RU2786211C1 - Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов - Google Patents
Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786211C1 RU2786211C1 RU2022107106A RU2022107106A RU2786211C1 RU 2786211 C1 RU2786211 C1 RU 2786211C1 RU 2022107106 A RU2022107106 A RU 2022107106A RU 2022107106 A RU2022107106 A RU 2022107106A RU 2786211 C1 RU2786211 C1 RU 2786211C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trec
- krec
- rpp30
- hprt
- immunity
- Prior art date
Links
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 title abstract description 4
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 64
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims abstract description 33
- 101710008635 CYP74A2 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101700023344 GAF1 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101700057967 RPP30 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100000665 RPP30 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102000018251 EC 2.4.2.8 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010091358 EC 2.4.2.8 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 14
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 11
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 10
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial Effects 0.000 claims description 4
- 101710011940 HPRT1 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000295 complement Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 12
- 201000003874 common variable immunodeficiency Diseases 0.000 description 12
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 6
- 208000002491 Severe Combined Immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 6
- 208000007924 IgA Deficiency Diseases 0.000 description 5
- 206010021449 Immunodeficiency common variable Diseases 0.000 description 5
- 206010039915 Selective IgA immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 5
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 201000007156 immunoglobulin alpha deficiency Diseases 0.000 description 5
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 4
- 208000000398 DiGeorge Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 4
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102100004545 IL17RA Human genes 0.000 description 3
- 101710035970 IL17RA Proteins 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000002992 thymic Effects 0.000 description 3
- 208000006673 Asthma Diseases 0.000 description 2
- 201000010717 Bruton-type agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 2
- 206010064063 CHARGE syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000004700 Fetal Blood Anatomy 0.000 description 2
- 206010027665 Immune disorder Diseases 0.000 description 2
- 206010021425 Immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 2
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 2
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108009000363 22q11.2 Deletion Syndrome Proteins 0.000 description 1
- 206010003594 Ataxia telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 210000000649 B-Lymphocyte Subsets Anatomy 0.000 description 1
- 241000349774 Bikinia letestui Species 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 206010009839 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 206010061596 Gastrointestinal malformation Diseases 0.000 description 1
- 208000005721 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010052739 Immunodeficiency disorder Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 206010028182 Multiple congenital abnormality Diseases 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 201000009446 chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003137 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 201000001820 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004160 naive B lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004296 naive T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920003255 poly(phenylsilsesquioxane) Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 201000002367 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010874 syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов. Диагностику проводят с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а также с использованием стандартных образцов плазмидной ДНК. Способ включает синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, с известными концентрациями. Выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Определение уровня TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, «нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Вывод о состоянии иммунитета делают на основании нормального или сниженного уровней TREC и KREC. Технический результат заключается в расширении арсенала средств, используемых для диагностики состояния иммунитета пациентов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к иммунодиагностике, в частности к проблеме оценки иммунного статуса пациентов. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови).
Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.
Иммунодефицитные состояния характеризуются полным или частичным отсутствием Т- или В-клеток, а также натуральных киллеров или ослаблением функций этих клеток. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток и функциональной активности соответствующих звеньев иммунной системы может служить содержание в периферической крови, соответственно, Т-рецепторных эксцизионных колец (T-cell receptor excision circles - TREC) и В-клеточных эксцизионных колец (kappa-deleting recombination excision circles - KREC), формирующихся в процессе V(D)J-реарранжировки.
Полное или частичное отсутствие (снижение уровня) Т- и/или В-клеток у новорожденных определяется при первичных иммунодефицитах, трисомиях 21 и 18 хромосом, различных цитогенетических мутациях, а также при недоношенности младенцев, в том числе при плановом кесаревом сечении (КС).
Первичные иммунодефициты (ПИД) представляют собой группу генетически детерминированных заболеваний, обусловленных нарушением одного или нескольких механизмов иммунной защиты. При этом возможны структурное или функциональное нарушение Т- и В-клеток адаптивного иммунитета, а также нарушение развития гуморального и клеточного компонентов системы врожденного иммунитета. На сегодняшний день известно более 250 форм генетически подтвержденных ПИД, среди которых выделяют заболевания с дефицитом Т-клеток, дефицитом В-клеток (преобладающая группа), комбинированным дефицитом Т- и В-клеток. Клиническая тяжесть колеблется от легкой до потенциально опасной для жизни. Учитывая, что симптомы ПИД обычно не являются специфичными, значимой проблемой данной группы заболеваний остается гиподиагностика - большинство пациентов с ПИД скрыты под маской других диагнозов (достаточно упомянуть проблему часто и длительно болеющих детей). Данное обстоятельство приводит к несвоевременному и неадекватному лечению, а у пациентов с тяжелыми формами ПИД к 100% летальности. К таким заболеваниям относится, например, Х-сцепленная агаммаглобулинемия (ХГБ). Снижение Т- и/или В-клеток показано для синдрома ДиДжорджи (делеция 22q11.2), телеангиэктазии атаксии, синдрома Неймегена, синдрома CHARGE. Тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН), представляющий собой редкую группу первичных нарушений иммунодефицита с известными или неизвестными генетическими изменениями. Дети с ТКИН обычно выглядят здоровыми при рождении, но в конечном итоге у них развиваются тяжелые, угрожающие жизни инфекции со 100%-ной смертностью, преимущественно в течение первого года жизни. Ранняя диагностика и лечение ТКИН с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток имеет важное значение для предотвращения смерти и восстановления нормальной функциональной иммунной системы. Если лечение проводится в течение первых 3,5 месяцев жизни, до развития угрожающих жизни инфекций, для детей с ТКИН показана более 95% выживаемость. Напротив, у детей с ТКИН, которые получали лечение после 3,5 месяцев, выживаемость падает до 60-70%, что свидетельствует о важности ранней диагностики и лечения. По оценкам, до 50% младенцев умирают из-за того, что им не был поставлен достаточно ранний диагноз для применения жизненно важных методов лечения.
Врожденные аномалии, включая пороки сердца, желудочно-кишечные пороки развития, множественные врожденные пороки развития, а также преждевременные роды могут быть связаны с вторичной лимфопенией младенцев.
Отдельный интерес представляет снижение иммунного статуса, связанное с преждевременными родами. Недоношенные дети имеют функциональную недостаточность иммунной системы. Незрелость врожденной иммунной системы и высокая потребность в инвазивных медицинских процедурах в контексте преждевременных родов делают этих детей очень восприимчивыми к распространенным патогенам новорожденных [Sharma А.А., Jen R., Butler A., Lavoie P.M. The developing human preterm neonatal immune system: a case for more research in this area. Clin Immunol. 2012 Oct;145(1):61-8. doi: 10.1016/j.clim.2012.08.006.].
Известно, что родоразрешение посредством КС связано с повышенным риском возникновения иммунных нарушений в более позднем возрасте, таких как аллергия, бронхиальная астма, диабет 1 типа, целиакия, злокачественные новообразования, иммунодефицитные состояния [Sevelsted A., Stokholm J., Bønnelykke K., Bisgaard Н. Cesarean section and chronic immune disorders. Pediatrics. 2015; 135(1):e92-8. doi: 10.1542/peds.2014-0596.]. К вероятным причинам развития этих заболеваний могут относиться несвоевременная и пониженная активация иммунной системы новорожденного, в том числе за счет более короткого гестационного возраста при КС по сравнению с естественными родами [Cho С.Е., Norman М. Cesarean section and development of the immune system in the offspring. Am J Obstet Gynecol. 2013;208(4):249-54. doi: 10.1016/j.ajog.2012.08.009.], что приводит уменьшению пула долгоживущих лимфоцитов и, в свою очередь, может иметь клинические последствия на более поздней стадии, особенно когда растущий индивид подвергается воздействию инфекционных агентов и антигенов. В связи с вышесказанным обращает на себя внимание, что, хотя клинически обоснованная частота КС не превышает 20%, мировой показатель КС увеличился в четыре раза менее чем за два десятилетия, что делает его наиболее распространенной хирургической процедурой, выполняемой у женщин детородного возраста без медицинских показаний [Schlinzig Т., Johansson S., Stephansson О., Hammarström L., Zetterström R.H., von Döbeln U., Cnattingius S., Norman M. Surge of immune cell formation at birth differs by mode of delivery and infant characteristics-A population-based cohort study. PLoS One. 2017;12(9):e0184748. doi: 10.1371/journal.pone.0184748.].
Современная стратегия развития скрининга новорожденных связана с максимально ранним, в идеале сразу после рождения, выявлением иммунодефицитов, связанных с нарушением пролиферации Т- и В-клеток. В случае генетически обусловленных заболеваний, таких как ПИД, отсутствие функциональных Т- и/или В-лимфоцитов служит диагностическим критерием, в случае преждевременных родов и КС оценка содержания Т- и/или В-лимфоцитов может служить прогностическим маркером, и в том, и в другом случае выявление и оценка уровня TREC и KREC может применяться для скрининга новорожденных. Таким образом, этот анализ дает ценную диагностическую и прогностическую информацию в отношении широкого спектра заболеваний, связанных с нарушением Т- и/или В-клеточного звена иммунитета, что позволяет выявлять пациентов для углубленного обследования и своевременного назначения адекватной терапии.
При первичном выявлении ПИД у взрослых пациентов определяют разнообразную и преимущественно сглаженную клиническую картину ПИД, например, селективный IgA-дефицит, ОВИН, являющихся наиболее частыми формами ПИД у лиц старше 18 лет. Характер клинических проявлений патологии у пациентов индивидуален и отличается вариабельностью течения даже в рамках одной нозологической формы [Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых. Медицинская иммунология. 2014. №4(16). С. 367-374]. Неоднородность клинической картины при ОВИН включает общую неспецифическую черту - рецидивирующие респираторные инфекции, которые поддаются определению и лечению на уровне первичного звена до более глубокого обследования пациентов [Deane S., Selmi С, Naguwa S.M., Teuber S.S., Gershwin M.E. Common variable immunodeficiency: etiological and treatment issues. International archives of allergy and immunology. 2009. №4 (150). C. 311-324. doi: 10.1159/000226232.].
У больных как с селективным IgA дефицитом, так и с ОВИН, снижено разнообразие кишечной микробиоты, значительно снижено альфа-разнообразие, что связано с повышенной проницаемостью для микробных компонентов, приводящих к усилению системного воспаления [Jørgensen S.F., Holm K., Macpherson М.Е., Storm-Larsen С., Kummen М., Fevang В., Aukrust P., Hov J.R. Selective IgA deficiency in humans is associated with reduced gut microbial diversity. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2019. 143(5): 1969-1971.e11. doi: 10.1016/j.jaci.2019.01.019.]. Согласно некоторым исследованиям, из-за задержки диагностики, ОВИН впервые может быть установлен и в возрасте 35 лет и старше. Несмотря на то, что состояния, связанные с гипогаммаглобулинемией, можно определить после исключения транзиторной младенческой гипогаммаглобулинемии, согласно возрасту [Латышева Е.А., Латышева Т.В. Федеральные клинические рекомендации Первичные иммунодефициты с преимущественным нарушением синтеза антител (Д80, Д83). 2018.]. Выделяют три возрастных пика диагностики ОВИН: 2-7, 25-30 и 50-60 лет; при установлении диагнозов селективного IgA дефицита (средняя продолжительность периода до установления диагноза 10,5 лет) и ОВИН (средняя продолжительность периода до установления диагноза 5,8 лет) [Deane S., Selmi С., Naguwa S.M., Teuber S.S., Gershwin M.E. Common variable immunodeficiency: etiological and treatment issues. International archives of allergy and immunology. 2009. №4 (150). C. 311-324. doi: 10.1159/000226232., Urm S.H., Yun H.D., Fenta Y.A., Yoo K.H., Abraham R.S., Hagan J., Juhn Y.J. Asthma and risk of selective IgA deficiency or common variable immunodeficiency: a population-based case-control study. Mayo Clinic proceedings. 2013. №8 (88). C. 813-21. doi: 10.1016/j.mayocp.2013.05.021.]. Однако в редких случаях у взрослых пациентов могут быть выявлены более тяжелые формы ПИД, например, синдром Ди Джорджи [Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых. Медицинская иммунология. 2014. №4 (16). С.367-374].
Диагностика таких ПИД, которые впервые дебютируют или выявляются в подростковом и взрослом возрасте, в основном стоится на исследовании клинической картины, анамнеза и исключении вторичной причины снижения уровней сывороточных иммуноглобулинов, оценке их количества в крови и проведении проточной цитометрии для количественной оценки имеющих поверхностно-мембранные Ig субпопуляции В-лимфоцитов в периферической крови. В связи с тем, что для пациентов с IgAdef не характерны отклонения количестве Т-лимфоцитов [Bateman Е.А., Ayers L., Sadler R., Lucas M., Roberts C, Woods A., Packwood K., Burden J., Harrison D., Kaenzig N., Lee M., Chapel H.M., Ferry B.L. T cell phenotypes in patients with common variable immunodeficiency disorders: associations with clinical phenotypes in comparison with other groups with recurrent infections. Clinical and experimental immunology. 2012. №2 (170): 202-11. doi: 10.1111/j.1365-2249.2012.04643.x.], исследование количества TREC у них в крови имеет малую диагностическую ценность. Описано применение анализа уровней TREC и KREC у взрослых пациентов с ОВИН и выявление его связи с тяжестью течения заболевания [Kamae С., Nakagawa N., Sato Н., Honma K., Mitsuiki N., Ohara О., Kanegane H., Pasic S., Pan-Hammarstrom Q., van Zelm M.C., Morio Т., Imai K., Nonoyama S. Common variable immunodeficiency classification by quantifying T-cell receptor and immunoglobulin к-deleting recombination excision circles. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2013. №5 (131): 1437-1440.e5. doi: 10.1016/j.jaci.2012.10.059.]. Уровни TREC достоверно снижены у взрослых больных с синдромом Ди Джорджи при нормальных уровнях KREC [Dar N., Gothelf D., Korn D., Frisch A., Weizman A., Michaelovsky E., Carmel M., Yeshayahu Y., Dubnov-Raz G., Pessach I.M., Simon A.J., Lev A., Somech R. Thymic and bone marrow output in individuals with 22q11.2 deletion syndrome. Pediatric Research. 2015. №4 (77): 579-585. doi: 10.1038/pr.2015.14.].
Известен метод оценки количества TREC с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовавшийся для выявления недавно вышедших из тимуса клеток у ВИЧ-инфицированных лиц, а также для диагностики иммунодефицитов [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396(6712):690-695.; Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal E, Spirer Z, et al. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res. 2010. 67(2): 211-216.]. Количественный анализ TREC применяли для диагностики новорожденных с ПИД при использовании выделения ДНК из сухих пятен крови [Douek DC, Vescio RA, Berts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000; 355(9218):1875-81.; Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009; 124(3):522-7]. Однако, методы, анализирующие состояние иммунной системы только по TREC, очевидно ограничены, так как учитывают только Т-клетки, но не В-клетки.
Известен метод использования количественного анализа TREC и BREC для определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток [van Dongen JJ.M. Replicative history of T-and B-cell subsets. EP 1849877 A1. Application number: 06075943.8 31.10.2007. Bulletin 2007/44. Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR). Date of filing: 24.04.2006], способ ограничен моноплексным осуществлением анализа, за счет чего снижена точность и сопоставимость получаемых результатов анализа.
Известен метод дуплексного количественного анализа TREC и KREC для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов [Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15;119(11):2552-5. doi: 10.1182/blood-2011-08-371021.], но предложенный метод ограничен низкими уровнями отсечения, а также применением исключительно с использованием конкретных аналитических приборов ABI 7500 и ViiA7 (Applied Biosystems).
Известен предложенный нами ранее [Семенов А.В., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Тотолян А.А. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов. Патент на изобретение RU 2756979 С2, 07.10.2021. Патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера». Заявка №2019142752 от 17.12.2019. Бюл. «Изобретения. Полезные модели» №28/10.10.2021.] способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета на основании оценки уровня ДНК TREC, KREC у новорожденных с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, недостатком метода является использование в качестве калибраторов стандартных образцов ДНК человека и сложностью двухэтапной постановки для рутинной лабораторной диагностики.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе российских иммунологов: Гордукова М.А., Продеус А.П., Филипенко М.Л., Корсунский И.А. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк. (Пат. №2587540 20.06.2016. Бюл. №17. Заявка: 2015132823/15, 06.08.2015). Согласно методу, выделяют ДНК из анализируемого образца крови. Затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA с использованием набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций. По результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Недостатком способа является использование одного нормировочного гена для нормирования данных. Недостатком способа нормирования данных с использованием одного эталонного гена является вариабельность результатов анализа, так как не существует идеального нормировочного гена, постоянного в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. В связи с этим выбор эталонного гена является одним из самых ответственных этапов при проведении анализа. Наиболее оптимальным можно считать подход, при котором анализируется одновременно несколько эталонных генов. Кроме того, расчет полученных результатов без учета эффективности ПЦР, коэффициента пропорциональности и уровня флуоресценции порогового цикла снижает чувствительность, повторяемость и воспроизводимость метода.
Авторами предложен способ, согласно которому в образце ДНК, выделенном из цельной крови или из капли сухой крови, определяют количество целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Уровни целевых молекул ДНК TREC и KREC определяют путем пересчета полученных в ходе работы абсолютных значений (количество копий в реакции) на калибровочных графиках с использованием в качестве калибраторов серии последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30.
Технический результат - повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (отсутствие и/или низкие уровни молекул ДНК TREC, KREC) результатов, а значит и расширение возможностей метода, расширение арсенала средств, используемых для диагностики состояния иммунитета пациентов.
Сущность метода заключается в том, что экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Для амплификации используют набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Определение уровня TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, «нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Абсолютное значение (количество копий в реакции) целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных графиков, построенных при амплификации серии последовательных десятикратных разведений стандартных образцов плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, с известными концентрациями
По результатам определения количества TREC и KREC в анализируемом образце проводят сравнение с нормальными уровнями TREC и KREC, показанными для возрастной группы и расы пациентов, на основании чего делают выводы о состояния их иммунитета, то есть о нормальном иммунитете, если выявленные уровни TREC и KREC соответствуют норме, или о снижении иммунитета, если уровни TREC и/или KREC ниже нормы, так как это свидетельствует о полном или частичном отсутствии (снижении уровня) Т- и/или В-клеток, что характерно для иммунодефицитных состояний.
Для выявления образцов с отсутствием или снижением уровня целевых молекул TREC и KREC в одной емкости из одной навески экстрагированной ДНК проводят мультиплексную постановку ПЦР участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30 с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов:
Состав амплификационной смеси представляет собой буферный раствор, содержащий Трис-HCl рН 8,8 (при 25°С), KCl, 6-7 мМ MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, SynTaq ДНК-полимеразу с ингибирующими активность фермента антителами (или 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы, или Hot-start Taq ДНК-полимеразы).
ПЦР и детекцию результатов проводят при следующих условиях:
Параллельно постановке ПЦР в образцах проводят постановку ПЦР для калибраторов, представляющих собой серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними: GCCACATCCCTTTCAACCATGCTGACGCCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCTCACTCCTGTGCACGGTGATGCATAGGCACCTGCAGCTGGCGTTCTCTTTCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTGCGCTGTCTGCACGGGCAGCAGGTTGGAACTCTAGGGTAAGAGCTGGCTCCTGGTGTCTTGCTCGAGATGTGATGAAGGAGATGGGAGGCCATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGGCTATAAATTCTTTGCTGACCTGCTGAGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTG
Первичный анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК TREC;
- по каналу для флуорофора HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК KREC;
- по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30;
- по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК HPRT.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct), сомнительным во всех других случаях.
Уровень ДНК TREC и KREC определяют в копиях на миллилитр и в копиях на 105 клеток. Расчет уровней целевых молекул осуществляют с использованием следующих формул:
Эффективность ПЦР:
где Е - эффективность, а - коэффициент из уравнения у=ах+b, получаемого при аппроксимации зависимости порогового цикла от концентрации матрицы в образце.
Коэффициент пропорциональности:
где α - коэффициент пропорциональности, Ct - пороговый цикл, С0 - исходная концентрация, FCt - уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е - эффективность.
Концентрация целевых молекул в копиях на мл:
где С0 - исходная концентрация, αm - α средняя для флуорофора, Ct - пороговый цикл, FCt - уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е - эффективность.
Концентрация целевых молекул в копиях на 100 тыс.клеток:
где С10 5 - количество TREC или KREC на 100 тысяч ядросодержащих клеток, С0 - исходная концентрация TREC или KREC в миллилитре образца, Chprt - исходная концентрация HPRT в миллилитре образца, CRPP30 - исходная концентрация RPP30 в миллилитре образца.
Расчет по указанным формулам возможен как вручную, так и с использованием разработанной авторами расчетной таблицы.
Расчет уровней TREC, KREC с использованием расчетной таблицы осуществляется следующим образом: для всей серии последовательных разведений плазмидной ДНК (калибраторов) вносят в соответствующие строки и столбцы таблицы известные концентрации калибраторов и значения пороговых циклов, указывают уровни пороговых линий, затем указывают название образца и соответствующие им значения пороговых циклов. Расчетные результаты будут получены в графах «Количество TREC» и «Количество KREC», соответственно, представлены в вариантах пересчета: копий на мл; копий на 105 клеток.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 - фиг. 2 представлены кривые флуоресценции и калибровочные графики, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе серии разведений калибраторов. А также чертежами, где на фиг. 3 представлен пример использования формул в расчетной таблице и расчета TREC и KREC в образцах с различными уровнями целевых молекул.
Таким образом, предложенный способ отличается от прототипа использованием двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, набором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов, использованием в качестве стандартных образцов серии последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30.
Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода, являющиеся одним из возможных способов его реализации.
Пример 1.
Новорожденные: образцы пуповинной крови 157 детей. Для всей группы количество TREC в пуповинной крови детей находилось в диапазоне от 10762 до 121068 копий/105 лимфоцитов. Среднее значение TREC составило 29945±1412 копий/105 лимфоцитов. Концентрация KREC составила от 10550 до 89533 копий/105 лимфоцитов, среднее 36199±1347 копий/105 лимфоцитов.
Пример 2.
Проанализирована кровь 5 пациентов с диагнозом Х-сцепленная агаммаглобулинемия. Диагноз поставлен на основании клинических и лабораторных данных, а также результатов генетического исследования ВТК-гена, выполненного в лаборатории молекулярной иммунологии НИИЭМ имени Пастера. Среди пациентов отмечается выраженное снижение KREC при содержании TREC в пределах нормальных значений.
Пример 3.
Обследованы более 2000 новорожденных с использованием анализа сухой капли крови на картах Гатри. Новорожденным с выявленным снижением уровней TREC и/или KREC была рекомендована консультация иммунолога. В обследованной группе выявлены 10 пациентов с ПИД различной нозологии, в том числе больные с синдромом Чарджа, ТКИН, транзиторная гипогаммаглобулинемия детского возраста, агаммаглобулинемия.
Пример 4.
Обследованы более 400 ВИЧ-инфицированных лиц в возрасте от 24 до 49 лет. Среднее количество TREC у ВИЧ-инфицированных с низкой вирусной нагрузкой составило 2539±510,5 копий/105 лимфоцитов, KREC 6048±1629 KREC/105 лимфоцитов. У больных с высокой вирусной нагрузкой среднее количество TREC составило 486,8±235,1 копий/105 лимфоцитов, KREC 5125±2238 копий/105 лимфоцитов. He выявлено достоверных различий ни по концентрации TREC, ни по концентрации KREC между ВИЧ-инфицированными с низкой вирусной нагрузкой и условно здоровыми донорами. Количество TREC у здоровых доноров в 7,6 раз выше, чем у ВИЧ-инфицированных с высокой вирусной нагрузкой (р=0,0001). Между группой больных с низкой вирусной нагрузкой и с высокой вирусной нагрузкой показаны достоверные различия по концентрации TREC (р=0,025).
Пример 5.
Также в течение 2017-2021 гг.проведено более 1200 исследований взрослых условно здоровых лиц различных возрастных групп предложенным методом. Все пациенты были разделены на возрастные группы: 18-29 лет, 30-39 лет, 40-49 лет, 50-59 лет, 60-69 лет, и лица старше 70 лет. Определены возрастные нормы содержания молекул TREC и KREC в периферической крови среди взрослых жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», ул. Мира, 14, Санкт-Петербург, 197101, Российская Федерация
<120> СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ИММУНИТЕТА ПАЦИЕНТОВ И НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫХ ЗОНДОВ, И СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ
<160> 13
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер ПЦР
<400> 1
cacatccctt tcaaccatgc t 21
<210> 2
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Обратный праймер ПЦР
<400> 2
tgcaggtgcc tatgcatca 19
<210> 3
<211> 26
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор FAM, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1 или BHQ1
<400> 3
cacctctggt ttttgtaaag gtgccc 26
<210> 4
<211> 27
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер ПЦР
<400> 4
tcccttagtg gcattatttg tatcact 27
<210> 5
<211> 24
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Обратный праймер ПЦР
<400> 5
aggagccagc tcttacccta gagt 24
<210> 6
<211> 21
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор HEX, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1 или BHQ1
<400> 6
tctgcacggg cagcaggttg g 21
<210> 7
<211> 22
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер ПЦР
<400> 7
cttgctcgag atgtgatgaa gg 22
<210> 8
<211> 25
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Обратный праймер ПЦР
<400> 8
cagcaggtca gcaaagaatt tatag 25
<210> 9
<211> 30
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор Cy5, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ2 или BHQ2
<400> 9
atcacattgt agccctctgt gtgctcaagg 30
<210> 10
<211> 16
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Прямой праймер ПЦР
<400> 10
tttggacctg cgagcg 16
<210> 11
<211> 20
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Обратный праймер ПЦР
<400> 11
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 12
<211> 23
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор ROX, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ2 или BHQ2
<400> 12
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 13
<211> 370
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность, представляющая собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, включенная в ТА-вектор
<400> 13
gccacatccc tttcaaccat gctgacgcct ctggtttttg taaaggtgct cactcctgtg cacggtgatg cataggcacc tgcagctggc gttctctttc ccttagtggc attatttgta tcactgtgcg ctgtctgcac gggcagcagg ttggaactct agggtaagag ctggctcctg gtgtcttgct cgagatgtga tgaaggagat gggaggccat cacattgtag ccctctgtgt gctcaagggg ggctataaat tctttgctga cctgctgagg tgtttgcaga tttggacctg cgagcgggtt ctgacctgaa ggctctgcgc ggacttgtgg agacagccgc tcaccttggc tattcagttg 370
Claims (9)
1. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов на основе определения количества Т- и В-клеток, для осуществления которого экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего проводят полимеразную цепную реакцию для целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а именно: TRECF-cacatccctttcaaccatgct, TRECR-tgcaggtgcctatgcatca, TRECzondFAM-FAM-cacctctggtttttgtaaaggtgccc-RTQ1/BHQ1, KRECF-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR-aggagccagctcttaccctagagt, KRECzondHEX-HEX-tctgcacgggcagcaggttgg-BHQ1, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2, а также стандартных образцов плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, а именно:
gccacatccctttcaaccatgctgacgcctctggtttttgtaaaggtgctcactcctgtgcacggtgatgcataggcacctgcagctggcgttctctttcccttagtggcattatttgtatcactgtgcgctgtctgcacgggcagcaggttggaactctagggtaagagctggctcctggtgtcttgctcgagatgtgatgaaggagatgggaggccatcacattgtagccctctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgacctgctgaggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttg, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, абсолютное значение (количество копий в реакции) целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных графиков, построенных при амплификации серии последовательных десятикратных разведений стандартных образцов плазмидной ДНК известных концентраций, и по результатам определения количества TREC и KREC в анализируемом образце проводят сравнение с нормальными уровнями TREC и KREC, показанными для расы, к которой принадлежит пациент, на основании чего делают выводы о состоянии их иммунитета, то есть о нормальном иммунитете, если выявленные уровни TREC и KREC соответствуют норме, или о снижении иммунитета, если уровни TREC и/или KREC ниже нормы, так как это свидетельствует о полном или частичном отсутствии (снижении уровня) Т- и/или В-клеток, что характерно для иммунодефицитных состояний.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, тем самым выявляя среди анализируемых образцов образцы с отсутствием или низким уровнем целевых молекул TREC и KREC.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для нормализации целевого продукта на эталонный ген при наличии двух эталонных нормировочных генов вводят «нормировочный коэффициент», который вычисляют как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения эталонных нормировочных генов.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стандартных образцов используют серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними.
а количество копий целевых молекул ДНК TREC и KREC на 105 клеток рассчитывают по формуле: где С10 5 - количество TREC или KREC на 100 тысяч ядросодержащих клеток, С0 - исходная концентрация TREC или KREC в миллилитре образца, Chprt - исходная концентрация HPRT в миллилитре образца, CRPP30 - исходная концентрация RPP30 в миллилитре образца.
6. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов для проведения амплификации целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30: TRECF-cacatccctttcaaccatgct, TRECR-tgcaggtgcctatgcatca, TRECzondFAM-FAM-cacctctggtttttgtaaaggtgccc-RTQ1/BHQ1, KRECF-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR-aggagccagctcttaccctagagt, KRECzondHEX-HEX-tctgcacgggcagcaggttgg-BHQ1, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2; в набор входят стандартные образцы, представляющие собой серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними:
gccacatccctttcaaccatgctgacgcctctggtttttgtaaaggtgctcactcctgtgcacggtgatgcataggcacctgcagctggcgttctctttcccttagtggcattatttgtatcactgtgcgctgtctgcacgggcagcaggttggaactctagggtaagagctggctcctggtgtcttgctcgagatgtgatgaaggagatgggaggccatcacattgtagccctctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgacctgctgaggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttg.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2786211C1 true RU2786211C1 (ru) | 2022-12-19 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019044952A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2019-03-07 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター | Trec又はkrecの量を評価する方法、当該方法に用いる粒子、並びにこれらの利用 |
RU2756979C2 (ru) * | 2019-12-17 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019044952A1 (ja) * | 2017-08-30 | 2019-03-07 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター | Trec又はkrecの量を評価する方法、当該方法に用いる粒子、並びにこれらの利用 |
RU2756979C2 (ru) * | 2019-12-17 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MENSEN A. et al., Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, J Transl Med., 2013, Volume 11, p. 188. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Seror et al. | Association of anti–Porphyromonas gingivalis antibody titers with nonsmoking status in early rheumatoid arthritis: results from the prospective French cohort of patients with early rheumatoid arthritis | |
US11236390B2 (en) | Means for diagnosing, predicting or monitoring Pneumocystis pneumonia | |
AU731856B2 (en) | Methods of screening for ulcerative colitis by detecting an interleukin-1 receptor antagonist polymorphism | |
JP6707181B2 (ja) | 早産のリスクがある妊娠女性を同定するためのキットまたはパッケージ、および、当該キットまたはパッケージの使用 | |
CN108513586A (zh) | 病原体生物标志物及其用途 | |
RU2587540C1 (ru) | Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк | |
Soriano et al. | HLA class II genes in soybean epidemic asthma patients | |
US20210395825A1 (en) | Urine biomarkers for detecting graft rejection | |
RU2786211C1 (ru) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов | |
Gomez et al. | Oral recurrent human herpes virus infection and bone marrow transplantation survival | |
RU2756979C2 (ru) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов | |
Azzi et al. | Periodontal microbioma and rheumatoid arthritis: The role of Porphyromonas gingivalis | |
CN107190074B (zh) | hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
JP2019193577A (ja) | 好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キット | |
RU2651038C1 (ru) | Способ выявления нарушений у детей иммунологической реактивности в условиях избыточной экспозиции стронцием | |
Ahmed et al. | Soluble T cell immunoglobulin and mucin-domain containing protein 3 in children hospitalized with pneumonia in resource-limited settings | |
RU2693471C1 (ru) | Способ диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза у детей в условиях избыточной контаминации алюминием | |
RU2739997C1 (ru) | Способ выявления и лабораторного подтверждения наследуемого хромосомно-интегрируемого вируса герпеса человека 6A/B | |
RU2779085C1 (ru) | Способ выявления предрасположенности к развитию метаболического синдрома в виде ожирения у школьников 7-10 лет | |
WO2022059745A1 (ja) | 乳幼児アトピー性皮膚炎の検出方法 | |
CN107190073A (zh) | hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
Sauerbrei et al. | Laboratory diagnosis of varicella-zoster virus infections | |
CN107345249B (zh) | hsa_circRNA_103112在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
Kievskaya et al. | SNP-Based Chromosomal Microarray Analysis for Detecting DNA Copy Number Variations in Fetuses with a Thickened Nuchal Fold | |
González-Mesa et al. | Transmitted Fetal Immune Response in Cases of SARS-CoV-2 Infections during Pregnancy. Diagnostics 2022, 12, 245 |