000个核苷酸长。虽然本发明中使用5至100个核苷酸的寡核苷酸，但是优选的寡核苷酸长度范围从大约5至大约15个碱基、长度范围从大约5至大约20个碱基、长度范围从大约5至大约25个碱基、长度范围从大约5至大约30个碱基、长度范围从大约5至大约40碱基、或长度范围从大约5至大约50个碱基。更具体地，本发明的组合物使用的检测寡核苷酸分子的长度可以包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个碱基中的任一种。应当进一步注意的是，术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的单链或双链低聚物或聚合物或其模拟物。该术语包括由天然存在的碱基、糖类和共价核苷间键合(如，主链)组成的寡核苷酸以及具有功能类似的非天然存在部分的寡核苷酸。
如贯穿全文指示的，在某些实施方式中，使用的检测分子为基于核酸的分子，具体而言，寡核苷酸。应当注意的是，本文中使用的寡核苷酸特异性杂交至本发明的生物标记基因的核酸序列。任选地，当还正检查生物标记基因中至少一种的表达时，本发明的方法可以使用特异性杂交至基因中所述至少一种的核酸序列的寡核苷酸作为检测分子。如本文所使用，术语“杂交”指在合适的严格条件下两个互补的核酸链退火至彼此的过程。杂交通常和优选地以探针长度核酸分子进行，例如，5-100、5-50、5-40、5-30或5-20个核苷酸长度。
如本文所使用，在本发明的背景下，“选择性或特异性杂交”指在本发明包括作为检测分子的多核苷酸和特异性生物标记基因和/或任意对照参比基因之间发生的杂交，其中杂交使得多核苷酸结合至测试样品中的基因或任意对照参比基因，优先于任意其他RNA。在具体实施方式中，“选择性杂交”的多核苷酸是以大于大于60％、大于70％、大于80％、大于90％和最优选100％的选择性杂交的多核苷酸(即，与其他RNA种类交叉杂交优选地以小于40％、小于30％、小于20％、小于10％发生)。本领域技术人员将理解的是，可以考虑长度和组成而设计“选择性杂交”至生物标记基因或任意对照参比基因的检测多核苷酸。
测量生物标记基因的任何一种和任何对照参比基因或其任何组合的表达可以通过使用对于本发明的生物标记基因是特异性和/或选择性的那些多核苷酸作为检测分子来完成，从而定量所述生物标记基因或任何对照参比基因的表达。在本发明的具体实施方式中，对所述基因具有特异性和/或选择性的多核苷酸可以是探针或引物对。应该进一步认识到，本发明的方法以及组合物和试剂盒可以包含引物和探针二者作为基于寡核苷酸的检测分子。
如本文所使用的，术语“引物”指能当置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶存在的情况下和在适合的温度和pH下，能够起到合成起始点作用的寡核苷酸，无论以纯化的限制酶切消化物天然存在，还是合成产生的。引物可以是单链或双链并且必须足够长以在诱导剂存在的情况下引发(prime)期望的延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度，引物的来源和使用的方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含10-30或更多个核苷酸，虽然其可以包含更少的核苷酸。更具体地，本发明的方法以及组合物和试剂盒使用的引物可以包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或更多。在某些实施方式中，这样的引物可以包括30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸或更多。在具体实施方式中，本发明的方法使用的引物可以具有茎和环结构。本领域技术人员知晓参与确定引物的合适长度的因素并且关于它们的信息是容易可获得的。
如本文所使用，术语“探针”意思是寡核苷酸以及其类似物，并且指通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键相互作用识别多核苷酸靶序列的一系列化学种类。探针或靶序列可以是单链或双链RNA或单链或双链DNA或DNA和RNA碱基的组合。探针长度为至少5个或优选地8个核苷酸。探针长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或上至30个核苷酸，只要其小于靶标记基因的全长。探针可以包括修饰的寡核苷酸，以便具有通过荧光、化学发光等可检测的标签。探针还可以被修饰，以便具有可检测标签和猝灭剂分子两者，例如TaqMan(R)和Molecular Beacon(R)探针，其将在下面详细描述。
寡核苷酸及其类似物可以是RNA或DNA，或者RNA或DNA的类似物，通常称为反义低聚物或反义寡核苷酸。这类RNA或DNA类似物包括但不限于2-'0-烷基糖修饰、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯、缩醛、3-硫代缩醛、砜、氨基磺酸酯和氮氧主链修饰和类似物，例如，LNA类似物，其中碱基部分已经被修饰。另外，低聚物的类似物可以是聚合物，其中糖部分已经被修饰或被另一适合的部分代替，得到包括但不限吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物的聚合物。探针还可以是寡核苷酸类似物类型连同天然DNA或RNA或与其组合中任意的混合物。同时，寡核苷酸和其类似物可以单独使用或与一种或多种额外寡核苷酸或其类似物组合使用。
因此，根据一个实施方式，这类寡核苷酸是引物对或核苷酸探针中任一个或至少一个，并且其中使用选自实时PCR、微阵列、PCR、原位杂交和比较基因组杂交的核酸扩增试验测定生物标记基因中至少一种的表达水平。
关于核酸序列的术语“扩增试验”指增加样品中核酸序列的群体的表现的方法。本领域技术人员熟知核酸扩增方法，诸如PCR、等温方法、滚环方法等。更具体地，如本文所使用的，当应用至核酸序列时，术语“扩增的”指优选地通过聚合酶链反应的方法由模板核酸产生具体核酸序列的一个或多个拷贝的过程。
“聚合酶链反应”或“PCR”指用于扩增具体核酸模板序列的体外方法。PCR反应包括重复系列的温度循环并且通常以50-100微升的体积进行。反应混合包括dNTP(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶和核酸模板。PCR反应包括提供一组多核苷酸引物，其中第一引物包含与核酸模板序列的一条链中的区域互补的序列并引发互补DNA链的合成，和第二引物包含与靶核酸序列的第二链中的区域互补的序列并引发互补DNA链的合成，并且在允许PCR循环步骤的条件下使用核酸聚合酶作为模板依赖性聚合剂扩增核酸模板序列，PCR循环步骤包括：(i)将扩增所需的引物退火至模板序列内含有的靶核酸序列，(ii)延伸引物，其中核酸聚合酶合成引物延伸产物。“一组多聚核苷酸引物”、“一组PCR引物”或“引物对”可以包含两种、三种、四种或更多种引物。
由于不需要预杂交扩增，实时核酸扩增和检测方法对靶标的序列鉴定和定量是有效的。扩增和杂交在单个步骤中被结合，并且可以以全自动的、大规模的闭合管格式进行。
使用杂交触发的荧光探针进行实时PCR的方法基于DNA聚合酶消化的探针的猝灭释放荧光(如使用TaqMan(R)，MGB-TaqMan(R)的方法)或基于完整探针的杂交触发的荧光(如分子信标和线性探针)。一般地，探针被设计为在退火阶段与PCR产物的内部区域杂交(也称为扩增子)。对于那些利用TaqMan(R)和MGB-TaqMan(R)的方法，接近DNA聚合酶的5'-外切核酸酶活性裂解荧光团和猝灭剂之间的探针，释放荧光。
因此，“实时PCR”或“RT-PCT”试验提供了PCR扩增反应中产生的扩增基因或任何对照参比基因的动态荧光检测。在PCR期间，使用适合的引物产生的扩增产物杂交至探针核酸(例如TaqMan(R)探针)，其可以根据一些实施方式用报道染料和猝灭剂染料标记。当这两种染料靠近时，即都存在于完整的探针寡核苷酸中时，报道染料的荧光被抑制。然而，可以在PCR反应中提供具有5'-3'核酸酶活性的聚合酶，例如AmpliTaq GoldTM。如果荧光探针与引发位点之间的靶核酸序列特异性结合，则该酶裂解荧光探针。报道染料和猝灭剂染料在裂解时被分离，允许报道染料的荧光检测。在通过激光——如通过测序装置提供——激发后，检测和/或定量由报道染料产生的荧光信号。荧光增加是PCR期间靶核酸扩增的直接结果。使用具有和/或不具有内对照的自猝灭荧光探针检测核酸应用产物的方法和杂交试验在本领域内是已知的，例如美国专利序号6,258,569；6,030,787；5,952,202；5,876,930；5,866,336；5,736,333；5,723,591；5,691,146；和5,538,848。
更具体地，也可以进行性质上定量的QRT-PCR或“qPCR”(定量RT-PCR)以提供基因表达水平的定量测量。在QRT-PCR中，逆转录和PCR可以在两步中进行，或者可以进行与PCR结合的逆转录。这些技术之一——对于其有商业上可获得的试剂盒，例如TaqMan(R)(Perkin Elmer，Foster City，CA)——利用转录-特异性反义探针进行。该探针对于PCR产物是特异性的(如来源于基因的核酸片段，或者在这种情况下来自pre-miRNA)，并且用附接至寡核苷酸的5'末端的猝灭剂和荧光报道探针制备。不同的荧光标记物附接至不同的报道分子，允许在一个反应中测量至少两种产物。
当Taq DNA聚合酶被激活时，它通过其5至3'外切核酸酶活性切割与模板结合的探针的荧光报道分子。在没有猝灭剂的情况下，报道分子现在发荧光。报道分子的颜色变化与每种特定产物的量成比例，并通过荧光计测量；因此，测量每种颜色的量并定量PCR产物。PCR反应可以在任何固体支持体，例如载玻片、微孔板、96孔板、384孔板等中进行，以使来自许多个体的样品同时被处理和测量。TaqMan(R)系统具有不需要凝胶电泳的额外优点，并且允许在与标准曲线一起使用时进行定量。
用于定量检测PCR产物的第二种技术是使用嵌入染料，诸如可商购的QuantiTectSYBR Green PCR(Qiagen，Valencia California)。使用SYBR green作为荧光标记进行RT-PCR，所述荧光标记在PCR阶段期间并入PCR产物中，并产生与PCR产物量成比例的荧光。
在RNA逆转录之后，TaqMan(R)和QuantiTect SYBR系统都可以使用。逆转录可以在与PCR步骤(一步方案)相同的反应混合物中进行，或者可以在利用PCR(两步方案)进行扩增之前首先进行逆转录。
另外地，定量测量mRNA表达产物的其它已知系统包括使用具有荧光分子和猝灭剂分子的探针的Molecular Beacons(R)，该探针能够形成发夹结构，使得当处于发夹形式时，荧光分子被猝灭，并且当杂交时，荧光增加，给出基因表达的定量测量。
根据该实施方式，检测分子可以是对应于生物标记基因或任何对照参比基因的任何区域或部分并从而与其杂交的探针的形式。更具体地，选择将允许与靶核酸杂交的区域是重要的。诸如寡核苷酸的Tm、百分比GC含量、二级结构的程度和核酸的长度等的因素是重要的因素。
应当进一步注意的是，根据本领域普通技术人员知晓常规的RNA杂交技术，标准RNA印迹试验也可用于确定RNA转录物大小和生物标记基因或任何对照基因产物的相对量。
本发明进一步考虑使用基于氨基酸的分子诸如蛋白质或多肽作为本文公开的检测分子，并且将被本领域技术人员已知用于测量本发明的标记基因的蛋白产物。然后可以使用本领域技术人员已知的技术(例如，诸如蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA、蛋白微阵列分析、流式细胞术等的技术)来测量与本发明的生物标记相对应的蛋白产物的水平。如本领域技术人员将理解的，本发明的生物标记的蛋白产物的表达水平的测量需要蛋白质，其特异性地和/或选择性地结合本发明的生物标记基因。
如上面所指示，本发明的检测分子可以是基于氨基酸的分子，其可以被称为蛋白质(一种或多种)或多肽(一种或多种)。如本文所使用的，术语“蛋白质”和“多肽”可交换地使用指通过肽键连接在一起的氨基酸的链。在具体实施方式中，蛋白质由通过肽键连接在一起的小于200、小于175、小于150、小于125、小于100、小于50、小于45、小于40、小于35、小于30、小于25、小于20、小于15、小于10或小于5个氨基酸组成。在另一实施方式中，蛋白质由通过肽键连接在一起的至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500或更多个氨基酸组成。应当注意的是，本文描述的肽键是在两个氨基酸残基之间形成的共价酰胺(amid)键。
在具体实施方式中，检测氨基酸分子是分离的抗体，如上详细说明的，选择性地特异性结合由生物标记基因编码的蛋白。使用这些抗体，可以使用选自FACS、蛋白质印迹、ELISA、RIA、狭线印迹、斑点印迹、免疫组织化学试验和放射性成像试验的免疫试验测定由基因编码的蛋白质的表达水平。
在仍其他具体实施方式中，本发明的方法可以使用任何样品。在更具体的实施方式中，这类样品可以是周围血单核细胞、羊水和器官或组织的活组织检查中的任一种。
应当注意的是，本发明的方法、组合物和试剂盒使用的任何检测分子都是分离并纯化的。还进一步，必须理解的是，本发明的组合物、试剂盒、阵列和方法的任何步骤中使用的任何检测分子(例如，引物和/或探针)或试剂都是非天然存在的产品或化合物。因此，本发明的检测分子都不涉及天然存在的化合物或产品。
还进一步，这类检测分子可以是引物对或核苷酸探针中的至少一种。
在一个实施方式中，本发明的基于多核苷酸的检测分子可以是核酸探针的形式，其可以被点滴(spot)到阵列上以测量来自待诊断对象的样品的RNA。
如本文所限定，“核酸阵列”指多个核酸(或“核酸成员”)，任选地附接至支持体，其中核酸成员中每种被附接至支持体的独特的预选和限定的区域。本文中，这些核酸序列被用作检测核酸分子。在一个实施方式中，附接至支持体表面的核酸成员是DNA。在优选实施方式中，附接于支持体表面的核酸成员是cDNA或寡核苷酸。在另一实施方式中，附接于支持体表面的核酸成员是通过聚合酶链反应(PCR)合成的cDNA。在另一实施方式中，“核酸阵列”指附接至DNA和/或RNA印迹技术中使用的硝化纤维素或其他膜的多个独特核酸检测分子。对于基于寡核苷酸的阵列，选择对应于可用作探针的感兴趣的基因的寡核苷酸是本领域熟知的。
如上所指示的，基于微阵列或RT-PCR的试验可以包括将探针附接或点滴在固体支持体上。如本文所使用的，术语“附接”和“点滴”指将核酸沉积到基底上以形成核酸阵列的过程，使得核酸通过共价键、氢键或离子相互作用稳定地结合至基底。
如本文所使用，“稳定地缔合”或“稳定地结合”指通过共价键、氢键或离子相互作用稳定地结合至固体基底以形成阵列的核酸，使得核酸相对于所有与阵列稳定地缔合的其它核酸，或相对于所有在通常分析阵列的条件下(即，在杂交、洗涤和/或扫描等一个或多个步骤期间)固体基底上其他预选区域，保留其独特的预选位置。
如本文所使用，当提及阵列时，“基底”或“支持体”或“固体支持体”指具有刚性或半刚性表面的材料。支持体可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或任何这些的组合，作为颗粒、股线、沉淀物、凝胶、片材、管材、球体、珠、容器、毛细管、垫、切片、薄膜、板、载玻片、芯片等等存在。通常，基底是硅或玻璃表面、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidendifmoride)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、带电的膜诸如尼龙或硝化纤维素或其组合。优选地，基底的至少一个表面将是基本上平的。支持体可以任选地包含反应性基团，其包括但不限于羧基、氨基、羟基、硫羟等。在一个实施方式中，支持体可以是光学透明的。如上所提到的，固体支持体可以包括聚合物，诸如聚苯乙烯、琼脂糖(agarose)、琼脂糖(sepharose)、纤维素、玻璃、玻璃珠和纤维素或其他聚合物的可磁化颗粒。固体支持体可以是大的或小的珠子、芯片或颗粒、管、板的形式或其他形式。
本发明人考虑了以区室形式的本发明的试剂盒。因此应当注意，用于检测生物标记基因的表达水平的检测分子可以在附接至阵列的试剂盒中提供。如本文所定义，“检测分子阵列”指多个检测分子，其可以是基于核酸的或基于蛋白的检测分子(具体地说，探针、引物和抗体)，任选附接至支持体，其中每个检测分子附接至支持体的独特的预选和限定区域中。
例如，阵列可以包含不同的检测分子，诸如特异性抗体或引物。如在此之前所指示的，在生物标记基因表达水平的组合检测的情况中，用于每个靶标的不同检测分子可以空间排列在阵列中的预定且分离的位置中。例如，阵列可以是多个容器(试管)、平板、微孔板中的微孔，每个含有针对本发明使用的标记基因编码的多肽的不同的检测分子，具体而言探针、引物和抗体。阵列也可以是任何固体支持体，它们在不同的区域(点、线、列)中容纳不同且已知的预定的检测分子。
如本文所使用的，“固体支持体”被定义为分子可通过共价键或非共价键附接至的任何表面。因此，有用的固体支持体包括固体和半固体基质，诸如气凝胶和水凝胶、树脂、珠、生物芯片(包括薄膜涂布的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称为微量滴定板或微量培养板)、膜、过滤器、导电和非导电金属、玻璃(包括显微镜载玻片)和磁性支持体。有用的固体支持体的更具体的实例包括硅胶、聚合物膜、颗粒、衍生塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖诸如琼脂糖、尼龙、乳胶珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠、淀粉等。这还包括但不限于微球颗粒，例如Lumavidin.TM.或LS-珠、磁珠、带电纸、Langmuir-Blodgett膜、功能化玻璃、锗、硅、PTFE、聚苯乙烯、砷化镓、金和银。还考虑了本领域已知的能够在其表面并入官能团例如氨基、羧基、硫羟或羟基的任何其他材料。这包括具有任何拓扑学的表面，其包括但不限于球表面和有沟的表面。
应当进一步认识到，本发明的任何方法和试剂盒中包括的任何试剂、物质或成分可提供作为嵌入、链接、连接、附接、放置或融合到上面描述的任何固体支持体材料的试剂。
根据其他实施方式，本发明的试剂盒可以适合用于检查样品，诸如周围血单核细胞、羊水和器官或组织的活组织检查。
应当认识到，本发明的方法也可以适用于作为预测工具，以在怀孕前筛选对象，具体而言人类对象，从而鉴定处于可能易于受到病毒病原体——具体而言CMV——的子宫内-传播并由此可能展示其的风险下的对象，具体而言人类对象或群体。
应当进一步认识到，除了诊断和预测方法、组合物和试剂盒之外，本发明还在其仍一些实施方式中提供了用于预防和减少由病毒病原体——具体而言CMV——的子宫内传播引起的病理损伤的发病率或风险的预防性方法和工具。在仍更具体的实施方式中，这些病理学病症、临床表现或损伤可包括但不限于子宫内生长迟缓、紫癜、黄疸、肝脾大、脑过小、听力和视力障碍、血小板减少症以及任何在此之前公开的损伤。
除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有本领域通常使用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本文频繁使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。
如本文所使用，术语“大约”指±10％。术语“包括(comprises、comprising)”，“包含(includes、including)”、“具有”及其缀合词意指“包括但不限于”。术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但是只有当该额外成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时。
如本文所使用，术语“大约”指示可能高于或低于提及的值偏离上至1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％、并且在某些情况下上至20％，偏差范围包括整数值，并且如果适用，也包括非整数值，其构成连续范围。
如本文所使用，术语“大约”指±10％。术语“包括(comprises、comprising)”，“包含(includes、including)”、“具有”及其缀合词意指“包括但不限于”。该术语包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。短语“基本上由……组成”是指组合物或方法可以包括额外的成分和/或步骤，但是只有当该额外成分和/或步骤不会实质性地改变要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征时。贯穿该说明书和随后的实施例和所附的权利要求书，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise、comprises、comprising)”将被理解为暗示包括叙述的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。
如本文所使用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包括但不限于被化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或易于从已知方式、手段、技术和过程开发的那些方式方式、手段、技术和过程。
如本文所使用，术语“大约”指示可能高于或低于提及的值偏离上至1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％、并且在某些情况下上至20％，偏差范围包括整数值，并且如果适用，也包括非整数值，其构成连续范围。
必须注意的是，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a、an)”和“该”包括复数指代物，除非上下文中明确另外规定。
实施例
实验过程
a.研究样品
参加以色列耶路撒冷Shaare Zedek医学中心回顾性检查的参与者有资格包括在本研究中。Shaare Zedek医学中心的机构审查委员会(institutional review board ofShaare Zedek Medical Center)批准了该协议，并且参与者提供了书面知情同意书。所有参与者都提供了病史，并在怀孕的第一个和第二个三月期期间针对原发性hCMV感染和病毒载量进行了身体检查和实验室免疫评估。
从诊断患有原发性CMV感染的怀孕女性顺序收集血液样品。表1总结了参与本研究的18位hCMV感染怀孕女性的数据。
表1:参与本研究的18位hCMV感染女性的列表和数据。
原发性CMV感染和子宫内传播的时机:
通过血清转化的时间点和/或IgG亲和力(avidity)的增量分析和/或通过临床症状确定原发性感染时机25。通过壳瓶培养(shell vial culture)和/或实时PCR检测羊水中或新生儿尿液中病毒DNA诊断子宫内CMV传播。
b.生物标记选择和测量结果
由体外未感染的和在感染后4-48小时(hpi)的hCMV感染的PBMC组成五个微阵列转录组数据集。使用下面的基因表达综合(Omnibus)登录号从公共可得的数据库[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]获得表达水平：
I.基因表达综合登录号GSE14490；描述源自6个模拟感染的和匹配的6个hCMV感染的供体的树突细胞的分析，6hpi。
II.基因表达综合登录号GSE14816；描述源自3个模拟感染的和匹配的3个hCMV感染的供体的树突细胞的分析，24hpi。
III.基因表达综合登录号GSE17948；描述源自4个模拟感染的和匹配的4个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，24hpi。
IV.基因表达综合登录号GSE19772；描述源自2个模拟感染的和匹配的2个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，48hpi。
V.基因表达综合登录号GSE14408；描述源自6个模拟感染的和匹配的6个hCMV感染的供体的单核细胞的分析，4hpi。
另外，执行未感染的或被hCMV感染的人类包皮成纤维细胞(感染后24、48和72小时)的深度测序的基因表达综合登录号GSE63797被用于验证。
筛选生物标记：
五个数据集(上面描述的I-V)包括了PBMC体外模拟处理的和hCMV感染的4-48hpi的匹配对。
在将这些数据库中的数据转换为相同的等级(scale)后，将五个数据集合并为模拟感染样品然后它们匹配的感染样品组成的一个数据组。进行火山分析(使用Matlab版本13)，生成满足>2倍变化和低于0.05的p值的条件的基因列表(图1A)。
在STRING(用于检索相互作用基因/蛋白质的检索工具-版本9.1)数据库中从合并的宽泛列表以小于0.05的伪发现率(FDR)限制选择基因清楚地指示了在取自健康供体的PBMC中在CMV感染后4-48h应答的IFN途径基因的主要作用(图1B)。具体地，观察到IFIT、OAS、IFI和遍在蛋白家族的关键作用。
通过对比较未感染的和被hCMV 24hpi感染的人包皮成纤维细胞的深度测序数据集GSE63797进行火山分析也指示了类似的基因集(未示出)。
因此，决定在CMV原发性感染的怀孕女性中测试这些基因家族的代表。实际上，这些测试的基因中的3-4种足以预测病毒至胎儿的传播。
c.实验室测试：
通过CMV-特异性IgG血清转化，或血液中低亲和力IgG抗体或CMV-特异性IgM——不具有先前IgG抗体——的存在或CMV或病毒产物的存在确定原发性CMV感染。
病毒载量-通过实时PCR反应执行CMV病毒血症。200拷贝数/ml血液为该试验的检测限。
qRT PCR：通过使用Kit(AM 1912Life Technology)从怀孕女性获得的PBMC纯化总RNA并在-70℃下储存直到使用。通过根据公司说明书使用High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit(AB-4374966 Life Technology)将RNA制剂转化为cDNA。对于基因表达分析，使用QuantStudio 12K Flex PCR系统(Life Technology)，其中反应混合物包含：5μl的TaqMan Gene Expression Master Mix(2X)和在0.4μl的H2O中的12ng的cDNA以及4.1μl的H2O。
并行地，“无模板对照”(NTC)包含没有cDNA的相同组分。向所有样品中加入体积0.5μl的TaqMan基因表达试验(20x)酶，所述样品与合适的引物预混合。在以下条件下进行PCR反应：50℃下2分钟，95℃下变性10分钟，和95℃中15秒接着60℃持续1分钟的40个循环。我们评估了GAPDH、B2M和RPLPO用作标准化基因的适用性。由于表达水平与IFN基因相关，因此舍弃了GAPDH。B2M被选为最合适的候选者。
d.统计分析–ROC
使用具有最低等级P值的三种基因：IFIT3、IS15和USP18，用MATLAB(版本R2013a)进行ROC曲线分析(图3C)。曲线下面积为0.9846，标准差为0.02716和95&C.I介于0.93137和1之间。截止点表
灵敏度(1-在非传播者对象基础上测试是传播者的概率)：92.3％
95％置信区间：77.8％-100.0％
假阴性比例：7.7％
特异性(1-在传播者对象基础上测试是非传播者的概率)：100.0％
95％置信区间：100.0％-100.0％
假阳性比例：0.0％
F-量度：96.0％
准确性或潜能：94.4％
错分率：5.6％
实施例1
通过hCMV感染活化细胞基因
在五个可得的出版的阵列数据集中描述了hCMV感染对PBMC中细胞基因表达的影响，每个阵列数据集由若干患者组成。未感染的细胞被用作限定hCMV依赖性基因表达变化的参比。
由整合全部五个数据集的组导出的火山图显示了由于hCMV感染而过表达的基因(图1A)。在String分析中由火山分析导出的上调基因的评价(图1B)显示了IFIT、OAS、IFI和遍在蛋白成员的关键作用。
为了预测每位女性对hCMV感染的应答，首先比较所有患者中ISG15基因的表达。图1C-1G显示了大多数女性(21位女性中的17位)通过增强ISG15基因表达来应答病毒感染，而在源自4位患者(19％)的细胞中，ISG15基因表达水平轻度增加。
通过评估21例患者对IFIT、OAS、IFI和遍在蛋白IFN信号转导基因——这些基因与每个病例的ISG15动力学平行——的应答，进一步证实了这些结果。这些数据清楚地显示了这些IFN信号传导家族的代表可以用作用于选择区分传播者和非传播者个体的生物标记的可靠集合。即，被认为是传播者(传播hCMV)的女性和被认为是非传播者的女性(将不会传播hCMV)。
实施例2
阐明病毒复制与IFN刺激的基因表达之间平衡的数学模型
据信，病毒感染的细胞感测病原体相关的分子模式(PAMP)并引发先天应答，即对抗运动(campaign)，导致减少复制病毒的量。
拯救细胞抗病毒应答，hCMV表达大量致力于中和先天免疫基因的基因，诸如IE1-p72和IE-86(19)。
数学模型模拟并预测单个细胞内病毒复制与其对抗战斗细胞蛋白之间的相互作用的时间过程。该模型表明了继续重复两个连续的周期过程；病毒作用周期，随后细胞反应周期。
K因子代表每个周期中不断的病毒复制。该因子等于病毒劫持细胞机制并以特定步速(pace)复制的能力。因子M表示由细胞防御机制消除的(细胞内)病毒的现有群体的部分(0至1之间)。因此平衡点可以确定M＝1-1/K。最后，N是病毒对细胞战斗的当前周期计数。因此，在周期N开始时，细胞中有X(N-1)个病毒。在周期结束时，这个数字可以通过下面的公式计算：
X(N)＝X(N-1)*K。
该模型假设战斗蛋白在随后的周期中报复(retaliate)。在周期N期间细胞战斗蛋白Y的量保持不变：
Y(N)＝Y(N-1).
在随后的周期N+1，战斗蛋白消除病毒的现有群体的M部分，因此：
X(N+1)＝X(N)-M*X(N)
因此，这类消除所需的战斗蛋白的量可表达为：
Y(N+1)＝M*X(N)。
其离散形式的重复过程可以写成如下：
X(N)＝X(N-1)*K
Y(N)＝Y(N-1)
X(N+1)＝X(N)-M*X(N)
而：Y(N+1)＝M*X(N)。
通过诸如细胞阻抗测量等手段提供的倍增时间可以获得不同病毒的K值。
WNV和SLEV的倍增时间分别估算为4.0hr和13.5hr21，指示了WNV可以以比SLEV几乎快三倍的速率增殖。类似地，假设HCV具有6小时的倍增时间和HIV具有10小时的倍增时间。因此，每个细胞中12hr HCV中将具有大于4份拷贝，因此我们可以假设K＝5。
在异基因造血干细胞移植(HSCT)患者中hCMV繁殖的情况下，Cromer及其合作者20估计hCMV的倍增时间为0.96/天，或者颗粒数乘以1.92/24hr的因子(K＝1.92)。
因此，假设该女性怀孕中K以尽快清除病毒，这样的女性M值应该大于1-1/1.92＝0.4792，优选尽可能接近1。
对于K＝2的hCMV，模型表明了非传播者应当具有大于0.5的M值(M＝1-1/K＝0.5)，对于传播者则M值小于0.5。
因此，通过从ISG15基因表达水平的RT PCR计算M，发现非传播者组具有接近于0的M值并且发现传播者组具有接近1的M值。
可以通过以下步骤执行计算样品的M(Msamp)值：(a)获得所述样品的表达值Exsamp，如通过本发明的方法测定的；(b)提供hCMV感染对象的表达值的标准曲线；(c)由(b)的所述标准曲线获得最大表达值Exmax和最小表达值Exmin；和(d)计算所述样品的Msamp值，其中Msamp＝1-[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]。
类似地，Msamp的值可以使用下面的等价方程计算：
Msamp＝(Exmax-Exsamp)/(Exmax-Exmin)]。
在1.92至13.5小时的倍增时间范围的情况下，模型表明了细胞专用战斗基因在病毒检测中应在12小时内上调它们的表达4-8倍。这再次符合从我们使用的微阵列数据集获得的数据。
M因子是个人的且因人而异，并且它可以被认为是通过维持与M＝1/K处平衡的差距确定细胞和病毒之间战斗结果的主要因素。
发明人证明，差距M与平衡1-1/K的比可以在一方面解释测量的病毒载量变异性和在另一方面解释细胞的战斗基因表达动力学。根据该模型，满足增加的病毒复制的细胞应答试图增加应答IFN基因的表达。结果是细胞可以通过快速上调IFN战斗基因尽可能快地达到病毒进入来战胜病毒复制机器。
图2显示了具有4个不同M值的对hCMV作出反应的模型的模拟。
当M＝0.495时，病毒复制超出了细胞战斗基因，导致测量的高基因表达水平和至胎儿的传播。当M＝0.65、0.8或0.95时，细胞战斗基因战胜病毒复制并阻断至胎儿的传播。
该模型还预测了下面的病毒载量剂量关系：
1)所有治疗中病毒载量的减少都是由最初的急剧下降，然后较慢和较长的下降组成。
2)增加剂量应当导致病毒载量更尖锐和更快速的下降。
3)治疗中病毒载量下降的差异仅取决于人快速上调其IFN战斗基因的能力。
实施例3
hCMV感染的怀孕女性中IFN信号传导基因的表达
怀孕女性的原发性hCMV感染赋予了先天性感染和疾病的最高风险。预计约40％的hCMV感染女性将病毒传播给其胎儿。发明人感兴趣地揭示了小集合的生物标记表达水平是否可用于鉴定处于赋予子宫内-病毒-传播风险的女性。
发明人从由27位同意的怀孕女性收集的存储的冷冻PMBC中提取全细胞RNA，其中18位具有至少200份拷贝/ml血液的hCMV载量。由于该模型需要病毒触发，因此排除未检测到病毒载量的样品。通过qRT-PCR分析所选生物标记表达强烈地表明hCMV感染的怀孕女性分为两组；12位怀孕女性表达低水平，而另外6位表达高水平的大部分生物标记。
图3A显示了18位hCMV感染的怀孕女性中3种所选基因(ISG15、IFIT3和USP18)的表达的总和，强调了两组女性之间的差异。
为了进一步证实结果，发明人绘制了箱型图，显示了两个女性群体的3种所选基因的表达水平(表2)(图3B)。
在图3C中显示了对两组中三种基因表达的Z分数标准化总和计算的ROC曲线。这些结果(图3A-C)清楚地指示，18名女性可以分为两组，其通过IFN-信号传导基因的表达水平区分。
更具体地，图3A显示，女性可分为两个独立的组：5个具有高基因表达水平的传播者和12个具有低基因表达水平的非传播者。3种基因的表达水平(图3A)表明女性16YM是一个边缘病例。这可能会导致不希望的临床结论。
预测的结果为：
准确性＝94.4％
灵敏度＝92.3％
特异性＝100％
图4A-C说明了使用RT-PCR测量的ISG15基因的表达水平来计算所有18位hCMV感染的患者的Msamp。表达水平在下表2中指示。因此，使用方程Msamp＝(Exmax-Exsamp)/(Exmax-Exmin)]，可以计算每个检查对象的M水平。例如，如图4A和表2所示，ISG15的最小表达是患者17-67MA(Exmin＝0.019)，最大表达水平是患者7-37LH(Exmax＝2.581)。因此，患者14-16YM(Exsamp＝1.217)的M是：
Msamp＝(Exmax-Exsamp)/(Exmax-Exmin)]＝(2.581-1.217)/(2.581-0.019)＝(1.364)/(2.562)＝0.53.
可选地，可以使用方程Msamp＝1-[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]计算相同的值。例如：1-[(1.217-0.019)/(2.581-0.019)]＝1-[(1.198)/(2.562)]＝1-0.467＝0.53。当该M大于阻止传播所需的最小M(0.495)时，该患者将不传播病毒至胎儿。
表2：18位感染hCMV的怀孕女性中3种所选基因的qRT PCR表达结果
实施例4：
在hCMV感染的怀孕女性中IFN信号传导基因的表达
对来自由24或29位同意的怀孕女性收集的存储的冷冻PMBC的全细胞RNA进行进一步分析(在实施例3中描述了其中的18位)。
为了获得清楚的区别和预测工具，发明人除了上面描述的三种基因(即IFIT3、USP18和ISG15)之外还分析了额外四种基因EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的表达水平。
如本文下面所示，通过qRT-PCR和随后的标准化对所选的七种生物标记表达的分析强烈地表明，hCMV感染的怀孕女性可以分为两组：表达低水平的女性和表达高水平生物标记的女性。
具体而言，在图5A至图5G中分别显示了在24位hCMV感染的怀孕女性中测量的七种基因IFIT3、USP18、ISG15、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1中每一种的表达。在这些图中，表示为#1至#13的怀孕女性表征为非传播者，表示为#15至#25的怀孕女性表征为传播者。
如图5A至5G所示，女性群体可以分成两个独立的组：11位具有高表达水平的七种基因的传播者和13位具有低表达水平的非传播者。
发明人已经进一步计算了全部七种基因的总和。图6A显示了在29位hCMV感染的怀孕女性中7种所选基因(ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1)的表达的总和，强调了两组女性之间的差异，其中低的总和值与13位非传播者女性相关联，和高的值与16位传播者女性相关联。
图6B显示了每个女性中七种基因的总和vs.阈值条(显示为虚线)，其显示低于阈值的总和指示非传播者女性，而高于阈值的总和指示传播者女性。
SEQUENCE LISTING
<110> 基因前沿公司
<120> 用于预测和诊断人巨细胞病毒(hCMV)先天性传播的方法和试剂盒
<130> 2446870
<150> US 62/239,609
<151> 2015-10-09
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
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ccagtacagg agcttgtgcc gtggcccaca gcccacagcc cacagccatg ggctgggacc 120
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tgtcagagct gaaggcgcag atcacccaga agatcggcgt gcacgccttc cagcagcgtc 240
tggctgtcca cccgagcggt gtggcgctgc aggacagggt cccccttgcc agccagggcc 300
tgggccccgg cagcacggtc ctgctggtgg tggacaaatg cgacgaacct ctgagcatcc 360
tggtgaggaa taacaagggc cgcagcagca cctacgaggt acggctgacg cagaccgtgg 420
cccacctgaa gcagcaagtg agcgggctgg agggtgtgca ggacgacctg ttctggctga 480
ccttcgaggg gaagcccctg gaggaccagc tcccgctggg ggagtacggc ctcaagcccc 540
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<213> 智人
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Met Gly Trp Asp Leu Thr Val Lys Met Leu Ala Gly Asn Glu Phe Gln
1 5 10 15
Val Ser Leu Ser Ser Ser Met Ser Val Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ile
20 25 30
Thr Gln Lys Ile Gly Val His Ala Phe Gln Gln Arg Leu Ala Val His
35 40 45
Pro Ser Gly Val Ala Leu Gln Asp Arg Val Pro Leu Ala Ser Gln Gly
50 55 60
Leu Gly Pro Gly Ser Thr Val Leu Leu Val Val Asp Lys Cys Asp Glu
65 70 75 80
Pro Leu Ser Ile Leu Val Arg Asn Asn Lys Gly Arg Ser Ser Thr Tyr
85 90 95
Glu Val Arg Leu Thr Gln Thr Val Ala His Leu Lys Gln Gln Val Ser
100 105 110
Gly Leu Glu Gly Val Gln Asp Asp Leu Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Glu Asp Gln Leu Pro Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Pro
130 135 140
Leu Ser Thr Val Phe Met Asn Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Thr Glu
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165
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cagcatttgc ttggaatcag taagctaaaa acaaaatcaa ccgggacccc agcttttcag 120
aactgcaggg aaacagccat catgagtgag gtcaccaaga attccctgga gaaaatcctt 180
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aatacaggag aatctgaagc tagtggaaat aaagagatga ttgaagcact aaagcaatat 1080
gctatggact attcgaataa agctcttgag aagggactga atcctctgaa tgcatactcc 1140
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gatgctgaaa agcaacaatc ccatcagcgc tactgcaacc ttcagaaata taatgggaag 1260
tctgaagaca ctgctgtgca acatggttta gagggtttgt ccataagcaa aaaatcaact 1320
gacaaggaag agatcaaaga ccaaccacag aatgtatctg aaaatctgct tccacaaaat 1380
gcaccaaatt attggtatct tcaaggatta attcataagc agaatggaga tctgctgcaa 1440
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gacagggggc cccaacctgg gattgctgag cagggaagct ttgcatgttg ctctaaggta 1740
catttttaaa gagttgtttt ttggccgggc gcagtggctc atgcctgtaa tcccagcact 1800
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cctttatata gttccttcag tatttacttg aggcagacag gaagacttct gaagaacaaa 180
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85 90 95
Trp Gly Asn Tyr Ala Trp Val Tyr Tyr His Leu Gly Arg Leu Ser Asp
100 105 110
Ala Gln Ile Tyr Val Asp Lys Val Lys Gln Thr Cys Lys Lys Phe Ser
115 120 125
Asn Pro Tyr Ser Ile Glu Tyr Ser Glu Leu Asp Cys Glu Glu Gly Trp
130 135 140
Thr Gln Leu Lys Cys Gly Arg Asn Glu Arg Ala Lys Val Cys Phe Glu
145 150 155 160
Lys Ala Leu Glu Glu Lys Pro Asn Asn Pro Glu Phe Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Ala Ile Ala Met Tyr His Leu Asp Asn His Pro Glu Lys Gln Phe Ser
180 185 190
Thr Asp Val Leu Lys Gln Ala Ile Glu Leu Ser Pro Asp Asn Gln Tyr
195 200 205
Val Lys Val Leu Leu Gly Leu Lys Leu Gln Lys Met Asn Lys Glu Ala
210 215 220
Glu Gly Glu Gln Phe Val Glu Glu Ala Leu Glu Lys Ser Pro Cys Gln
225 230 235 240
Thr Asp Val Leu Arg Ser Ala Ala Lys Phe Tyr Arg Arg Lys Gly Asp
245 250 255
Leu Asp Lys Ala Ile Glu Leu Phe Gln Arg Val Leu Glu Ser Thr Pro
260 265 270
Asn Asn Gly Tyr Leu Tyr His Gln Ile Gly Cys Cys Tyr Lys Ala Lys
275 280 285
Val Arg Gln Met Gln Asn Thr Gly Glu Ser Glu Ala Ser Gly Asn Lys
290 295 300
Glu Met Ile Glu Ala Leu Lys Gln Tyr Ala Met Asp Tyr Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Glu Lys Gly Leu Asn Pro Leu Asn Ala Tyr Ser Asp Leu Ala
325 330 335
Glu Phe Leu Glu Thr Glu Cys Tyr Gln Thr Pro Phe Asn Lys Glu Val
340 345 350
Pro Asp Ala Glu Lys Gln Gln Ser His Gln Arg Tyr Cys Asn Leu Gln
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Lys Tyr Asn Gly Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Gln His Gly Leu Glu
370 375 380
Gly Leu Ser Ile Ser Lys Lys Ser Thr Asp Lys Glu Glu Ile Lys Asp
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Tyr Trp Tyr Leu Gln Gly Leu Ile His Lys Gln Asn Gly Asp Leu Leu
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Gln Ala Ala Lys Cys Tyr Glu Lys Glu Leu Gly Arg Leu Leu Arg Asp
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Ala Pro Ser Gly Ile Gly Ser Ile Phe Leu Ser Ala Ser Glu Leu Glu
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Asp Gly Ser Glu Glu Met Gly Gln Gly Ala Val Ser Ser Ser Pro Arg
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Glu Leu Leu Ser Asn Ser Glu Gln Leu Asn
485 490
<210> 7
<211> 2037
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gggaagctcg ggccggcagg gtttccccgc acgctggcgc ccagctcccg gcgcggaggc 60
cgctgtaagt ttcgctttcc attcagtgga aaacgaaagc tgggcggggt gccacgagcg 120
cggggccaga ccaaggcggg cccggagcgg aacttcggtc ccagctcggt ccccggctca 180
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gggactaccc tcatggcctg gttggtttac acaacattgg acagacctgc tgccttaact 540
ccttgattca ggtgttcgta atgaatgtgg acttcaccag gatattgaag aggatcacgg 600
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atacgatccg ggtgaaggac tccttgattt gcgttgactg tgccatggag agtagcagaa 900
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tgccccagac cctgacaatc cacctcatgc gattctccat caggaattca cagacgagaa 1140
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<212> PRT
<213> 智人
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Asp Ser Asn Met Lys Arg Glu Gln Pro Arg Glu Arg Pro Arg Ala Trp
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Ser Asn Ile Cys Leu Val Ser Trp Glu Asp Ile Gln Cys Thr Tyr Gly
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<212> DNA
<213> 智人
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gcaaaatggg acagaaagaa tatagtattg gtacaggttc tactaaacag gaagcaaaac 1020
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actacctgtc ctctggttct tttgctacta cgtgtgagtc ccaaagcaac tctttagtga 1140
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ttaaacgtgt taaatataat aacgagaagg cggagcgtga agtaaaagca ttggcaaaac 1500
ttgatcatgt aaatattgtt cactacaatg gctgttggga tggatttgat tatgatcctg 1560
agaccagtga tgattctctt gagagcagtg attatgatcc tgagaacagc aaaaatagtt 1620
caaggtcaaa gactaagtgc cttttcatcc aaatggaatt ctgtgataaa gggaccttgg 1680
aacaatggat tgaaaaaaga agaggcgaga aactagacaa agttttggct ttggaactct 1740
ttgaacaaat aacaaaaggg gtggattata tacattcaaa aaaattaatt catagagatc 1800
ttaagccaag taatatattc ttagtagata caaaacaagt aaagattgga gactttggac 1860
ttgtaacatc tctgaaaaat gatggaaagc gaacaaggag taagggaact ttgcgataca 1920
tgagcccaga acagatttct tcgcaagact atggaaagga agtggacctc tacgctttgg 1980
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tcacagacct acgggatggc atcatctcag atatatttga taaaaaagaa aaaactcttc 2100
tacagaaatt actctcaaag aaacctgagg atcgacctaa cacatctgaa atactaagga 2160
ccttgactgt gtggaagaaa agcccagaga aaaatgaacg acacacatgt tagagccctt 2220
ctgaaaaagt atcctgcttc tgatatgcag ttttccttaa attatctaaa atctgctagg 2280
gaatatcaat agatatttac cttttatttt aatgtttcct ttaatttttt actattttta 2340
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tggagaaata tggtactcat taaaaaaaaa aaaaaaagtg atgtacaacc acttcggaaa 2940
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ttcctacata cgtgcttaca agaatgtcca taaaaccctg tttataatag ccaaaagaac 3060
agggaacaac cataatgcac atcaaaagaa gaatggatta aaaaaattat attcacacac 3120
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<213> 智人
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Glu Tyr Trp Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Phe Ser Lys Leu Val Gln
530 535 540
Met Phe Lys Thr Ala Val Ile Cys Gln Leu Asp Tyr Trp Asp Glu Ser
545 550 555 560
Ala Glu Glu Asn Gly Asn Val Gln Ala Leu Leu Glu Met Leu Lys Lys
565 570 575
Leu His Arg Val Asn Gln Val Lys Cys Gln Leu Pro Glu Ser Ile Phe
580 585 590
Gln Val Asp Glu Leu Leu His Arg Leu Asn Phe Phe Val Glu Val Cys
595 600 605
Arg Arg Tyr Leu Trp Lys Met Thr Val Asp Ala Ser Glu Asn Val Gln
610 615 620
Cys Cys Val Ile Phe Ser His Phe Pro Phe Ile Phe Asn Asn Leu Ser
625 630 635 640
Lys Ile Lys Leu Leu His Thr Asp Thr Leu Leu Lys Ile Glu Ser Lys
645 650 655
Lys His Lys Ala Tyr Leu Arg Ser Ala Ala Ile Glu Glu Glu Arg Glu
660 665 670
Ser Glu Phe Ala Leu Arg Pro Thr Phe Asp Leu Thr Val Arg Arg Asn
675 680 685
His Leu Ile Glu Asp Val Leu Asn Gln Leu Ser Gln Phe Glu Asn Glu
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Asp Leu Arg Lys Glu Leu Trp Val Ser Phe Ser Gly Glu Ile Gly Tyr
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Asp Leu Gly Gly Val Lys Lys Glu Phe Phe Tyr Cys Leu Phe Ala Glu
725 730 735
Met Ile Gln Pro Glu Tyr Gly Met Phe Met Tyr Pro Glu Gly Ala Ser
740 745 750
Cys Met Trp Phe Pro Val Lys Pro Lys Phe Glu Lys Lys Arg Tyr Phe
755 760 765
Phe Phe Gly Val Leu Cys Gly Leu Ser Leu Phe Asn Cys Asn Val Ala
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Asn Leu Pro Phe Pro Leu Ala Leu Phe Lys Lys Leu Leu Asp Gln Met
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Leu Gln Thr Leu Leu Asp Asp Glu Gly Asp Asn Phe Glu Glu Val Phe
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835 840 845
Pro Asn Gly Ser Ser Ile Thr Val Asn Gln Thr Asn Lys Arg Asp Tyr
850 855 860
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865 870 875 880
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Gly
<210> 17
<211> 3512
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
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agactgctga tttccatccc tatataaaga gagtccctgg catacagaga ctgctctgct 120
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tgtgttcagg caacctctga gctctctgtg gaggagcctg gtcccgctgt tctgctggct 240
gagggcaacc ttctggctgc tagctaccaa gaggagaaag cagcagctgg tcctgagagg 300
gccagatgag accaaagagg aggaagagga ccctcctctg cccaccaccc caaccagcgt 360
caactatcac ttcactcgcc agtgcaacta caaatgcggc ttctgtttcc acacagccaa 420
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tggtatggag aagatcaact tttcaggtgg agagccattt cttcaagacc ggggagaata 540
cctgggcaag ttggtgaggt tctgcaaagt agagttgcgg ctgcccagcg tgagcatcgt 600
gagcaatgga agcctgatcc gggagaggtg gttccagaat tatggtgagt atttggacat 660
tctcgctatc tcctgtgaca gctttgacga ggaagtcaat gtccttattg gccgtggcca 720
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agtcgctttc aagataaatt ctgtcattaa tcgtttcaac gtggaagagg acatgacgga 840
acagatcaaa gcactaaacc ctgtccgctg gaaagtgttc cagtgcctct taattgaggg 900
tgagaattgt ggagaagatg ctctaagaga agcagaaaga tttgttattg gtgatgaaga 960
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cagtggattt gatgaaaaga tgtttctgaa gcgaggagga aaatacatat ggagtaaggc 1200
tgatctgaag ctggattggt agagcggaaa gtggaacgag acttcaacac accagtggga 1260
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
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165 170 175
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275 280 285
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Ser Lys Ser Ile Leu Asp Val Gly Val Glu Glu Ala Ile Lys Phe Ser
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Gly Phe Asp Glu Lys Met Phe Leu Lys Arg Gly Gly Lys Tyr Ile Trp
340 345 350
Ser Lys Ala Asp Leu Lys Leu Asp Trp
355 360
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
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Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro
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Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu
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Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala
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Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg
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Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp
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<212> DNA
<213> 智人
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catatttcag ggatctgctg gaggaaggaa aggccacggt tccctgcctg gcagaaaaac 1200
ttaccagcga gctcatcaca catatctgta aatctctgcc cctgttagaa aatcaaatca 1260
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gctcggcaac agactcttcc atggaggaga tctttcagca cctgatggcc tatcaccagg 1980
aggccagcaa gcgcatctcc agccacatcc ctttgatcat ccagttcttc atgctccaga 2040
cgtacggcca gcagcttcag aaggccatgc tgcagctcct gcaggacaag gacacctaca 2100
gctggctcct gaaggagcgg agcgacacca gcgacaagcg gaagttcctg aaggagcggc 2160
ttgcacggct gacgcaggct cggcgccggc ttgcccagtt ccccggttaa ccacactctg 2220
tccagccccg tagacgtgca cgcacactgt ctgcccccgt tcccgggtag ccactggact 2280
gacgacttga gtgctcagta gtcagactgg atagtccgtc tctgcttatc cgttagccgt 2340
ggtgatttag caggaagctg tgagagcagt ttggtttcta gcatgaagac agagccccac 2400
cctcagatgc acatgagctg gcgggattga aggatgctgt cttcgtactg ggaaagggat 2460
tttcagccct cagaatcgct ccaccttgca gctctcccct tctctgtatt cctagaaact 2520
gacacatgct gaacatcaca gcttatttcc tcatttttat aatgtccctt cacaaaccca 2580
gtgttttagg agcatgagtg ccgtgtgtgt gcgtcctgtc ggagccctgt ctcctctctc 2640
tgtaataaac tcatttctag cagacaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2683
<210> 22
<211> 662
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn
20 25 30
Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys
35 40 45
Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser
65 70 75 80
Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro
85 90 95
Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys
100 105 110
Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp
115 120 125
Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn
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Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu
145 150 155 160
Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu
165 170 175
Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala
180 185 190
Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg
195 200 205
Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala
210 215 220
Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp
225 230 235 240
Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr
245 250 255
Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys
260 265 270
Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp
275 280 285
Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys
325 330 335
Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg
340 345 350
Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu
355 360 365
Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Val Asn Ala Phe Asn Gln
370 375 380
Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp
385 390 395 400
Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr
405 410 415
Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys
420 425 430
Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe
435 440 445
Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala
450 455 460
Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val
465 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe
485 490 495
Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu
500 505 510
Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu
515 520 525
Gln Ile Val Tyr Cys Gln Asp Gln Val Tyr Arg Gly Ala Leu Gln Lys
530 535 540
Val Arg Glu Lys Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Trp Asp
545 550 555 560
Phe Gly Ala Phe Gln Ser Ser Ser Ala Thr Asp Ser Ser Met Glu Glu
565 570 575
Ile Phe Gln His Leu Met Ala Tyr His Gln Glu Ala Ser Lys Arg Ile
580 585 590
Ser Ser His Ile Pro Leu Ile Ile Gln Phe Phe Met Leu Gln Thr Tyr
595 600 605
Gly Gln Gln Leu Gln Lys Ala Met Leu Gln Leu Leu Gln Asp Lys Asp
610 615 620
Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Lys Glu Arg Ser Asp Thr Ser Asp Lys Arg
625 630 635 640
Lys Phe Leu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Leu Thr Gln Ala Arg Arg Arg
645 650 655
Leu Ala Gln Phe Pro Gly
660
<210> 23
<211> 3409
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
aaattcgcgg tgggggcgga gagcgcaggg agaagtaagc ccagtgcagg atcctgaggc 60
ccgtgtttgc aggaccaggg ccggccttcc gattccccat tcattccaga agcaccgaac 120
cacgctgtgc ccggatccca agtgcagcgg cacccagcgt gggcctgggg ttgccggttg 180
acccggtcct cagcctggta gcagaggcca ggccagtgcc acaaggcacc taagtccacc 240
tgggcctgga gcaggacagg ttgcaaaaga aaatatctcg ggacccccaa actccttatg 300
ctaagggaaa catcgagcct gggaactgag ccatcaacgc tgccattctt tttcccaaac 360
agaaccctgt tgtcagaggt acacccagag caactccaca ccgggtgcat gccacagcaa 420
ctccatctta aataggagct ggtaaaacga ggctgatacc tactgggctg cattcccaga 480
cggcatagcg aggaggtgct gaagagcgca ggtttggaga atgatcacct ggattggaac 540
catagctcta ccaatatgga acccagctcc ttaggcctcg gtcttctcat ggagaacatg 600
gtgtgataat cctactcctc tgggagggtg gctgttaagc cttggaccgc agttgccggc 660
caggaatccc agtgtcacgg tggacacgcc tccctcgcgc ccttgccgcc cacctgctca 720
cccagctcag gggctttgga attctgtggc cacactgcga ggagatcggt tctgggtcgg 780
aggctacagg aagactccca ctccctgaaa tctggagtga agaacgccgc catccagcca 840
ccattccaag gaggtgcagg agaacagctc tgtgatacca tttaacttgt tgacattact 900
tttatttgaa ggaacgtata ttagagctta ctttgcaaag aaggaagatg gttgtttccg 960
aagtggacat cgcaaaagct gatccagctg ctgcatccca ccctctatta ctgaatggag 1020
atgctactgt ggcccagaaa aatccaggct cggtggctga gaacaacctg tgcagccagt 1080
atgaggagaa ggtgcgcccc tgcatcgacc tcattgactc cctgcgggct ctaggtgtgg 1140
agcaggacct ggccctgcca gccatcgccg tcatcgggga ccagagctcg ggcaagagct 1200
ccgtgttgga ggcactgtca ggagttgccc ttcccagagg cagcgggatc gtgaccagat 1260
gcccgctggt gctgaaactg aagaaacttg tgaacgaaga taagtggaga ggcaaggtca 1320
gttaccagga ctacgagatt gagatttcgg atgcttcaga ggtagaaaag gaaattaata 1380
aagcccagaa tgccatcgcc ggggaaggaa tgggaatcag tcatgagcta atcaccctgg 1440
agatcagctc ccgagatgtc ccggatctga ctctaataga ccttcctggc ataaccagag 1500
tggctgtggg caatcagcct gctgacattg ggtataagat caagacactc atcaagaagt 1560
acatccagag gcaggagaca atcagcctgg tggtggtccc cagtaatgtg gacatcgcca 1620
ccacagaggc tctcagcatg gcccaggagg tggaccccga gggagacagg accatcggaa 1680
tcttgacgaa gcctgatctg gtggacaaag gaactgaaga caaggttgtg gacgtggtgc 1740
ggaacctcgt gttccacctg aagaagggtt acatgattgt caagtgccgg ggccagcagg 1800
agatccagga ccagctgagc ctgtccgaag ccctgcagag agagaagatc ttctttgaga 1860
accacccata tttcagggat ctgctggagg aaggaaaggc cacggttccc tgcctggcag 1920
aaaaacttac cagcgagctc atcacacata tctgtaaatc tctgcccctg ttagaaaatc 1980
aaatcaagga gactcaccag agaataacag aggagctaca aaagtatggt gtcgacatac 2040
cggaagacga aaatgaaaaa atgttcttcc tgatagataa agttaatgcc tttaatcagg 2100
acatcactgc tctcatgcaa ggagaggaaa ctgtagggga ggaagacatt cggctgttta 2160
ccagactccg acacgagttc cacaaatgga gtacaataat tgaaaacaat tttcaagaag 2220
gccataaaat tttgagtaga aaaatccaga aatttgaaaa tcagtatcgt ggtagagagc 2280
tgccaggctt tgtgaattac aggacatttg agacaatcgt gaaacagcaa atcaaggcac 2340
tggaagagcc ggctgtggat atgctacaca ccgtgacgga tatggtccgg cttgctttca 2400
cagatgtttc gataaaaaat tttgaagagt tttttaacct ccacagaacc gccaagtcca 2460
aaattgaaga cattagagca gaacaagaga gagaaggtga gaagctgatc cgcctccact 2520
tccagatgga acagattgtc tactgccagg accaggtata caggggtgca ttgcagaagg 2580
tcagagagaa ggagctggaa gaagaaaaga agaagaaatc ctgggatttt ggggctttcc 2640
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accaggaggc cagcaagcgc atctccagcc acatcccttt gatcatccag ttcttcatgc 2760
tccagacgta cggccagcag cttcagaagg ccatgctgca gctcctgcag gacaaggaca 2820
cctacagctg gctcctgaag gagcggagcg acaccagcga caagcggaag ttcctgaagg 2880
agcggcttgc acggctgacg caggctcggc gccggcttgc ccagttcccc ggttaaccac 2940
actctgtcca gccccgtaga cgtgcacgca cactgtctgc ccccgttccc gggtagccac 3000
tggactgacg acttgagtgc tcagtagtca gactggatag tccgtctctg cttatccgtt 3060
agccgtggtg atttagcagg aagctgtgag agcagtttgg tttctagcat gaagacagag 3120
ccccaccctc agatgcacat gagctggcgg gattgaagga tgctgtcttc gtactgggaa 3180
agggattttc agccctcaga atcgctccac cttgcagctc tccccttctc tgtattccta 3240
gaaactgaca catgctgaac atcacagctt atttcctcat ttttataatg tcccttcaca 3300
aacccagtgt tttaggagca tgagtgccgt gtgtgtgcgt cctgtcggag ccctgtctcc 3360
tctctctgta ataaactcat ttctagcaga caaaaaaaaa aaaaaaaaa 3409
<210> 24
<211> 662
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Val Val Ser Glu Val Asp Ile Ala Lys Ala Asp Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ser His Pro Leu Leu Leu Asn Gly Asp Ala Thr Val Ala Gln Lys Asn
20 25 30
Pro Gly Ser Val Ala Glu Asn Asn Leu Cys Ser Gln Tyr Glu Glu Lys
35 40 45
Val Arg Pro Cys Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Arg Ala Leu Gly Val
50 55 60
Glu Gln Asp Leu Ala Leu Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Ser
65 70 75 80
Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ala Leu Ser Gly Val Ala Leu Pro
85 90 95
Arg Gly Ser Gly Ile Val Thr Arg Cys Pro Leu Val Leu Lys Leu Lys
100 105 110
Lys Leu Val Asn Glu Asp Lys Trp Arg Gly Lys Val Ser Tyr Gln Asp
115 120 125
Tyr Glu Ile Glu Ile Ser Asp Ala Ser Glu Val Glu Lys Glu Ile Asn
130 135 140
Lys Ala Gln Asn Ala Ile Ala Gly Glu Gly Met Gly Ile Ser His Glu
145 150 155 160
Leu Ile Thr Leu Glu Ile Ser Ser Arg Asp Val Pro Asp Leu Thr Leu
165 170 175
Ile Asp Leu Pro Gly Ile Thr Arg Val Ala Val Gly Asn Gln Pro Ala
180 185 190
Asp Ile Gly Tyr Lys Ile Lys Thr Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Gln Arg
195 200 205
Gln Glu Thr Ile Ser Leu Val Val Val Pro Ser Asn Val Asp Ile Ala
210 215 220
Thr Thr Glu Ala Leu Ser Met Ala Gln Glu Val Asp Pro Glu Gly Asp
225 230 235 240
Arg Thr Ile Gly Ile Leu Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr
245 250 255
Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn Leu Val Phe His Leu Lys
260 265 270
Lys Gly Tyr Met Ile Val Lys Cys Arg Gly Gln Gln Glu Ile Gln Asp
275 280 285
Gln Leu Ser Leu Ser Glu Ala Leu Gln Arg Glu Lys Ile Phe Phe Glu
290 295 300
Asn His Pro Tyr Phe Arg Asp Leu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Thr Val
305 310 315 320
Pro Cys Leu Ala Glu Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ile Thr His Ile Cys
325 330 335
Lys Ser Leu Pro Leu Leu Glu Asn Gln Ile Lys Glu Thr His Gln Arg
340 345 350
Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Gly Val Asp Ile Pro Glu Asp Glu
355 360 365
Asn Glu Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Val Asn Ala Phe Asn Gln
370 375 380
Asp Ile Thr Ala Leu Met Gln Gly Glu Glu Thr Val Gly Glu Glu Asp
385 390 395 400
Ile Arg Leu Phe Thr Arg Leu Arg His Glu Phe His Lys Trp Ser Thr
405 410 415
Ile Ile Glu Asn Asn Phe Gln Glu Gly His Lys Ile Leu Ser Arg Lys
420 425 430
Ile Gln Lys Phe Glu Asn Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Pro Gly Phe
435 440 445
Val Asn Tyr Arg Thr Phe Glu Thr Ile Val Lys Gln Gln Ile Lys Ala
450 455 460
Leu Glu Glu Pro Ala Val Asp Met Leu His Thr Val Thr Asp Met Val
465 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Thr Asp Val Ser Ile Lys Asn Phe Glu Glu Phe Phe
485 490 495
Asn Leu His Arg Thr Ala Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu
500 505 510
Gln Glu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ile Arg Leu His Phe Gln Met Glu
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580 585 590
Ser Ser His Ile Pro Leu Ile Ile Gln Phe Phe Met Leu Gln Thr Tyr
595 600 605
Gly Gln Gln Leu Gln Lys Ala Met Leu Gln Leu Leu Gln Asp Lys Asp
610 615 620
Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Lys Glu Arg Ser Asp Thr Ser Asp Lys Arg
625 630 635 640
Lys Phe Leu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Leu Thr Gln Ala Arg Arg Arg
645 650 655
Leu Ala Gln Phe Pro Gly
660

Claims (37)

1.用于预测和诊断哺乳动物对象中病毒病原体的子宫内-传播的方法，所述方法包括：
(a)测定所述对象的生物样品中ISG15遍在蛋白类调节物(ISG15)、干扰素-诱导的具有三角形四肽重复的蛋白3(IFIT3)、遍在蛋白特异性肽酶18(USP18)、真核翻译起始因子2α激酶2(EIF2AK2)、包含HECT和RLD结构域的E3遍在蛋白蛋白连接酶5(HERC5)、包含自由基S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(RSAD2)以及MX发动蛋白类GTP酶1(MX1)基因中至少一种的表达水平，从而获得所述样品中的表达值Exsamp；
(b)计算所述样品的M(Msamp)值，其中所述值指示所述对象阻止所述病毒病原体的子宫内-传播的能力；
(c)提供非传播对象的标准M(Mstand)值，所述值指示阻止所述病毒病原体的子宫内-传播所需的最小能力；
(d)确定步骤(b)中计算的所述样品的M(Msamp)值关于(c)中提供的非传播对象的标准M(Mstand)值是否是正或负中的任一个；
其中Msamp的正值指示所述对象是非传播对象和Msamp的负值指示所述对象是病毒病原体传播对象，由此预测所述对象中所述病毒病原体的子宫内-传播。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤执行计算所述样品的M(Msamp)值：
(a)获得由1(a)测定的所述样品的表达值Exsamp；
(b)提供所述病毒病原体感染的对象的表达值的标准曲线；
(c)由(b)的所述标准曲线获得最大表达值Exmax和最小表达值Exmin；和
(d)计算所述样品的Msamp值，其中Msamp＝1-[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]。
3.根据权利要求1和2任一项所述的方法，其中所述病毒病原体是人巨细胞病毒(hCMV)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是人类女性对象。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述人类女性对象是怀孕处于妊娠早期阶段的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中测定所述对象的生物样品中所述ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因中至少一种的表达水平通过使对所述基因特异性的检测分子与所述对象的生物样品接触或与从其获得的任何核酸或蛋白产物接触的步骤执行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述检测分子选自分离的检测核酸分子和分离的检测氨基酸分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸检测分子包括分离的寡核苷酸(一种或多种)，每种寡核苷酸特异性杂交至所述ISG15、IFIT3、USP18、EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因中至少一种的核酸序列，并任选地特异性杂交至对照参比基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述检测分子是引物对、至少一种引物、核苷酸探针或其任意组合中至少一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血细胞和羊水中任一种。
11.根据权利要求1和2任一项所述的方法，其中所述第一步骤(a)包括测定ISG15、IFIT3和USP18中至少一种的表达水平。
12.试剂盒，其包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18基因的表达水平的检测分子。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，进一步包括特异于测定EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1的表达水平的检测分子。
14.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，进一步包括以下至少一个：
(a)用于计算测试对象的M(Msamp)值的工具，其中所述值指示所述对象阻止病毒病原体的子宫内-传播的能力；
(b)非传播对象的标准M(Mstand)值，所述值指示阻止所述病毒病原体的子宫内-传播所需的最小能力；
(c)用于计算非传播群体的标准Mstand值的工具；
(d)特异于测定生物样品中至少一种对照参比基因的表达水平的检测分子；和
(e)至少一种对照样品。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中用于计算测试对象的M(Msamp)值的工具包括以下至少一种：
(a)检测分子，其特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3、USP18基因和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平，从而测定所述样品中的表达值Exsamp；
(b)预定的校准曲线，其提供所述病毒病原体感染的对象中ISG15、IFIT3、USP18基因和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的标准表达值或从所述标准曲线计算的预定的最大表达值Exmax和最小表达值Exmin；和
(c)用于计算Msamp值的公式，其中所述公式为Msamp＝[(Exsamp-Exmin)/(Exmax-Exmin)]。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的试剂盒，其中所述病毒病原体是hCMV。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述试剂盒是用于预测哺乳动物对象中hCMV的子宫内-传播的诊断试剂盒。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述对象是hCMV感染的对象。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述对象是人类女性对象。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述人类女性对象是怀孕处于妊娠早期阶段的。
21.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，进一步包括使用说明书，其中所述说明书包括以下至少一种：
(a)用于进行所述ISG15、IFIT3、USP18基因和任选地所述EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达的检测和定量的说明书；
(b)用于进行所述至少一种对照参比基因的表达的检测和定量的说明书；
(c)用于确定计算的所述样品的M(Msamp)值关于非传播对象的标准M(Mstand)值是否是正或负中的任一个的说明书。
22.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，其中所述检测分子包括分离的检测核酸分子和分离的检测氨基酸分子中的至少一种。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述检测分子包括分离的寡核苷酸，每种所述寡核苷酸特异性杂交至所述ISG15、IFIT3和USP18基因和任选地所述EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因之一的RNA产物的核酸序列。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述检测分子是至少一种引物、至少一种引物对、至少一种核苷酸探针或其任意组合中的至少一种。
25.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，进一步包括用于进行核酸扩增类试验的至少一种试剂，所述试验选自实时PCR、微阵列、PCR、原位杂交和比较基因组杂交。
26.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，进一步包括固体支持体，其中所述检测分子中每种以阵列布置。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中检测分子的所述阵列包括多个寻址容器。
28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中检测分子的所述阵列包括在不同区域中容纳检测分子的固体支持物。
29.根据权利要求12和13中任一项所述的试剂盒，其中所述样品是血液样品和羊水中的至少一种。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述样品是血液样品，和其中所述试剂盒包括特异于测定所述血液样品中ISG15、IFIT3和USP18基因和任选地EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子(一种或多种)。
31.特异于ISG15、IFIT3和USP18基因的检测分子的阵列，其中所述检测分子是分离的检测核酸分子或分离的检测氨基酸分子(一种或多种)。
32.根据权利要求31所述的阵列，进一步包括特异于EIF2AK2、HERC5、RSAD2和MX1基因的检测分子。
33.根据权利要求31和32中任一项所述的阵列，包括包含所述检测分子(一种或多种)的多个寻址容器。
34.根据权利要求33所述的阵列，其包括在不同区域中容纳检测分子的固体支持体。
35.预后组合物，其包括特异于测定生物样品中ISG15、IFIT3和USP18基因的表达水平的检测分子。
36.根据权利要求35所述的预后组合物，进一步包括特异于测定生物样品中EIF2AK2，HERC5，RSAD2和MX1基因的表达水平的检测分子。
37.根据权利要求35和36中任一项所述的预后组合物，用于预测和诊断哺乳动物对象中人巨细胞病毒(hCMV)的子宫内-传播。
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